Тест-система імуноферментна для кількісного визначення антитіл класу igg проти вірусу червонички в сироватці крові людини (dia-rubella-igg)

Винахід належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використаний для виявлення імуноглобулінів класу G у сироватці крові людини, визначення їх концентрації, титру антитіл проти вірусу червонички і може бути використаний в клініці для постановки та підтвердження діагнозу червонички (особливо вагітним жінкам та немовлятам, оцінки їх імунного статусу), а також для проведення сероепідемічних досліджень та скринінгу сироваток при контролі результатів вакцинопрофілактики. В Україні тест-системи для виявлення зараженості людей вірусом червонички не виробляються. В Росії випускається тест-система "ВектоРубелла-IgG-стрип" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибірськ), в складі якої на твердій фазі використовуються білки-антигени вірусу червонички, сироватки досліджуються після попереднього розведення 1:100, а як кон'югат беруть антивидов! антитіла проти імуноглобулінів класу G людини, мічені пероксидазою [1]. В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі імуносорбенту з очищеними поверхневими білками-антигенами вірусу червонички. Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів. Досліджувані сироватки використовують без попереднього розведення. В складі кон'югатів беруть моноклональні антитіла проти імуноглобулінів людини класу G, мічені ферментом. Ферментативну реакцію визначають за допомогою субстратного розчину з хромогеном. За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 88 сироваток. Приклад 1 Визначення антитіл проти вірусу червонички у сироватці кровіхворої М., 1980 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього вносять у лунки планшета-імуносорбенту з фіксованими на ньому білками-антигенами вірусу червонички по 90мкл розчину для розведення сироваток та по 10мкл сироватки кровіхворої для виявлення антитіл класу G (IgG). В чотири лунки вносять по 90мкл розчину для розведення сироваток та контрольні зразки, а в три лунки по 10мкл позитивних контрольних зразків - сироваток з визначеними титрами антитіл (щоб побудувати калібрувальну криву), а в одну - 10мкл негативної контрольної сироватки. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37°С протягом 60 хв. Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів. В лунки планшета вносять по 100мкл розчину моноклонального кон'югату проти імуноглобулінів людини, мічених пероксидазою, та інкубують планшет при 37°С у термостаті 30хв. Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять по 100мкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22°С у темряві 30хв. Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 100мкл стоп-реагента. Не більш як через 1хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості антитіл у сироватці. Значення кількості антитіл проти вірусу червонички у сироватці хворої, визначене при застосуванні нашої тест-системи, порівнювали зі значеннями, отриманими при використанні тест-системи виробництва ЗАО "Вектор-Бест" (Росія). Досліджені сироватки хворої було ідентифіковано як позитивні на наявність антитіл проти антигенів вірусу червонички. Приклад 2 Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (по 20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у двох повторностях кожною тестсистемою за описаною методикою. Усі 20 позитивних сироваток показали наявність антитіл проти вірусу червонички, що складає 100% чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними всі 100 (специфічність - 100%) у пропонованій тест-системі. В порівнюваній тест-системі з Росії з 20 достеменно позитивних сироваток 20 були позитивними (чутливість 100%), але з 100 негативних сироваток 2 сироватки були виявлені як хибно-позитивні. Специфічність порівняльної тест-системи становила 98%. Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл класу IgG проти антигенів вірусу червонички у сироватках людей. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Використана література 1. Инструкция по применению тест-системы "ВектоРубелла-IgG-стрип" производства ЗАО "Вектор-Бест", п. Кольцове, Новосибирской обл., 2003, 3с. 2. А.Т. Ми хайлов, В.Н. Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития". М. "Наука", 1981.