Процес довгострокового культивування фітопатогенних вірусів в рослинах культури in vitro

Винахід відноситься до біології і сільського господарства. Ефективні способи зберігання вірусів рослин необхідні на всіх етапах вивчення виділених в природних умовах патогенів і практичного їх використання для подальшої розробки і виробництва діагностикумів, при організації інфекційних фонів для контролю вірусостійкості селекційного матеріалу, напрацювання вакцинних препаратів, то що. Методи мають бути придатними для підтримання віруса, гарантувати тривале зберігання його характеристик, бути зр учними для використання в практичній роботі. Проблема підтримання в активному стані колекції фітопатогенних вірусів в основному вирішується насуванням патогенів в вегетуючи х рослинах, що є дорогим, трудомістким, потребує постійного ретельного фітосанітарного контролю і все ж не гарантує від випадкового перезараження зразків. При роботі з вірусами картоплі їх часто зберігають в бульбах ураженої рослини, що потребує виключно ізольованих умов вирощування зразків при постійному контролі зараженості. При цьому не завжди вдається уникнути перезараження іншими патогенами. Крім того, при ураженні патогенними штамами рослини картоплі взагалі не дають бульб 3-4 репродукції. Визначений час можливо зберігати інфекційний матеріал в замороженому листі, ліофілізованому соку інфікованих рослин, у вигляді чистих препаратів. В той же час, відмічені зміни властивостей і при зберіганні очищених препаратів вірусів (Lane L. Propagation and purification of RNA plant viruses // Meth.EnzymoL.Odando e.a. - 1986. - v.118. - 687-696). Все більш широке застосування знаходять методи культури клітин і тканин (Жук И.П. Культура клеток и тканей растений в молекулярнобиологических и прикладных исследованиях фитопатогенных вирусов (обзор) // С.-х. биология. - 1987. - №8. - 57-62; Жук И.П., Л.Ф. Диденко. Использование культуры клеток и тканей при изучении вирусов растений // Вирусные болезни с.-х. культур. - М., Колос. - 1980. - 46-122; Максимова Н.И., Мерзляк М.Н., Гусев М.В. Культура клеток и тканей в изучении взаимоотношений патогена и растения-хозяина // Биол. науки. - 1990. - №2. - с.6-21). Найбільш близьким за ознаками до пропонованого процесу довгострокового культивування фітопатогенних вірусів в рослинах культури in vitro є спосіб підтримання колекції вірусів в лабораторних умовах в калусній культурі рослин (Тимошенко Н.А., В.А. Вн учкова, В.К. Винниченко, С.К. Завриев Поддержание У-вируса картофеля в культуре каллусной ткани Nicotiana glutinosa // Докл. ВАС ХНИЛ. - 1989. - №11. - c.8-11; Dedic P. Konzervace a uchovani infekcnosti A,Y a M viru bramboru // Ved. Prace Vyzk. Slecht. Ustavu Brambor v Havlickove Brde. - 1983. - 9. - 63-70). На основі антигенів, розмножених в калусній культурі, отримані діагностичні антисироватки (Горбунова Н.И., Л.Б. Шевцова, А.Б. Соболева, Р.В. Лялько. Приготовление диагностических антисывороток на основе вирусных антигенов, размноженных в культуре растительной ткани. // Метод, указания. - M., 1986. Недоліком цього способу є те, що довгострокове субкультивування вірус-інфікованої калусної тканини веде до створення нових форм вірусу з ослабленою вірулентністю (Жук И.П., А.Д. Бобырь, Т.Н. Сахно. Ослабление вирулентности вируса мозаики свеклы в культуре ткани сахарной свеклы // Докл. ВАСХНИЛ. - 1990. - №12. - c.1517). Крім того, необхідним є додавання в поживне середовище речовин-активаторів репродукції вірусів (аденін, гліцин, валін тощо). Мета винаходу, що пропонується, - розробка способу ефективного лабораторного довгострокового культивування фітопатогенних вірусів в рослинах культури in vitro. Для цього: здорові рослини картоплі або рослини-індикатори інокулювали штамами фітопатогенних вірусів; за результатами вірусологічного аналізу відбирали інфіковані рослини; із фрагментів стебел уражених рослин після попередньої стерилізації діацидом в умовах боксу виділяли бокові бруньки на поживне середовище Мурасиге-Скута (Muraschige Т., Scoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantamm. - 1961. - v. 15, n. 3. - 473-497) в пробірки; отримували рослини-регенеранти. Вірус-інфіковані рослини-регенеранти підтримували в культурі in vitro шляхом мікроживцювання за числом міжвузлів в стерильних умовах (Винклер Г.Н., Бутенко Р.Г. Применение черенкования при выращивании безвирусных растений картофеля методом культуры меристемы // Физиология растений. - 1970. - 17, №4. - 851853; Остапенко Д.П. Метод культуры меристемы в элитном семеноводстве картофеля на безвирусной основе в УССР // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. с.-х. наук. - 1978). Культивування проводили в умовах люміностата. Ефективність застосування процесу довгострокового культивування фітопатогенних вірусів в рослинах культури in vitro, що пропонується, відображають наведені приклади. Приклад 1. Аналіз вірусінфікованого матеріалу, отриманого в культурі in vitro. Для контролю використовували симптоматичний, серологічний, імуноферментний, електронномікроскопічний, індикаторний методи діагностики Інфіковані вірусами рослини картоплі та тест-рослини безпосередньо в пробірці були життєздатними, зовні не відрізнялися від здорових рослин того ж виду, або проявляли на листі слабку мозаїку (в залежності від комбінації рослина-вірус) при дотриманні в люміностаті оптимального температурного та світлового режиму. Аналіз пробіркових рослин-носіїв вірусів крапельним та імуноферментним методами виявив відповідні віруси. При висаджуванні в грунт пробіркових рослин-носіїв вірусів, а також мікробульб від уражених вірусами пробіркових рослин картоплі, спостерігали проявлення симптомів, характерних для означеного зразка. В табл.1 наведені результати аналізу висаджених в гр унт пробіркових рослин картоплі, інфікованих штамами М-вірусу картоплі (МВК) і S-вірусу картоплі (SBK) різної патогенності: симптоматичні характеристики на рослині-хазяїні і на рослині-індикаторі (Lycopersicon chilense Dun., диференціатор штамів карлавірусів картоплі) відповідали вихідним характеристикам. Таблиця 1 Симптоматичне проявлення штамів МВК і SBK на висаджених в гр унт пробіркових рослинах картоплі Зразок вихідна характеристика Слабопатогенний штам МВК М Ї39 картопля с. Луговська с. Невська с. Приєкульська рання Сильнопатогенні штами МВК картопля с.Приєкульська рання, М200 с. Луговська, М200 с. Світанок київський МСК с. Пекуровська МПек Середньопатогенний штам SBK 4 с. Воротинська рання Симптоми на рослинах: картоплі L. chilense Виявлені віруси LCuSl LCuSl, бc LcuSl бc бc бc,VC Sl МВК МВК МВК LCu, Dis, St LCu. St LTw, St LTw, St LЕp S1 LDis, St LDis, St LDis, M, St LDis, M, St LEp МВК МВК МВК МВК SBK Умовні позначення: бс - рослини безсимптомні; LCu - закручування листя верхівки; LDis - деформація листків; LTw - кучерявість; LEp - скривлення листків вздовж головної жилки; М - мозаїка; VC - просвітління жилок листків; Sl - слабо виражений симптом; St - відставання в рості рослин. Приклад 2. Відповідність властивостей штамів вірусів, що інфікують рослини пробіркової культури, ви хідним характеристикам через 5 років підтримання в культурі in vitro. Для проведення контролю висадили в грунт мікробульби і пробіркові рослини картоплі - носії вірусів, провели вірусологічний аналіз зразків. Встановили відповідність властивостей штамів вірусів, присутніх в пробіркових рослинах-носіях, їх паспортним характеристикам за такими показниками: проявлення симптомів на рослинах картоплі і рослинах-індикаторах, значення точки температурної інактивації і кінцевого розведення соку без втрати інфекційності, рівень активності РНКази в соку листя рослин (табл. 2, 3). Таблиця 2 Характеристики штамів МВК різної патогенності при 5-річному зберіганні в рослинах картоплі в культурі in vitro Характеристики TTt °С ТКР Строк вистоювання при 18-24°С, дн. Реакція рослин картоплі: симптоми урожай, ±до контролю, %, (с. Прискульська рання, 3 бульбова репродукція) Реакція тест-рослин: марь біла марь стінна марь кіноа вігна початкова дурман індійський тютюн Дебнея паслін полягаючий томат чилійський РНКазна активність соку листя уражених рослин, %, ±до контролю Показники для штамів М М139 слабопатогенный 70-73 10-3-10-4 2-3 BKM 200 сильнопатогенный бc, LCu Sl + 16,6-36,6 LTw. St -24,3-76,6 L:YSp L:YSp L:YSp L:Ne S:Lcu L:YSp S:VCSl бc, S:LcuSl L:YSp L:YSp L:YSp L:Ne S:LCu L:YSp S:LCu, St S:LCu, M 3,3-11,6 12,0-27,0 70-73 10-2-10-3 2-3 Умовні позначення: бс - симптоми відсутні; L - локальна реакція; S - системна реакція; LCu - закручування листя верхівки; Dis - деформація листків; LTw - кучерявість; Ne - некрози; VC - просвітління жилок; M - мозаїка; Sl - слабкі симптоми; St - відставання в рості. Таблиця 3 Результати аналізу здорових і інфікованих МВК пробіркових рослин картоплі сорту Луговська Варіанти дослідів Контроль-здорові Заражені M139 Проявлення Результат діагностики симптомів Пробіркові рослини (розсада) бс бв бс МВК 100% Урожай, г/кущ 197,0 188,0 Заражені М200 НСР05 Контроль-здорові Заражені M139 Заражені М200 НСР05 Контроль-здорові Заражені M139 Заражені М200 НСР05 Lсu МВК 100% Рослини 1ї бульбової репродукції бс МВК 7% бс МВК 100% LCu. St МВК 100% Рослини 3ї бульбової репродукції бc, Lcu МВК 73,8% бc, LCuSl МВК 100% LTw, St МВК 100% 73,0 12,0 440,0 420,0 238,0 32,0 545,1 556,1 175,3 28,4 Умовні позначення: бв - віруси не виявлені; бс - рослини безсимптомні; LCu - закручування лисків верхівки; LTw - кучерявість; Sl - слабі симптоми; St - відставання в рості. Представлені в таблицях характеристики відповідають паспортним даним штамів МВК : М139 слабопатогенний, М200 - сильнопатогенний (Патент Україна 20194 C12N7/00 Штам М-вірусу картоплі для виробництва діагностичної сироватки 4469127/SU. - 29.07.88. (ІСГМ УААН); Патент Україна 20195 C12N7/00 А 01 N 63/00, 01.08.88, 25.12.97. Штам S-вірусу картоплі для одержання діагностичних сироваток (ІСГМ УААН). Приклад 3. Використання рослин-носіїв вірусів культури in vitro для накопичення антигена. Розроблено методику використання рослин-носіїв вірусів культури in vitro для накопичення антигена для подальшого виробництва імунодіагностикумів. Для виготовлення інфекційного інокулюму 3-5 пробіркових рослин гомогенізували з додаванням 5 мл 0,01М Кфосфа тного буферного розчину, pH7,4. Об'єм інокулюму достатній для зараження 20-25 рослин-накопичувачів. Ефективність зараження МВК та SBK рослин томату, наприклад, становила 51-57% за результатами серологічного аналізу. Для підвищення ефективності інокуляції (до 78-100%) уражені від пробіркових рослин картоплі рослини томату використовували як проміжну стадію для послідуючого зараження партії рослин томату і накопичення вірусного матеріалу. Крім того, підвищенню ефективності передачі вірусів сприяло використання для виготовлення інокулюму листя рослин, що виросли в ґрунті з мікробульб рослини-носія, або підрощених в ґр унті пробіркових рослин-носіїв вірусів. Таким чином, розроблений процес довгострокового культивування фітопатогенних вірусів в рослинах культури in vitro забезпечує стабільність характеристик вірусів. З використанням пробіркової культури картоплі та рослин-індикаторів створено колекцію штамів і ізолятів фітопатогенних вірусів, виділених в природних умовах України. Матеріал використовується при виконанні дослідницьких робіт, а також для накопичення антигена і послідуючого виробництва імунодіагностикумів.