Процес виробництва насіннєвого матеріалу картоплі в культурі in vitro

Винахід стосується галузі сільського господарства, зокрема - технології вирощування вихідного меристемного матеріалу картоплі для елітного насінництва. Вихідний матеріал картоплі, оздоровлений методом культури меристеми, забезпечує вірогідне підвищення врожаю та якості насіння. (Трофимец Л.Н. Получение безвирусного картофеля для элитного семеноводства // Современные методы получения безвирусного картофеля. - М., 1975. -С.10-11.). Якість вихідного матеріалу у первинному насінництві картоплі в значній мірі залежить від технології культивування оздоровлених меристемних рослин, що набуває особливого значення на етапі масового передпосадкового мікроклонального розмноження та адаптації до ґрунтових умов. Головні фізіологічні регулюючі фактори - це трофічні і біологічно активні компоненти поживних середовищ, їх співвідношення і концентрації, температура і світловий режим (Бутенко Р.Г. Рост и развитие картофеля в культуре in vitro // Регуляция роста и развития картофеля. - М.: "Наука". -1990. -С.88-98). Відомі способи прискореного розмноження вихідних оздоровлених рослин картоплі та підрощування розсади в ґрунті (Кильчевский А.В., Никонович Т.В., Курганская С.Д., Васильева Н.В., Кудрявцев Η.Η. Влияние регуляторов роста на приживаемость и продуктивность пробирочных растений картофеля после их переноса в грунт теплицы // Материалы научно-практической конференции Новое в семеноводстве картофеля. - Минск, 2000; Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В. В. Технология микроклонального размножения растений. - Киев: Наук. думка, 1992. -194с.). Найбільш близьким за ознаками до пропонованого процесу виробництва вихідного насіннєвого матеріалу картоплі культури in vitro є спосіб з використанням регуляторів росту для підвищення приживлюваності та продуктивності пробіркових рослин після їх переносу в грунт (Кильчевский А.В., Никонович Т.В., Курганская С.Д., Васильева Н.В., Кудрявцев Η.Η. Влияние регуляторов роста на приживаемость и продуктивность пробирочных растений картофеля после их переноса в грунт теплицы // Материалы научно-практической конференции Новое в семеноводстве картофеля. - Минск, 2000). Недоліком цього способу є те, що для поліпшення якості рослин під час переведення рослин із культури in vitro в умови ґрунту використовують дорогі синтетичні регулятори росту. Відомий штам мікроміцета Chaetomium cohliodes Palliser 3250, який є антагоністом фітопатогенних грибів, що спричиняють кореневі гнилі, не проявляє фітотоксичної дії і слугує діючою основою біопрепарату хетомік. Виходячи з наведеної в описі до патенту на винахід характеристики, гриб може використовуватись для захисту рослин в ґрунті від фітопатогенних грибів (Пат. Україна 40556, A01N63/04, C12N1/14, 2001. Штам гриба Chaetomium cohlioides Palliser для отримання препарату проти фітопатогенних грибів / С.П.Надкерничний. Заявл. 27.11.1989, Бюл. №6, 2001) Попередні дослідження виявили рістстимулюючу дію щодо рослин картоплі культури in vitro самого гриба і його культуральної рідини (Демчук І.В., Петренко О.М., Коломієць Л.П., Надкерничний С.П., Зарицький М.М. Особливості вирощування картоплі в культурі in vitro // Наукові записки. Сер. біологія. -2002. -3(18). -С.205-209.) Мета винаходу, що пропонується, - поліпшення росту і розвитку меристемних рослин картоплі культури in vitro на етапі адаптації пробіркових рослин до ґрунтових умов в процесі виробництва вихідного насіннєвого матеріалу картоплі культури in vitro шляхом заміни дорогих синтетичних регуляторів росту грибом-антагоністом Chaetomium cohliodes Palliser 3250 і продуктами його життєдіяльності. Культуральну рідину та суспензію сумкоспор гриба Chaetomium cochliodes 3250, що використовували при вирощуванні рослин картоплі, отримували відповідно методик, наведених в описі до патенту на винахід (Пат. Україна 40556, A01N63/04, C12N1/14, 2001. Штам гриба Chaetomium cohlioides Palliser для отримання препарату проти фітопатогенних грибів / С.П.Надкерничний. Заявл. 27.11.1989, Бюл. №6, 2001p.). Культуральну рідину С. cochliodes 3250 отримували при вирощувані гриба на пивному суслі 3-4° за Баллінгом. Гриб розвивається при рН4.2-11.2, температурі 14-35°С. Оптимальні значення рН середовища - 6.47.2, температури культивування - 25-28°С. Культуральну рідину С. cochliodes 3250 додавали в модифіковане рідке поживне середовище Мурасіге-Скуга і на цьому середовищі вирощували меристемні рослини картоплі останнього строку живцювання перед висадкою в ґрунтові умови. Попередньо встановлена оптимальна доза культуральної рідини гриба становила 10-50мл/л поживного середовища. Суспензію сумкоспор гриба-антагоніста С. cochliodes 3250 отримували на твердому поживному середовищі (сусло-агарі) і вносили в землесуміш із розрахунку 5-6х107; 5-6х108; 5-6х109 сумкоспор гриба на 1кг землесуміші. Ефективність застосування процесу, що пропонується, відображають наведені приклади. Приклад 1 Мікроживцювання рослин картоплі культури in vitro перед висадкою в грунт. Для вирощування рослин картоплі в культурі in vitro використовували стандартне (МС1) та модифіковане (МС2) рідке поживне середовище Мурасіге-Скуга (Замотаев А.И., Трофимец Л.Н., Гуров В.А., Костюшина З.С., Макарова Р.В., Оберг В.В., Алборова З.П. Методические указания по ускоренному размножению в первичном семеноводстве картофеля. - Μ.: Колос, 1983. -С.6-7.), що містило половинну норму макросолей, повну мікросолей та хелату заліза, 20г/л сахарози, за відсутності вітамінів і регуляторів росту (табл.1). Мікроживцювання пробіркових рослин проводили в стерильних умовах. Світловий режим вирощування рослин регулювався автоматично: фотоперіод 16-годинний з періодичністю освітлення 2 години через 1 годину відключення. Температура в люміностаті коливалась від +8-10°С вночі до +18°С вдень. Середню площу листової пластинки визначали ваговим методом. Статистична обробка результатів дослідів проводилась за прийнятими методами. При додаванні в поживне середовище без гормонів культуральної рідини гриба C.cohliodes 3250 в концентрації 10-50мл/л поживного середовища встановлено збільшення висоти рослин, кількості стеблових міжвузлів, збільшення площі листової пластинки, тобто мало місце підвищення якості пробіркового матеріалу на етапі підготовки до висаджування в грунт. Таким чином, введення в поживне середовище культуральної рідини C.cochliodes 3250 в кількості 10-50мл/л стимулює ріст і розвиток меристемних рослин картоплі in vitro. Таблиця 1 Склад поживних середовищ, що застосовували Основні інгредієнти, мг/л Поживне середовище стандартне МС1 Макроелементи ΝН4 ΝΟ3 ΚΝΟ3 MgSО4*7H2O КН2РO4 CaCl2 Ca(NO3)2 Хелат заліза Na2 едта FeSO4*Н2О Мікроелементи Na2 MoO4 Н3ВО3 MnSO4 ZnSO4*7H2O ΚΙ CuSO4*5H2O СоСІ 2*6Н2O Вітаміни В1 B6 РР С Мезоінозитол Регулятори росту ІОК Аденін Кінетін Сахароза 1650 1900 370 170 440 модифіковане МС2 825 950 185 85 0.16 37.3 27.8 440 0.16 37.3 27.8 0.25 6.2 22.3 8.6 0.83 0.025 0.025 0.25 6.2 22.3 8.6 0.83 0.025 0.025 1.0 1.0 1.0 3.0 100 3.0 100 0.5 0.5 0.1 15.0 20.0 Таблиця 2 Якісні показники меристемних рослин картоплі сорту Косень-95 при вирощуванні на поживному середовищі без гормонів (МС2) з внесенням культуральної рідини гриба C.cohliodes 3250 (КР) Варіанти поживного середовища МС2 (контроль) МС2+КР, 10мл/л середовища МС2+КР, 50мл/л середовища НІР05 Висота рослин, см 6.46 7.7 7.42 0.24 Число стеблових міжвузлів 5.8 6.6 7.0 0.22 Середня площа листової пластинки, см2 0.94 1.33 1.58 0.08 Таблиця 3 Якісні показники меристемних рослин картоплі сорту Фантазія при вирощуванні на поживних середовищах різного складу з внесенням культуральної рідини (КР) гриба C.cohliodes 3250 Абс. суха маса 1 Доза КР гриба, мл/л Висота рослин, Поживне середовище см рослини, г середовища МС1 контроль 12.28 0.12 +КР 10 15.14 0.14 +КР 50 14.14 0.14 МС1 без вітамінів контроль 10.1 0.12 +КР 10 14.76 0.15 +КР 50 13.3 0.12 МС1 без регуляторів росту Контроль 11.82 0.12 +КР 10 13.76 0.11 +КР 50 14.76 0.12 МС1 без вітамінів і регуляторів росту контроль 13.94 0.11 +КР 10 15.26 0.14 +КР 50 15.04 0.13 HIP05 0.46 0.01 Приклад 2 Підрощування меристемних рослин картоплі в ґрунті. Приживлюваність пробіркових рослин в ґрунті залежить від багатьох факторів, в тому числі віку і ступеню розвитку пробіркової рослини, стану кореневої системи, якості землесуміші, її температури, вологості та наявності в ній фітопатогенних мікроорганізмів і шкідників. Для підрощування розсади картоплі використовували стерилізовану і нестерилізовану землесуміш, що складалася з торфу і піску в співвідношенні 2:1, рН7,3, вміст рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 220-250мг Р2O5, обмінного калію (за Кірсановим) 210-220мг К2О на 1кг ґрунту. Добавлено 1г/кг КNО3 і по 0,5г/кг Са(NO3)2 та MgSО4, а також 25мг/кг CuSО4 y вигляді розчинів. Таблиця 4 Ріст та розвиток меристемних рослин картоплі в ґрунті при внесенні в землесуміш гриба С.cochliodes 3250 Варіанти досліду Контроль С. cochliodes 3250, 5-6х107 сумкоспор /кг землесуміші С. cochliodes 3250, 5-6х108 сумкоспор /кг землесуміші С. cochliodes 3250, 5-6х109 сумкоспор /кг землесуміші HIP05 Контроль С. cochliodes 3250, 56х107сумкоспор /кг землесуміші С. cochliodes 3250, 5-6x108 сумкоспор /кг землесуміші С. cochliodes 3250, 5-6x109 сумкоспор /кг землесуміші НІР05 Висота рослин, см Кількість листків, шт. Ступінь розвитку листків стерилізована землесуміш: 2,52 6 ювен. Площа Маса сухої листка, мм2 речовини рослини, г 80,38 0,41 3,72 8 ювен. 294,58 1,02 4,30 6 ювен. 182,25 0,96 1,36 4 ювен. 55,38 0,11 0,96 нестеρилізована землесуміш: 3,30 8 справжні 27,00 0,12 137,88 1,60 4,10 8 справжні 190,00 3,03 4,90 7,5 справжні 184,00 1,88 5,00 8 справжні 236,25 1,98 31,01 0,09 0,5 Стерилізовану землесуміш використовували, щоб виявити безпосередню дію різних норм внесення сумкоспор гриба на ріст та розвиток рослин, а нестерилізовану - для моделювання природних ґрунтових умов та виявлення захисних властивостей гриба. Гриб-антагоніст вносили із розрахунку 5-6х107; 5-6х108; 5-6х109 сумкоспор гриба на 1 г землесуміші. Рослини висаджені в стерильну землесуміш, в яку було внесено C.cochliodes 3250 із розрахунку 5-6x107 і 56x108 сумкоспор гриба на 1кг ґрунту, більш активно розвивались: збільшувалась висота рослин, площа листових пластинок, маса сухої речовини порівняно з контрольним варіантом (табл.4). Найбільш ефективним виявилось застосування гриба на землесуміші без стерилізації із розрахунку 5-6х109 сумкоспор на 1кг ґрунту. Приклад 3 Підрощування розсади картоплі з використанням різних способів внесення гриба С. cochliodes 3250 в землесуміш. Застосовували 2 варіанти внесення сумкоспор гриба в землесуміш: 1. Препарат вносили із розрахунку 5-6x107; 5-6x108; 5-6x109 сумкоспор гриба на 1кг нестерилізованої землесуміші за 10 днів до висадки меристемних рослин. 2. Препарат вносили в кореневу зону розсади, для цього коріння кожної меристемної рослини разом з паперовим містком перед висадкою занурювали в водяну суспензію сумкоспор гриба, після чого висаджували в грунт. Для поліпшення прилипання сумкоспор використовували натрієву сіль карбоксиметилцелюлози (NaКМЦ). Коріння контрольних пробіркових рослин занурювали у воду. Внесення гриба в землесуміш сприяє значному підсиленню росту і розвитку рослин картоплі, висаджених з пробірок (табл.5, 6). Значно збільшується маса рослин, об'єм кореневої системи, маса і площа листків (табл.7). Таким чином, внесення гриба С. cochliodes 3250 безпосередньо в землесуміш сприяє значному підсиленню росту і розвитку рослин картоплі, висаджених з пробірок. Більш економним способом внесення препарату виявилося нанесення його водяної суспензії з NaKMЦ, на кореневу систему рослин. Використання гриба С. cochliodes 3250 є доцільним в технології одержання розсади картоплі із пробіркових рослин для покращення її якості. Таблиця 5 Ріст та розвиток розсади картоплі сорту Обрій при підрощуванні з внесенням гриба С. cochliodes 3250 в землесуміш Критерії оцінки Норма внесення гриба, сумкоспор /кг землесуміші контроль 5-6х107 5-6х108 5-6х109 ΗΙΡ05 висота рослин, см діаметр стебла, мм кількість листків на 1 рослині маса лист. пл., мг площа лист. поверхні 1 рослини, дм2 загальна біомаса рослин, г в т. ч. маса коренів всіх рослин, мг біомаса 1 рослини, мг в т. ч. коренів, мг 17 3 8 546 25 3 10 871 23 3 11 720 21 3.5-4 9 833 0.40 0.31 0.09 18.70 0.491 0.783 0.647 0.755 0.072 1.41 1.92 1.53 2.17 0.02 352 372 264 410 7.8 141 35.2 192 37.2 153 26.4 217 41.0 0.2 0.8 Таблиця 6 Ріст та розвиток розсади картоплі сорту Косень-95 при підрощуванні з внесенням гриба С. cochliodes 3250 в землесуміш Критерії оцінки висота рослин, см діаметр стебла, мм кількість листків на 1 рослину маса лист. пл., мг площа лист. поверхні 1 рослини, дм2 Загальна біомаса рослини, г в т. ч. маса коренів всіх рослин, мг маса мікробульб, мг біомаса 1 рослини, мг в т. ч. коренів, мг контроль 28 2.5 10 485 Норма внесення гриба, сумкоспор /кг землесуміші 5-6х107 5-6х108 5-6х109 НІР05 30 34 18 1.9 3.5 3.5 3.5 0.82 12 10 12 0.20 1301 1061 1000 32.2 0.436 1.170 0.954 0.899 0.02 1.27 2.70 2.22 3.07 0.12 225 368 415 527 8.64 322 182 32.14 860 300 40.89 295 222 41.5 795 307 52.7 0.21 0.48 0.75 Таблиця 7 Ріст та розвиток розсади картоплі сорту Світанок Київський при підрощуванні в ґрунті з передсадивною обробкою пробіркових рослин зануренням коренів в суспензію сумкоспор гриба С. cochliodes 3250 Вміст сумкоспор гриба в суспензії, шт./мл контроль 4-5x106 4-5x107 НІР05 Висота рослини, cм Об'єм кореневої системи, см3 Маса листків, мг 10.06 10.92 11.40 0,42 0.14 0.18 0.32 0,01 228.40 575.80 648.00 71,25 Маса сухої Площа речовини рослини, листків, cм2 г 10.38 0.32 24.11 0.40 29.68 0.75 4,07 0,02 Приклад 4. Забезпечення захисту розсади пробіркових рослин картоплі від стеблових нематод при внесенні в землесуміш гриба С. cochliodes 3250. При висадженні рослин в грунт використовували землесуміш, заражену стебловою нематодою. Гриб вносили із розрахунку 5-6х109 сумкоспор гриба на 1кг землесуміші. Це забезпечувало захист розсади картоплі від ураження стебловою нематодою протягом всього періоду її вирощування. По завершенні періоду підрощування розсади на землесуміші без внесення гриба-антагоніста збереглось 50% висаджених рослин, а з внесенням - 100% рослин. Таким чином, внесення С. cochliodes 3250 в землесуміш для вирощування пробіркових рослин картоплі забезпечує їх захист від ураження стебловою нематодою і сприяє підвищенню якості рослин.