Штам гібридомних тваринних клітин mus musculus l.-продуцент моноклональних антитіл, які специфічно реагують з епітопом n-кінцевої ділянки g-ланцюга d-димеру фібрину та d-фрагмента фібриногену людини

Винахід належить до області біотехнології, а саме до клонування гібрид омних клітин, і пов'язаний з одержанням моноклональних антитіл (мон AT) до антигенної детермінанти, яка є загальною для фібрин(оген)у людини та їхні х D- (DD)-фрагментів. Мон AT можуть бути використані в бісайтовому імуноферментному аналізі (ІФА) для визначення фібрин(оген)у та продуктів їхньої деградації. Фібриноген - розчинний білок плазми крові з молекулярною масою 340 000. Його основна функція - участь у зсіданні крові та припинення кровотеч. За дії високоспецифічної протеїнази тромбіну, фібриноген перетворюється на нерозчинний полімер фібрин. Унаслідок цього утворюється тривимірний згусток фібрину, що є каркасом для включення клітин крові під час утворення тромбу. Полімеризація фібрину здійснюється за міжмолекулярної взаємодії відповідних центрів, які утворені певними амінокислотними залишками. Локалізацію всіх центрів полімеризації в молекулі фібрину ще не виявлено. З моменту формування протофібрил фібрину активується фібринолітична система крові. Плазміноген, що циркулює у крові, перетворюється на плазмін, який руйнує стабілізований фактором ХІІІа фібрин до кінцевих продуктів, зокрема до D-димера. Концентрація D-димера у крові суттєво зростає при різних захворюваннях, наприклад таких, як інфаркт міокарда, емболія легенів, дисеміноване внутрішньосудинне зсідання (ДВЗ) крові, а також за хірургічного втр учанння тощо. D-димер є молекулярним маркером стану системи зсідання крові. Важливе значення для медицини має також визначення рівня фібриногену у плазмі крові людини. У нормі кількість його коливається від 2 до 4г/л плазми. Фібриноген одержав назву "реагент гострої фази". Його концентрація різко збільшується при запальних процесах в організмі. Підвищені рівні фібриногену свідчать також про небезпечність внутрішньосудинного тромбоутворення. З іншого боку, за деяких патологічних станів, наприклад ДВЗ-синдромі, спостерігається значне зниження концентрації фібриногену у плазмі крові. Використання мон AT, специфічних до різних ділянок фібрин(оген)у та їхні х фрагментів, дає можливість розробити чутливі діагностичні тести. Відомо декілька гібридом, описаних у науковій та патентній літературі, які продукують мон AT до уланцюга фібрин(оген)у. Так штам гібридомних клітин, одержаний групою W. Nieuwenhuizen до синтетичного пептиду у(312-324), синтезує мон AT, які реагують з неоепітопом при перетворенні фібриногену на фібрин.[1]. Є також гібридоми, які синтезують мон AT, епітопи яких розташовані в зоні ізопептидних зв'язків, що визначають g-g прошивку фібрину фактором XIII. Вони використовуються для визначення продуктів розщеплення стабілізованого фібрину плазміном у плазмі крові [2, 3]. Задача винаходу - одержання штаму гібридомних клітин Mus Musculus L., продуцентів мон AT до нової антигенної детермінанти на D-димері фібрину людини, загальної для фібрин(оген)у та їхніх D- (DD )фрагментів, які разом з мон AT, специфічними до окремих доменів молекули, дають можливість розробити бісайтовий імуноферментний аналіз концентрацій D-димера та фібриногену у плазмі крові людини. Найбільш подібний до запропонованого штаму II-4d штам гібридомних клітин, здатний до синтезу мон AT J88B, епітоп яких розташований у чутливій до дії плазміну N-кінцевій ділянці у-ланцюга фібрин(оген)у, у(63-78) [4]. Відмінність моноклональних антитіл, одержаних за використання запропонованого штаму, від уже відомих в літературі у тому, що антигенна детермінанта їх включає амінокислотні залишки N-кінцевої ділянки gланцюга D-домену, в районі у(86-240), експоновані як у фібрин(оген)і, так і в їхніх D-(DD)-фрагментах. Ці амінокислотні залишки містяться безпосередньо у відкритому нами центрі полімеризації фібрину, що бере участь в утворенні протофібрил (або біля нього) [5]. В літературі відсутні дані щодо одержання мон AT саме до цієї ділянки у-ланцюга. Штам одержують наступним чином. Мишей лінії Balb/c імунізують введенням у порожнину черева 100мкг очищеного препарату D-димера з повним ад'ювантом Фрейнда (1 : 1) у вигляді емульсії. D-димер очищають за методом, описаним у статті [6]. Повторні імунізації проводять тією самою кількістю антигену в неповному ад'юванті Фрейнда. Мишам з достатнім титром антитіл у сироватці крові вводять антиген у забуференому фізіологічному розчині — 0,01М К-фосфа тний буфер (рН 7,4) з 0,14 М NaCl (ЗФР) за три дні до гібридизації [7,8]. У мишей у стерильних умовах видаляють селезінку, яку гомогенізують, спленоцити промивають розчином Хенкса. Клітини (1 * 10 8) гібридизують із клітинами мієломи миші X63-Ag8.6.5.3 (5 • 107), додаючи до осаду суміші клітин протягом однієї хвилини 1мл 50%-го поліетиленгліколю з молекулярною масою 3000. Після злиття клітини промивають розчином Хенкса і розсівають у чотири 24-лункові планшети (по 1 мл на лунку). Для культивування і селекції гібридом використовують поживне середовище RPMI-1640, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, 10-4 М гіпоксантин, 4 • 10-7М аміноптерин і 1,6 • 10-5 М тимідин. Вибір гібридомних клітин, що секретують в окремих лунках антитіла потрібної специфічності, здійснюють за результатами твердофазного ІФА. У лунки полістиролового планшета, заздалегідь покриті антигенами в концентрації 10мкг/мл (для D-димера і Dфрагмента в 0,02М бікарбонатному буфері, рН 9,5; для фібриногену в 0,2М ацетатному буфері, рН 8,5; а для фібрину ще з 2,0М сечовини) вносять поживне середовище, в якому культивували гібридомні клітини. Інкубацію здійснюють 1год при 37°С. Планшет промивають проточною водою шість разів, воду видаляють струшуванням, лунки заповнюють ЗФР з 0,05%-м твін-20 (ТФБ) Через три хвилини його знову струшують, старанно видаляючи залишки вологи, а в лунки вносять кон'югат пероксидази із кролячими антитілами до IgG миші в розведенні 1 : 1000. Після інкубації протягом однієї години при 37 °С планшет знову промивають, лунки заповнюють субстратною сумішшю, яка містить 0,03% Н2О2 і 0,4мг/мл о-фенілендіаміну в 0,05М Кфосфа тному буфері (рН 6,0). Реакцію зупиняють додаванням до розчину 50 мкл 2 М H2SO4 . Оптичн у густину визначають за довжини хвилі 492нм на автоматичному спектрофотометрі MR-580 («Dynatech», США). Гібридоми, що продукують мон AT, клонують чотири рази методом кінцевих розведень, висіваючи по одній клітині в лунку, що містить 5*104 неімунних клітин селезінки миші. Після клонування частка клітин, які синтезують антитіла заданої специфічності, становить 100%. Продукція антитіл зберігається, як мінімум, протягом 20 пасажей. Штам позначається II-4d і має такі характеристики. Культуральні властивості. Для вирощування штаму використовують культуральні флакони з поживним серодовищем Ігла в модифікації Дульбекко або RPMI-1640, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ глутамін, 1мМ піруват натрію, 0,05мМ 2-меркапто-етанол, 50мкг/мл гентаміцину, 20 мМ HEPES. Посівна доза 50 - 100 тис. клітин/мл. Через 3 — 4 дні клітини підраховують, пересівають і культивують при 37 °С. У разі використання в поживному середовищі 20мМ HEPES можна не створювати 5%-g-концентрацію СО2 в атмосфері. Характер росту - стаціонарна суспензія. Характеристика корисного продукту. МонАТ II-4d належать до IgG2a з легкими ланцюгами к-типу. Антигенна детермінанта (епітоп), що розпізнається антитілами, розташована в N-кінцевій ділянці у-ланцюга Dдомену фібрину, у(86-240). Вона експонована у фібрині, фібриногені та в D- і DD- фрагментах. Константа дисоціації з фібриногеном становить 1,4 • 10-9 М, а з D-димером - 2,8 • 10 -9 М. Продуктивність штаму. Концентрація антитіл у культуральній рідині за 3 - 4 дні культивування досягає 40 50мкг/мл. Контамінації. За довготривалого спостереження бактерій, грибів і мікоплазм не виявлено. Кріоконсервування. Для зберігання клітин штаму II-4d їх ресуспендують у суміші, що містить 10% диметилсульфоксиду і 90% ембріональної телячої сироватки, в концентрації 5*106клітин/мл. Суспензію розливають у пластикові ампули, поміщають у контейнери із спіненого полістиролу з товщиною стінок 1см і переносять у заморожувач (-70°С) на 18 год. Потім клітини переносять у рідкий азот для довгого зберігання. Розморожують їх при + 37°С у водяній бані. Життєздатність клітин оцінюють після фарбування їх трипановим синім. Звичайно вона становить близько 50%. Приклад 1. Застосування біотинильованих мон AT II-4d для визначення концентрацій D-димера у плазмі крові людини за допомогою ІФА та специфічних мон AT ІИ-3b. Мон AT виділяють із культурального середовища, на якому протягом 3-4 днів культивувались гібридомні клітини штаму II-4d. Культуральну рідину пропускають через колонку із фібриноген-сефарозою, яку заздалегідь урівноважують ЗФР, (імобілізують фібриноген на бромціан-сефарозі за рекомендацією фірми «Pharmacia»). Елюцію зв'язаних антитіл проводять 0,1М гліцин-НСІ-буфером з рН 2,8. Розчин антитіл нейтралізують 1 М К2НРО 4, концентрують і діалізують методом ультрафільтрації проти ЗФР. Концентрацію антитіл визначають на спектрофотометрі. Вважають, що оптична густина, яка становить 1,4 (l 280нм) відповідає концентрації IgG 1мг/мл. Біотинилювання мон AT II-4d здійснюють у 0,1М бікарбонатному буфері (рН 9,2), змішуючи N-оксисукцинімідний ефір біотину (1 мг/мл диметилсульфоксиду) і білок у співвідношенні 1 : 8. Через 4 год інкубації за кімнатної температури мічений білок ретельно діалізують проти ЗФР. Концентрацію білка визначають спектрофотометрично [9]. У 96-лункові полістиролові планшети з підвищеною адсорбційною здатністю (фірма «NUNC», Данія) вносять по 110мкл розчину специфічних до D-димера мон Ат ІІІ-3b у ЗФР із концентрацією 10мкг/мл і інкубують їх при 4°С протягом 18год. Розчин антитіл струшують, промивають проточною водою з-під крана шість разів, лунки заповнюють ТФБ і витримують 30хв за кімнатної температури. Перед експериментом ТФБ старанно видаляють. До адсорбованих на полістиролі мон AT додають 100мкл розчину, що містить зразок Dдимера, наприклад розведену в 10 разів плазму крові людей. Плазму розводять ТФБ, до якого додають сухе обезжире молоко і цитрат натрію до кінцевої концентрації 5% і 0,38% відповідно. У контрольні лунки D-димер не вносять. Розчин інкубують 1год при 37°С. Лунки планшета промивають послідовно проточною водою і ТФБ, після чого в них вносять 100 мкл біотинильованих антитіл II-4d у концентрації 0,5мкг/мл, які, на відміну від ШЗЬ, розпізнають іншу ділянку на молекулі D-димера. Інкубацію здійснюють 1год при 37°С, планшет промивають, як описано вище, і заповнюють кожну лунку 100мкл кон'югата стрептавідину з пероксидазою хріну у розведенні 1 : 1000 (фірма «Pharmacia», Швеція). Знову проводять інкубацію і промивають планшет, як описано вище. У кожну лунку планшета додають субстратну суміш (склад якої наведено вище). Оптичну густину визначають при 492нм на автоматичному мікроспектрофотометрі. Концентрацію D-димера обчислюють, використовуючи калібрувальну криву, яку будують згідно з результатами контрольного експерименту, в якому використовують відомі концентрації D-димера. Чутливість визначення D-димера становить 15нг/мл плазми, розведеної у десять разів. Таким чином, одержані біотинильовані монАТ II-4d сумісно з специфічними до D-димера мон AT ІП-ЗЬ можуть бути використані для кількісного визначення D-димера у плазмі крові людини. Приклад 2. Застосування біотинильованих мон AT II-4d для визначення концентрацій фібриногену у плазмі крові людини за допомогою ІФА та специфічних мон AT 2d-2a. У 96-лункові полістиролові планшети з підвищеною адсорбційною здатністю (фірма «NUNC», Данія) вносять по 110мкл розчину специфічних до фібриногену мон At 2d-2a у ЗФР з концентрацією 10мкг/мл які інкубують при 4°С протягом 18 год. Розчин антитіл струшують, промивають проточною водою з-під крана шість разів, лунки заповнюють ТФБ і витримують 30хв за кімнатної температури. Перед аналізом розчин ТФБ старанно видаляють. До адсорбованих на полістиролі мон AT додають 100мкл розчину, що містить зразок фібриногену (наприклад розведену у 200 разів плазму крові людини). Плазму розводять ТФБ, до якого додають сухе обезжирене молоко і цитрат натрію з кінцевою концентрацією 5% і 0,38% відповідно. У контрольні лунки фібриноген не вносять. Розчин інкубують 1год при 37°С. Лунки планшета послідовно промивають проточною водою і ТФБ, після чого в кожну лунку додають 100мкл біотинильованих антитіл II-4d у концентрації 0,5мкг/мл, які, на відміну від 2d-2a, розпізнають іншу ділянку на молекулі фібриногену. Інкубацію здійснюють 1год при 37°С, планшет промивають, як описано вище, і заповнюють лунки кон'югатом стрептавідину з пероксидазою хріну у розведенні 1 : 1000 («Pharmacia», Швеція). Знову проводять інкубацію 1 год при 37°С, після чого планшет промивають, як описано раніше. В кожну лунку планшета вносять субстратну суміш (склад якої наведено вище). Оптичну густину визначають за l 492нм на автоматичному мікроспектрофотометрі. Концентрацію фібриногену обчислюють з використанням калібрувальної кривої, яку будують згідно з результатами контрольного експерименту, в якому використовують відомі концентрації фібриногену (5 - 80мкг/мл). Чутливість визначення фібриногену становить 5мкг/мл плазми, розведеної у двісті разів. Таким чином, одержані біотинильовані монАТ II-4d сумісно зі специфічними до фібриногену мон AT 2d-2a можуть бути використані для кількісного визначення фібриногену у плазмі крові людини. СПИСОК ПОСИЛАНЬ 1. Schielen W.G., Adams H., van Leuven K., Voskilen M., Tesser G.I., Nieuwenhuizen W., The sequence y-[312324] is a fibrin-specific epitope // Blood. - 1991. - 77. - P. 2169 - 2173. 2. Brenner В., Francis C.W., Marder V.J., The role of soluble cross-linked fibrin and D-dimer immunoreactivity of plasmic digests // J. Labor.Clin. Medic. - 1989. - V. 6. - P. 682 - 688. 3. Taubenfeld S.M.,Yeqing Song, DeQuan Sheng, Ball E.L., Matsueda G.R., A monoclonal Antibody against a Peptide Sequence of Fibrinogen Gamma chain Acts as an Inhibitor of Factor XIII - Mediated Crosslinking of Human Fibrin // Thromb.Haemostas. - 1995. - V. 74. - P. 923 - 927. 4. Odrljin T.M., R ybarczyk B.J., Francis C.W., Lawrence S.O., Hamaguchi M., Simpson-Haidaris P.J., Calcium modulates plasmin cleavage of the fibrinogen D-fragment gamma chain N-terminus: Mapping of monoclonal antibody J88B to a plasmin sensitive domain of the gamma chain // Biochim. Biophys. Acta: Protein Structure and Molecular Enzymology. -1996.-V. 1298.-P. 69-77. 5. Lugovskoy E.V., Gritsenko P.G., Kolesnikova I.N., Zolotarova E.N., Chernishov V.I., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S.V., A new site of fibrin polymerization in D-domain of fibrin // 16 lh International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis in conjunction with the 17 th International Fibrinogen Workshop, Munich, Germany. September 08 - 13, 2002. -Oral presentation session, Abstr. 97. 6. Lugovskoy E.V., Kolesnikova I.N., Gritsenko P.G., Zolotareva E.N., Geffney P., Nieuwenhuizen W., Komisarenko S.V., A neoantigenic determinant in the D-dimer fragment of fibrin // Trombosis research. - 2002. -107, 3-4,-P. 151 -156. 7. Kohler G., Milstein C, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity //Nature. 1975. - 256, - P. 495 - 497. 8. Lerner E.A., How to make a hybridoma // Yale j. Biology and medicine. 1981.-54,-P. 387-402. 9. Harlow E., Lane D., // Antibodies, A Laboratory Manual. - 1988. - Cold Spring Harbor Laboratory. - P. 340 341.