Штам гібридомних тваринних клітин mus musculus l. – продуцент моноклональних антитіл, що специфічні до епітопу n-кінцевої ділянки вb-ланцюга фібриногену людини

Винахід належить до області біотехнології, а саме: до клонування гібридомних клітин, і пов'язаний з одержанням моноклональних антитіл (мон AT) до фібриногену за допомогою нового штаму гібридом. Мон AT можуть бути використані для визначення фібриногену у плазмі крові людини. Фібриноген - розчинний білок плазми крові з молекулярною масою 340000. Його молекула складається із двох субодиниць, кожна з яких утворена трьома неоднаковими поліпептидними ланцюгами. Всього в молекулі є шість поліпептидних ланцюгів, які позначаються як Аa, Bb, g. Молекула фібриногену позначається формулою: (Аa, Bb, g)2 , а фібрину, у якому фібринопептиди А та В відсутні, - (a, b, g) 2. У молекулі фібриногену розрізняють три структурні блоки - домени. Кожна субодиниця має половину центрального домену Е та один периферійний D. N-кінці всіх поліпептидних ланцюгів молекули фібриногену знаходяться в домені Е. Звідки по три ланцюги (Аa, Bb та g) розходяться у два домени D. С-кінцеві ділянки ланцюгів Bb і у містяться у доменах D, С-кінцева ділянка ланцюга Аa утворює особливий домен aС. Розщеплення фібриногену ферментом плазміном спричиняє переважне утворення фрагментів D та Е. Кількість фібриногену у плазмі крові людини коливається від 2 до 4г/л. Фібриноген одержав назву «реагент гострої фази». Концентрація його значно збільшується за гострих інфекційних процесів, запаленнях, туберкульозі, ракових захворюваннях тощо. Низький рівень цього білка спостерігається при захворюваннях печінки (травмах, інфекціях), гострій емболії легень, фібриногенолізі тощо. Тому визначення вмісту фібриногену у плазмі крові має важливе діагностичне значення. Відомо декілька гібридом, описаних у науковій та патентній літературі, що продукують мон AT до різних сайтів фібриногену, які використовують для імунодіагностики фібрин(оген)у у плазмі крові. Групою W. Nieuwenhuizen були одержані мон AT-Y18 до фрагмента Y фібриногену, який містить у своєму складі фрагменти D та Е. Ці антитіла розпізнають епітоп, що складається з амінокислотних залишків фібринопептиду А. Вони реагують лише з фібриногеном та його фрагментами, у структурі яких є фібринопептид А, але не з ізольованим пептидом А. Автори використали ці антитіла сумісно зі специфічними до фібриногену мон AT G8, епітоп яких розташований в С-термінальній частині Аa-ланцюга, для визначення фібриногену у розводеній в 16 разів плазмі крові людини [1]. Описано також гібридоми, що синтезують мон AT до N-кінцевої ділянки Bb-ланцюга фібрин(оген)у, які використовуються з діагностичною метою [2, 3, 4]. Так, К. Hui, Е. Haber, G. Matsueda одержали мон AT 59D8 до синтетичного пептиду Gl y-HisArg-Pro-Leu-Asp-Lys, який відповідає амінокінцевому пептиду Bb Gly15-21 фібрину. Мон AT 59D8 реагують з мономерним та полімерним фібрином за присутності фібриногену in vitro та in vi vo і використовуються для детекції тромбу [3]. Подібні мон AT T2G1, одержані В. Kudryk, застосовувались для детекції тромбу та визначення пептидного фрагмента, що містить амінокислотні залишки Bb 15-42. Цим автором також одержані мон AT 1-8C6, які реагують із фібриногеном та фрагментами, які мають у своїй структурі фібринопептид В [4]. Задача винаходу - одержання штаму гібридомних клітин Mus musculus L.-продуцентів мон AT, що специфічно реагують із фібриногеном, але не взаємодіють із продуктами його деградації тромбіном, і які можна використати для розроблення бісайтового імунохімічного аналізу фібриногену у плазмі крові людини. Найбільш подібний до запропонованого штаму 2d-2a штам гібридомних клітин, одержаний В. Kudryk [4]. Мон AT 1-8C6, субкласу IgG2a , реагують із Ba-ланцюгом фібриногену, N-кінцевим дисульфідним вузлом (NДСВ) фібриногену та пептидом Bb 1-42 фібриногену і не зв'язують b-ланцюг фібрину, N-ДСВ фібрину, пептид Bb 15-42 та фібринопептид В (1-14). Автори використали ці антитіла для визначення пептиду Bb 142 при захворюваньнях, які пов'язані з фібриногенолізом. У цьому разі фібриноген попередньо видаляли із плазми крові. На відміну від ви щеозначеного штаму, запропонований штам гібридомних клітин 2d-2a продукує мон AT, що належать до субкласу IgG1. Високе значення константи дисоціації цих мон AT (1,04·10-9М) дає можливість використати їх для визначення нативного фібриногену у плазмі крові людини за розведення її у 200 разів. При цьому концентрації фібринопептиду Bb 1-42 та фібрину des AA, з якими ці антитіла також реагують, знижуються настільки, що чутливість методу не дозволяє їх виявити, і тому вони не заважають визначенню рівня фібриногену. Штам одержують наступним чином. Мишей лінії Balb/c імунізують введенням внутрішньочеревинно 100мкг очищеного препарату N-ДСВ фібриногену з повним ад'ювантом Фрейнда (1:1) у вигляді емульсії. N-ДСВ очищають за методом, описаним у ста тті [5]. Повторні імунізації проводять тією самою кількістю антигену в неповному ад'юванті Фрейнда. Мишам із достатнім титром антитіл у сироватці крові вводять антиген у забуференому фізіологічному розчині -0,01М К-фосфатний буфер, pH 7,4 з 0,14 М NaCl (ЗФР) за три дні до гібридизації [6.7]. У мишей у стерильних умовах видаляють селезінку, яку гомогенізують, промивають розчином Хенкса і клітини (1·108) гібридизують із клітинами мієломи миші X63-Ag8.6.5.3 (5·10), додаючи до осаду суміші клітин 1мл 50%-го поліетиленгліколю з молекулярною масою 3000 на протязі однієї хвилини. Після злиття клітини промивають розчином Хенкса і розсівають у чотири 96-лункові планшети (200мкл на лунку). Для культивування і селекції гібридом використовують поживне середовище RPMI-1640, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, 10-4М гіпоксантин, 4·10-7М аміноптерин та 1,6·10-5М тимідин. Вибір окремих лунок з гібридомними клітинами, що секретують антитіла потрібної специфічності, здійснюють за результатами твердофазного ІФА. У лунки полістиролового планшету, заздалегідь покриті антигенами в концентрації 10мкг/мл (для NДСВ фібриногену, N-ДСВ фібрину, фібриногену в 0,2М ацетатному буфері з pH 8,5, а для фібрину ще з 2,0М сечовини) вносять поживне середовище, на якому культивувались гібридомніні клітини, інкубують 1 год при 37°С. Промивають планшет проточною водою шість разів, видаляють воду стр ушуванням, заповнюють лунки ЗФР із 0,05%-м твін-20 (ТФБ). Через 3хв. планшет знову стр ушують, старанно видаляють залишки вологи а в лунки вносять кон'югат пероксидази із кролячими антитілами до IgG миші в розведенні 1:1000. Після інкубації протягом однієї години при 37°С планшет промивають, як описано вище, лунки заповнюють субстратною сумішшю - 0,03% Н2О2 і 0,4мг/мл орто-фенілендіаміну у 0,05М К-фосфатному буфері з pH 6,0. Реакцію зупиняють додаванням до розчину 50мкл 2М H 2SO4. Оптичну густину визначають при довжині хвилі 492нм на автоматичному спектрофотометрі MR-380 («Dynatech», США). Гібридоми, що продукують мон AT, клонують чотири рази методом кінцевих розведень, висіваючи по одній клітині в лунку, що містить 5·104 неімунних клітин селезінки миші. Після клонування частка клітин, що синтезує антитіла заданої специфічності, становить 100%. Продукція антитіл зберігається, як мінімум, протягом 16 пасажей. Штам позначається 2d-2a і має такі характеристики. 1. Культуральні властивості. Для вирощування штаму використовують культуральні флакони з поживним середовищем Ігла в модифікації Дульбекко або RPMI-1640, що містить 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ глутамін, 1мМ піруват натрію, 0,05мМ 2-меркаптоетанол, 50мкг/мл гентаміцину, 20мМ HEPES. Посівна доза 50-100тис.клітин/мл. Через 3-4 дні клітини підраховують і пересівають. Клітини культивують при 37°С. У разі використання в поживному середовищі 20мМ HEPES необов'язково створювати 5%-у концентрацію СО2 в атмосфері. Характер росту - стаціонарна суспензія. 2. Характеристика корисного продукту. Мон AT 2d-2a належать до IgGl з легкими ланцюгами k-типу. Антигенна детермінанта (епітоп), що розпізнається антитілами, розміщена в N-кінцевій ділянці Bb-ланцюга і включає амінокислотні залишки, які розташовані по обидва боки зв'язку, який розщеплюється тромбіном Арг14-Глі15. Константа дисоціації в реакції з фібриногеном становить 1,04·10-9М. 3. Продуктивність штаму. Концентрація антитіл у культуральній рідині за 3-4 дні культивування досягає 25-35мкг/мл. 4. Контамінації. За довготривалого спостереження бактерій, грибів і мікоплазм не виявлено. 5. Кріоконсервування. Для зберігання клітин штаму 2d-2a їx ресуспендують у суміші, що смістить 10% диметилсульфоксиду і 90% ембріональної телячої сироватки, в концентрації 5·106клітин/мл. Суспензію розливають у пластикові ампули, поміщають у контейнери із спіненого полістиролу з товщиною стінок 1см, переносять у заморожувач (-70°С) на 18год. Потім клітини переносять у рідкий азот для довгого зберігання. Розморожують клітини при +37°С у водяній бані. Життєздатність клітин оцінюють шляхом фарбування трипановим синім. Звичайно вона становить близько 50%. Приклад 1. Мон AT виділяють методом афінної хроматографії з поживного середовища, на якому впродовж 3-4 днів культивувались гібридомні клітини штаму 2d-2a. Культуральну рідину пропускають через колонку з фібриноген-сефарозою, яку урівноважують ЗФР. Імобілізацію фібриногену на BrCN-сефарозі здійснюють за рекомендацією фірми «Pharmacia». Елюцію зв'язаних антитіл проводять 0,1М К-фосфатним буфером з pH 2,8, Розчин антитіл нейтралізують 1М К2НРО4, концентрують і діалізують методом ультрафільтрації проти ЗФР. Концентрацію антитіл визначають на спектрофотометрі. Вважають, що оптична густина, яка становить 1,4 (за l 280нм) відповідає концентрації IgG 1мг/мл. Мон AT 2d-2a використовують для визначення рівня нативного фібриногену у плазмі крові людини за допомогою бісайтового ІФА. У 96-лункові полістиролові планшети з підвищеною адсорбційною здатністю (фірма «NUNC», Данія) вносять по 110мкл розчину специфічних до фібриногену мон At 2d-2a у ЗФР із концентрацією 10мкг/мл і інкубують при 4°С протягом 18год. Розчин антитіл струшують, планшет промивають проточною водою з-під крана шість разів, лунки заповнюють ТФБ і витримують 30хв. при кімнатній температурі. Перед експериментом ТФБ старанно видаляють. До адсорбованих на полістиролі мон AT додають 100мкл розчину, що містить зразок фібриногену (наприклад, розведену у 200 разів плазму крові людини). Плазму розводять у ТФБ, до якого додають сухе обезжирене молоко і цитрат натрію до кінцевої концентрації 5% та 0,38% відповідно. У контрольні лунки фібриноген не вносять. Розчин інкубують 1год. при 37°С. Лунки планшета промивають послідовно проточною водою і ТФБ, після чого додають у кожну лунку по 100мкл біотинильованих антитіл II-4d у концентрації 0,5мкг/мл, які, на відміну від 2d-2a, розпізнають іншу ділянку на молекулі фібриногену. Інкубацію здійснюють 1год при 37°С, планшет промивають, як описано вище, і кожну лунку заповнюють (по 100мкл) кон'югатом стрептавідину з пероксидазою хріну у розведенні 1:1000 («Pharmacia», Швеція). Знову проводять інкубацію 1год при 37°С, після чого планшет промивають, як і в попередні рази. У кожну лунку планшета вносять по 100мкл субстратн у суміш (склад якої описано вище). Оптичну густин у визначають при 492нм на автоматичному мікроспектрофотометрі. Концентрацію фібриногену обчислюють, використовуючи калібрувальну криву, яку будують згідно з результатами паралельного експерименту, в якому використовують відомі концентрації фібриногену. Чутливість визначення фібриногену становить 5мкг/мл плазми, розведеної у двісті разів. Таким чином, мон AT 2d-2a можуть бути використані для визначення нативного фібриногену у плазмі крові людини. СПИСОК ПОСИЛАНЬ. 1. Hoegee-de Nobel E., Voskuilen M., Briet Е., Brommer E., Nieuwenhuizen W., A monoclonal antibody-based quantitative enzyme immunoassay for the determination of plasma fibrinogen concentrations // Thromb Haemostas. - 1988. - 60(3). - P.415-418. 2. Koppert P.W., Koopman J., Havercate F., Nieuwenhuizen W., Production and characterization of a monoclonal antibody reactive with a specific neoantigenic determinant (comprising Bb 54-118) in degradation products of fibrin and of fibrinogen // Blood. - 1986. - V.68. - P.434-441. 3. Hui K.Y., Haber E., Matsueda G.R., Monoclonal antibodies to a synthetic fibrin-like peptide bind to human fibrin but not fibrinogen // Science. - 1983. - V.222. - P.1129-1132. 4. Пат. 0151239 Європейський, МКИ 4 С12P21/00 С12N5/00, G01N33/577 А61М1/36. Monoklonal antibodies specific to in vivo fragments derived from fibrinogen / Kudryk B.J. - Опубл. 14.08.85. 5. Чудновец B.C., Луговской Э.В., Гоголинская Г.К., Дерзская С.Г., Назимов З.В., Комисаренко С.В., Выделение N-концевых дисульфидных узлов фибриногена и фибрина человека и фрагментов полипептидных цепей, входящи х в их соста в // Доклады Академии наук СССР. - 1991. - т.317. - №6. с.1496-1499. 6. Kohler G., Milstein С, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. - 256. - P.495-497. 7. Lerner E.A., How to make a hybridoma // Yale j Biology and medicine. - 1981. - 54. - P.387-402.