Застосування n-метил-4-бензилкарбамідопіридинію йодиду як інгібітора вірусу грипу а

Застосування N-метил-4бензилкарбамідопіридинію йодиду загальної формули Винахід стосується вірусології, зокрема антивірусних препаратів і може бути використаний для гальмування утворення вірусу грипу А. Прототипом запропонованого винаходу обраний препарат Oseltamivirum (товарна назва "Таміфлю") [Lament Koriser M.D.; Cynthia Wat, MBBS, MRCP; Tracy Mills, Msc; Paul Mahoncy Msc; Penelope Ward, MBBS, Frederick Hayden, M.D.// Impact of Oseltamivir Treatment on Influenza-Related Lower Respiratory Complications and Hospitalizations - Arch.Intem. Med., 2003; 163 : 1667 -1672.]. Хімічна раціональна назва препарату - Етил (3R,4R,5S)-4ацетиламіно-5-аміно-3-(1-етилпропоксі)-1циклогексан-1-карбоксилат. Препарат є ефективним проти вірусів грипу А та В у дорослих і дітей віком після 12 років. Проте компоненти, які входять у склад препарату є дуже чутливими організмом людини. У дослідах на дорослих було показано, що кількість побічних реакцій на прийом (нудота, рвота, безсоння, запороки) перевищує показники плацебо. Крім того препарат відзначається високою вартістю. В основу винаходу покладено завдання винайдення менш токсичного та з покращеними властивостями антивірусного засобу, який інгібує вірус грипу А. Поставлене завдання досягається застосуванням N-метил-4-бензил-карбамідопіридинію йодиду загальної формули O C NH CH2 C6 H 5 r N+ C2 CH3 NH CH2 C6 H 5 r N+ CH3 (11) (19) C UA O 75307 (13) як інгібітора вірусу грипу А. 3 75307 4 збудника. Кров півня з підкрильцевої вени змішали в якості інгібітора вірусу грипу А з 2% розчином лимоннокислого натрію, Сполука N-метил-4-бензилкарбамідопіридинію профільтрували, відмили у фізіологічному розчині йодид була синтезована як ненаркотичний аналь(0,85% розчин NaCl) тричі шляхом додавання розгетик, який виявив анальгезуючу, протизапальну, чину до еритроцитів з подальшим жарознижуючу та інтерфероногенну дію. В перемішуванням суміші та центрифугуванням при результаті додаткових досліджень виявлено 1000 об./хв. протягом 10 хв. З осаду еритроцитів об'єктивний вплив сполуки на активність вірусу приготували 1% розчин на фізіологічному розчині. грипу А. У порівнянні з відомими засобами запроВідібрали алантоїсну рідину від 14-денних понований засіб ефективніше гальмує утвоембріонів. Центрифугували при 1500 об/хв. протярення вірусу грипу А. гом 10 хвилин. Відібрали надосадкову рідину для Відоме застосування N-метил-4подальшої роботи. Для проведення реакції зробибензилкарбамідопіридинію йодиду в медицині як ли послідовні розведення алантоісної рідини у знеболюючого засобу з інтерферогенними, протифізіологічному розчині у полі стиролових планшезапальними та жарознижуючими властивостями тах на 96 лунок. У пропорції 1:1 змішали розведе(Патент України № 6752, Кл. А61 К 31/44, ну алантоісну рідину та 1% розчин еритроцитів у C07D213/20, публ. 1994 р.) для лікування тяжких лунках планшетів, перемістили та залишили при ускладнень форм епідемічного паротиту (Патент температурі +18°+20°С на годину. Досліди провоУкраїни № 38388, Кл. А61 Р31/00, пул.2001 р.), для дили на 10-11 - добових курячих ембріонах вагою лікування ангін [Патент України № 40248, Кл.АбІК від 20,0 до 22,0 г. 31/44, пул.2001 р.) вірусного гепатиту А (Патент N-метил-4-бензилкарбамідопіридинію йодид України № 21337, Кл.А 61К 35/14, пул.2001 р.]. одержали у вигляді кришталевої субстанції. Для Приклад. Активність дії N-метил-4досліджень використовували розчин на бензилкарбамідопіридинію йодиду проти вірусу фізіологічному розчині NaCl різної концентрації грипу А. (від 200 мкг/мл до 10 000 мкг/мл), LD50 амізону В якості об'єкту дослідження було обрано становила 8 мкг/0,1мл. вірус грипу типу A (H1N1) штам 209. Штам вірусу В дослідженні знаходилося 5 груп експерибуло виділено від хворої на грип дитини. До початменту: перша - контроль утворення вірусу грипу у ку дослідження штам підтримували пасажами на курячих ембріонах, що не піддавалися дії курячих ембріонах. Культивування здійснювали в запропонованої сполуки; друга - вплив сполуки, умовах термостату при температурі 37,5° С, який вводили у кількості 1600 мкг/ембріон; третя, вологості повітря 40-70%. Для культивування четверта, п'ята групи одержували сполуку, вірусу грипу використовували курячі ембріони відповідно, у кількості 800, 400,200 мкг на ембріон. віком 10-11 діб з вираженою сіткою кровоносних Вивчали профілактичну дію сполуки, тобто судин. препарат вводили одноразово у алонтоісну поВсі операції протягом зараження та розтину рожнину курячого яйця в обсязі 0,2 мл його робоембріонів проводили в окремому чого розчину за 4 години до зараження їх простерилізованому боксі. Ембріони розміщували досліджуваним вірусом грипу А (H1N1) у кількості на підставці повітряною камерою вгору. Поверхню 0,1 мл при інфікуючій дозі 112,0±0,29 ГО/0,1 мл. шкарлупи обробляли розчином етилового спирту Інфіковані ембріони вирощували протягом 72 годин при t°=36,5±0,5°С, відносній вологості повітря (70 ), далі розчином йоду ( 5%). Шкарлупу у центрі у термостаті 75,0±0,5%. повітряної камери проколювали голкою, після чого Кількість вірусу, що утворювався визначали в крізь отвір за допомогою шприца з голкою вводили РГА за загальноприйнятою методикою. матеріал для культивування на глибину 2-3 мм Результати дослідження наведені у таблиці 1. нижче межі повітряної камери. У порожнину Найбільш виразний профілактичний ефект від алантоїсу матеріал вводили у об'ємі 0,2 мл. Отвір дії сполуки N-метил-4-бензилкарбамідопіридинію у шкарлупі заливали розплавленим стерильним йодиду виявився при застосуванні його у дозі 400 парафіном. Після цього курячі ембріони мкг/ембріон. Різниця між показниками (у середньпомішували у термостат, а інкубування ембріонів оарифметичних та середньо геометричних титрах) здійснювали 72 години після інфікування. Перед контролю та дослідними групами сягали 2,5 -10 розтином курячі ембріони витримували 3 години разів при статистичній достовірності. при температурі -10°С. В умовах боксу проводили Для порівняння досліджували дію сполуки на обробку шкарлупи розчином етилового спирту вірус грипу A (H1N1) та дію прототипу (препарат (70°) та йоду (5%). Поверхню шкарлупи обпалюOseltamivirum - товарна назва "Таміфлю"). вали у вогні пальника. Шкарлупу зрізували за доПорівняльні дані (результати досліджень) щопомогою ножиць вище межі повітряної камери на до впливу на утворення вірусу грипу А (H1N1) in 1-2 мм та скидали. Пастерівською піпеткою ovo (профілактична схема) наведені у таблиці 2. відбирали алантоісну та амніотичну рідину з кожЗ наведених даних у таблиці 2 видно, що ного ембріону в окрему пробірку. Отриману рідину гальмуюча дія запропонованої сполуки на утвоцентрифугували у режимі 1500 об/хв. протягом 10 рення вірусу грипу A (H1N1) становить 60,0±15,49 хв. Надосадову рідину у стерильній пробірці ГО/0,1 мл, а гальмуюча дія прототипу зберігали у холодильнику при температурі 4°С. 59,33±22,61 ГО/0,1 мл. Антивірусну активність сполуки визначали за Статистичне дослідження цих показників впливом її концентрації на кількість (ГО/0,1 мл) показує рівень їх високої достовірності стосовно вірусу грипу A (H1N1), що утворювався в курячих даних контрольної групи і підтверджує критерієм t° ембріонах, які є чутливою системою до цього 5 75307 6 їх повну рівнозначність. ність, майже повну відсутність протипоказань і Запропонована винаходом сполука має певні значно нижчу (у 20 разів) вартість профілактичного переваги над прототипом, а саме - низьку токсичкурсу застосування. Таблиця 1 Групи експерименту І 54 II 54 III 54 IV 54 V 54 n Зворотні титри гемаглютининів (M±m) (ГО/0,1 мл) Середньоарифметичне Середньогеометричне 103,8±0,12 79,0 - 0,94 68,0±0,22 60,0 - 0,9 48,2±0,26 30,0 - 1,46 33,7±0,19 22,6 - 1,3 114 ±16,95 Т 2 5,3 18 0,97 Примітка: "n" - кількість курячих ембріонів у групі. Групи: І - контроль вірусу грипу II - вплив сполуки у дозі 1600 мкг/ембріон III - вплив сполуки у дозі 800 мкг/ембріон IV - вплив сполуки у дозі 400 мкг/ембріон V - вплив сполуки у дозі 200 мкг/ембріон "Т" - критерій достовірності різниці показників у контрольній та дослідній групі. За достовірний прийнятий показник Т 3. Таблиця 2 Група досліду І Контроль вірусу II Запропонована сполука 200 мкг/0,1 мл + вірус ПІ Запропонована сполука 400 мкг/0,1 мл + вірус IV Таміфлю 12 мкг/0,1 мл + вірус Комп’ютерна верстка М. Клюкін Зворотні титри гемаглютининів (ГО/0,1мл) Середньоарифметичні у групах Т досліду (М±m) 170,66 ±17,41 120,0 ± 8,07 2,64 60,0 ±15,49 4,7 59,33 ±22,61 3,9 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601