Застосування 4-(n-бензил)амінокарбонілу-1-метилпіридинію йодиду як профілактичного інгібітора цитомегаловірусної інфекції людини

Застосування 4-(М-бензил)амінокарбонілу-1 метил піридинію йодиду [амізону) як профілактичного інгібітора цитомегаловірусно'і інфекції людини. Корисна модель відноситься до області медицини і біології, конкретно - вірусологи" і молекулярної біологи, може бути використаний для створення антивірусного препарату, а також для наукових досліджень І стосується сполуки 4-(Nбензил)амінокарбоніл-1 - метил піридин і й йодид (амізон) [3], яка може використовуватись за новим призначенням в якості профілактичного інгібітора цитоме гало вірусної інфекції людини у культурі клітин. Відомо сполуки - аналоги нуклеозиду, що мають протицитомегаловірусну активність. В даний час, для лікування цитомегал овіру су людини використовують 9-(1,3-дигідроксі-2 пропоксіметил) гуанін (ганцикловір), що було обрано як аналог та C0sNa3-6H2O (фоскарнет), який було розглянуто як прототип [4-6]. Амізон відноситься до групи аралкіламідів ізонікотинової кислоти - знеболюючий засіб із інтерфероногенними, протизапальними та жарознижуючими властивостями [3]. Задачею корисної моделі є застосування амізону, як профілактичного інгібітора цитомегаловірусу людини. Поставлена задача досягається тим, що в якості інгібітора цитомегаловірусу застосовується речовина 4-(М-бензил)амінокарбоніл-1 метилпіридиній йодид (амізон). Суть корисної моделі полягає у тому, що запропонована сполука (1) забезпечує високу профілактичну інпбіруючу дію при цитоме галові русі (ЦМВ) людини у культурі клітин, що не поступається за активністю прототипу, але у порівнянні із ганцикловіром має низьку цитотоксичну дію. Крім того амізон має протизапальну, анальгетичну та жарознижуючу дії, доведена імуномодулююча активність при відсутності канцерогенних, мутагенних та ембрютоксичних властивостей. Експериментально доведено, що сполука (1) ефективно пригнічує розвиток цитомегал о вірусної інфекції людини in vitro у профілактичній схемі застосування. Крім того, амізон має здатність до накопичення у культурі клітин фібробластів легень ембріона людини і таким чином, пригнічувати вірусспецифічну цитопатичну дію цитомегаловірусу людини на 10 відсотків ефективніше у порівнянні із звичайною профілактичною схемою. Інпбіруючу активність амізону вивчали, використовуючи первинну культуру диплоїдних фібробластів легень ембріону людини (ФЛЕЛ), отриману із банку клітинних культур Інституту вірусологи ім.Д.І. Івановського РАМН. Клітини культивували у середовищі ДМЕМ (ПанЕко, Росія) із додаванням 5% сироватки ембріону корови ("Ну Clone", США) і 5% пуповинноГ сироватки людини (ПанЕко, Росія) в атмосфері 5% СОг. Використовували референс-штам цитомегаловірусу AD-169, люб'язно наданий проф. L.Pereira (Медичний Центр, Університету СанФранциско, США). Приклад 1. Визначення цитотоксичності сполуки (1). ЦитотоксичнІсть визначали за впливом на життєздатність клітин ФЛЕЛ, яку оцінювали методом виключення вітального барвника трипанового синього. Для цього на монослой фібробластів людини наносили підтримуюче середовище, що містило амізон у різних концентраціях. Протягом 10 діб спостереження, клітини кожного дня знімали CD 00 00 О З . 10889 сумішшю трипсину та версену і пожиттєво зафаргодини культивування у незначній мірі відрізнялось бовували 0,4% розчином трипанового синього. У від контролю. При концентраціях сполуки (1) камері Горяєва підраховували число нежиттєздат100мкг/мл і 800мкг/мл число мічених клітин відносних (забарбованих) і життєздатних (не зафарбовано контролю складало 60% і 30%, відповідно них) клітин. Життєздатність клітин у популяції оці(Фіг.2). Через 72 години число клітин, що синтезунювали як відношення життєздатних клітин до вали ДНК, знизилось відносно контрольної попукількості нежиттєздатних клітин і виражали у відляції на 50% у присутності 100мкг/мл амізону, а сотках від загального числа клітин. при концентрації 800мкг/мл - практично на 100%. Отримані дані показали, що на 3-ю добу 50% зниДля визначення цитотоксичності, клітини кульження числа клітин, що синтезували ДНК (АПД5о), тивували у середовищі, із вмістом амізону у конспостерігалось при концентрації амізону центраціях 0,1мкг/мл-1000мкг/мл. Протягом перЮОмкг/мл. Підрахунок приросту клітин у контрольшої' доби культивування амізон виявляв незначну ній та дослідній культурах показав, що через 3-й цитотоксичну дію (Фіг.1). На 3-ю добу культивудоби культивування виникає зменшення числа вання при концентрації амізону - 1000мкг/мп споклітин на 50% відносно контрольної популяції при стерігалась загибель 80% клітин. В присутності концентрації сполуки (1) ЮОмкг/мл. сполуки (1) у концентрації 800мкг/мл кількість життєздатних клітин складала 50% від загального чиТаким чином, концентрація сполуки (1), що висла клітин, а при концентрації 500мкг/мл - 70%. кликала 50% пригнічення синтезу ДНК клітин Амізон у концентрації 200мкг/мл виявляв незначну (АПД5о) на 3-ю добу складала - ЮОмкг/мл, і виявицитотоксичну дію, кількість нежиттєздатних клітин лась нижче концентрації, що впливала на життєскладала менше 10%. В нижчих концентраціях (від здатність клітин - 800мкг/мл та порівнювалась із ЮОмкг/мл до 0,1 мкг/мл) амізон не впливав на життакою для ганцикловіру. тєздатність клітин протягом 3-х діб культивування. Приклад 3. Визначення антицитомегаловірус100% життєздатність клітин зберігалась протягом ної активності сполуки (1). Дослідження впливу 5-й діб у присутності амізону у концентраціях від амізону на розвиток вірусної цитопатичної дії розЄОмкг/мл до 10мкг/мл та протягом 10-и діб - при глядали у профілактичній схемі. На монослой кліконцентраціях сполуки (1) 1мкг/мл-0,1мкг/мл. тин вносили підтримуюче середовище, що містило амізон у концентраціях 5мкг/мл, 1мкг/мл, Таким чином, амізон виявляв слабку цитоток0,1мкг/мл, 0,05мкг/мл та інкубували у термостаті сичну дію на фібробласти людини, 50% загибель протягом однієї та двох діб. Після обробки конценклітин (ЦД 50 ) на 3-ю добу спостерігалась при контраціями сполуки (1), клітини двічі промивали та центрації амізону - 800мкг/мл (Фіг. 1). Концентрація Інфікували вірусом із різною множинність інфікусполуки (1), що викликала 50% цитотоксичний вання (МІ) - від 0,0001 БУО/кл до 0,001 БУО/кл проефект, майже у 10 разів нижче у порівнянні із татягом 1 години при 37°С. Монослой клітин двічі кою для ганцикловіру [4]. промивали І вносили средовище підтримки. АнтиПриклад 2. Визначення дії амізону на пролівірусну активність оцінювали по здатності ЦМВ до ферацію клітин ФЛЕЛ. бляшкоутворення і по цитопатогенній дії вірусу Вплив амізону на синтез ДНК у фібробластах (ЦПД). Концентрацію сполуки, що викликала інгібілюдини аналізували по включенню радіоактивне 3 рування вірусної ЦПД на 50% по відношенню що міченого тимідину ( Н-ТД) методом радіоавтоградо контролю, приймали за ІД50- Хіміотерапевтичфії. Для цього клітини фібробластів ембріона люний індекс (ХТІ), або індекс селективності (1С), дини (ФЛЕЛ) у концентрації (6-Ю 4 клітин/мл) вирозраховували як відношення концентрації' препасаджували на покривні скельця, що розміщувались рату, що викликала клітинну деструкцію (ЦД5о) та у лунках 24-х лункових панелів. Через добу вносизнижувала синтез клітинної ДНК на 50% (АПД5о), ли амізон у концентраціях 1мкг/мл, 10мкг/мл, до концентрації, що викликала 50% антивірусний 100мкг/мл і 800МКҐ/МЛ. Потім, через 24г, 48г. і 72 ефект (ІДю). години у купьтуральну рідину вносили 3Н-ТД на 1 годину у концентрації 5мкКю/мл. Клітини відмивали, фіксували сумішшю метилового спирту і концентрованої оцтової кислоти. Потім препарати обробляли 5% розчином трихлороцтової кислоти, промивали дистильованою водою і покривали радіоавтографічною емульсією типу М (НДІ ХімФотоПроект, Росія). Через 3 доби препарати проявляли, фарбували гематоксиліном ("Shandon", США) і підраховували число КЛІТИН, ЩО МІСТИЛИ мічені і немічені ядра на 1мм2 покривного скла у контролі і досліді [2]. Підрахунок клітин, що містили 3Н-ТД-мітку, показав, що у культурі, не обробленій сполукою (1), через 1 добу після посадки 30% клітин знаходились у стадії синтезу ДНК. У процесі культивування кількість мічених клітин у контрольній культурі поступово знижувалось. Через 3-й доби їх кількість складала 12%. У культурі клітин, обробленій амізоном у концентраціях від 1мкг/мл до 10мкг/мл, число клітин, що містили 3Н-ТД-мітку, через 24 Результати дослідження представлені на Фіг.З. Амізон у концентрації' 5мкг/мл при інфікуванні ЦМВ із МІ 0,0001 БУО/кл викликав пригнічення вірусспецифічної ЦПД через 5 діб на 90%, із МІ 0,001 БУО/кл на 70%. Сполука (1) у концентрації 1мкг/мл Інпбірувала здатність вірусу до бляшкоутворення при МІ 0,0001 БУО/кл на 70%, при МІ 0,001 БУО/кл на 40%. Зменшення ЦПД ЦМВ із МІ 0,0001 БУО/кл було відмічено при концентрації 0,1мкг/мл на 60%, із МІ 0,001БУО/кл - на 40%. Амізон у концентрації 0,05мкг/мл інгібірував здатність вірусу до бляшкоутворення при МІ 0,0001 БУО/кл на 40%, при МІ 0,001 БУО/кл на 30%. Вплив амізону на ЦМВ інфекцію клітин було вивчено також при використанні накопичувальної профілактичної схеми. Для цього сполуку (1) у концентраціях 5мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05мкг/мл та 0,001 мкг/мл тричі наносили на культуру клітин - за 48г., за 24г та за 1 годину до внесення вірусу із МІ 0,001 БУО/кл та МІ 10889 0,0001 БУО/кл. Показано, що пригнічення вірусспедною культурами по кількості клітин, зафарбовацифічного ЦПД, збільшилось на 10% при вивченні них МКА до дВ. Число клітин, що синтезували дВ у усіх концентрацій амізону у порівнянні Із пригнікультурі, обробленій амізоном, ганцикловіром і у ченням ЦПД ЦМВ у звичайній профілактичній схеконтрольній (не обробленій) культурах складало мі {Фіг.4). 3%, 1,8% І 10%, відповідно (Фіг.4). Таким чином, на 5-у добу після зараження, під дією амізону накопиОтже, сполука (1) ефективно пригнічує розвичення пізнього структурного білку дВ було знижено ток ЦМВІ у культурі клітин при профілактичній в 3 рази відносно контрольної популяції. схемі застосування. Встановлено, що інгібіруюча доза (ІДЙО), при якій спостерігалась 50% інгібіруАмізон подібно ганцикловіру пригнічує синтез вання ЦПД ЦМВ із МІ 0,001 БУО/кл складала пізнього структурного білку, продукція якого зале1мкг/мл, а із МІ 0,0001 БУО/кл-0,1мкг/мл, порівнюжить від реплікації вірусної ДНК. В то же час, споється із 1С ганцикловіру (100-1000) [4]. лука (1) не впливає на ранні стадії вірусної інфекції, що передують репродукції ЦМВ. Приклад 4. Виявлення вірусспецифічних білків ЦМВ. Таким чином, амізон має вибіркову здатність пригнічувати ЦПД ЦМВ у культурі клітин і знижуваПонадранній р72, ранній рр65, та пізній структи рівень синтезу пізнього глікопротеїну дВ. 50% турний дВ білки ЦМВ визначали у інфікованих кліпригнічення ЦПД ЦМВ із МІ 0,001 БУО/кл, спостерітинах ФЛЕЛ методом імуноцитохімічного зафаргається при концентрації' амізону 1мкг/мл, із МІ бування. Для цього монослой клітин, промивали 0,0001 БУО/кл при концентрації 0,1мкг/мл, при 0,1М фосфатно-солевим буфером (ФСБ), рН7,4. цьому 50% цитотоксична дія сполуки (1), що оціПотім клітини фіксували абсолютним метанолом нюється за різними тестами (вплив на число жит10хв. при - 20°С. Після промивки на препарати тєздатних клітин (ЦД5о), на синтез ДНК або на наносили очищені моноклональні антитіла (МКА) приріст клітин (АПД5о)) складає від 100мкг/мл до отримані у лабораторії клітинної інженерії Інститу800мкг/мл. Індекс селективності (1С), що визначату вірусології ім.. Д.І. Іванівського РАМ [1] та інкується як відношення ЦДбо до ІДбо; при МІ бірували протягом 1-ї години при 37°С. В якості 0,001 БУО/кл складає 100-800, при МІ виявляючих антитіл використовували поліклона0,0001 БУО/кл 1000-8000, що порівнюється із 1С льні імуноглобуліни кролика, коньюговані із перокганцикловіру (100-1000) [4], (див. Фіг.5). сидазою хріна (DakoCytomation, Данія). Реакцію проявляли диамінобензидином (DAB), Biosciences, Отже, як видно із експериментальних даних, США. Препарати аналізували за допомогою інверамізон являється перспективним вітчизняним тованого мікроскопу Leitz (Німеччина). профілактичним засобом при ЦМВ інфекції людини. Проводили імуноцитохімічне зафарбування Джерела інформацГі: контрольних і дослідних клітин моноклональними антитілами (МКА), направленими до ІЕр72, Ерр65 1. Макарова Н.Е., Кущ А.А., Иванова Л.А. и др. та пізнього структурного білку дВ ЦМВ. НакопиПолучение моноклональных антител к сверхранчення вірусних білків у інфікованих клітинах виним белкам цитомегаловируса человека и их привчали при застосуванні амізону у концентрації менение для выявления инфицированных клеток. 50мкг/мл та ЦМВ із МІ 0,001 БУО/кл. У якості спо// Вопр. вирусол. -1996. - №1. С.28-32. луки порівняння використовували ганцикловір 2. Н.Е. Фёдорова, С М . Адуева, А.А. Меджидохіміопрепарат, Із відомим механізмом дії [4, 6]. ва, B.C. Романова, З.Н. Парнес, ГА. Галегов, А.А. Аналіз понадранніх та ранніх вірусних білків у конКущ. Подавление цитомегаловирусной инфекции трольних та дослідних клітинах проводили протяв клеточной Системе аминокислотными производгом 3-х діб розвитку інфекції. Результати підрахунными фулерена. // Вопросы вирусологии, 2002. ків показали, що через 1 добу після зараження у №1.-С.30-34. контрольній культурі клітин, 7%, клітин містили 3. Патент України №6752. 4-{NІЕр72, Ерр65 - синтезувався у 5%, клітини, що місбензил)амінокарбоніл-1-метилпіридиній йодид тили білок дВ не виявлялись. На 2-у добу кількість знеболюючий засіб з інтерфероногенними, протиклітин, що містили ІЕр72 та Ерр65, зростало і запальнимита жарознижуючими властивостями. складало 16% та 8% популяції, відповідно. На 3-ю 29.12.94. Бюл. №8-1. добу кількість клітин, зафарбованих МКА до ІЕр72 4. Clyde S. Crumpacker, M.D. Ganciclovir. // The складало 50% популяції, а кількість клітин, зафарnew england journal of medicine. - 1996. - Vol.335. бованих МКА до Ерр65-17%. Протягом 3-х діб спо№10.-P.721-729. стереження, число клітин, що містили білки ІЕр72 5. Erice A. Resistance of human cytomegalovirus та Ерр65 у ДОСЛІДНІЙ культурі, майже не відрізняto antiviral drags // Clin. Microbiol. Rev. - 1999. лось як від контрольної популяції клітин, так і від Vol.12.- P.286. культури обробленої ганцикловіром. Кількість клі6. Mar E.C., Chenng Y.C., Huang E S. Effect of тин, що містила структурний вірусний білок дВ, у 9(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine on human контролі і у ДОСЛІДІ достовірно не відрізнялась cytomegalovirus replication in vitro // Antimicrob. протягом перших 2-х діб. Через 3-й доби після Agents Chemother. -1983. - Vol.24. - P.518-521. зараження вірусний білок дВ було виявлено у конДодаток до опису заявки на Корисна модель: трольній культурі (не обробленій амізоном) у 2,5% "4-(М-бензил)амінокарбонілу-1-метилпіридинію клітин. У культурі клітини обробленій сполукою (1) йодиду як профілактичного інгібітора цитомегалокількість клітин, що містила дВ, складала 0,5% вірусної інфекції людини. (Фіг.4). На 5-у добу після зараження спостерігалась найбільша різниця між контрольною та дослі 10889 ••— 1-а доба 3-я доба Фіг.1 Цитотоксична дія амізону на життєздатність диплоідних клітин людини. По асі ординат - кількість життєздатних клітин, (% від контролю}; По асі абсцис - концентрація амізону, шкг/мл). '-* Зміна пцопіферативноі активності клітин ФЛЕЛ під дісю ймЬпну. По осі ординат - кількість клітин, мічених 3 НТД, (% від По осі абсцис концентрація ампону. іикг нп). За %Ш% прийнято кількість клітин, що містили 3 НТД нітігу. у культурі ФЛЕП, не обробленій лмізоном. 10889 10 О МІ В,О0ї БУШюі MVD 0.O001 БУО/юі Фіг.З Лнти ЦГЛВ активність амізинуу профілактичній схені. По осі ординат - пригнічення Інфекційної активності ЦМВр {% від контролю^; По осі абсцис - концентрація амізону, шкг нл); За 100% принято інфекційну активність LIMB у культурі ФПЕД не обробленій амізоном, що оцінювали за тестон бляшкоушореннл. Фіг.4 Анти ЇДМЕЇ активність аиізонуу профілактичній накопичувальній схемі. По псі ординат пригнічення інфекційної активності ЦМВ. (% від контролю); По осі абсцис - концентрація амізону, (мкг/мл); За ШО'^ принято інфекційну активність ЦІІВ у культурі ФП^Л, н(! аоіюплоиіи амїзоном, ЩП оцінювали за тестом олдшкоуіворення. 10889 11 12 *•-. 6 - •* - ЦМВ інфіковані КЛІТИНИ - - ш - - ЦМВ інфіковані кщтнни у прдср-кості 6 мкг/адлГЦ — -А— ЦМВ інфіковані югітинн у нрисугності 5€ мкг/мл амізоиу Фіг.5 НО ОСІ Вппкв амізону «з синтез пізнього дВ у клітинах ФЛЕЛ, заражених ЦМВ. ординат п-число юіітин, зафарбованих МКА до По осі абсцис - час після зараження (діб) Комп'ютерна верстка М Мацело Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м. Київ - 42,01601