Спосіб виділення вірусу грипу на культурі клітин

Спосіб виділення вірусу грипу на культурі клітин, що включає відбір носоглоткових змивів у хворих у перші 23 дні захворювання і наступне дослідження, який відрізняється тим, що додатково використовують сироватку крові великої рогатої худоби, культивують культуру епітеліальних клітин нирки собаки шляхом змішування живильного середовища ДМЕМ з сироваткою крові великої рогатої худоби у співвідношенні 9 1, ВІДПОВІДНО, І'І інокуляцію носоглотковими змивами та інкубацію протягом першої доби проводять при температурі 38-39°С і наступної доби - при температурі 34 С Корисна модель процесу відноситься до медицини, а саме, до досліджень або аналізу матеріалів особливими способами, переважно біологічних, здебільшого носоглоткових змивів від хворих на грип, та може бути використана при проведенні вірусологічних досліджень з метою виділення вірусу грипу для етіологічної діагностики епідемічних спалахів Відомий спосіб виділення вірусу грипу на культурі клітин полягає у дослідженні носоглоткових змивів від хворих на чутливій перещеплюваній культурі клітин MDCK (Madian Darby Kidney Cells епітеліальні клітини нирки собаки) [1, 2] Для культивування культури клітин застосовують поживне середовище Ігла (MEM) з подвійним набором амінокислот та телячу ембріональну сироватку, процес інокуляції клітин носоглотковими змивами від хворих проводять в термостаті при температурі 36°С протягом 30-60 хвилин, а інкубацію заражених клітин до виявлення цитопатичної дії здійснюють при температурі 34°С [3, 4] Найбільш близьким є спосіб виділення вірусу грипу на культурі клітин, що вирощена на середовищі Ігла (MEM) із бичим сироватковим альбуміном, Хепес буфером та 10% телячої ембріональної сироватки Перед зараженням культуральні флакони ДВІЧІ промивають середовищем, потім вносять по 0,2мл носоглоткового змиву від хворого на грип і залишають на 30-60 хвилин в термостаті при температурі 36°С, добавляють середовище, в складі якого ТРСК трипсин (США) в концентрації 2мкг/мл [5] До причин, що стримують досягнення очікуваного результату, належить те, що виконання відомого способу технічно складне, не є таким, що може бути використаним в рутинній вірусологічній практиці, не економічне, бо погребує складних реактивів (переважно зарубіжних виробників) Рівень техніки, що досліджений заявником, інформує про відсутність у джерелах патентної та науково-технічної інформації відомостей про використання інших "об'єктів того ж призначення", що дозволяє вважати відоме рішення найбільш близьким В основу корисної моделі поставлена задача розробити такий спосіб виділення вірусу грипу на культурі клітин, який шляхом вірусологічного дослідження носоглоткових змивів від хворих на грип спрощує проведення аналізу та знижує собівартість при використанні Означений вище технічний результат досягається тим, що в способі виділення вірусу грипу на культурі клітин, згідно з корисною моделлю, застосовують культуру клітин адаптовану до поживних середовищ та розчинів виробництва України та Роси, використовують для культивування сироватку крові великої рогатої худоби та підвищену температуру при інкубації інокульованої культури клітин Причинно-наслідковий зв'язок сукупності істотних ВІДМІННИХ ознак, що заявляються, з вищезгаданим технічним результатом полягає у наступному Під час епідемічних спалахів для виділення ві « • О) СЧ о> 7290 русу грипу застосовують перещеплювану культуру чутливих для вірусу грипу клітин MDCK (Madian Darby Kidney Cells - епітеліальні клітини нирки собаки) Новизна запропонованою способу виділення вірусу грипу під час епідемічних спалахів полягає у тому, що замість складу середовище Ігла (MEM), бичий сироватковий альбумін, Хепес - буфер, теляча ембріональна сироватка, для культивування культури епітеліальних клітин нирки собаки застосовують тільки середовище Ігла в модифікації Далбекко (ДМЕМ) та сироватка крові великої рогатої худоби у співвідношенні 9 1, ВІДПОВІДНО, інокуляція культури носоглотковими змивами проводиться при кімнатній температурі без використання термостату, інокульовані флакони з культурою клітин інкубують першу добу при підвищеній температурі 38-39°С, а потім до закінчення дослідження при 34°С Отже, сукупність відокремлюючих ознак корисної моделі, що заявляється, є істотною, бо має причинно-наслідковий зв'язок із очікуваним технічним результатом, а саме спрощення проведення аналізу, підвищення економічності одночасно із результативністю виділення вірусів грипу ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здій снення способу виділення вірусу грипу на культурі клітин, що заявляється, полягають у наступному Для здійснення способу залучають таке обладнання та матеріали термостат, центрифуга, біологічний мікроскоп, перещеплювана культура клітин MDCK (епітеліальні клітини нирки собаки), поживні середовища та розчини для культури клітин, середовище ДМЕМ, розчин трипсину, версену (виробник "Підприємство з виробництва бактерійних та вірусних препаратів" Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів їм М П Чумакова РАМП, Росія), сироватка крові великої рогатої худоби (виробник AT "Конотопм'ясо", Україна), лабораторний посуд, автоматичні дозатори, полістиролові планшети для серологічних реакцій мікрометодом, суспензія еритроцитів людини 0 (І) групи крові Для виділення вірусу грипу під час епідемічного спалаху використовують носоглоткові змиви від хворих на грип, відібрані в перші 2-3 дні хвороби Деконтамінацію змиву проводять пеніциліном (400од/мл), стрептоміцином (200мкг/мл) та ністатином (100од/мл) Дослідження здійснюють на одношарових культурах клітин, що вирощені у флаконах Таблиця 1 Результати виділення вірусу грипу на культурі клітин MDCK (епітеліальні клітини нирки собаки) під час епідемічних спалахів Рік 2001 2002 2003 2004 Всього КІЛЬКІСТЬ КІЛЬКІСТЬ досліджень виділених штамів 72 9 146 147 53 418 3 2 3 17 Тип виділених штамів вірусу грипу A(H1N1) В A(H1N1) A(H3N2) A(H1N1), A(H3N2), В Як інформує таблиця 1, протягом чотирьох епідемічних сезонів нами проведено 418 досліджень, щорічно від 53 до 147 аналізів Щосезонна КІЛЬКІСТЬ позитивних знахідок коливається від 1,4% до 12,5%, в середньому 4,0% Виділені штами вірусів грипу належать до різних типів A(H1N1), A(H3N2), В, які циркулюють серед популяції людей Приклад конкретного використання Культуру клітин MDCK попередньо адаптують до поживного середовища ДМЕМ з додаванням 10% сироватки крові великої рогатої худоби з антибіотиком гентаміцином (100мкт/мл) Клітини знімають розчинами версену та трипсину у співвідношенні 1 1, розсівають по флаконах по 1,5-2,0мл Для виділення вірусу грипу використовують 48годинну одношарову культуру клітин MDCK Після контакту матеріалу (по 0,2мл) протягом 2 годин при кімнатній температурі до флакону з культурою клітин вносять підтримуюче середовище, ДМЕМ з трипсином (2мкг/мл) Інокульовані клітини інкубують при температурі 38°-39°С протягом першої Відсоток ПОЗИТИВНИХ 12,5 2,1 1,4 5,6 4,0 КІЛЬКІСТЬ штамів, що підтверджені Українським Центром грипу та ГРВІ 9 (перші в Україні віруси, що виділені на культурі клітин) 3 2 3 17 доби, потім при 34°С протягом 4 діб, щоденно проводять мікроскогоювання дня обліку цитопатичної дії Для індикації вірусу грипу в культуральних рідинах проводять реакцію гемаг-лютинаци із 0,4% суспензією еритроцитів 0(1) групи крові людини Суспензію еритроцитів людини готують із еритроцитарної маси, що приготована на станції переливання крові Титрування та ідентифікацію вірусвмісного матеріалу здійснюють мікрометодом із використанням автоматичних піпеточних дозаторів, що дозволяє економне використовувати як культуральну вірусвмісну рідину, так і діагностичні препарати Цитопатична дія вірусу грипу спостерігається не раніше як через 72 години після інокуляції культури клітин, у вигляді дегенерації, яка нагадує "макові розсипи", що швидко відокремлюються від скла флакону, з подальшою фрагментацією клітинного моношару Таким чином, після проведення лабораторного випробування запропонованого способу виділення вірусу грипу на культурі клітин, заявником встано 7290 влено, що заявлений спосіб може бути широко використаний в лабораторній практиці санітарію епідеміологічної служби, для заявляемого об'єкту в тому вигляді, як він схарактеризований у належному пункті формули, підтверджена можливість його здійснення за допомогою вказаних у заявці або відомих до дати пріоритету діагностичних приладів; спосіб, що втілює заявляема корисна модель при здійсненні, забезпечує досягнення позитивного результату, а саме спрощення проведення аналізу, зниження собівартості в 1,9 рази та підвищення його економічності по відношенню до прототипу з можливістю його використання для вірусологічного нагляду за грипозною інфекцією для етіологічної розшифровки епідемічних спалахів. Отже, розроблена корисна модель відповідає умовам "промислова придатність", "винахідницький рівень" і може бути кваліфікований корисною моделлю України. Комп'ютерна верстка А Рябко Джерела інформації: 1. Вороненко С.Г. Віруси грипу / Посібник з медичної вірусологи. - Київ: Здоров'я. - 1995 с.222-229. 2. Наказ №30 МОЗ України від 09.02.1998р. "Про заходи щодо профілактики та боротьбі з грипом та гострими респіраторними захворюваннями в Україні". 3. Голубева Л.И., Клевцова Г.А., Иванова ВТ. и др. Выделение вирусов гриппа в Новгороде в 1990-1991 гг // Вопросы вирусологии. - 1993. - №1. - с. 7-8. 4. Иванова ВТ., Бурцева Е.И., Слепушкин А Н., Оскерко Т.А. и др. Распространение и свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, вызвавших подъем заболеваемости в России в 1999-2002гг // Вопросы вирусологии. - 2003. - №4. -с.11-17. 5. "Рекомендации по работе с культурой клеток МДСК" ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, 2004г. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601