Гемостатично активний препарат, що містить фактор фон віллібранда, і спосіб його одержання

1. Спосіб одержання гемостатично активного препарату, що містить фактор фон Віллібранда (vWF), з фракції плазми людини шляхом, який включає наступні етапи: І проводять хроматографічне очищення фракції плазми, що містить vWF, на аніонообмінному матеріалі, який має аніонообмінні групи на трансплантованих полімерних матеріалах (розгалужені матеріали), збирають фракції, що містить vWF; ІІ виконують очищення зазначеної фракції методом фракціонувально-витиснювальної хроматографії для одержання очищеного теплотривкого препарату, що містить vWF; і ІІІ нагрівають препарат у ліофілізованому стані до температури, більше ніж 800С для інактивації вірусів. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що теплотривкий препарат і нагрітий препарат показують тільки один пік в аналізі методом рідинної хроматографії високого розділення з використанням фракціонувально-витиснювальної хроматографії. 3. Спосіб за п.2, який відрізняється тим, що препарат нагрівають при температурі, більше ніж 90°С, зокрема при 100°С. 4. Спосіб за п.2 або 3, який відрізняється тим, що препарат нагрівають протягом інтервалу часу що C2 2 (19) 1 3 76714 4 Хвороба фон Віллібранда являє собою порузми крові людини, який відрізняється тим, що здійшення функції коагулювання крові, яке на відміну снюють хроматографічне очищення фракції плазвід гемофілії А і В характеризується кровотечами у ми крові, що містить vWF, на аніонообмінному мам'яких тканинах, особливо у слизових оболонках. теріалі, який має аніонообмінні групи на Було визнано, що причиною цієї хвороби є дефіприщеплених полімерних структурах (розгалужені цит так званого фактора Віллібранда (vWF). До матеріали), збирають фракцію, що містить vWF, цього часу зазначений фактор вводили пацієнтам після чого проводять очищення фракції, викорисза допомогою препаратів фактора VIII, в яких татовуючи метод фракціонувально-витиснювальної кож міститься vWF, але часто він незадовільної хроматографії, і препарат нагрівають для інактиякості і знаходиться у недостатній кількості. Хоча вації вірусів. Зазначені розгалужені матеріали, які одержання vWF за допомогою генної інженерії є можна використовувати у способі згідно з даним успішним, однак існує нагальна потреба у застосувинаходом, розкриті, зокрема, [у заявці ЕР-А-0 337 ванні удосконалених способів очищення для оде144]. У даному описі ця заявка включена як посиржання vWF з донорської крові або плазми. лання. Зазначені матеріали переважно є поліак[У заявці ЕР-А-0 934 748] описується vWF з риламідними полімерами, прищепленими на діоли високим ступенем очищення, що містить, щонайфрактогелю (Fractogel), який поставляє фірма менше, 15% мультимерів vWF, які складаються з Мерк (Merck), Дармштадт, Німеччина. 13 або більше протомерів (мультимерів vWF з виНа Фіг.1 показана стабільність продукту, одесокою молекулярною вагою). Зазначений фактор ржуваного згідно з даним винаходом, у порівнянні одержують за допомогою багатоступінчастого з продуктами, що очищаються тільки за допомохроматографічного очищення, у якому при поділі гою аніонообмінної хроматографії. груп замість кріопреципітації можна спочатку викоУ результаті здійснення зазначеного способу нати гель-фільтрацію. Для інактивації вірусів була несподіваним чином одержують продукт, що має описана, наприклад, обробка розчинниками та високий вміст vWF у порівнянні з фактором VIII. детергентами і теплова обробка у ліофілізованому Завдяки стадії проникнення в пори гелю послідовстані протягом 72 годин при 80°С. ний ряд операцій, згідно з даним винаходом, призРоботи Джосика (Josic) та ін. «Очищення факводить до вилучення інгібітора інтер- -трипсину, а тора VIII і фактора vWF з плазми крові людини за також інших факторів, які можуть справляти вплив допомогою аніонообмінної хроматографії», на погіршення якості продукту у відомих способах [Journal of Chromatography B,662 (1994), 181-190, і одержання препарату. Послідовність хроматограШвина (Schwinn) та ін.], «Оброблений розчиннифічних операцій, згідно з даним винаходом, доком/детергентом, пастеризований концентрат фазволяє одержати препарат, який надзвичайно стактора VIII з високим ступенем очищення», більний. Несподіваним чином фракція vWF, [Arzneimittel-Forschung I Drug Research 44 (1), 2, одержувана з використанням способу згідно з да188-191 (1994)], стосуються очищення комплексу ним винаходом, в основному стабільна у водному фактора VllI/vWF, причому очищення здійснюють розчині при кімнатній температурі протягом тривачерез іонообмінний матеріал і виконують дві незалих періодів часу (вимір здійснювали протягом лежні стадії інактивації вірусів. Проводять обробку приблизно одного тижня). Крім того, препарат, розчинником/детергентом і пастеризацію (протяодержаний згідно з даним винаходом, містить vWF гом 10 годин при температурі 63 °С) за присутності у нативній формі і вільний від фрагментів. стабілізаторів. Хоча фактор VIII майже не денатуБільш прийнятно, щоб теплотривкий препарат рується при пастеризації (95% залишкової активі нагрітий препарат показували тільки один пік в ності), фактор vWF змінює свою активність і розаналізі методом рідинної хроматографії високого поділ мультимерів (85% залишкового антигену), і розділення з використанням гель-фільтрації. відбувається втрата мультимерів з високою молеЗокрема, теплотривкий зразок можна нагрівакулярною вагою, що призводить до співвідношенти при температурі понад 80°С у ліофілізованому ня антигену vWF до активності, дорівнюючому 2.2 стані відповідно до зазначеного способу. В іншому (співвідношення активності до антигену =0.5). варіанті виконання способу, згідно з даним вина[У патенті US-A-5,714,590] описаний спосіб ходом, препарат нагрівають при температурі поочищення комплексу фактора VIII за допомогою над 90°С, зокрема при 100°С. Згідно з даним виіонообмінної хроматографії. Так, наприклад, як находом, нагрівання більш прийнятно проводять матеріал колонки застосовують EMD-TMAEпротягом періоду часу, дорівнюючого, щонайменFractogel, який також використовують для метода ше, від 1 до 5 годин, зокрема від 2 до 3 годин. Тафракціонувально-витиснювальної хроматографії. ким чином, відбувається інактивація усіх вірусів, Для здійснення вірусної інактивації запропонована обумовлених переливанням крові, особливо віруобробка розчинником/детергентом. Теплова обросів без ліпідної оболонки, таких як парвовіруси або бка не описана. Одержаний продукт містить також віруси гепатиту А. Як не дивно, але продукт, одерфактор vWF, причому вказують тільки на антигенжуваний згідно з даним винаходом, витримує цю ність фактора vWF. необхідну теплову обробку без істотного зниження Метою винаходу є забезпечення нового споактивності. собу очищення vWF з плазми крові людини. Такий Згідно з даним винаходом, очищення фракції, спосіб полягає в одержанні фактора vWF поліпшещо містить vWF, можна додатково здійснювати за ної якості та ефективності. допомогою, щонайменше, однієї адсорбційної Метою винаходу є створення способу одері/або афінної хроматографії. жання гемостатично активного препарату, що місЗгідно з даним винаходом, можна також викотить фактор фон Віллібранда (vWF) з фракції пларистовувати фракцію, що містить vWF, яку одер 5 76714 6 жують з плазми крові людини і яку можна очистити Використовуються наступні буфери: способом згідно з даним винаходом. Буфер AM, перша стадія промивання: Даний винахід також стосується гемостатично 120mM NaCl, 10mМ цитрату Na, 120mM гліциактивного препарату, що містить vWF, який можна ну, 1mМ СаСl2, рН6.9-7.1; осмотичний тиск: 360одержати способом згідно з даним винаходом. 400mosmol/кг. Препарат, згідно з даним винаходом, не місБуфер ВМ, друга стадія промивання: тить інфекційних вірусів крові, особливо вірус іму235mM NaCl, 10mM цитрату Na, 120mM гліцинодефіциту людини, вірус гепатиту В, вірус гепану, 1 mM CaCh, pH6.9-7.1; осмотичний тиск: 570титу А, вірус гепатиту С і парвовіруси. Зокрема, 610 mosmol/кг. препарат, згідно з даним винаходом, містить vWF Буфер CM, елюція: з високою молекулярною вагою, що показує як 700 mM NaCl, 10 mM цитрату Na, 120 mM глімінімум від 13 до 16 мультимерних зон після елекцину, 1 mM СаСЬ, рН 6.9-7.1; осмотичний тиск: трофоретичного аналізу. Число мультимерів і ха1380-1480mosmol/кг. рактер їх розподілу є мірою подібності препарату, Буфер DM, третя стадія промивання: що містить vWF, нативному vWF, який міститься в 1.5Μ NaCl. плазмі крові. Крім того, співвідношення кофактора Фракції, що показують активність vWF/FVIII, ристоцитину як сурогатного маркера активності піддають хроматографії за розміром на Fractogel vWF до антигену vWF у препараті згідно з даним EMD Bio SEC (гель поставляє фірма Мерк, Дармвинаходом складає, щонайменше, 0.8. Це є друштадт, Німеччина). Після ультра-/діафільтрації гим показником цілісності молекули vWF. використовують буфер наступного складу: 400mМ Крім того, препарат, одержаний згідно з даним NaCl, 10mM цитрату Na, 1mM СаСl2, 133mM гліцивинаходом, містить фактор VIII у нативній формі. ну, 1% сахарози. Використання комплексів фактора VIII і vWF для Після цього йде стерильна фільтрація. Препалікування хвороби фон Віллібранда виявилося рат поміщають в пробірки та ліофілізують, потім дуже корисним при клінічному застосуванні. здійснюють теплову обробку при температурі Крім того, із препарату, виготовленого згідно з 100°С. Теплова обробка триває протягом 120 хвиданим винаходом, були вилучені наступні білки лин. нижче межі імунохімічного виявлення: імуноглобуНа Фіг.1 показана стабільність продукту, одержуваного згідно з даним винаходом, у порівнянні ліни, фібриноген, фібронектин і інгібітор інтер- з продуктами, очищеними тільки за допомогою трипсину. Це імовірно є причиною великої стабільаніонообмінної хроматографії. Після аніонообмінності продукту, одержаного відповідно до виної хроматографії продукт, одержаний згідно з находу. даним винаходом, піддавали хроматографії за Приклади розміром. Відзначають, що продукт, одержаний Близько 47кг кріопреципітату обробляють 15% згідно з даним винаходом, мав активність 80% (у ваговому відношенні) 2%-го (у ваговому віднопісля зберігання з гепарином або без нього у водшенні) розчину гідроксиду алюмінію. Після ному розчині при кімнатній температурі, тоді як центрифугування зразок піддають вірусній інактипродукти, які не були піддані хроматографії за ровації 0.3% TnBP/1% Triton x 100. За екстракцією зміром, показували активність тільки 20% після 7 олії йде аніонообмінна хроматографія на Fractogel днів зберігання. EMD ТМАЕ (гель, що поставляється фірмою Мерк, Дармштадт, Німеччина). Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601