Спосіб одержання вірусоінактивованої фракції, що містить фактор yiii, та фракція, що містить фактор yiii

1 Способ получения вирусоинаїсгивированной фракции, содержащей фактор YIN, посредством хроматографических методов с использованием криопреципитата после его растворения или плазмы крови, выборочно обработанных гидроокисью алюминия, отличающийся тем, что вирусоинактивацию осуществляют посредством обработки указанной фракции диили триалкилфосфатом или неионным поверхностноактивным веществом с последующей по меньшей мере одной операцией разделения с помощью мембранной хроматографии 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что операцию разделения осуществляют с помощью ионообменного материала, выбранного из группы, состоящей из ионообменного материала, находящегося внутри мембраны, и ионообменного материала, находящегося снаружи мембраны 3 Способ по любому из пп 1 - 2, отличающийся тем, что дополнительную вирусоинактивацию осуществляют пастеризацией с последующей при необходимости дополнительной операцией разделения с использованием мембранной хроматографии 4 Способ по любому из пп 1, 3, отличающийся тем, что мембранную хроматографию осуществляют на материале, имеющем высокое сродство к фактору YIN 5 Способ по любому из пп 1, 3, 4, отличающийся тем, что материал, имеющий высокое сродство к фактору YIN, модифицируют лигандами с высоким и/или низким молекулярным весом 6 Способ по п 5, отличающийся тем, что материал мембраны модифицируют антителами к фак тору YIN 7 Способ ,по любому из пп 4 - 6, отличающийся тем, что модифицированный материал с высоким сродством к фактору YIN имеет иммобилизованные лиганды с высоким сродством к фактору YIN 8 Способ по любому из пп 1, 3, отличающийся тем, что в качестве хром ато граф и чес ко го материала используют материал, выбранный из группы, состоящей из хром ато граф и чес ко го материала, обеспечивающего гидрофобное взаимодействие с фактором YIN, подлежащим выделению, и хром ато граф и чес ко го материала, имеющего соответствующие лиганды, способствующие гидрофобному взаимодействию 9 Способ по любому из пп 1 , 3 - 7 , отличающийся тем, что пробу, подлежащую разделению, наносят на мембрану, содержащую ионообменный материал в водной системе с ионной силой, соответствующей от 0 до 150 ммоль раствора хлорида натрия, при необходимости промывают в водной системе с ионной силой, соответствующей от 200 до 400 ммоль раствора хлорида натрия и затем элюируют в водной системе с ионной силой, соответствующей от 500 до 1500 ммоль раствора хлорида натрия, поддерживая величину рН в пределах от 4 до 9 10 Способ по любому из пп 1 , 3 - 7 , отличающийся тем, что пробу, подлежащую разделению, наносят из раствора, который обеспечивает связь фактора YIN с антителами, при необходимости сродственную мембрану промывают, а затем осуществляют элюирование с помощью хаотропных реагентов с концентрацией, соответствующей, например, от 1 до 6 М мочевины, или соответствующего высококонцентрированного солевого раствора 11 Способ по любому из пп 1, 3, 8, отличающийся тем, что пробу, подлежащую разделению, наносят из раствора, имеющего ионную силу, например, от 500 до 1500 ммоль, на мембрану, имеющую на своей поверхности гидрофобные лиганды, и элюируют системами растворителей с более низкими значениями ионной силы 12 Способ по любому из пп 1 - 11, отличающийся тем, что элюированную фракцию, содержащую фактор YIN, концентрируют, разливают и/или лиофилизируют О ю ю 00 го 43855 13 Способ по любому из пп 1 - 12, отличающийся тем, что вирусоинактивацию осуществляют посредством обработки детергентом с содержанием до 15 мае % 14 Фракция, содержащая фактор YIN, отличающаяся тем, что она получена согласно способу по любому из пп 1 -13 Изобретение касается способа получения фракции, содержащей вирусоинактивированный фактор УТЛ, посредством хроматографических методов, а также фракции, содержащей фактор YIN, получаемой по способу согласно изобретению Фактор YIN является жизненно важным веществом, который играет значительную роль в свертывании крови Так, нарушения в свертывании крови поддаются терапевтическому действию путем приема фактора YIN Поэтому существует большая потребность в препарациях фактора YIN, годных к употреблению Было достаточно попыток, чтобы выделить фактор YIN в существенно обогащенной форме из естественных источников Так, уже известны хроматографические методы для промывки фактора YIN из криопреципитата Последний является фракцией, которая может быть получена путем обработки плазмы холодом Публикакция ЕР 367 840 В1 касается хроматографического метода для выделения фактора YIN из плазмы крови без предшествующей риппрскипитации При этом фракция, содержащая фактор YIN, выделяется посредством хроматографического разделения на гидрофильном хроматографическом материале, который модифицирован ионообменными группами Публикакция ЕР 0 238 701 касается способа получения высокочистого инфекционного антигемофильного фактора, причем криопреципитатом являются предварительно обработанные фракции, которые посредством осаждения этанола освобождаются от фибриногена, глобулина, альбуминов и других создающих помехи составных частей В европейской патентной заявке 88 108 458,6 описывается осуществление после вирусоинактивации криопреципитатной фракции хром ато граф и чес ко го разделения с помощью ионообменных веществ В публикации ЕР 0 173 242 А описан способ хроматографического получения препарации фактора YIII на анионообменных материалах, которые базируются исключительно на углеводах При этом углеводная матрица модифицирована диэтиламиноэтиловыми (DEAE) группами В качестве подходящих описываются прежде всего DEAE-сефарозе, а также DEAE-целлюлоза В GB-A-1,178,958 описывается промывка фактора YIN с помощью ECTEOLAцеллюлозных колонок Модифицированная целлюлоза содержит базовые заместители, которые вводились посредством реакции эпихлоргидрина и триэтаноламина Названный уровень техники использует или разделение хроматографическим способом в форме Batch-метода или хроматографию на колонке Этими способами достигают действительно хороших результатов, однако попрежнему желательным остается повышение выхода биологически ценного фактора YIN как по экономическим, так и этическим причинам В основу настоящего изобретения поставлена задача разработки способа, который позволит на основе существующего уровня техники усовершенствовать процесс получения фактора YIN в отношении выхода и биологической активности Поставленная образом задача решается посредством способа, при котором на основе криопреципитата или плазмы крови, в данном случае на основе обработки гидроокисью алюминия, после растворения криопреципитата осуществляется операция разделения путем мембранной хроматографии Способ согласно изобретению может также осуществляться с использованием торгового криопреципитата или плазмы крови Предпочтительно для предварительного концентрирования фактора YIN размороженный криопреципитат для последующей предварительной промывки пробы обрабатывается гидроокисью алюминия Предпочтительно перед собственно хроматографической промывкой на материалах, которые размещены в или на мембранах, проводитя вирусоинактивация При этом вирусоинактивация осуществляется по методу, который описывается в ЕР 131 740 А1, путем обработки биосовместимыми органическими растворителями (детергентами), Triton X - 100/TNBP, предпочтительно Tween /TNBP (трй-n-бути л фосфат) Хороших результатов достигают также при использовании хлората натрия/TNBP Предпочтительно используемые количества - до 15вес % детергента Вирусоинактивацию можно также осуществить после разделения путем мембранной хроматографии Операция разделения хроматографическим способом для промывки фактора YIN в пробе может осуществляться на основных материалах, модифицированных ионообменными группами, прежде всего, анионитами, или на материалах, модифицированных иммунносродственными лигандами При этом решающим является то, что названные материалы размещены в мембранах Предпочтительно мембраны состоят из основного материала, такого как модифицированная целлюлоза или искусственное волокно Прежде всего подходят мембраны, а также компактные диски из пористых полиглицидилметакрилатов и/или из других пористых гидрофильных полимеров с подобной структурой, как и из гирофилизированного полистирола В первом случае пригодная для разделения мембрана состоит или из тонких уложенных стопой друг на друга пленок из целлюлозы или искусственных волокон или во втором случае из компактных дисков из силикагеля или полимеровносителей Основные материалы мембран или дисков снабжены соответствующими анионооб 43855 менными группами или иммунносродственными лигандами В качестве ионообменных групп рассматриваются, прежде всего, анионообменные группы, такие как четверичные амины или диэтиламиноэтиловые группы В качестве катионитов рассматриваются, как правило, слабо- и сильнокислые катиониты, такие как материалы, которые можифицированы группами сульфокислота или фосфорной кислоты Ионообменные группы могут быть не связаны или связаны посредством так называемого промежуточного слоя или наполнителя с волокнами основного материала Материалы, снабженные наполнителем, называются также как материалы "щупальца" В DE 42 04 694 перечислены соответствующие наполнителии лиганды В качестве наполнителя может также служить, например, глюкозаминный радикал Также с мембранами из пористого полиглицидилметакрилата или других упомянутых материалов могут быть связаны анионообменные группы, как DEAE или четверичные амины При этом связь анионообменных групп осуществляется или непосредственно с материалом, образующим мембрану, или равным образом через наполнитель, например, глюкозаминный радикал В другом варианте способа согласно изобретению применяется мембранная хроматография по иммунному сродству с иммобилизованными веществами, которые имеют высокое сродство к фактору YIN Прежде всего для этого рассматриваются моноклональные и/или политональные антитела или фрагменты антител, связывающие фактор YIN, (мембранная хроматография по иммунному сродству) Антитела имеют предпочтительно органическое или минеральное происхождение Вещества со сродством к фактору YIN иммобилизуются на носителях посредством химически активных групп Предпочтительно активная группа связывается не непосредственно с материаломносителем, ас концом наполнителя Иммобилизация вещества для фактора YIN осуществляется путем связывания с активными группами, как тозил, трезил, гидрацид и другие Соответствующие способы известны из Т М Phillips "Affinity chromatography" в публикации "Chromatography" (Е Heftmann, ed ), 5th ed Elsevier, Amsterdam 1992 Антитела могут также предварительно адсорбироваться на мембранах лигандами протеина А или протеина G Путем последующего ковалентного сшивания можно воспрепятствовать элюированию антител (обескровление колонок) Для сшивания антител на мембранах протеина А или протеина G может быть применен способ, подобный тому, как при пустых носителях Преимущество иммобилизации на протеине А или протеине G состоит в том, что антитела иммобилизуются исключительно на постоянном сегменте молекулы (F) В этом случае антигенно - связывающая часть (F) остается свободной и не встречает препятствия в своем взаимодействии с фактором YIN В другом предпочтительном варианте осуществления для отделения фактора YIN используются материалы, которые могут обеспечить гидрофобное взаимодействие В качестве гидрофобных материалов используются нецикличные и/или цикличные алкиловые цепи, например, алкиловые цепи С1 до С18, а также ароматические вещества В качестве гидрофобных подготавливающих взаимодействие материалов рассматриваются также предпочтительно материалы со ступенчатой гидрофобностью Гидрофобность можно сделать ступенчатой путем введения полярных, как полярно-протонных или полярно-а- протонных групп, как гидрокси-, амино-, циано-группы Предпочтительно это согласовывают, принимая во внимание соответствующие условия разделения Внрусоинактивацию можно также осуществить путем тепловой обработки При этом предпочтительно после первой мембранной хроматографии элюированная проба, содержащая фактор YIN, подвергается операции пастеризации Соответствующий способ предлагается в Р 43 18 435 9 При этом фракции, которые обогащены фактором YIN, в присутствии стабилизаторов приводятся в состояние контакта с ди- или триалкилфосфатами и в данном случае со смачивающими агентами и одновременно или последовательно подвергаются обработке при высокой температуре в диапазоне от 55 до 67С° продолжительностью от 5 до 30 часов Может быть выгодным применить комбинацию обоих способов вирусоинактивации - обработкой детергентом и теплом Для удаления химикатов, используемых при операции пастеризации, можно также присоединить вторую мембранную хроматографию Предпочтительно отделение добавленных стабилизаторов осуществляется с помощью соединений DEAE или четверичных соединений аммония, которые размещены над наполнителем на поверхности хром ато граф и чес ко го материала-носителя, от модифицированной мембраны Равным образом соответствующие лиганды можно разместить без наполнителя на поверхности материаланосителя Стабилизаторы не замедляются этим анионитным материалом при выбранных условиях, в то время как фактор YIN адсорбируется на хроматографическом материале После этого фактор YIN элюируется посредством системы водных растворителей, солевые концентрации которых ступенчато повышаются Фракция, содержащая полученный таким путем фактор YIN, разливается в концентрированном виде посредством традиционных способов и в данном случае лиофилизируется Предпочтительно фактор YIN в первой ступени разделения путем мембранной хроматографии наносится из раствора невысокой ионной силы Предпочтительно водная система имеет ионную силу, которая соответствует от 0 до 150тМ раствора хлорида натрия При таких величинах ионной силы фактор YIN еще адсорбируется на хроматографическом материале, в то время как более слабо связывающие примеси посредством промывания водными системами с такими же величинами ионной силы могут вымываться Промывку адсорбированного материала можно выполнить по другому варианту осуществления способа согласно изобретению посредством водной системы с ионной силой, которая соответствует от 200 до 400тМ раствора хлорида натрия 43855 Десорпция фактора YIN и элюирование этой фракции осуществляется в этом случае посредством водной системы с ионной силой, которая соответствует от 500 до 1500тМ раствора хлорида натрия При этом водородный показатель рН выдерживается в диапазоне от 4 до 9 Если проводится катионная хроматография, то она осуществлется предпочтительно при водородном показателе менее 6, тогда как анионитную хроматографию лучше проводить при более высоком водородном показателе, превышающем значение 6 Если промывка фактора YIN осуществляется посредством мембранной хроматографии по иммунному сродству, то в отличие от вышеназванного метода, в котором используются анионитные материалы, элюирование проводится хаотропными реактивами или высококонцентрированными солевыми растворами Элюирование осуществляется предпочтительно при таких концентрациях хаотропных реагентов или солей, которые достаточны, чтобы ослабить связь между веществом с высоким сродством к фактору YIN и самим фактором YIN При этом концентрация вышеназванных веществ в соответствующих системах элюирования зависит от силы сродства фактора YIN и соответствующего связующего компонента Предпочтительно используются антитела с не слишком высоким сродством в качестве иммунносродственных лигандов Вследствие этого можно осуществить элюирование водными растворами невысокой денатурирующей силы Предпочтительно 8 используются водные растворы с концентрацией от 1 до 6М мочевины, прежде всего от 2 до 4М мочевины, или соответственно высококонцентрированные солевые растворы для элюирования фактора YIN из иммунносродственной мембраны При хроматографии гидрофобного взаимодействия проба наносится в водном растворе очень высокой ионной силы, как например, высококонцентрированный сульфат аммония (с концентрацией до 4М) или хлорид натрия (с концентрацией до 5М) Элюирование осущестляется прежде всего ступенчато или непрерывно посредством солевых растворов низкой ионной силы В качестве растворов с низкой ионной силой для элюирования проб при мембранной хроматографии гидрофобного взаимодействия можно также применять водный раствор с органическими растворителями, прежде всего разбавленный спиртовой раствор Способ согласно изобретению обеспечивает чрезвычайно быструю и несложную промывку фактора YIN и наряду с высокой чистотой отличается и высоким выходом продукта Кроме того, удельная активность полученного так и путем фактора YIN весьма высока, что объяснимо невысоким денатурированием активного фактора при использовании способа согласно изобретению Таким образом, предметом изобретения является также фракция фактора YIN, которая может быть получена посредством способа согласно изобретению ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90