Спосіб біологічної оцінки токсичності морського середовища

Передбачуваний винахід відноситься до біологічних способів оцінки екологічного ризику та аналізу забруднення водного середовища і може бути використаний в марикультурі, водній токсикології, рибництві. Аналіз якості водного середовища в цілому, і морського, зокрема, має не тільки екологічне значення, але й економічне, що визначає необхідність оцінки придатності використання водних ресурсів у рекреаційних, харчових, марикультурних та інших цілях. У зв'язку з цим, розробка швидких, добре відтворених і адекватних способів тестування морського середовища є актуальною задачею. Існуючі способи аналізу вмісту хімічних і мікробіологічних забруднювачів тривалі і дорого коштують, вимагають наявності спеціальної технічної бази, що складається з комплексу дорогих приладів і реагентів, спеціального обладнання і вивченого персоналу. Крім того, одержувані дані, як правило, порівнюють із гранично припустимими нормативами (ГПК і ГПС), що відрізняються в різних країнах і не завжди відображають справжню небезпеку середовища для живих організмів. В даний час все більшу популярність здобувають способи біотестування, тобто дослідження відповідних реакцій різних живих організмів на дію токсичних речовин чи їх суміші. Відомо, що пагубний ефект стресового впливу ініціює, у першу чергу, відповідну реакцію клітинних систем, що припускає проводити аналіз саме цих відгуків, як найбільш чуттєвих. Молекулярні параметри відповідних реакцій (біомаркери) мають ту перевагу, що відображають ефекти основних обмінних процесів на клітинному рівні. Біомаркери дають можливість оцінити як ранні прояви стресу, що передують видимому погіршенню загального стану життєдіяльності, так і відповідні параметри, що вимірюють на рівні організму. У той же час, вони дозволяють визначити механізми адаптації і відновлення гомеостазу організму в умовах дії несприятливих факторів середовища. Як біомаркери використовуються ферменти захисних систем організму (МОГ і антиоксидантной, показники перекісного окислювання ліпідів та ін.), індукція яких під дією несприятливих факторів у різних морських організмів була показана нами та іншими авторами [Руднева, Жерко, 1994; Руднева и др., 2004а, б, в; Goksoyr et al., 1996; Viarengo, 1989; Winston, 1991]. Разом з тим, реакції перерахованих вище біохімічних показників не завжди чітко виражені і мають однакову спрямованість, їх вектор багато в чому залежить від концентрації діючого фактора і фізіологічного стану організму. Варто враховувати також, що всі ці біохімічні виміри можливі тільки після загибелі тварин, що вносить додатковий стресовий фактор. Саме тому особливу значимість здобувають такі тест-системи, що дозволяють оцінити середовище проживання організму прижиттєво протягом досить короткого часу, не травмуючи тест-об'єкт. Відомо Спосіб біологічної оцінки токсичності водного середовища [див. А.с. №1294315, СССР, МКИ А01K61/00], у якому тест-об'єкти - молодь п'явок, що нехарчувалася, (Hirudo redicinalis), розділяли на 2 групи дослідну і контрольну та розташовували у відповідні ємності. Здійснювали подачу чистої і досліджуваної води в ємності, періодично реєстрували поведінкові функції тест-об'єктів у групах, порівнювали отримані результати і визначали наявність токсичності речовин у воді по зміні поведінкової функції досліджуваних тест-об'єктів у порівнянні з контрольними. Недоліки способу полягають у суб'єктивності, внаслідок візуального визначення зміни поведінкової функції тест-об'єктів, його низької чутливості. Відомо Спосіб визначення токсичності водних середовищ [див. А.с. №1328756 G01N33/18, СССР), у якому гідробіонтів попередньо адаптували до умов утримування в чистому водному середовищі, будували калібровочні криві залежності концентрації еталонного токсиканту від часу появи естремумів показників гідробіонтів і відносної величини цих екстремумів. Потім досліджуване водне середовище нагрівали та аерирували до одержання значення температури і концентрації кисню в ній, що відповідають тим, до яких раніше адаптували гідробіонтів. Замінювали чисте водне середовище в ємностях з гідробіонтами на досліджуване водне середовище, реєстрували зміни в часі величин показників у гідробіонтів у досліджуваному водному середовищі, визначали час появи екстремумів показників чи відносну величину цих екстремумів. Після цього за допомогою каліброваних кривих визначали концентрацію еталонного токсиканта, що відповідає часу появи екстремумів показників гідробіонтів, які знаходяться в досліджуваному водному середовищі, чи відносні величини цих екстремумів. Як тест-об'єкти використовували риб, молюсків, річкових раків, вищі водні рослини. Як показник, що реєструється, розглядали або рухову активність, або інтенсивність споживання кисню гідробіонтами, або їх термостійкість. Відомий спосіб має ряд недоліків: - при проведенні ранньої діагностики стану водного середовища використані в способі рухова активність, інтенсивність споживання кисню, аналіз поведінкових реакцій, термостійкість є суб'єктивними, не здатними продемонструвати відгук системи і не мають високої чутливості; - у способі йдеться порівняння з ГПК; - спосіб не дозволяє зафіксувати ранні патологічні зміни у фізіологічному стані організму при дії несприятливих факторів у малих дозах; - спосіб не здатний проводити експрес-оцінку стану водного середовища через його тривалість. В основу винаходу «Спосіб біологічної оцінки токсичності морського середовища» поставлена задача шляхом мікрокалориметрічних вимірювань параметрів біологічних тест-об'єктів у прижиттєвому стані, забезпечити проведення ранньої діагностики токсичності морського водного середовища і підвищення чутливості способу. Поставлена задача досягається тим, що в Способі біологічної оцінки токсичності морського середовища як біологічні тест-об'єкти використовуються личинки чорноморської риби атерини (Atherina hepsetus, Atherina Mochon pontica). Личинки атерини розміщуються в досліджуваному середовищі та в стерилізованій морській воді, а контролем є досліджуване середовище і стерилізована морська вода без токсиканту. Проводять мікрокалориметричні виміри теплопродукції личинок і, на підставі розрахунку питомої теплопродукції, а також її зниженні у тест-об'єктів, які були піддані дії токсикантів відносно показників інтактних личинок, виконують висновок про рівень токсичності морського середовища. Застосування мікрокалориметричного методу має ряд переваг: По-перше, він дозволяє провести прижиттєві виміри основних енергетичних параметрів гідробіонтів: загальний метаболізм організму і його зміни при дії несприятливих факторів; По-друге, мікрокалориметричний метод найбільш адекватний при вимірі показників теплопродукції, що відбиває стан загальної метаболічної активності організму, і відрізняється високою чутливістю; По-третє, пропонований спосіб відбиває неспецифічні реакції біологічних тест-обє'ктів на дію несприятливих факторів. Використання як контроль 2-х ампул, що містять морську воду з токсикантом і стерилізовану морську воду відповідно, дозволяє одержати достовірні дані. Відомо, що риби, особливо на ранніх стадіях онтогенезу (ікра, личинки, мальки), найбільш чуттєві до дії несприятливих факторів, що створює додаткову можливість підвищити чутливість біотестування з використанням як тест-об'єкт ікри чи личинок риб. Часто використовуються прісноводні риби (гупі, даніо), але для аналізу морського середовища вибір іхтіологічних об'єктів вкрай обмежений. Авторами був проведений аналіз теплопродукції личинок чорноморської риби атерини Atherina hepsetus і було показане зниження теплопродукції личинок при дії несприятливих факторів. Одночасно, по зміні біохімічних маркерів було встановлено, що личинки атерини є дуже чуттєвими об'єктами до дії токсикантів. Інші дослідники також використовували личинок атерини як тест-об'єкти в екотоксикологічних дослідженнях, однак параметри, що вимірювались, були обмежені, винятково, оцінкою виживаності, росту і розвитку деяких біологічних параметрів. Винахід пояснюється фігурами: Фіг.1 - Дія ПХБ для личинок атерини; Фіг.2 - Дія фунгіциду купросата; Фіг.3 - Дія стічних вод; Фіг.4 - Рівні метаболізму личинок риб з чистого та забрудненого районів Спосіб реалізується таким чином. Личинок атерини довжиною 6-7мм відновлюють за допомогою сака в прибережній частині моря і переносять у ємності з профільтрованою морською водою в лабораторію. Дослідження теплопродукції личинок здійснюють на Моніторі біологічної активності ТАМ 2277 (Швеція, Thermometric). В ампули, що містять по 2мл морської води з токсикантом і стерилізованої морської води відповідно, вносять по одній личинці чорноморської атерини Atherina hepsetus прижиттєвому стані. Контролем є ампули з морською водою з токсикантом та стерилізованою морською водою. Ампули герметично закривають і поміщають у вимірювальні циліндри Монітора біологічної активності, де проводять вимір теплопродукції при температурі +20°С на протязі 15-24 годин. Сигнал калориметра фіксують через кожні 10 хвилин і перераховують інтегральне значення теплопродукції за допомогою спеціально адаптованої комп'ютерної програми Digitam. Подальший аналіз результатів проводять по калориметричним кривим, отриманим у результаті 3-4 рівнобіжних вимірів. При цьому середні показники теплопродукції розраховували на підставі значень, отриманих щогодини, і обробляли статистично (М+m); вірогідність розходжень аналізували за допомогою критерія Ст'юдента (р