Фармацевтична композиція пептиду тимозин a1, кон’югованого з поліетиленгліколем, спосіб її приготування та спосіб лікування

Даний винахід стосується пептидів тимозину a 1. Тимозин a 1 (який іноді згадується як ТА1) являє собою пептид тимуса з імуномодулюючими властивостями, який складається з 28 амінокислот, гомологічний до природного продукту, який спочатку був виділений з тимозинової фракції 5 вилочкової залози теляти. Його біологічні ефекти включають збільшення функцій Тлімфоцитів і включають модуляцію інтерлейкіну-2 (IL-2), стимуляцію продукції g-інтерферону, індукцію Тлімфоцитів, активність природних кіллерів (NK-клітин) і стимуляцію тимопоезу. Показано також, що тимозин a 1 регулює експресію головного комплексу гістосумісності (МНС) класу І. Залишається необхідність у даній галузі техніки в удосконаленні композицій, які містять ТА1 і споріднені пептиди. Фармацевтична композиція відповідно до даного винаходу включає фізіологічно активний кон'югат, який містить пептид тимозин a 1 (ТА1), кон'югований з речовиною, яка збільшує період напівіснування пептиду ТА1 у сироватці пацієнта, коли згаданий кон'югат вводять пацієнту. Речовина може бути по суті неантигенним полімером. Відповідно до способу за винаходом по суті неантигенний полімер кон'югують з пептидом ТА1. Композиції за даним винаходом вводять пацієнтам, які потребують стимуляції імунітету. Даний винахід застосовний до пептидів ТА1, включаючи існуючий у природі ТА1, а також синтетичний ТА1 і рекомбінантний ТА1, який має амінокислотну послідовність природного ТА1, амінокислотну послідовність, у значній мірі подібну до нього, або скорочену форму його послідовності, і їх біологічно активні аналоги, які містять заміщену, вилучену, подовжену, замінену або іншим способом модифіковану послідовності, які мають біологічну активність, у значній мірі подібну до активності ТА1, наприклад, пептид ТА1, який має достатню амінокислотну гомологію з ТА1, так що він функціонує в основному таким же способом і в значній мірі з такою ж активністю, як ТА1. Фармацевтична композиція відповідно до даного винаходу включає фізіологічно активний кон'югат, який містить пептид ТА1, кон'югований з речовиною, яка збільшує період напіврозпаду пептиду ТА1 у сироватці пацієнта, коли згаданий кон'югат вводять пацієнту. Речовина може бути по суті неантигенним полімером. Відповідні полімери будуть мати молекулярну масу в діапазоні приблизно 200-300000, переважно в діапазоні приблизно 1000-100000, більш переважно в діапазоні приблизно 5000-35000 і найбільш переважно в діапазоні приблизно 10000-30000, полімери з молекулярною масою 20000 є особливо переважними. Такі полімерні речовини є переважно також водорозчинними при кімнатній температурі. Перелік таких полімерів, який не обмежує винахід, включає гомополімери поліалкіленоксиду, такі, як поліетиленгліколь (PEG) або поліпропіленгліколі, поліоксіетиленовані поліоли, їх співполімери і їх блокові співполімери, за умови, що розчинність у воді блокових співполімерів підтримується. Серед по суті неантигенних полімерів розглядаються моноактивовані поліалкіленоксиди з кінцевим алкілом (PAOs), такі, як поліетиленгліколі з кінцевим монометилом (mPEGs). Крім mPEG, можуть бути також корисні полімери з кінцевим (С1-С4)алкілом. Як альтернативу заснованим на РАО полімерам можуть бути використані ефективно неантигенні речовини, такі, як декстран, полівінілпіролідони, поліакриламіди, полівінілові спирти, засновані на вуглеводах полімери тощо. Фахівці в даній галузі зрозуміють, що наведений вище перелік є усього лише ілюстративним і що розглядаються всі полімерні речовини, які мають властивості, описані в контексті. Для цілей за даним винаходом термін «ефективно неантигенний» означає всі речовини, які розуміються в даній галузі як нетоксичні і не виявляють помітної імуногенної відповіді в ссавців. Полімер може бути у вигляді лінійного ланцюга або розгалуженого. Поліетиленгліколь (PEG) є особливо переважним полімером. Полімер може бути кон'югований з пептидом ТА1 будь-яким придатним способом. Типові способи кон'югації полімерів з пептидами розкриті в [патентах US 4179337, 4766106, 4917888, 5122614 і 6177074, а також у заявці WO 95/13090], всі з яких включені в контекст шляхом цитування. Тимозин a 1 має п'ять окремих потенційних сайтів для кон'югації з полімером по аміногрупі, і полімер може бути кон'югований по одному або декількох сайтах. Відповідно до одного варіанта втілення винаходу PEG з молекулярною масою 20000 кон'югують з N-кінцем ТА1 з утворенням PEG-ТА1. Це може бути здійснене шляхом твердофазного пептидного синтезу ТА1 на полімерній основі у вигляді кульок, як відомо в даній галузі, з відповідними захисними групами в боковому ланцюзі. Після завершення синтезу ТА1 захи щений ТА1 відщепляють від кульок, залишаючи на N-кінці вільну аміногрупу, яка реагує з PEG з молекулярною масою 20000. Потім видаляють захисні групи бокового ланцюга, щоб утворити кон'югат відповідно до даного варіанта втілення за винаходом. Композиції відповідно до даного винаходу можуть використовуватися для лікування пацієнтів, які потребують стимуляції імунітету. Такі можуть включати пацієнтів із злоякісними пухлинами, гепатитом, включаючи пацієнтів, інфікованих вірусом гепатиту В або гепатиту С, вірусом імунодефіциту людини (HIV) і ін. Спосіб включає введення пацієнту імуностимулюючої е фективної кількості фізіологічно активного кон'югата відповідно до даного винаходу. Виділення, характеристика і застосування пептидів ТА1 описано, наприклад, у [патентах US 4079127, 4353821, 4148788 і 4116951]. Імуностимулюючі ефективні кількості пептиду ТА1 можна визначити за допомогою рутинних експериментів титрування дози. Було знайдено, що ТА1 безпечний для людей при введенні в таких високих дозах, як 16мг/кг маси тіла/день. Переважні дози пептиду ТА1 знаходяться в діапазоні від 0,001мг/кг маси тіла/день до 10мг/кг маси тіла/день при типовій дозі, яка становить приблизно 0,02мг/кг маси тіла/день. Відповідно до одного варіанта втілення винаходу імуностимулюючі ефективні кількості є дозами, які включають пептид ТА1 у кількості, яка знаходиться в діапазоні приблизно 0,1-10мг. Переважні дози включають пептид ТА1 у кількості, яка знаходиться в діапазоні приблизно 1-5мг. Наведені вище дози відображають лише кількість пептиду ТА1, який присутній у композиції, а не масу кон'югованого з ним полімеру. У переважних варіантах втілення винаходу пептид ТА1 присутній у фармацевтично прийнятному рідкому носії, такому, як вода для ін'єкції, сольовий розчин у фізіологічних концентраціях або що-небудь подібне. Період напіврозпаду в плазмі підшкірно ін'єкованого ТА1 становить тільки близько 2год. Однак кон'югація полімеру з пептидом ТА1 відповідно до даного винаходу істотно збільшує період напіврозпаду пептиду. Далі винахід ілюструється наступними прикладами, які не претендують на те, щоб бути обмежуючими. Приклад 1 Щури одержували ін'єкцію 5-фторурацилу (5-FU), щоб викликати пригнічення імунітету, потім були оброблені шляхом ін'єкції тимозином a 1 (200мкг/кг) або модифікованим поліетиленгліколем тимозином a 1 [PEG (молекулярна маса 2000) - тимозин a 1] (молярний еквівалент 200мкг/кг тимозину), щоб визначити вплив на параметри імунітету. Було знайдено, що: (1) відновлення активності NK-клітин (після пригнічення, яке викликане 5FU) було більше у тварин, які одержували ін'єкцію PEG-тимозин a 1 ніж тільки тимозин a 1, і (2) відновлення активованих Т-клітин, CD25+, було більше у тварин, які одержували ін'єкцію PEG-тимозин a 1, ніж лише тимозин a 1. У наступних прикладах, які не претендують на обмеження винаходу, оцінювали безперервну інфузію ТА1 на моделі протипухлинної терапії з застосуванням імплантованих хірургічним способом осмотичних мініпомп, які доставляли рідини з постійною швидкістю потоку протягом 5 днів. Щурам давали 5-фторурацил (5-FU), щоб викликати пригнічення імунітету, і потім через 8 днів обробляли за допомогою ін'єкції або інфузії ТА1 (найнижчий рівень кількості лейкоцитів після введення 5-FU). Групами обробки, по 8 щурів у кожній, були: контрольна (мініпомпи з фізіологічним розчином); яка отримувала низьку дозу ТА1 (0,2мг/кг, підшкірна ін'єкція; порожні мініпомпи); яка отримувала високу дозу ТА1 (3,5мг/кг, підшкірна ін'єкція; порожні мініпомпи); і яка отримувала високу дозу ТА1 шля хом інфузії (3,5мг/кг, інфузовані за допомогою мініпомп). Параметри імунітету визначали по відношенню до базисної лини і через 8 днів після обробки 5-FU (день 1 обробки ТА1), а також у дні 5, 12, 20 і 27 після обробки з ТА1. Приклад 2 Щури десятитижневого віку, масою 250-300г одержували 100мг/кг 5-фторурацилу (5-FU) для пригнічення імунітету. Через 8 днів після обробки 5-FU щурів рандомізовано визначали в одну з наступних гр уп (n=8). Контроль (фізіологічний розчин у мініпомпі). Низька доза ТА1, ін'єкована підшкірно при 0,2мг/кг (з порожніми мініпомпами). Висока доза ТА1, ін'єкована підшкірно при 3,5мг/кг (з порожніми мініпомпами). Безперервна інфузія ТА1, забезпечена за допомогою мініпомпи при 3,5мг/кг/5днів. Параметри імунітету визначали по відношенню до базисної лінії і через 8 днів після обробки 5-FU (день 1 обробки ТА1), а також у дні 5, 12, 20 і 27 після обробки ТА1. Оцінки включали активність природних кіллерів (NK-клітин) [лактатдегідрогеназа (LDH), вивільнена з клітин лінії YAC-1 після експозиції протягом 4год з моноядерними клітинами периферичної крові (РВМС) людини], загальна кількість лейкоцитів (підтверджена за допомогою цитофлуориметричних параметрів після перевірки специфічності за допомогою моноклонального антитіла), загальна кількість лімфоцитів (CD3+ за допомогою проточної цитометрії) і активовані лімфоцити (CD25+/CD3+ за допомогою проточної цитометрії). Активність NK-клітин становила 42±5% по відношенню до базисної лінії і була знижена до 9+2% після 5FU. Обробка низькою дозою ТА1 привела до значного відновлення активності NK-клітин через 12 днів, тоді як при високій дозі ТА1 досягалося значне відновлення усього за 5 днів. Однак безперервна інфузія ТА1 була здатна подвоїти відповідь за 5 днів до 32±4% (у порівнянні з 16±2% для ін'єкованої високої дози, 12±3% для ін'єкованої низької дози і 11±1% для контролю). Тільки у тварин, оброблених ТА1 шля хом безперервної інфузії, виявлялося повне відновлення активності NK-клітин до рівнів базисної лінії. Загальне число лейкоцитів, визначене морфологічно, знижувалося від 14590±2071 клітин/мм 3 до 2597±582 після обробки з 5-FU. Обробка низькою або високою дозою ТА1 шляхом ін'єкції мала тенденцію скоріше до посилення відновлення в порівнянні з необробленими тваринами. Однак безперервна інфузія ТА1 забезпечувала статистично значуще і повне відновлення до рівнів базисної лінії тільки через 5 днів. Кількість активованих лейкоцитів (CD3+/CD25+) знижувалася незначно при обробці 5-FU (від 65±21 клітина/мм 3 до 37±10), однак їх рівні різко підвищувалися в дні 12 і 20 після обробки високою дозою ТА1 (297±136 і 321±75 клітин/мм 3 у порівнянні з 166±70 і 212±77 клітин/мм 3, відповідно). Безперервна інфузія ТА1 приводила навіть до більшого підвищення, до 422±105 і 446±73 клітини/мм 3. Приклад 3 Щури десятитижневого віку, масою 250-300г одержували 100мкг/кг 5-фторурацилу (5-FU) для пригнічення імунітету. Через 8 днів після обробки 5-FU щурів рандомізовано визначали в одну з наступних гр уп (n=15). Контроль (фізіологічний розчин у мініпомпі). Висока доза ТА1, ін'єкована підшкірно при 3,5мг/кг (з порожніми мініпомпами). Безперервна інфузія ТА1, забезпечена за допомогою мініпомп при 3,5мг/кг/5 днів. Параметри імунітету визначали по відношенню до базисної лінії і через 8 днів після обробки 5-FU (день 1 обробки ТА1), а також у дні 5 і 14 після обробки ТА1. Оцінки включали загальну кількість лейкоцитів (підтверджену за допомогою фізичних цитофлуориметричних параметрів після перевірки специфічності за допомогою моноклонального антитіла), гранулоцити (проточна цитометрія з використанням міченого флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) антищурячого гранулоцита HIS-48), загальну кількість лімфоцитів (CD3+ за допомогою проточної цитометрії), Т-хелпери (CD4+ за допомогою проточної цитометрії), активовані лімфоцити (CD25+/CD3+ за допомогою проточної цитометрії) і експресію цитокінів у плазмі [інтерлейкіну-2 (IL-2) і g-інтерферони (IFN-g) за допомогою імуноферментного аналізу ELISA]. Після визначення в прикладі 2, що ТА1, який доставляється безперервною інфузією, у порівнянні з підшкірною ін'єкцією виявляє різкий вплив на загальне число лейкоцитів, представляло інтерес визначити, який тип лейкоцитів відповідальний за збільшення. Очевидно, гранулоцити є підгрупою лейкоцитів, яка найбільш піддана дії ТА1, який доставляється безперервною інфузією. Кількість гранулоцитів знижувалася після 5-FU від 4485±1116 до 1249±432. Обробка з ТА1 приводила до збільшення до 14652±2463 протягом 5 днів (у порівнянні з 9924±3218 при ін'єкції ТА1 або 6954±1519 без ТА1), і даний рівень був ще ви ще через 14 днів. Цікаво, що в даному дослідженні була одна тварина, яка одержувала ТА1 як ін'єкцією (3,5мг/кг), так і безперервною інфузією (ще 3,5мг/кг). Ця тварина була не тільки здоровою і бадьорою, без очевидних несприятливих явищ, але й виміряні впливи ТА1 на параметри імунітету були навіть більше за такі в інших тварин. Що стосується гранулоцитів, ця досліджувана тварина мала значно підвищений рівень, 19376 клітин/мм 3 через 5 днів, у порівнянні із середнім значенням 14652±2463 в інших тварин, що піддавалися інфузії. Кількість загальних лімфоцитів (CD3+) була надзвичайно підвищеною після обробки з 5-FU (від 10904±1973 клітини/мм 3 до 1740±560). Обробка з ТА1 привела до відновлення рівнів базисної лінії, що виявлялося тільки через 5 днів, при доставці ТА1 безперервною інфузією, але не було помітним до 14 днів у випадку ін'єкованого ТА1. Тварина, яка одержувала ТА1 як шляхом ін'єкції, так і інфузії, мала рівні лімфоцитів, які не набагато відрізнялися від інших тварин (9765 клітин/мм 3 у порівнянні із середнім значенням 9644±961), але відсоток тих лімфоцитів, які залишалися активованими, був значно підвищений (від 428±89 клітин/мм або 4% лімфоцитів для тварин, які одержували інфузію ТА1, до 976 клітин/мм 3 або 10% лімфоцитів для тварини, яка одержувала ТА1 у високій дозі ін'єкцією, яка супроводжується інфузією). Т-хелпери (CD3+/CD4+) були також зниженими при обробці з 5-FU: від 5411±1084 клітин/мм до 1710±449 клітин/мм . Ці знижені рівні Т-клітин не збільшувалися без обробки з ТА1 протягом 14 днів експерименту. На противагу результатам, отриманим для гранулоцитів, при яких ТА1, доставлений безперервною інфузією, переважав ТА1, доставлений ін'єкцією для відновлення кількості клітин, доставленого одним зі способів ТА1 було досить для повернення рівнів Т-хелперів до базисної лінії. Оскільки ТА1, який доставляється або шляхом ін'єкції, або шляхом безперервної інфузії, приводить до збільшення Т-хелперів CD4+, представлялося цікавим визначити, чи відбувається це збільшення через вплив на підгрупу Т-хелперів - на Тh1 або Th2. Попередні дані in vitro і in vivo демонстрували, що ТА1 збільшує підгруп у Th1 Т-клітин, і в даному дослідженні був виявлений той же ефект. Доставка ТА1 безперервною інфузією приводила навіть до більшого збільшення в плазмі рівня цитокіну інтерлейкіну-2 (IL-2) підгрупи Th1, ніж спостерігалося після підшкірної ін'єкції (42±7пг/мл через 14 днів після доставки ТА1 шляхом безперервної інфузії в порівнянні з 21±16пг/мл для ін'єкованого ТА1 і 10±16пг/мл для контрольних тварин). Обробка за допомогою ТА1 приводила до збільшення цитокіну IL-2 підгрупи Тh1 і уможливлювала збільшення іншого цитокіну підгрупи Th1 - g-інтерферону (IFN-g). І хоча рівні цитокіну були низькими, на день 5 після обробки підшкірно ін'скований ТА1 приводив до більш високих рівнів IFN-g у плазмі. На день 14 після обробки тварини, що одержали ТА1 шляхом безперервної інфузії, мали найвищі рівні (14±5пг/мл у порівнянні з 10±1пг/мл при ін'єкції або 8±8пг/мл у контролі). Тварини, які одержували ТА1 як ін'єкцією, так і безперервною інфузією, мали навіть більш високі виміряні рівні обох цитокінів підгрупи Th1, особливо IFN-g, рівень якого становив 45пг/мл після 14 днів, у порівнянні з 14±5пг/мл для інших тварин. Висновки Підтримання постійного рівня ТА1 у кровоносній системі протягом деякої кількості днів підвищує вимірювані імунологічні ефекти. Цей дозовий режим приводить до несподіваних позитивних впливів на гранулоцити, а також до позитивних впливів на моноцити, які виявляються після ін'єкції ТА1. Не спостерігалося ніяких несприятливих явищ, навіть при дозах ТА1 у 15 разів вище за звичайні (а в однієї тварини при дозах у 30 разів вище за звичайні).