Спосіб підготовки патологічного матеріалу для бактеріологічного дослідження на туберкульоз

Винахід відноситься до медичної та ветеринарної мікробіології і може бути використаний в науководослідних і виробничих лабораторіях медичного і ветеринарного профілю. Найбільш близьким способом за технічною суттю до заявляємого є обробка проби матеріалу, що надійшов для дослідження з метою виявлення збудника туберкульозу, методом збагачення посівного матеріалу флотацією (прототип). В прототипу для концентрації мікобактерій тканину розтирають в фарфоровій ступці з фізіологічним розчином до консистенції сметани. У вузькогорлу колбу ємкістю 250 мл поміщають 10 мл досліджуваного матеріалу, додають рівну кількість однопроцентного розчину їдкого натрію. Суміш ретельно струшують до одержання однорідної консистенції (не більше 10 хв). Потім гомогенізований матеріал розводять в 10 раз стерильною дистильованою водою і додають 1-2 мл ксилолу або авіаційного бензину. Суміш знову струшують протягом 5-10 хв, додають до неї дистильовану воду (до горла колби) і залишають на 30 хв при кімнатній температурі до утворення флотаційного кільця на поверхні рідини. Для посіву на поживні середовища пінясту частину флотаційного кільця переносять пастерівською піпеткою в стерильні пробірки, додають рівну кількість 3 -6% розчину сірчаної кислоти. Пробірки ретельно струшують протягом 3-5 хв і залишають стояти 10 хв. Вміст знову утворює компактне кільце, яке засівають петлею в пробірки з поживним середовищам (Петраньяні, Гельберга або Левенштейна-Йєнсена). Початок росту колоній збудника туберкульозу на таких середовищах виявляють через 20-60 діб, а Інколи через 3 місяці [1]. Відсутність росту збудника туберкульозу на поживному середовищі раніше 3 місяців не дає підстав для негативного результату бактеріологічної експертизи. Головним недоліком культурального способу діагностики туберкульозу у тварин є велика тривалість досліджень, що негативно впливає на санітарно-профлактичні заходи в господарствах з метою недопущення поширення туберкульозу. Несвоєчасна діагностика завдає тваринництву великих економічних збитків. Задачею винаходу є удосконалення способу підготовки патологічного матеріалу для бактеріологічного дослідження на туберкульоз, в якому досягається скорочення часу діагностики туберкульозу шляхом прискореного росту мікобактерій на поживному середовищі певного складу. Задача вирішується тим, що посівний матеріал, який містить бактерії туберкульозу, обробляють реактивом "В" (до складу якого входять, мас.%: Мg - 1,66, Na - 26,73, СІ - 40,75, J - 12,39, О - 18,46) і препаратом "ОВ" (до складу якого входять, мас.%: С - 62,07, Η - 8,33, О - 13,79, J - 9,20, Na - 6,61), після розміщування одержаної проби в поживне середовище її витримують в термостаті при 37-1°С. Від тварин, що дали позитивну реакцію на туберкулін, загальноприйнятим способом відбирають патологічний матеріал, а якщо його немає, то беруть лімфатичні вузли (заглоточні, бронхіальні або середостінні у великої рогатої худоби). Тканини розрізують на шматочки і 2-4,5 г поміщають в фарфорову ступку, заливають 3-6%-ним розчином сірчаної кислоти. Через 10-20 хв кислоту зливають, шматочки промивають протягом 5 хв фізрозчином, змінюючи його 2-3 рази. Потім в ступку додають 2 г стерильного піску і 1 г реактиву "В", ретельно розтирають з невеликим об'ємом (6-8 мл) фізрозчину до утворення сметаноподібної консистенції. Одержану суспензію тканини кількісно переносять в 6 центрифужних пробірок порівну, додають по 8 мл 10%-ного розчину препарату "ОВ" на фізрозчині, нумерують і центрифугують. Надосадкову рідину видаляють залишаючи в пробірці приблизно біля 2 мл для подальшого дослідження. Одержаний осад з кожної пробірки, загальноприйнятим способом засівають в 10 пробірок, тобто з кожного центрифугата роблять 10 посівів на поживне середовище. Пробірки з засіяним середовищем поміщають в термостат при 37±1°С. Облік результатів проводять візуально загальноприйнятим методом. Приклад 1. Підготовку і збагачення посівного матеріалу (лімфовузли корів) проводили згідно методик, де знищували супутню мікрофлору 5%-ним розчином сірчаної кислоти. Через 10-20 хв. кислоту видаляли, а шматочки тканини промивали фізрозчином 2-3 рази. Потім в фарфорову ступку до шматочків тканини вносили 2 г піску і 0,5; 1,0; 2,0 г реактиву "В", ретельно розтирали, додаючи 6-8 мл фізрозчину. Одержану суспензію тканин з кожної ступки кількісно переносили порівну в 6 центрифужних пробірок. В кожну пробірку вносили по 8 мл 10%-ного розчину препарату "ОВ", і піддавали центрифугуванню. Потім відсмоктували надосадкову рідину, залишаючи біля 2 мл її для посіву на поживнісередовища. Посів, термостатування і облік результатів проводили по загальноприйнятій методиці. Результати дослідження показані в таблиці 1. Результати таблиці 1 свідчать проте, що кількість реактиву "В" впливає на результати дослідження. Приклад 2. Послідовність технічних операцій аналогічна прикладу 1, але додавали різну кількість препарату "ОВ". Контролем служило збагачення посівного матеріалу методом флотації. Результати досліджень приведені в таблиці 2. З таблиці 2 видно, що при обробці патологічного матеріалу методом флотації (контроль) ріст колоній мікобактерій туберкульозу на поживних середовищах появляється через 20-60 діб, спочатку він слабий, малопомітний. При обробці пропонуємим способом слабий ріст мікобактерій появляється через 24 години, а через 48 годин він добре помітний. Оптимальною концентрацією препарату "ОВ" є 5-10%, яка в 90% випадків забезпечує хороший ріст мікобактерій навіть через 24 години. Приклад 3. Підготовку патологічного матеріалу з метою збагачення мікобактеріями туберкульозу проводили за методами Гона-Левенштейна-Суміоші, Алікаєвої, флотації і пропонуємим способом. Перед посівом робили мазки згідно загальноприйнятої методики за методом Гона-Левенштейна-Суміоші з осаду, Алікаєвої - з суспензії, флотації - з вмісту бензинового кільця, а в пропонуємому способі для приготування мазків використовували осад після центрифугування. Готували по 2 мазки з проби загальноприйнятим методом. Мазки висушували на повітрі, фіксували, фарбували по Ціль-Нільсену і досліджували під мікроскопом, переглядаючи 50 полів зору. При виявленні мікобактерій туберкульозу в полях зору їх підраховували. Результати дослідження представлені в табл. 3. З таблиці 3 видно, що після обробки патологічного матеріалу пропонуємим способом при мікроскопії мазків виявляється в багато разів більше мікобактерій туберкульозу. Таким чином, виходячи з наведених прикладів, бачимо, що відібраний для дослідження патологічний матеріал обробляється 3-6%-ним розчином сірчаної кислоти протягом 10-20 хв. з метою знищення супутньої мікрофлори. Потім кислоту видаляють, шматочки тканини промивають 5 хв. фізрозчином за загальноприйнятою методикою Збагачення мікобактеріями туберкульозу посівного матеріалу в пропонуємому способі настає після додавання до нього 1 г реактиву "В" і 6-8 мл фізрозчину з наступним розтиранням тканин у фарфоровій ступці до сметаноподібної консистенції. З одержаної суміші відбирають біля 2 мл і переносять в центрифужну пробірку, куди додають 8 мл 10%-ного розчину препарату "ОВ" на фізрозчині, центрифугують. Виділені культури мікобактерій з патологічного матеріалу пропонуємим методом при подальшій диференціації були віднесені до M.bovis. Кращі результаті одержані, коли використовували середні параметри: 1. Доза реактиву "В" - 1 г. 2. Концентрація препарату "ОВ" - 10%. Ефективність запропонованого способу порівняно з відомими в багато разів вища: забезпечується ріст мікобактерій туберкульозу в поживному середовищі у 100% випадків наявності збудника в патматеріалі за 1-2 дні, тоді як при відомих методах ці показники становлять 40-50% за 30-90 днів. Одночасно з цим збільшується вихід ("урожай") мікобактерій туберкульозу на поживному середовищі, що забезпечує більш високу точність і переконливість при постановці діагнозу на туберкульоз. Все це досить цінно для виробничих і науково-дослідних лабораторій ветеринарного і медичного напрямку.