Спосіб ідентифікації карбонатного хлорозу рослин

Спосіб ідентифікації карбонатного хлорозу рослин, який ґрунтується на опроміненні листка рослини після темнової фази світлом з довжиною хвилі в діапазоні 400-650нм, прийомі, вимірювані і реєстрації сигналів флуоресценції в діапазоні довжин хвиль 670-770нм, із значень яких будують криву індукції флуоресценції з виділенням початкового F0 і максимального Fm значень флуоресценції, який відрізняється тим, що в ньому визначають ширину кривої індукції флуоресценції на рівні 0,75 (Fm–F0) для дослідної td і контрольної Спосіб належить до області дослідження матеріалів шляхом визначення фізичних властивостей, (зокрема визначення ураженості рослин карбонатним хлорозом) шляхом запису і аналізу кривої індукції флуоресценції нативного хлорофілу рослинних об'єктів. Спосіб орієнтовано на застосування у сільському господарстві, зокрема рослинництві, селекційній роботі та моніторингу стану ґрунтового середовища, бо карбонатний хлороз є індикатором цинкового та залізного голодування рослин і підвищеного РН ґрунту. Зовнішні ознаки ураженості листя хлорозом, зокрема карбонатним, хлоротичною плямистістю, вірусною строкатістю, тощо, схожі і розрізнити їх складно, навіть при явних ознаках, а окомірні визначення суб'єктивні. Відомо [«Способ обнаружения вирусных инфекций растений» SU 1507253; A01G67/00, G01N21/35], який полягає у реєстрації інфрачервоного поглинання листа рослини у спектральній області 850¸1750см у мінус першому ступені із швидкістю 160¸400см у мінус першому ступені /хв. Ураженим вважають зразок з максимальною інтенсивністю інфрачервоного поглинання в порівняні із здоровою рослиною. Спільними рисами аналогу і запропонованого способу є опромінення рослини, прийом та вимірювання оптичного сигналу, що взаємодіє з опроміненою областю листа. Причиною, що заважає одержанню очікуваного технічного результату є те, що спосіб-аналог не дозволяє ідентифікувати карбонатний хлороз рослин. Відомо спосіб запису, інтерпретації та використання індукції флуоресценції нативного хлорофілу представлений у [роботі Корнєєв Д.Ю. «Информационные возможности индукции флуоресценции хлорофилла», Киев, Альтерпрес, 2002г., ст.15-28]. Спосіб-аналог запису кривої індукції флуоресценції хлорофілу полягає в осві тлені листа рослини в діапазоні хвиль 400-650нм після його темнової адаптації, прийому та вимірювані сигналів флуоресценції в діапазоні хвиль 670¸770нм та побудові кривої індукції флуоресценції хлорофілу з поточних значень флуоресценції. Спільними рисами аналогу та запропонованого способу є вимірювання і реєстрація поточних значень флуоресценції з яких будують криву індукції флуоресценції нативного хлорофілу. Причиною, що заважає одержанню очікуваного те хнічного результату є те, що у способі аналогу (19) UA (11) 82894 (13) C2 tк рослин, а одержані значення порівнюють і при значенні td ³ 2 tк дослідну рослину вважають ураженою карбонатним хлорозом. 3 82894 не визначені показники, які дозволяють ідентифікувати карбонатний хлороз. Найближчим по суті до запропонованого способу є [«Спосіб реєстрації та використання світло індукованих вимірювань флуоресценції хлорофілу», патент DD 300049, А7, G01N21/64]. Спосіб прототип полягає в одержані і електронній реєстрації індукційної кривої індукції флуоресценції хлорофілу, визначені двох показників кривої, зокрема початкової F0 і максимальної Fm флуоресценції, та їх співвідношення, по якому і визначають стан рослини. Криву індукції флуоресценції хлорофілу будують із поточних значень флуоресценції, одержаних при опромінені листка рослини світлом у діапазоні хвиль 400¸650нм, збуджуючим флуоресценцію хлорофілу, після попереднього опромінення коротким насичуючим спалахом, темнової фази, наступного прийому, виділення і вимірювання сигналів флуоресценції у діапазоні хвиль 670¸770нм. Спільними рисами прототипу і запропонованого способу є опромінення листка рослини після темнової фази світлом з довжиною хвилі 400¸650нм, прийому, вимірювані і реєстрації сигналів флуоресценції з довжиною хвилі 670¸770нм, із значень яких будують криву індукції флуоресценції з виділенням початкового F0 і максимального Fm значень флуоресценції. Причиною, що заважає одержанню очікуваного те хнічного результату є те, що у способі прототипі не визначені показники кривої індукції флуоресценції хлорофілу, які дозволяють ідентифікувати карбонатний хлороз рослин. Задачею винаходу є вибір таких характерних ознак індукції флуоресценції хлорофілу, способу їх визначення та інтерпретації, які дозволяють ідентифікува ти карбонатний хлороз рослин. Вирішення поставленої задачі досягається тим, що запропонований спосіб включає опроміненя листка рослини після темнової фази світлом з довжиною хвилі 400¸650нм, прийому, вимірювані і реєстрації сигналів флуоресценції з довжиною хвилі 670¸770нм, із значень яких будують криву індукції флуоресценції з виділенням початкового F0 і максимальної Fm значень флуоресценції, а також визначають ширину кривої індукції флуоресценції на рівні 0,75 (Fm–F0) для дослідної td і контрольної tк рослин, а одержані значення порівнюють і при значені td³2tк дослідну рослину вважають ураженою карбонатним хлорозом. Відмінними ознаками запропонованого способу є те, що в ньому визначають ширину кривої індукції флуоресценції на рівні 0,75 (Fm–F0) для дослідної td і контрольної tк рослин, а одержані значення порівнюють, і приначені td³2tк дослідну рослину вважають ураженою карбонатним хлорозом. Введення у відомий спосіб операцій визначення ширини кривої індукції флуоресценції хлорофілу на рівні 0,75 варіабельної флуоресценції дослідної і контрольної рослин дозволить ідентифікувати ураженість рослин карбонатним хлорозом по збільшенню ширини кривої індукції флуоресценції хлорофілу дослідної рослини в по 4 рівнянні з шириною кривої індукції флуоресценції хлорофілу контрольної рослини більш ніж вдвічі. На Фіг. зображено загальний вигляд кривої індукції флуоресценції хлорофілу (індукційна крива, крива Каутського) де значення флуоресценції представлені у відносних одиницях: Fo - початкове значення флуоресценції після початку опромінення; Fm - максимальне значення флуоресценції; Fm-F o - варіабельна флуоресценція. t1 - час досягнення 0,75 варіабельної флуоресценції з боку наростання кривої індукції флуоресценції хлорофілу; t2 - час досягнення 0,75 варіабельної флуоресценції з боку падіння кривої індукції флуоресценції хлорофілу для контрольної рослини. t3 - час досягнення 0,75 варіабельної флуоресценції з боку падіння кривої індукції флуоресценції хлорофілу для дослідної рослини. tк , td - ширина кривої індукції флуоресценції хлорофілу відповідно контрольної і дослідної рослини. Проміжок часу між точками t1 і t2 приймають за ширину кривої індукції флуоресценції хлорофілу на рівні 0,75 варіабельної флуоресценції для контрольної рослини tк , а проміжок часу між точками t1 i t2 приймають за ширину кривої індукції флуоресценції хлорофілу для дослідної рослини td. При ураженості рослини карбонатним хлорозом, саме цей проміжок збільшується в порівнянні дослідної і контрольної рослин. Відомо, що певні ділянки кривої індукції флуоресценції хлорофілу є індикаторами відповідних фізиологічних процесів у ланцюгу фотосинтезу, Тому порушення окремих ланок фотосинтезу, викликані екзо- та ендогенними чинниками проявляються у характерних змінах відповідних ділянок кривої індукції флуоресценції хлорофілу. Такі зміни кривої індукції флуоресценції хлорофілу дослідної рослини, на яку діє збуджуючий чинник у порівнянні з індукцією флуоресценції хлорофілу контрольної рослини на яку чинник не діє, свідчать про вплив чинника. Ідентифікація дії чинника потребує вибору специфічного показника кривої індукції флуоресценції хлорофілу якому відповідає дія саме цього чинника. Таким показником на основі експериментальних досліджень вибрано ширину кривої індукції флуоресценції хлорофілу на рівні 0,75 різниці максимального і початкове значень флуоресценції; тобто на рівні 0,75 варіабельної флуоресценції. Саме цей показник вибрано ідентифікаційною ознакою ураженості карбонатним хлорозом. Запропонований спосіб реалізує наступний порядок визначень: з допомогою хронофлуориметра записують криву індукції флуоресценції хлорофілу контрольної рослини шляхом освітлення листа рослини після темпової фази, прийому, вимірювання та реєстрації сигналів флуоресценції. Листок рослини витримують без доступу світла від 2 до 15хв у конверті з темного паперу, або з допомогою виносного оптоелектронного сенсора, який має зажим із двома пластинами, між якими розміщують листок. Далі листок, чи його фрагмент, опромінюють світлом, яке збуджує флуоресценцію 5 82894 хлорофілу. Часті ше довжину хвилі опромінення вибирають у діапазоні поглинання хлорофілу 400650нм, який охоплює головні l=450нм, l=650нм та проміжні l=500нм, l=550нм максимуми поглинання нативного хлорофілу. Ін тенсивність опромінення актинічним світлом здійснюють у діапазоні 1002000 мкмоль фотонів м-2 с-1, яка підтримує фо тосинтез. Одночасно з освітленням здійснюють прийом, виділення, вимірювання і реєстрацію сигналів флуоресценції зосвітленої плями листка в діапазоні довжин хвиль 670¸770нм. Цей діапазон охоплює обидва максимуми флуоресценції нативного хлорофілу на l=680нм та l=735нм. Із поточних значень флуоресценції будують криву індукції флуоресценції, виділяють початкове F0 та максимальне Fm значення флуоресценції і розраховують 0,75 варіабельної флуоресценції 0,75 (Fm–F0) (див. Фіг.). З кривої індукції флуоресценції з боку наростання на рівні 0,75 варіабельної флуоресценції визначають t1, з боку спаду кривої визначають t2. Ширину кривої індукції флуоресценції для контрольної рослини t визначають як tК=t2-t1. Аналогічно будують криву індукції флуоресценції хлорофілу з поточних значень флуоресценції дослідної рослини з підозрою на ураження хлорозом, і теж визначають ширину кривої індукції флуоресценції хлорофілу на рівні 0,75 варіабельної флуоресценції. Якщо ширина кривої індукції флуоресценції хлорофілу дослідної рослини більша за ширину кривої індукції флуоресценції хлорофілу контрольної рослини більше ніж вдвічі (td³2tк ), то дослідну рослину вважають ураженою саме карбонатним хлорозом. Запропонований спосіб ідентифікації ураженості рослини карбонатним хлорозом, як видно з його опису, може бути реалізований у виробних умовах, так як для його реалізації використовують серійні хронофлуорометри, які дозволяють записува ти криву індукції флуоресценції хлорофілу. При реалізації способу був застосований переносний флуорометр «Флоратест» виробництва державного Науково-інженерного центру мікроелектроніки Інституту кібернетики НАН України, але Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 6 можна використати інші прилади, наприклад, портативний хлорофіл-флуорометр РАМ-2100 німецької фірми Heinz Walz GmbH, або хлорофілфлуорометр OS-30р фірми ОРТІ-Sciences, USA. Спосіб реалізовано при тестуванні карбонатного хлорозу саженців яблуні (Malus domestika) сорту «слава переможця». Листок неураженої (контрольної) яблуні розміщували між пластинами сенсора і витримували без світла 10хв. Для опромінення листка рослини було використано 4 синіх світлодіода NSPB500S (Nicbia) з довжиною хвилі випромінення 460нм±10нм. Діоди розміщені попарно на протилежних сторонах каркаса, симетрично відносно фотоприймача і в межах плями освітлення діаметром 7мм створюють рівномірне освітлення. При інтенсивності освітлення 450мкмоль м -2 с-1 і більше сигнал індукованої флуоресценції надійно фіксується. Для виділення сигнала флуоресценції нами був застосований широкополосний червоний світлофільтр з майларової плівки, який забезпечує надійне відсікання випромінення світлодіодів і пропускання сигналів флуоресценції в діапазоні 670¸770нм. У якості фотоприймача використано монолітний з підсилювачем світлодіод ОРТ301М (Burr-Brown), у якого максимум чутливості в діапазоні хвиль 650¸800нм. Для вимірювання і реєстрації сигналів використано мікроконтролер ADuC 842 (Analog Devieces). Спеціалізовані програми роботи контролера дозволяють визначити F0, Fm, 0,75(Fm– F0), t 1, t 2. t 3, tк , td , та td:tк . Визначена ширина індукційної кривої контрольної яблуні становила tк =320mсек. Аналогічно здійснювалось визначення ширини індукційної кривої з листка яблуні ураженої карбонатним хлорозом. При цьому ширина індукційної кривої була рівною 740mсек. Відношення td:tк =2.3 засвідчує ураженість карбонатним хлорозом. Неуражені саженці вибирались з сортопитомника, а уражені вибирались на основі окомірних визначень ураження та контролю підвищеного РН ґрунту. Запропонований спосіб дозволяє ідентифікувати карбонатний хлороз на раніх стадіях ураження при масових експресних визначеннях. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601