Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Rhodococcus erythropolis EK-1 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення, який відрізняється тим, що на початку стаціонарної фази росту продуцента у середовище вносять 0,2-0,25% фумарату і 0,1-0,15% цитрату. UA (21) a200901923 (22) 03.03.2009 (24) 10.12.2010 (46) 10.12.2010, Бюл.№ 23, 2010 р. (72) ПИРОГ ТЕТЯНА ПАВЛІВНА, ТАРАСЕНКО ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ЯЦУК ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ (56) UA U 33569, 25.06.2008 UA C2 84803, 25.11.2008 UA U 16721, 15.08.2006 UA A 71792, 15.12.2004 UA 10327, 15.11.2005 SU A 10467, 25.12.1996 UA U 44144, дата подачі 03.03.2009 Пирог Т.П., Тарасенко Д.А. Влияние фумарата и цитрата на образование поверхностно-активных веществ штаммом Rhodococcus erythropolis ЭК-1 // Біотехнологія. - 2008. - №3, C.48-55 Пирог Т.П. и др. Особенности с2-метаболизма и интенсификация синтеза поверхностно-активных C2 2 (19) 1 3 кому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Згідно винаходу на початку стаціонарної фази росту продуцента у середовище вносять 0,2-0,25% фумарату і 0,1-0,15% цитрату. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Добавлення на початку стаціонарної фази росту продуцента у середовище 0,2-0,25% фумарату і 0,1-0,15% цитрату дає змогу підвищити концентрацію ПАР та скоротити тривалість культивування бактерій. Експериментально доведено, що внесення на початку стаціонарної фази росту продуцента у середовище 0,2-0,25% фумарату і 0,1-0,15 % цитрату дає змогу скоротити тривалість періодичного культивування R. erythropolis EK-1 зі 120 до 100год. і підвищити у 1,5-2 раза показники синтезу ПАР. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis EK-1 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 6,8 NaOH 1,0 NH4NO3 0,6 MgSO4×7H2O 0,4 СаСl2×2Н2О 0,1 FeSO4×7H2O 0,001 рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол і гексадекан у концентрації 2% (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis EK-1 з середини експоненційної фази (44-48год. росту), вирощену на рідкому середовищі з 1,0% (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5% від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту (58-60 год) у середовище вносять фумарат натрію у концентрації 0,2-0,25% і цитрат натрію у концентрації 0,1-0,15%. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10%-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750мл з 100мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 100год. Використання нового способу дає змогу скоротити тривалість культивування (зі 120 до 100год.) і підвищити умовну концентрацію ПАР майже у 2 раза (зі 3,4 до 6,6). Приклад 1. Визначення оптимальної концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування R. erythropolis ЕК-1 Культивування R. erythropolis ЕК-1 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі наведеного вище складу. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2% (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis ЕК-1 з середини експоненційної фази (44-48год. росту), вирощену на рідкому середовищі з 1,0% (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Концентрація посівного матеріалу становить 5% від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту (58-60 год) у 92819 4 середовище вносять фумарат натрію у концентрації 0,1-0,3%, а також цитрат натрію у концентрації 0,05-0,2%. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750мл з 100мл середовища на качалці (320об/хв) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 120год. (на етанолі) і 168год. (на гексадекані). Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрація ПАР (ПАР*), який визначають як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності поверхневого натягу від логарифму значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. Значення показника ПАР* залежно від концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування наведено у табл. 1. Отже, найвищий показник ПАР* спостерігається за умови внесення у середовище як з етанолом, так і гексадеканом фумарату у концентрації 0,2-0,25% і цитрату у концентрації 0,1-0,15%. Слід зазначити, що за внесення фумарату або цитрату у досліджуваних концентраціях на початку процесу культивування R. erythropolis EK-1 спостерігали підвищення концентрації біомаси; при цьому умовна концентрація поверхнево-активних речовин дещо знижувалася порівняно з вирощуванням штаму ЕК-1 на середовищі без фумарату і цитрату. Тому у наступних дослідженнях фумарат і цитрат вносили на початку стаціонарної фази росту продуцента. Таблиця 1 Вплив концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування R. erythropolis EK-1 на синтез ПАР Концентрація Концентрація фумарату, % цитрату, % Умовна концентрація ПАР (ПАР*) за умов росту на етанолі гексадекані Без фумарату і цитрату (контроль) од 0 0,15 0 0,2 0 0,25 0 0,3 0 0 0,05 0 0,1 0 0,15 о 0,2 3,4 3,4 4,0 4,2 4,8 4,8 4,6 3,4 3,6 3,6 3,2 4,1 4,5 5,8 5,75 5,4 3,7 4,1 4,1 3,3 Приклад 2. Синтез ПАР R. erythropolis EK-1 за одночасної присутності у середовищі з гексадеканом і етанолом фумарату і цитрату Культивування R. erythropolis EK-1 здійснюють в умовах, описаних вище. На початку стаціонарної фази росту продуцента у середовище одночасно вносять фумарат у концентрації 0,15-0,3% і цитрат - 0,05-0,15%. Тривалість культивування становить 5 92819 120год. (на етанолі) і 168год. (на гексадекані) Рівень синтезу поверхнево-активних речовин R. erythropolis EK-1 наведено у табл.2. Умовна концентрація ПАР є найвищою за умови одночасного внесення у середовище з етанолом або гексадеканом фумарату у концентрації 6 0,2-0,25% і цитрату у концентрації 0,1-0,15%. За таких умов культивування показник ПАР* підвищується майже у 1,5-2 раза порівняно з вирощуванням продуцента на середовищі без фумарату і цитрату. Таблиця 2 Синтез ПАР Rhodococcus erythropolis ЕК-1 залежно від концентрації у середовищі з етанолом і гексадеканом суміші фумарату і цитрату Умовна концентрація ПАР (ПАР*) за умов росту на етанолі гексадекані 3,4 3,4 3,7 4,1 3,9 4,3 3,8 4,4 3,8 4,5 4,5 6,1 5,1 6,6 5,1 6,6 4,8 6,2 4,8 5,9 5,2 6,5 5Д 6,5 4,7 6,0 4,0 5,1 3,9 5,3 3,9 5,3 3,8 5,2 Концентрація фумарату і цитрату, % Без фумарату і цитрату (контроль) Цитрат, 0,05 + фумарат, 0,15 Цитрат, 0,05 + фумарат, 0,2 Цитрат, 0,05 + фумарат, 0,25 Цитрат, 0,05 + фумарат, 0,3 Цитрат, 0,1 + фумарат, 0,15 Цитрат, 0,1 + фумарат, 0,2 Цитрат, 0,1 + фумарат, 0,25 Цитрат, 0,1 + фумарат, 0,3 Цитрат, 0,15 + фумарат, 0,15 Цитрат, 0,15 + фумарат, 0,2 Цитрат, 0,15+ фумарат, 0,25 Цитрат, 0,15 + фумарат, 0,3 Цитрат, 0,2 + фумарат, 0,15 Цитрат, 0,2 + фумарат, 0,2 Цитрат, 0,2 + фумарат, 0,25 Цитрат, 0,2 + фумарат, 0,3 Приклад 3. Залежність синтезу ПАР від тривалості культивування R. erythropolis EK-1 Культивування R. erythropolis EK-1 здійснюють в умовах, описаних вище. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2% (об'ємна частка). На початку стаціо нарної фази росту у середовище вносять фумарат (0,2%) і цитрат (0,1%). Тривалість культивування становить 100 і 120год. Рівень синтезу поверхнево-активних речовин R. erythropolis EK-1 за таких умов культивування наведено у табл.3. Таблиця 3 Вплив тривалості культивування Rhodococcus erythropolis EK-1 на синтез ПАР за присутності у середовищі з етанолом і гексадеканом 0,2% фумарату і 0,1% цитрату Джерело вуглецевого живлення Гексадекан Етанол Тривалість культивування, год 120 100 120 100 Таким чином, за присутності фумарату і цитрату у середовищі з етанолом або гексадеканом умовна концентрація ПАР досягає найвищого значення на 100год. культивування продуцента. Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко ПАР* 6,6 6,6 5,1 5,1 Отже, використання запропонованого способу дає змогу скоротити (зі 120 до 100год.) тривалість культивування R. erythropolis EK-1 і підвищити майже у два раза (до 6,6) умовну концентрацію ПАР. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601