Штам lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus imb b-7281 – активатор фагоцитів

Штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ B-7281 - активатор фагоцитів. (19) UA (11) (21) a200907302 (22) 13.07.2009 (24) 27.12.2010 (46) 27.12.2010, Бюл.№ 24, 2010 р. (72) СПІВАК МИКОЛА ЯКОВИЧ, ПІДГОРСЬКИЙ ВАЛЕНТИН СТЕПАНОВИЧ, ШИНКАРЕНКО ЛЮБОВ МИКОЛАЇВНА, ЛАЗАРЕНКО ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА, ТИМОШОК НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА, ГОРЧАКОВ ВОЛОДИМИР ЮРІЄВИЧ, СТАРОВОЙТОВА СВІТЛАНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Козлов Л.В. Ростовцева Л.И. и соавт. Действие на комплимент человека бластолизина, а также гликопептидных (МДП, ГМДП) и углеводных фрагментов пептидогликанов. Биоорганическая химия. Том 11, №11, 1985 весь документ UA64160A 15.02.2004 весь документ UA63201A 15.01.2004 весь документ Довідка з переліку депонованих у ВКПМ мікроорганізмів про штам Lactobacillus bulgaricus. http://www.genetika.ru/vkpm/katalogmikroorganizmov/group_ весь документ Довідка з переліку депонованих у ВКМ мікроорганізмів про штам Lactobacillus bulgaricus. C2 2 92983 1 3 знаходиться в колекції живих культур Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. На Україні потреби у пробіотичних штамах лактобактерій із імуномодулювальнами та інтерфероногенними властивостями задовольняються переважно за рахунок штамів закордонного походження. Найбільш близьким до винаходу за результатами впливу на активність макрофагів є штами Lactobacillus bulgaricus CRL 423 (Center of Reference for Lactobacilli Culture Collection, Tucuman, Аргентина) [1] та Lactobgcillus bulgaricus LB51 (DeoDan Laboratories Ltd, Болгарія) [2], однак запропонований нами штам відрізняється виразнішою імуномодулювальною активністю. Культурально-морфологічні властивості. Грампозитивиі, факультативно анаеробні, нерухливі палички з округлими краями, які не утворюють спор. В неблагоприємних умовах культивування можуть набувати ломану або звиту форму. Штам вирощують при 38,0±1,0 °С протягом 1824 год на середовищі MRS або посівних середовищах № 1, 2 або на капустяному середовищі. Склад середовища MRS: пептон 10 г/л, м'ясна вода 100 мл, дріжджовий екстракт 10 г/л, глюкоза 20 г/л, K2НРО4 2 г/л, СН3СОONа 5 г/л, амоній лимоннокислий 2 г/л, MgSO4 0,2 г/л, MnSO4 0,05 г/л, твин-80 1 мл, вода дистильована до 1 л. РН стерилізації дорівнює 6,6-6,8 (після стерилізації - 6,2-6,6). Для отримання більш щільного середовища MRS добавляють 2% агару. Можливо вирощувати штам на середовищі без твину-80. Модифіковане середовище MRS: в 200 мл дистильованої води розчиняють 0,05 г MnSO4, 0,2 г MgSO4, 0,2 г цистеїну, 2 г K2НРО4, 2 г цитрату амонію, 5 г CH3COONa, 20 г глюкози, 10 г пептону. Добавляють також 1 мл твину-80 (попередньо розчиняють окремо в невеликій кількості гарячої дистильованої води), 50 мл дріжджового автолізату, по 100 мл екстракту печінки та м'ясного екстракту. Об'єм рідини доводять дистильованої водою до 500 мл та добавляють 500 мл гідролізованого молока, рН дорівнює 6,2-6,8. Середовище фільтрують та стерилізують. Склад посівного середовища № 1 (г/л): ферментаційний гідролізат харчових дріжджів 100 мг/мл NH2+; сахароза - 10,0; CH3COONa - 7,5; K2НРО4 - 3,0; MgSO4 - 0,5; рН середовища до стерилізування дорівнює 6,5-6,8, дистильована вода добавляється до 1 л. Склад посівного середовища № 2 (г/л): ферментаційний гідролізат соєвого шроту або муки - 1 л; NH2+ - 0,5 мг/мл; дріжджовий екстракт - 2,0; NaCl - 3,0; K2НРО4 - 2,2; KН2РО4 - 1,7; MgSO4 - 0,12, глюкоза - 5,0; рН дорівнює 6,7-6,8 (до стерилізації). Склад капустяного середовища - 200 г ретельно подрібненої білокачанної капусти кип'ятять про 92983 4 тягом 10 хв в 1 л водопровідної води, проціджують через подвійний шар марлі, фільтрують через складчастий фільтр, добавляють 2% глюкози та 1% пептону. Штам зберігається при 4°С на бульйоні, який містить 0,5% глюкози та 2% крейди. Пересівають культуру один раз на 1,5-2 місяці. Можливе довготривале зберігання (протягом 2 років і більше) у сублімованому стані в запаяних ампулах. Захисне середовище для ліофільного висушування: сахароза 10%, желатин 1%, рН 7,0±0,2. Фізіолого-біохімічні властивості. Штам росте при 38±1°С протягом 18-24 год на поживному середовищі MRS та капустяному середовищі. Зберігає життєздатність на середовищі з широким діапазоном рН - від 2,5 до 9,6. Оптимальним значенням рН для початку росту с 5,5-6,5. Виживає після прогрівання при 63°С протягом 30 хв. Росте при температурах 40, 45 та 50°С, але не росте при 15 та 20°С. Не утворює слизь при рості на середовищі з сахарозою; зберігає життєздатність на середовищах із жовчю. Глюкозу ферментує без утворення вуглекислого газу. У рідкому середовищі MRS з 2% глюкози накопичує 0,330% молочної та 0,053% оцтової кислоти, не утворює етанол. Ферментує вуглеводи: глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, сахарозу, фінозу. Слабко ферментує мальтозу, арабінозу. Не ферментує спирти та вуглеводи: целобіозу, глюконат, маніт, рамнозу, сорбіт, дульцит, ксилозу, інозит, інсулін, ескулін, сорбозу, амігдалін, метил-D-глюкозид, гліцерин, декстрин. Для свого росту потребує в амінокислотах та вітамінах, насамперед в рибофлавіні та біотині. Потребує іонів магнію та марганцю, які виконують роль активаторів бактеріальних протеїназ. Штам є непатогенним. Відношення до кисню: факультативний анаероб. Відношення до температури: оптимальна температура для росту 38,0±1,0°С. Штам довготривало зберігається (2 роки і більше) в сублімованому стані в запаяних ампулах. Захисне середовище під час ліофільного висушування: сахароза 10%/желатин 1%, рH 7,0±0,2. Імуномодулювальні властивості. Результати проведених нами досліджень показали, що введення мишам Lactobacillus delbrueckіi subsp. bulgctricus ІМВ B-7281 per os призводило до зміни активності клітин фагоцитарної системи. Після введення штаму підвищувалась здатність макрофагів перитонеальної порожнини до поглинання латексу. Показник фагоцитозу на 1, 6 та 12 добу підвищувався відповідно до 44,4±1,6; 46,4±2,1 та 45,8±1,8% проти 30,1±1,1% у контролі. Фагоцитарне число макрофагів на 3 добу зберігалось на рівні контролю, а 6 та 12 добу зростало суттєво - відповідно до 6,1±0,2 та 7,3±0,1 ум. од. порівняно з 4,4±0,2 ум. од. у контролі. Спостерігалась активація киснезалежної бактерицидної активності макрофагів, яку вивчали у тесті відновлення нітросинього тетразолію (НСТтест). На 1 добу встановлено підвищенням кількості НСТ-позитивних макрофагів у спонтанному та 5 92983 стимульованому НСТ-тесті відповідно до 59,8 і 1,9 та 68,0±1,2% (у контролі відповідно 42,0±4,3 та 59,7±1,5%). Виявлено тенденцію до підвищення показників спонтанного та стимульованого НСТтесту на 6 (49,6±2,2 та 60,3±2,5%) та 12 (44,3±2,7 та 55,0±2,4%) добу, однак різниця порівняно з контролем була невірогідною. Функціональний резерв макрофагів не змінювався порівняно з показниками контролю: на 1, 6 та 12 добу він дорівнював відповідно 8,2±0,5; 9,7±0,4 та 10,7±0,3% (у контролі 9,9±0,3%). Отримані дані свідчать, що запропонований штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ В-7281 підвищує функціональну активність клітин фагоцитарної системи. Антагоністична активність. Запропонований штам має антагоністичну активність відносно музейних та клінічних штамів деяких бактерій. Так, під його впливом спостерігається затримка росту музейних штамів: Staphylococcus aureus В-918, Staphylococcus aureus B-917, Staphylococcus aureus 209-P, Staphylococcus aureus 43, Staphylococcus aureus 8325, Staphylococcus aureus spp., Staphylococcus epidermidis B-919, Enterococcus faecalis B-915, Escherichia coli B-915, Klebsiella pneumonia B-920, Pseudomonas Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 6 aeruginosa B-900, Candida albicans Y-1918. Запропонований штам мав антагоністичну дію відносно таких клінічних штамів: Staphylococcus epidermidis 38 Staphylococcus epidermidis 14 Staphylococcus aureus Q394 Pseudomonas aeruginosa Q351 Escherichia coli 5921 Enterococcus faecalis 347 Klebsiella oxytoca Candida albicans 1763. Таким чином, запропонований штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ІМВ B-7281 може знайти використання у харчовій промисловості при створенні харчових продуктів з оздоровчими властивостями та в медицині при створенні лікувальних, лікувально-профілактичних та профілактичних медичних і ветеринарних засобів. Література 1. G. Perdtgon, Μ. Ε. de Macias, S. Alvarez, G. Oliver, A, A. de Ruiz Holgado Effect of perorally administered lactobaciІІi on macraphage activation in mice // Infect Immun. - 1986. - 53(2). - P. 404-410. 2. Popova P., Guencheva G., Davidkova G., Bogdanov Α., Pacelli E, Opalchenova G., Kutzarow Т., Koychev С. Stimulating effect of DEODAN (an oral preparation from Lactobacillus bulgaricus "LB51") on monocytes/macrophages and host resistance to experimental infections // Int. J. Immunopharmacol. 1993. - 15(1). - P. 25-37. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601