Спосіб очищення фактора vііі згортання крові

Спосіб очищення фактора VIII згортання крові, який відрізняється тим, що кріопреципітат додатково очищують з використанням афінної сорбції на макропористих кремнеземних сорбентах з лігандами - активними триазиновими барвниками, вибраними з групи Procion blue НВ, Активним яскравоголубим К, Активним червоним 4ЖТ та Procion blue MXR. UA (21) a200906990 (22) 03.07.2009 (24) 26.04.2011 (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) ШУРКО НАТАЛІЯ ОЛЕГІВНА, ДАНИШ ТАРАС ВАСИЛЬОВИЧ, НОВАК ВАСИЛЬ ЛЕОНІДОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПАТОЛОГІЇ КРОВІ ТА ТРАНСФУЗІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ", ШУРКО НАТАЛІЯ ОЛЕГІВНА, ДАНИШ ТАРАС ВАСИЛЬОВИЧ, НОВАК ВАСИЛЬ ЛЕОНІДОВИЧ (56) UA U 24182, 25.06.2007. Нестеренко В.Ф. , Андреева Ж.И. “Преимущества красителей в качестве лигандов для аффинной хроматографии и аналитический прибор для быстрого выбора таких сорбентов”, Материалы Третьей международной конференции из серии «Наука и бизнес», 19-21 июня 2006 г., Пущино. Знайдено в інтернет: [Знайдено 14.02.2011]. Даниш Т. та інш.: “Синтез кремнеземних сорбентів із лігандами – активними барвниками тріазинового ряду”, Вісник Львів. УН-ТУ, Серія біологічна. 2008. Вип. 47. С. 63-69. C2 2 (19) 1 3 Для виділення та очищення фактора згортання крові VIII як ліганди біоспецифічних сорбентів використовують іммобілізовані на органічних матрицях гепарин [2,3], декстран-сульфат [4,5], гістидин та пептиди RSRSFY [6]. Згідно наших досліджень, серед носіїв, що використовуються для хроматографічного виділення та очищення білкових препаратів, достатньо ефективними є макропористі кремнеземні матриці з регульованим розміром пор. Вони достатньо жорсткі, хімічно інертні, термостійкі, а хроматографічні сорбенти на їх основі легко регенеруються, витримують високу швидкість пропускання розчинів з достатньою специфічною ємкістю по відношенню до досліджуваних білків, не піддаються гідролізу мікроорганізмами [7-9]. Найближчим по сукупності ознак, подібних до сукупності суттєвих ознак даного винаходу є спосіб [10], який полягає в отриманні із крові донорів препарату кріопреципітату, як джерела фактора VIII. Для здійснення цього способу проводять декілька стадій виробництва: 1) одержання плазми крові донорів; 2) одержання кріопреципітату із плазми шляхом її заморожування-розморожування, відділення кріопреципітату центрифугуванням; розчинення осаду кріопреципітату у буферному розчині; 3) заморожування та сублімаційна сушка кріопреципітату; 4) отримання та контроль готової продукції. Недоліком даного способу є те, що до складу препарату кріопреципітату, крім самого фактора, входить також достатньо велика кількість домішкових білків: альбумін, фібриноген, імуноглобулін G, фактор XIII та інші білки з високою молекулярною масою (понад 100 кД). Наявність домішкових білків підвищує імуногенність даного препарату, внаслідок застосування якого у хворих на гемофілію А часто виникають значні негативні побічні реакції: виникнення інгібіторних форм гемофілії, розвиток імунореактивності та інше. Задачею даного винаходу є підвищення ступеня очищення препарату кріопреципітату шляхом додаткового застосування хроматографічного етапу. Поставлена задача досягається запропонованим способом одержання антигемофільного фактора, яка включає інкубацію розчину кріопреципітату з хроматографічним сорбентом. Дослідження показали, що фактор VIII практично не сорбувався жодним з синтезованих нами сорбентів. Зв'язувалися тільки домішкові білки, внаслідок чого питома активність фактора VIII в супернатанті зростала. Фактично шляхом одноетапної нетривалої процедури сорбції нам вдалося значно очистити фактор VIII від інших білків (як мінімум в 3,4 рази) (див. приклади 1-4). Відмінність запропонованого способу полягає у застосуванні методу негативної афінної сорбції на кремнеземних сорбентах з лігандами - активними барвниками триазинової групи. Використання даних хроматографічних сорбентів дозволяє підвищити ступінь очищення фактора VIII у 3-4 94299 4 рази (до 0,138 МО/мг білка), удосконалити технологію одержання препарату за рахунок проведення додаткового хроматографічного етапу. Синтез кремнеземних сорбентів з іммобілізованими барвниками здійснювали згідно роботи [11]. Кількісне визначення фактора VIII проводили за одностадійною уніфікованою методикою [12] та з використанням хромогенного субстрату S 2765 [13] (Набір реактивів фірми Chromogenix наданий Західно-Українським Біомедичним Центром). В представлених прикладах кількість білка наведена в мг, питома активність антигемофільного фактора виражена в міжнародних одиницях МО/мг білка. Приклад 1. До 2 мл сорбенту СилохромProcion blue HB, врівноваженого 0,05М Tris-HCl буферним розчином з рН 8,0, додавали 2 мл розчину препарату кріопреципітату на цьому ж буфері. Через певні проміжки часу в супернатанті визначали концентрацію білка та активність антигемофільного фактора. Дослідження показали, що фактор VIII практично не сорбувався. Зв'язувалися тільки домішкові білки, внаслідок чого питома активність фактора VIII в супернатанті через 3 год. інкубації зростала в 3,9 рази (від 0,035 МО/мг білка до 0,138 МО/мг білка, відповідно). Приклад 2. До 2 мл сорбенту СилохромАктивний яскраво-голубий К, врівноваженого 0,05М Tris-HCl буферним розчином з рН 8,0, додавали 2 мл розчину препарату кріопреципітату на цьому ж буфері. Через певні проміжки часу в супернатанті визначали концентрацію білка та активність антигемофільного фактора. Дослідження показали, що фактор VIII практично не зв'язувався цим сорбентом. Зв'язувалися тільки домішкові білки, внаслідок чого питома активність фактора VIII в супернатанті зростала в 3,9 рази. Приклад 3. До 2 мл сорбенту СилохромАктивний червоний 4ЖТ, врівноваженого 0,05М Tris-HCl буферним розчином з рН 8,0, додавали 2 мл розчину препарату кріопреципітату на цьому ж буфері. Через певні проміжки в супернатанті визначали концентрацію білка та активність антигемофільного фактора. Дослідження показали, що фактор VIII практично не сорбувався цим сорбентом. Зв'язувалися тільки домішкові білки, внаслідок чого питома активність фактора VIII в супернатанті зростала в 3,6 рази. Приклад 4. До 2 мл сорбенту СилохромProcion blue MXR, врівноваженого 0,05М Tris-HCl буферним розчином з рН 8,0, додавали 2 мл розчину препарату кріопреципітату на цьому ж буфері. Через певні проміжки часу в супернатанті визначали концентрацію білка та активність антигемофільного фактора. Дослідження показали, що фактор VIII практично не сорбувався цим сорбентом. Зв'язувалися тільки домішкові білки, внаслідок чого питома активність фактора VIII в супернатанті зростала в 3,4 рази. В таблиці представлені характеристики препарату кріопреципітату, одержаного пропонованими способами і способом-прототипом. 5 94299 6 Таблиця Показники в супернатанті через 10 хв. інкубації через 3 год інкубації питома активпитома активконцентр, білконцентр, білність фактора, ність фактора, ка, мг/мл ка, мг/мл МО/мг МО/мг приклад 1 (сорбент Силохром-Рrосіоn blue HB) приклад 2 (сорбент Силохром-Активний яскраво-голубий К) приклад 3 (сорбент Силохром-Активний червоний 4 ЖТ) приклад 4 (сорбент Силохром-Рrосіоn blu MXR) прототип (кріопреципітат) 24,0 0,040 6,5 0,138 23,3 0,030 7,0 0,137 20,0 0,037 8,0 0,125 17,5 0,046 8,5 0,118 26,0 0,035 26,0 0,035 З наведених даних видно, що ступінь очищення кріопреципітату, який характеризується підвищенням його питомої активності, вищий у пропонованих способах як мінімум в 3,4 рази. Таким чином, проведення додаткової процедури негативної афінної сорбції покращує аналітичні показники кінцевого продукту - діагностичного чи лікувального препарату фактора VIII. Джерела інформації: 1. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. Казань: Фен, 2000. - 364 с. 2. Pat. 6228613US. Stable factor VIII/von Willebrand factor complex/ B. Mitterer, A. Dorner, F., et al.//Appl. №.: 09/142.768 Filed: 6.11.1998; Publ. 08.05.2001. 3. Pat. 6831159US. Method for purifying factor VIII/vWF company by cation-exchange chromatography./M. Fischer, B. Schonberger, T. Urban et al.// Appl. № 09/367.459; Filed: 08.05.2000; Publ. 14.12.2004. 4. Pat. 6953837US. Factor VIII/vWF complexes and compositions/ M. Fischer, B. T. Urban, K. Dorner et al.//Appl. № 10/003.621; Filed: 02.11. 2001; Publ. 11.10.2005. 5. Pat. 7166709US. Haemostatically active preparation containing vWF and method for the production thereof. /J. Stadler, M. Gruber//Appl. № 10/257.375; Filed: April 04.04. 2001; Publ. 23.01.2007. 6. Pat. 5688912US. Peptide ligands which bind to von willebrand factor/ С Dadd, Baumbach G., Hammond D.//Appl. № 08/537.069; Filed 22.09.1995; Комп’ютерна верстка В. Мацело Publ. 18. 11.1997. 7. Биоспецифическая хроматография тромбина и урокиназы на кремнеземных сорбентах, модифицированных ингибиторами протеиназ./ Магеровский Ю.В., Монастирский В.А., Гайда А.В., Даниш Т.В./ В кн.: "Хроматография в биологии и медицине". М. - 1986. - С. 183-184. 8. Affinity chromatography of human thrombin on modified silica /Gaida A. V., Monastyrskii V. A., Magerovskii Yu.V. et al. //J. Chromatogr. - 1987. - V. 424, No. 2. - P. 385-391. 9. Патент України на корисну модель № 24182 від 25.06.2007 p., C12N9/96, А61К38/02. Спосіб виділення та очищення тромбіну./ Магеровський Ю. В., Брагінець О. Г., Шурко Н. О., та ін. //Бюл. № 9, 2007 р. 10. Лобунец К. А., Ларичева Н. И. Типовий регламент производства препарата «Криопреципитат сухой», 1992. 11. Синтез кремнеземних сорбентів із лігандами - активними барвниками тріазинового ряду / Т.В. Даниш, М.І. Вороняк, Н.А. Дульцева, Н.О. Шурко // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2008. - В.47. – С. 63-69. 12. Козлов А.А. Метод определения активности фактора VIII в плазме крови человека и в антигемофильных препаратах.// Весник службы крови. - 2006. - № 3. - С.35-40. 13. Rosen S. et al. Clinical application of a chromogenic substrate method for determination of factor VIII activity. //Thromb. Haemost - 1985. - V. 54. - P. 818-823. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601