Фрагмент днк, що включає ген, який кодує карміноміцин-4-0-метилтрансферазу, вектор, штам escherichia coli, штам streptomyces lividans, клітинний екстракт, пептид, що має карміноміцин-4-0-метилтрансферазну акти

1. Фрагмент ДНК, включающий ген, кодирующий карминомицин-4-0-метилтрансферазу и имеющий следующую нуклеотидную последовательность: (19) (21) 93004588 (22) 17.11.1992 (24) 16.07.2001 (31) 07/793.873; 07/959.941 (32) 18.11.1991; 09.10.1992 (33) US (86) PCT/US92/09580, 17.11.1992 (46) 16.07.2001, Бюл. № 6, 2001 р. (72) Хатчінсон Чарльз Річард, US, Маддурі Крішна Марті, IN, Торті Франческа, IT, Коломбо Анна Луїза, IT 39922 2 39922 2. Вектор, включающий регуляторную последовательность и фрагмент ДНК, охарактеризованный в п. 1. 3. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой плазмиду, выбранную из группы, состоящей из pWHM901, pWHM902 и pWHM903. 4. Штамм Escherichia coli, трансформированный вектором, охарактеризованным в п. 2 или 3, где указанный штамм является продуцентом даунорубицина. 5. Штамм Streptomyces lividans, трансформированный вектором, охарактеризованным в п. 2 или 3, где указанный штамм является продуцентом даунорубицина. 6. Клеточный экстракт, полученный из клеток, охарактеризованных в п. 4 или 5. 7. Пептид, обладающий карминомицин-4-0-метилтрансферазной активностью и включающий всю следующую аминокислотную последовательность или ее часть: 8. Способ продукции пептида, охарактеризованного в п. 7, отличающийся тем, что получают экспрессирующий вектор, включающий ген, кодирующий карминомицин-4-0-метилтрансферазу; подходящие клетки-хозяева трансформируют указанным экслрессирующим вектором; указанные клетки-хозяева культивируют в подходящей среде 3 39922 и стимулируют экспрессию полученного таким образом гена. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанные клетки-хозяева выбраны из группы, состоящей из Escherichia соli и Streptomyces lividans. 10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой плазмиду. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанная плазмида выбрана из группы, состоящей из pWHM901, pWHM902 и рWHM903. 12. Способ получения даунорубицина, отличающийся тем, что подходящие клетки-хозяева трансформируют экспрессирующим вектором, кодирующим карминомицин-4-0-метилтрансферазу; указанные клетки-хозяева культивируют в подходящей среде; стимулируют экспрессию указанного гена и выделяют даунорубицин. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой Strepto myces lividans. 14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой плазмиду. 15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанная плазмида выбрана из группы, состоящей из pWHM901, pWHM902 и рWHM903. 16. Способ преобразования карминомицина в даунорубицин, отличающийся тем, что используют препарат, содержащий полипептид, обладающий карминомицин-4-0-метилтрансферазной активностью, или трансформированную клеткухозяина, охарактеризованную в п. 4 или 5. 17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанный препарат состоит, по существу, из пептида, охарактеризованного в п. 7. 18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанный препарат состоит, по существу, из клеточного экстракта, охарактеризованного в п. 6. Настоящее изобретение относится к способу продуцирования антрациклинов, используемых при лечении рака, путем модификации биосинтеза даунорубицина в целях усиления продуцирования даунорубицина из карминомицина в стрептомицетах, не являющихся Streptomyces pencetins 29050, и в экстрактах бактерий. Антрациклины группы даунорубицинов, такие, как доксорубицин, карминомицин и аклациномицин, являются наиболее широко используемыми лекарственными средствами, применяемыми в противораковой терапии [F.Arcomone, Doxorubicin, Acodemic Press, New York, 1981, pp. 12-25; A.Grein, Process Biochem, 16:34 1981, T.Kaneko, Chimicoggy, May : 11 (1988)]. Улучшенные производные даунорубицина и доксорубицина были получены путем химического синтеза в целях усиления их противоопухолевой активности, особенно, при пероральном способе введения, а также в целях устранения острой токсичности и хронической кардиотоксичности, связанной с использованием этих лекарственных средств при лечении рака [Penco, Process Biochem 15:12 (1980) T.Kaneko, Chimicоggi May : 11 (1988)]. Примерами таких аналогов являются 4'-эпидоксорубицин (Epirubicinâ ) и 4-деметоксидаунорубицин (1 darubicinâ ). Указанные природные соединения продуцируются различными штаммами стрептомицетов (S.pencetius, S.coeruleorubidus, S.galilaeus, S.griseus, S.griseoruber, S.insignis, S.viridochomogenes, S.bifurcus u Streptomyces sp. штамм C5), а также Actinomyces carminata. Доксорубицин продуцируется только S.pencetius под видом saesius, а даунорубицин продуцируется как S.pencetius, так и другими штаммами стрептомицетов, указанными выше. Штаммы S.pencetius подвид caesius IM RU 3920 (этот штамм идентичен АТСС 27952, и далее он будет сокращенно обозначаться "S.pencetius 3920"), S.pencetius АТСС 29050 ("S.pencetius 29050") и S.pencetius подвид caesius АТСС 27952 ("S.pencetius 27952") являются известными и описаны в USA - 3 590 028. S.pencetius 29050 и 27952 были депонированы в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, МД, США, под номерами допуска ATCC 29050 и 27952. Антрациклин доксорубицин (2) продуцируется S.pencetius 27952 из малоновой кислоты, пропионовой кислоты и глюкозы в соответствии с путем метаболизма, показанным на Фиг. 1 (см. рисунки, прилагаемые в конце описания). Как видно из этой фиг., e-родомицинон (4), карминомицин (3) и даунорубицин (1) являются промежуточными соединениями в данном процессе метаболизма [Grein Ad vоn. Appl. Microbiol 32:203 (1987), Ескаrdt St. Wagner J. Basic Microbiol 28:137 (1988). Две стадии указанного пути метаболизма включают в себя 0-метилирование дискретных промежуточных соединений, а именно: превращение акланоновой кислоты в метилакланонат, и превращение карминомицина (3) в даунорубицин (1). Было показано, что бесклеточные экстракты S.pencetius 29050, S.insignis AТCC 31913, S.coeruleorubidus АTCC 31276, и Streptomyces sp. C5 катализуют последнюю из двух выше указанных стадий в присутствии S-аденозил-L-метионина [Connors и др., J. Gen. Microbiol 136:1895 (1990)], что позволяет предположить, что все указанные штаммы содержат специфическую карминомицин-4-0-метилтрансферазу (СОМТ-белок). Гены, кодирующие биосинтез даунорубицина и резистентность к даунорубицину, были получены из S.pencetius 29050 и S.pencetius 27952 путем экспериментального клонирования [Stutzman-Engwall u Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3135 (1988); Otten и др., J.Bacteriol 172-3427 (1990)]. Эти исследования показали, что при введении в Streptomyces lividans 1326, указанные клонированные гены приобретают способность к продуцированию e-родомицинона и резистентность к даунорубицину и доксорубицину для этого хозяина. В последующей работе проведены исследования с целью проверки, могут ли указанные клоны приобретать способность к превращению карминомицина в даунорубицин при введении их в S.lividans. В этой работе был выделен ДНК-сегмент в 1,6 тысяч оснований (кв), который вводит 4 39922 ген карминомицин-4-0-метилтрансферазы, сокращенно обозначаемый далее "dnrK". Настоящее изобретение относится к ДНК, расположение сайтов рестрикции которой показано на Фиг. 2 (см. приложение) или к фрагменту, происходящему от указанной ДНК и содержащему ген dnrK, кодирующий карминомицин-4-0-метилтрансферазу. Для удобства показанный на Фиг. 2. ДНК-сегмент далее будет именоваться "ДНКвставкой", а ДНК-последовательность указанного гена dnrK представлена на Фиг. 3 (см. приложение). Кроме того, настоящее изобретение относится: (1) к рекомбинантным векторам, которые обладают способностью к трансформации клеткихозяина, и содержат ДНК-вставку или происходящий от нее рестрикционный фрагмент, содержащий ген dnrK; (2) к рекомбинантным векторам, которые обладают способностью повышать число копий гена dnrK и количество его продукта в штамме Streptomyces sp.p., продуцирующем даунорубицин; (3) к рекомбинантным векторам, которые обладают способностью экспрессировать ген dnrK в Escherichia coli, в результате чего может быть продуцирован очищенный фермент карминомицин-4-0-метилтрансфереза; (4) к микробному источнику карминомицин-4-0метилтрансферазы для осуществления биоконверсии карминомицина в чистый даунорубицин. На фиг. 1 схематически проиллюстрирован биосинтетический путь метаболизма доксорубицина. На фиг. 2 проиллюстрирован рестрикционный анализ путем картирования первой ДНК настоящего изобретения. Эта ДНК представляет собой вставку в рекомбинатной плазмиде pwHM 902, сконструированной путем инсерции Sph1/Pvn11(1,6 кв) фрагмента ДНК, содержащего ген карминомицин-4-0-трансферазы (dnrK), который был получен из рекомбинатной плазмиды рwНМ 901 путем переваривания ферментами Sph1 и Pvn11, в Sph1/Smal сайты плазмиды pwHM3, представляющей собой Е.coli-Streptomyces - челночный вектор [Vara и др., J.Bacteriol 171:5872 (1989). Карта, показанная на фиг. 2, не должна рассматриваться как исчерпывающая иллюстрация всех рестрикционных сайтов, присутствующих в ДНК-сегменте. Однако сайты, показанные на фиг., являются достаточными для точного распознавания сегментов. На фиг. 3 схематически проиллюстрирована нуклеотидная последовательность ДНК-сегмента dnrK, кодирующего карминомицин-4-0-трансферазу. Этот сегмент соответствует области, расположенной между Sphl и Рvn11 - сайтами рестрикции плазмиды рwНМ 902, и представляет собой кодирующую нить в направлении 5'®3'. Выведенная аминокислотная последовательность транслированной открытой рамки считывания, кодирующей карминомицин-4-0-метилтрансферазу, показана после нуклеотидной последовательности гена dnrK (SEQ ID № 1, SEQ ID № 2). На фиг. 4 проиллюстрировано рестрикционное картирование второй ДНК настоящего изобретения. Эта ДНК представляет собой вставку в рекомбинатной плазмиде pwHM 903, сконструиро ванной путем инсерции Nde 1/EcoR1 -(1,4 кв) фрагмента ДНК, полученного из 5,8 кв -Spnl-фрагмента ДНК плазмиды pwHM 901 с помощью сайтнаправленного мутагенеза, в Nde 1 и EcoR1-сайты плазмидного вектора экспрессии рТ7-7 E.coli [Tabor u Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1074 (1986)]. Карта, показанная на фиг. 4, не должна рассматриваться как исчерпывающая информация относительно всех рестрикционных сайтов, присутствующи х в данном ДНК-сегменте. Однако показанные на этом рисунке сайты являются достаточными для однозначного распознавания сегментов. ДНК-вставки и рестрикционные фрагменты настоящего изобретения содержат ген (dnrK), кодирующий карминомицин-4-0-метилтрансферазу. Для данного экспрессируемого гена, ДНК может иметь свою собственную последовательность, регулир ующую транскрипцию, а, в частности, свой собственный промотор, который соответствующим образом соединен с данным геном, и который распознается РНК-полимеразой хозяйской клетки. Альтернативно, ДНК-вставка или рестрикционный фрагмент могут быть лигированы соответствующим образом с другой, регулирующей транскрипцию, последовательностью либо они могут быть клонированы в вектор в соответствующем рестрикционном сайте, надлежащим образом расположенном возле регулирующей транскрипцию последовательности в указанном векторе. ДНК-вставка или рестрикционный фрагмент, несущие ген карминомицин-4-0-метилтрансферазы, могут быть клонированы в вектор для клонирования рекомбинатных ДНК. Для этого может быть использован любой автономно реплицирущийся и/или интергирующий агент, содержащий ДНК-молекулу, к которой могут быть добавлены один или несколько дополнительных ДНК-сегментов. Однако обычно в качестве такого вектора используется плазмида. Предпочтительной плазмидой является многокопийная плазмида рwНМЗ или р1 J 702 [Katz и др., J. Gen. Microbiol 129/2703 (1983)]. Другими подходящими плазмидами являются p1J 385 [Mayeri и др., J. Bacteriol. 172:6061 (1990)]; p1J 680 [Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. A laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, ИК, 1985], pwНМ 601 [Guilfoilen Hutchinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8553 (991)] или pwPM 927 [SmoKina и др., Gene 94:52 (1990)]. Для введения ДНК-вставки или рестрикционного фрагмента в вектор может быть использована любая подходящая техника. Указанная инсерция может быть осуществлена путем лигирования ДНК в линеаризованный вектор в соответствующем сайте рестрикции. Для этих целей, может быть осуществлено прямое присоединение "липких" или "тупых" концов, присоединение гомополимера, либо могут быть использованы линкерная или адаптерная молекулы. Рекомбинантный вектор используется для трансформации соответствущей клетки-хозяина. Эти клетки-хозяева могут быть карминомицин- или даунорубицин-восприимчивыми, то есть они не могут расти в присутствии определенного количества карминомицина или даунорубицина, либо эти клетки могут быть карминимицин- или даунорубицин-резистентными. Таким хозяином может быть 5 39922 микроорганизм. Поэтому могут быть трансформированы штаммы S.pencetius, в частности, S.pencetius 29050, и другие штаммы видов Streptomyces, которые продуцируют, либо не продуцируют антрациклины. Трансформанты штаммов стрептомицетов обычно получают путём трансформации протопластов. Ген dnrK может быть также введен в другие векторы и экспрессирован в бактериях, не относящихся к стрептомицетам, например, в E.coli СОМТ-белок, полученный с помощью трансформированного хозяина, может быть иcпользован для биоконверсии карминомицина в даунорубицин. Этот способ дает возможность получать даунорубицин высокой чистоты из клеточного экстракта, продуцированного путем ферментации, и содержащего, помимо даунорубицина, нежелательный побочный продукт в виде карминомицина. Процесс биоконверсии может быть осуществлен либо путем непосредственного использования свободных или иммобилизованных трансформированных клеток, либо путем выделения СОМТбелка, который может быть использован в свободной форме, иммобилизован стандартными способами на полимере, стекле, целлюлозе или на аналогичных субстратах посредством ионной или ковалентной связи, или привит к волокнам, проницаемым для субстрата, либо он может быть иммобилизован посредством перекрестного сшивания. СОМТ-белок может быть также использован в неочищенном клеточном экстракте. Рекомбинантный вектор настоящего изобретения может быть также использован для трансформации соответствующей хозяйской клетки, которая продуцирует даунорубицин, в целях усиления биоконверсии карминомицина и минимизации количества нежелательного промежуточного соединения, присутствующего в конечном клеточном экстракте. Эти хозяйские клетки могут быть карминомицин-, даунорубицин- или доксорубицинрезистентными, т.е. они могут расти в присутствии любого количества карминомицина, даунорубицина или доксорубицина. Поэтому могут быть трансформированы штаммы S.pencetius, в частности, S.pencetius 29050, и другие штаммы стрептомицетов, продуцирующие антрациклины. Трансформанты штаммов стрептомицетов обычно получают путем трансформации протопластов. Даунорубицин может быть получен путём культивирования трансформированного штамма S.pencetius или други х видов Streptomyces, которые не содержат гена dnrK с последующим выделением продуцированного таким образом даунорубицина или родственных антрациклинов. ДНК-вставки получают из геномной ДНК S.pencetius 29050. Этот штамм был депонирован в Американской коллекции типовых культур [Роквилл, Мэриленд (МД) США] под номером допуска, АТСС 29050. Для этих целей может быть также использован штамм S.pencetius 27952, который происходит от S.pencetius 29050 и который также способен превращать карминомицин в даунорубицин. Следовательно, ДНК-вставки могут быть изготовлены путем: (а) получения библиотеки геномной ДНК штамма S.pencetius 29050 или происходящего от него штамма; (в) скрининга полученной библиотеки на наличие в ней клонов, способных превращать карминомицин в даунорубицин; (с) получения ДНК-вставки из рекомбинантного вектора, который является частью библиотеки и который дал положительный результат при скрининге на способность к превращению кардиномицина в даунорубицин; и (d) необязательного получения из указанной ДНК-вставки рестрикционного фрагмента, содержащего ген, который кодирует карминомицин-4-0метилтрансферазу. Указанная в стадии (а) библиотека может быть получена путем частичного переваривания геномной ДНК штамма S.pencetius 29050 или происходящего от него штамма. Для этого предпочтительно использовать рестриктирующий фермент Mb01. Полученные таким образом ДНК-фрагменты могут быть подвергнуты фракционированию по размерам, причем, предпочтительными являются размеры от 3 до 5 кв. Эти фрагменты лигируют в линеаризованный вектор, такой, как pwНМЗ или P1 J 702. Хозяйские клетки трансформируют лигирующей смесью. Обычно хозяйские клетки могут не продуцировать карминомицин или даунорубицин и могут быть карминомицин- или даунорубицин-восприимчивыми, например, они могут быть восприимчивыми к 10 микрограммам или менее карминомицина или дауномицина на мл. Например, могут быть трансформированы протопласты штамма S.lividans Jl b23 (Hopwood и др., Genetic Manipn. lation of Streptomyces. A. Laboratory Manual, John Jones Foundation, Norwich, ИК, 1985). В стадии (в) полученные трансформанты скринируют на способность поглощать карминомицин, превращать его в даунорубицин, и экскретировать этот да унорубицин. Клоны, способные превращать карминомицин в даунорубицин, идентифицируют с помощью хроматографического анализа экстрактов культуральной среды, содержащей карминомицин, проводимого в целях обнаружения даунорубицина в указанных экстрактах. Эти клоны выделяют, а содержащиеся в них рекомбинантные векторы экстрагируют. После переваривания рекомбинантных векторов соответствующими рестриктирующими ферментами в стадии (с), ДНК S.pencetius 29050, инсертированная в каждый с вектор, может быть идентифицирована с определением ее размера, и картирована. Таким образом, может быть установлено, что данный вектор содержит ДНК-вставку настоящего изобретения. Кроме того, могут быть выделены две или несколько перекрывающихся вставок, которые полностью или частично включены в ДНК настоящего изобретения. Эти вставки могут быть объединены вместе путем расщепления в их общем рестрикционном сайте с последующим лигированием в целях получения ДНК настоящего изобретения, которую, если это необходимо, урезают по длине соотвествующими рестриктирующими ферментами. Рестрикционные фрагменты ДНК-вставки, которые содержат ген, кодирующий СОМТ-белок, могут быть получены в стадии (d) также путем расщепления ДНК-вставки соответствующим рестриктирующим ферментом. ДНК настоящего изобретения может быть мутирована с использованием методов, не влияю 6 39922 щи х на ее способность сообщать признак, ответственный за превращение карминомицина в даунорубицин. Это может быть достигнуто, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза. Мутированная таким образом ДНК является частью настоящего изобретения. ДНК настоящего изобретения может быть также введена в векторы, подходящие для экспрессии гена dnrK в хозяине, не относящемся к стрептомицетам, например, в Е.соIi. Представленные ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Материалы и методы: Бактериальные штаммы и плазмиды: Штамм Е.coli ДН5, который является восприимчивым к ампициллину и апрамицину, был использован для субклонирования ДНК-фрагментов, а штамм Е.coli К38 (Russel & Modet, T.Bacteriol 159. 1034 (1984)) был использован для экспрессии гена dnrK S.pencetius. Для получения однонитиевой ДНК для секвенирования dnrK-гена был использован штамм Е.coli JM 105. Среды и буферы: Е.coli ДН 5a выдерживали нa LB-агаре (Sambrook и др., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Horbor, NY, 1989). При селекции на присутствие трансформантов добавляли ампициллин или апрамицин в концентрациях 50 мкг/мл и 100 мкг/мл, соответственно. E.coli JM 105 выдерживали на агаровой минимальной среде М9 (Sambrook и др., Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2-ое изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989), а колонии переносили на LВ-среду и в течение ночи культивировали при 37° С в целях получения бактерий, используемых для продуцирования однонитевой ДНК. Н-агар (Sambrook и др., Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2-ое изд. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) использовали для культивирования Е.coli ДН52 трансформированных репликативной формой ДНК M3 [(Yansch-Perron и др., Gene 33:103 (1985)]. S.lividans выдерживали на агаре R 2YE (Hopwood и др., Genetic Manupulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Iones Foundation, Norwich, ИК, 1985) для получения спор, а также для регенерации протопластов. Субклонирование ДНК-фрагментов: ДНКобразцы переваривали соответcтвующими рестриктирующими ферментами и подвергали разделению на агарозном геле стандартными методами (Sambrook и др., Molecular Cloning. A. Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Агарозные срезы, содержащие нужные ДНК-фрагменты, вырезали из геля и из этих срезов, используя устройство Geneclean (Bio101, La Tolla, CA), выделяли ДНК. С помощью традиционной техники (Sambrook и др., Molecnlar Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring, Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). выделенные ДНК-фрагменты субклонировали в Е.coli и Е.coli/Streptomyces - челночные векторы для экспериментальной биотрансформации и экспрессии, соответственно, и в векторы MIЗ [(Yansch-Perron и др., Gene 33:103 (1985)] для секвенирования. Секвенирование ДНК. После субклонирования нужных ДНК-фрагментов в вектор МДЗ, получали однонитевую ДНК с использованием стандартной техники (Sambrook и др., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и использовали при секвенировании. Данные о ДНК-последовательности были получены с использованием набора для секвенирования с секвеназой версии 2.0 (US Biochemicals, Claveland, ОН) в соответствии с инструкцией изготовителей. Во избежание компрессии вместо dGТР использовали 7-Deaza dGТР. Сначала для получения последовательности первых 200-250 оснований использовали универсальный праймер вектора MIЗ, а затем из этой последовательности, используя ДНК-синтезатор Applied Вiosystems 391, в соответствии c инстр укцией изготовителей, синтезировали 17-мерный олигонуклеотид, который использовали в качестве праймера для дальнейшего секвенирования ДНК до тех пор, пока не будут получены данные о полной ДНК-последовательности. Трансформация видов Streptomyces и E.coli. Компетентные клетки E.coli получали методом с использованием хлорида кальция (Sambrook и др., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Hаrbor, NY, 1989) и трансформировали стандартными способами (Sambrook и др., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Мицелий S.lividans ТК 24 культивировали в среде YЕМЕ (Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. John Iones Foundation, Norwich, ИК, 1985) и через 48 часов собирали. Мицелярные пеллеты дважды промывали 10,3 % раствором сахарозы и использовали для получения протопластов способом, oписанным в руководстве Hopwood (Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. John Jones Foundation, Norwich, ИК, 1985). Пеллеты протопластов суспендировали, примерно, в 300 микролитрах Рбуфера (Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. John Jones Foundation, Norwich, ИК, 1985), и 50микролитровую аликвоту этой суспензии использовали для каждой трансформации. Протопласты трансформировали с помощью плазмидной ДНК в соответствии с методом мелкомасштабной трансформации Hopwood и др. (Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. John Jones Foundation, Norwich, ИК, 1985). После 17-часовой регенерации на среде R 2YE при 30° C чашки покрывали 50 мкг/мл тиострептона и культивировали при 30° С до тех пор, пока не будут образовываться споры. Биоконверсия карминомицина в даунорубицин: Трансформанты S.lividans, включающие в себя различные плазмиды, были инокулированы в жидкую среду R 2 YE (Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Jones Foundation, Norwich, ИК, 1985), содержащую 5 мкг/мл тиострептона. После 2-х дневного культивирования при 30° С 2,5 мл этой культуры переносили в 25 мл среды Stroh1 [(DeKleva и др., CanT, Microbiol. 31:287 (1985)], содержащей 7 39922 20 мкг/мл тиострептона. Культуры выращивали в колбе Эрленмейера с перегородкой на роторном шейкере при 300 об/мин при 30° С в течение 72 часов, после чего к культурам добавляли карминомицин (в виде водного раствора при концентрации 10 млг/мл) до получения конечной концентрации 5 мкг/мл. После дополнительного 24-часового инкубирования на шейкере, культуры инкубировали в водяной бане при 60° С в течение 45 минут после добавления 150 млг/мл щавелевой кислоты для гидролиза гликозидных форм антрациклиновых метаболитов. Эти метаболиты экстрагировали из культур с использованием 15 мл хлороформа после того, как рН культур доводили до 8,4-78,6. Затем раствор хлороформа фильтровали через 0,45 мкм - Acrodisc CR-фильтр (Gelman Sciences, Ann Arbor, M 1) и 100 мкл этого фильтрата анализировали с помощью ВЭЖХ на кассете (8 мм х х 10 см) с Water Nova-Pak C 18 (подвижная фаза : метанол: вода, 85:15, доведенная до рН 2,5 путем добавления фосфорной кислоты, скорость потока 3 мл/мин). Выход колонки контролировали с помощью системы подачи, содержащей водный растворитель Water 6000 УФ-детектора 441, работающего при 254 нм, и модуля обработки данных 740. Для определения количества указанных метаболитов, выделенных из культур, в качестве внешних стандартов использовали карминомицин и даунорубицин (10 мкг/мл в метаноле). Пример 1. Клонирование гена dnrK, кодирующего карминомицин-4-0-метилтрансферазу. Несколько космидных клонов, описанных Stutzman-Engwall и Hutchinson [(Proc.Natl.Acad. USA 86:3135 (1989)] и представляющих собой геномную ДНК S.pencetius 29050 (приблизительно, 96 кВ), трансформировали в S.liwidans ТК24, и полученные трансформанты анализировали на биоконверсию карминомицина в даунорубицин в соответствии с методом, описанным в главе "Материалы и методы" настоящей заявки. Космидный клон pwНМ 339 [Otten и др., J. Bacteriol 172 : 3427 (1990)] осуществлял биоконверсию 22% добавленного карминомицина в даунорубицин. Eco R1фрагмент (11,2 кв) из вставки в рwНМ339 субклонировали в космидный вектор рКС 505 [Richardson и др, Gene 61:231 (1987)], в результате чего получали плазмиду pwHM 534 S.liwidans ТК 24, трансформированный с использованием плаpмиды pwHM 534, обнаруживал 25-60 % биоконверсию добавленного карминомицина в даунорубицин. Sph1-фрагмент (5,8 кВ) из pwHM 534 субклонировали Sph1-сайте высококопийной плазмиды pwНM3, и получали плазмиду pwHM901, S.liwiXba1 Bam H1 dans, трансформированный c помощью плазмиды pwHM901, обнаруживал 50-85%-ную биоконверсию карминомицина в даунорубицин. Sph1/Pvn 11фрагмент (1,6 кв) клонировали из pwHM 901 сначала в Sph1/Smal 1-сайты pUC 19 (Yansch- Perron и др. Gene 33:103 (1985)], а затем этот 1,6 - кв ДНК-фрагмент субклонировали из последней плазмиды в виде Hind 111/Eco R1-фрагмента в Нind 111/Eco R1-сайты pwНМЗ, в результате чего получали плазмиду рwНМ 902 (фиг. 2). S.lewidans, трансформированный с помощью рwНМ902, обнаруживал 100%-ную биоконверсию добавленного в культуру карминомицина в даунорубицин. Область ДНК-последовательности, содержащая ген dnrK. Секвенирование 2,5 кв - ДНК-сегмента из 5,8 – кв - Sph1-фрагмента в pwHM 901 осуществляли путем субклонирования 0,4 кв - Sph1/Xho1, 0,7 кв Xho1/Sst1, 0,6 кв×Sst1/Sall 0,8 кв Sall/Xho1фрагментов из pwHM 902 в М 1З mр 18 и mp 19векторы [Yanich Perron и др., Gene 33:103 (1985)] с получением обеих ориентаций каждого ДНК-сегмента. ДНК-секвенирование полученных четырех клонов осуществляли как описано в главе "Материалы и методы" настоящей заявки. Полученная ДНК-последовательность 1,6 кв - фрагмента ДНК, содержащего dnrK-ген, и аминокислотная последовательность СОМТ-белка, выведенная путем анализа ДНК-последовательности, с использованием программы Codon Prefepence, описанной Derevens и др. [Nucl. Acids. Res. 12:387 (1984)], показаны на фиг. 3. Открытая рамка считывания dnrK, идентифицированная с помощью анализов Codon Preference и Tpanslate (Derevanx и др., Nucl. Acids-Res.12:387 (1984)] кодирует СОМР-белок. Пример 2. Конструирование вектора экспрессии гена dnrK в Е.coli Sph1/Pvn11 - фрагмент ДНК, составляющий приблизительно 1,6 кв и содержащий полную открытую рамку считывания dnrK вместе с одной фланкирующей последовательностью (фиг. 3), субклонировали в Sph11 - и Sma1 - переваренную pUC 19, С [Yansch-Perron и др., Gene 33:103 (1985)], в результате чего получали плазмиду pwHM904 (на рисунке не показана). Затем, используя ДНК-синтезатор (АррIied Biosystems 391), в сooтвeтcтвии с инстр укциями изготовителей синтезировали два олигодезоксинуклеотидных праймера, соответствующи х последовательностям на обеих сторонах амплифицированного фрагмента, содержащего ген dnrK и представляющих собой: rbs Nde1 5' GGG TCTACA GGATCC AGGAG CAG CATATG ACC GCT CAA CCG ACC GTC GCG GCC CGG CCG CCG CAC AT – 3' : Праймер № 1 (SEQ IД № 3) Sph1 Pst1 3' – AC CGC TAG CCT CAC GAG CTC CTC CGTACG GACCGC CCC – 5' Праймер № 2 (SEQ IД № 4) 3-е положение второго, третьего и шестого кодонов (показанных буквами жирным шрифтом) гена dnrK изменяли с использованием примера № 1 для восстановления наиболее часто используемо го кодона в высокоэкспрессируемых генах Е.coli, что способствуе т усилению экспрессии гена dnrK в Е.coli 8 39922 ATG ACC GCT GAA CCG ACC GTC GCG CCC CGC CCG CAG CAGA: мутированная последовательность (SEQ ID № ) ATG ACA GCC GAA CCG ACG GTC GCG GCC CGG CCG CAG CAGA: последовательность дикого типа (SEQ IД № ) Эти праймеры использовали для амплификации dnrK последовательности pwHM 904 от нуклеотида 205 (начало отк. рамки счит. dnrK до нуклеотида 445) (фиг. 3) с помощью стандартных методов, использующи х полимеразно-цепную реакцию с ДНК Streptomyces (см., например, Guilfoile и Hutchinson, J. Bacteriol 174:3659 (1992) из амплифицированного продукта вырезали Nde1/Nco1фрагмент (88 п.о.) и лигировали с Nco1/EcoR1фрагментом (1,3 кв), полученным из pwHM 902, содержащим оставшийся ген dnrK (Фиг. 2 и 3), и cNde 1/Eco R1-переваренным вектором р Т7-7 [Tabor и Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985)], в результате чего происходило слияние открытой рамки считывания гена dnrK с промотором гена 10 Т7 указанного вектора экспрессии Е.coli. Компетентные клетки ДН5a Е.coli трансформировали лигированной ДНК, и полученные трансформанты скринировали на рТ7-7 dnrK. Сконструированную в результате плазмиду обозначали pwHM 903 (фіг. 4). Экспрессия гена dnrK в Е. coli Компетентные клетки Е.coli, содержащие плазмиду рGP1-2 [Tahor и Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA] подвергали селекции на LВ-агаре (Sambrook и др., Molecnlar Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Hаrbor, NY, 1989), содержащем ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл), после их культивирования при 30° С. Процедура получения компетентных клеток Е.coli, содержащих рGРI-2, в основном, такая же как и для любого другого штамма Е.coli, за исключением того, что культуры клеток выдерживают при 30° С, а не при 37° С. Компетентные клетки, Е.coli, содержащие рGР1-2, получали из клеток, культивированных при 30° С до ОП 550 = 0,5-0,6 в LВ-среде, содержащей канамицин. Во избежание чрезмерной экспрессии РНКполимеразы Т7, что может привести к получению мутированной плазмиды, очень важно при обычном хранении и при предварительном культивировании штаммов, содержащих рGР1-2, поддерживать температуру 30° С. Один трансформант, содержащий pGP1-2 и pwHM 903 инокулировали в 25 мл 2 х YТ-среды (Sambrook и др., Molecnlar Cloning. A Laboratory Manual, 2-ое изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Hаrbor, NY, 1989), содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30° С в течение ночи, энергично размешивая при этом. На следующее утро культуры подвергали резкому нагреванию при 42° С в течение 30 минут в водяной бане-шейкере, а затем снова переносили в условия температуры 30° С. После последующей 90-минутной инкубации, 1 мл культуры центрифугировали 1 минуту в микроцентрифуге при 14000 об/мин, супернатант отбрасывали, а клеточный дебрис ресуспендировали в 100 мкл буфера Лэммли (Laemmli, Nature (Лондон), 227:680 (1970) и кипятили в течение 5 минут. Белки, содержащиеся в прокипяченом образце, анализировали в 10% ДСН-полиакриламидном геле, используя стандартную технику [La emmli, Nature (Лондон), 227:680 (1970)], путем сравнения c белками, полученными клеточного экстракта Е.coli, трансформированной с помощью вектора рТ7-7, не содержащего ген dnrK СОМТ-белок мигрирует при М 38700. Пример 3. Превращение карминомицина в даунорубицин клетками, содержащими СОМТ-белок Один трансформант Е.coli, содержащий рGР12 и pwMH 903, инокулировали в 25 мл 2 х УТсреды, содержащей 100 мкг/мл и 50 мкг/мл канамицина, и культивировали при 30° С в течение ночи, энергично размешивая при этом. На следующее утро, культуры подвергали резкому нагреванию при 42° С в течение 30 минут в водяной банешейкере, а затем, после добавления 5 мкг/мл карминомицина, снова переносили в условия 30° С. После этого культуры культивировали еще 90 минут, затем антрациклиновые метаболиты выделяли стандартными методами, и анализировали с помощью ВЭЖХ. Сравнение соответствующи х областей пиков сигналов для карминомицина и даунорубицина на ВЭЖХ-хроматограмме показало, что 75-80 % карминомицина, добавленного в культуральную среду, превратилось в даунорубицин. (2) Данные для последовательности SEQ ID № 1. (1) Характеристики последовательности: (А) Длина: 1632 пар оснований; (В) Тип: нуклеиновая кислота; (С) Цепочечность: двухцепочечная; (D) Топология: линейная. (11) Тип молекулы: ДНК (геномная). (1X) Отличительные особенности: (А) Название/Ключ: CDS; (В) Локализация: 204..1271 (Х1) Описание последовательности SEQ ID №1 9 39922 10 39922 11 39922 №2 (2) Данные для последовательности SE0 1D (D) Топология: линейная (11) Тип молекулы: белок (X1) Описание последовательности SEQ 1D № 2 (1) Характеристики последовательности: (А) Длина: 356 аминокислот (В) Тип: аминокислотная 12 39922 (2) Данные для последовательности SEQ 1D №З (1) Характеристики последовательности: (A) Длина: 67 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (С) Цепочечность: одноцепочечная (D) Топология: линейная (11) Тип молекулы: ДНК (X1) Описание последовательности SEQ 1D №З (2) Данные для последовательности SEQ 1D (1) Характеристики последовательности: (A) Длина: 38 пар оснований №4 13 39922 (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (D) Топология: линейная (11) Тип молекулы: ДHК (X1) Описание последовательности SEQ 1D №4 (2) Данные для последовательности SEQ 1D №5 (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Цепочечность: одноцепочечная (D) Топология: линейная (11) Тип молекулы: ДНК (1) Характеристики последовательности: (А) Длина: 40 пар оснований (2) Данные для последовательности SEQ 1D (С) Цепочечность: одноцепочечная (D) Топология: линейная (11) Тип молекулы: ДHК (X1) Описание последовательности SEQ 1D №6 (1) Характеристики последовательности: (A) Длина: 40 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота №6 Фиг. 1 14 39922 Фиг. 2 15 39922 Нуклеотидная последовательность гена карминомицин-4-О-метилтрансферазы (dnrK). Предполагаемые сайты инициации и терминации трансляции гена dnrK подчеркнуты у н уклеотидов 205 и 1273, соответственно. Аминокислотная по следовательность, выведенная исходя из трансляции открытой рамки считывания гена dnK показана ниже ДНК-последовательности (SEQ 1D № 1) Фиг. 3 16 39922 Фиг. 3 (продолжение) 17 39922 Фиг. 3 (продолжение) 18 39922 Фиг. 3 (продолжение) 19 39922 Фиг. 4 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 20