Saf-поліпептид, фрагмент днк, що кодує saf-поліпептид, рекомбінантна плазмідна днк для експресії safполіпептиду (варіанти), штам грибів streptomyces lividans, спосіб експресії saf-поліпептиду

Изобретение относится к области биотехнологии. Точнее, оно относится к новым полипептидам, повышающим производство внеклеточных энизмов, ДНК, которая кодирует эти полипептиды, рекомбинантным плазмидным ДНК, штамму, трансформированными этим рекомбинантным вектором, который включает эту ДНК, кодирующую этот полипептид. Кроме того, изобретение направлено на последовательность промотора гена, кодирующего этот новый полипептид. Настоящее изобретение далее касается экспрессионной системы Streptomyces и способов экспрессии чужеродных последовательностей ДНК в Streptomyce и для секретирования в окружающую среду полипептидов и белков, кодированных посредством этой чужеродной последовательности ДНК. Виды Streptomyces являются хорошо известными продуцентами разнообразных внеклеточных энзимов, включая протеазы, фосфатазы, ксиланазы, целлюлазы, амилазы, липазы и нуклеазы. В дополнение к этому, члены рода Streptomyces продуцируют большое количество антибиотиков, пигментов и других вторичных метаболитов, и имеют свойства, требующие сложной методики дифференциации, приводящей к образованию спор. В экспериментальных сериях культур Streptomyces обычно присутствует совпадение в производстве внеклеточных энзимов, активизации продуцирования антибиотиков, биосинтезе пигмента и споруляции. Все эти процессы подавляются условиями питания, благоприятствующим скорости роста и активируются ограничением источников фосфора, или углерода, или азота. Вероятно, что секреция энзимов, образование вторичных, метаболитов и дифференциация полностью независимы, но отвечают на сходные спусковые механизмы. Ранее клонировали некоторые гены Streptomvces, кодирующие внеклеточные энзимы. Эти энзимы включают агаразу от Streptomyces coelicolor. эндогликозидазу И от Streptomyces plicatus. ксиланазу от Streptomyces Lividans. альфа-амилазу от Streptomyces hydroscopicuS. целлулазу от штамма SpA2 Streptomyces, бета-галактозудазу от Strep. Lividans и бета-лактамазы от Strep. cacaoi badius и fradiai. Однако, регуляторные механизмы, которые управляют экспрессией этих генов, все еще остаются неизвестными. В дополнение к специфическим регуляторным механизмом, таким как индукция амилазы декстринами или мальториозой и углеродно-метаболитное регулирование амилазы или агаразы, вероятно, происходит снятие подавления образования нескольких внеклеточных энзимов, поскольку после снижения питания у Streptomyces наблюдалось одновременное продуцирование нескольких энзимов, разлагающих полимерные субстраты. Такие трансактивирующие регуляторные гены были обнаружены у Bacillus subtilis (J. Bacteriol. 169: 324-333, 1987), Bacillus natto (J. Bacteriol. 166: 20-28, 1986), и Bacillus Licheniformis. Позитивные регуляторные гены, воздействующие на синтез энзимов и/или секрецию могли клонироваться при поиске повышенной секреции внеклеточных энзимов у слабо секретирующих штаммов, как S. Lividans. Системы для экспрессии чужеродных последовательностей ДНК в Streptomyces ранее были описаны в, например, ЕР 148552 и WO-88/07079. Эти системы используют эндогенные промоторы внеклеточных энзимов, продуцируемых Streptomyces. Основным объектом изобретения является клонирование и характеризование вновь выделенного гена, в дальнейшем упоминаемого как saf-ген, (т. е. фактор активирования вторичного метаболизма), кодирующего новый аминокислотный полипептид) далее - "SAF-полипептид"). Этот SAF-полипептид непосредственно или косвенно изменяет экспрессию генов внеклеточных энзимов у Streptomyces путем взаимодействия с управляющей областью структурного гена для внеклеточных энзимов. SAF-полипептид имеет молекулярную массы около 15000 D, и следующую последовательность аминокислот, установленную на основании последовательности нуклеотидов кодирующего фрагмента ДНК: Met Cys Ser Ala Val Val Ala Ala Ala Val Ser Ser Met Ser Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ser Ala Thr Arg Arg Ser Ala Ala Val Ser Pro Pro His Thr Pro Tyr Gly Ser Gly Cys lie Ser Ala Cys Ser Trp His Ser Thr lie Thr Gly His Arg Ala Gin Thr Arg Leu Ala Ala Ser Ser Arg Ala Ser Arg Ala Ala Val Gly Ser Phe Asp Gly Ala Lys Asn Arg Pro Ala Ser Ser Arg Arg Gin Ala Ala Ser Glu Cys Gin Gly Pro Ala Ser Ser Ser Arg Ala Gly Val Arg Trp Ala Gly Thr Ala Ala Asn Gly Arg Gly ter Другим аспектом изобретения является фрагмент ДНК, включающий нуклеотидные последовательности, которые при экспрессии кодируют вышеописанный SAF-полипептид. Фрагмент ДНК, получен путем молекулярного клонирования из Streptomyces griseus ATCC 10137, кодирующего SAFполипептид и иметь следующую последовательность нуклеотидов: ATG TGC TCG GCC GTC GTC GCG GCG GCC GTG AGC TCG ATG TCC CGC CGT CGC CGC CGG GCC AGC GCC ACC CGG CGC TCC GCT GCG GTG AGC CCG ССС САС ACT CCG TAC CGC TCG GGC TGT ACT AGC GCG TGC TCC TGG САС TCC ACC АТС ACC GGA САС CGG GCA CAG ACC CGC TTG GCC GCC TCC TCG CGG GCC AGC CGG GCG GCG GTC GGC TCC TTC GAC GGG GCG AAG AAC AGG CCG GCC TCG TCG CGG CGG CAG GCC GCA TCG GAA TGC CAG GGG CCC GCG TCG TCC TCC CGT GCG GGG GTC CGC TGG GCC GGA ACG GCG GCG AAC GGC AGA GGC TGA. Третьим аспектом изобретения являются рекомбинатная плазмидная ДНК pULADS для экспрессии SAF-полипептида, содержащая следующие конструктивные элементы: -последовательность ДНК из Streptomyces griseus ATCC 10137 размером 1 кб, включающую кодирующий SAF-полипептид фрагмент ДНК и промотор гена SAF следующей структуры: AGATCTCCTCGTCCCACCGGCTGTCGAAGCTCCGCGCCTACAGCGCCATCGACTTCGACCGGGCGAAATA GGAAGCGGCCGGCGACAAAACGGGGAGGGGCGGGAAACGGTGGTCCGTTTCCCGCCCCTGCCCGTAGGC CGTGCGCGTCCCGCCGGTGCGCGGCGTTCAGCCCGCCGCCGCT -фрагмент ДНК плазмиды pIJ 702, включающий ген резистентности к тиострептону и ген Меl, кодирующий тирозиназу. Четвертым аспектом изобретения является рекомбинатная плазмидная ДНК для экспрессии SAFполипептида, содержащая следующие конструктивные элементы: -последовательность ДНК из Streptomyces griseus ATCC 10137, включающую кодирующий SAFполипептид фрагмент ДНК и промотор гена SAF следующей структуры: AGATCTCCTCGTCCCACCGGCTGTCGAAGCTCCGCGCCTACAGCGCCATCGACTTCGACCGGGCGAAATA GGAAGCGGCCGGCGACAAAACGGGGAGGGGCGGGAAACGGTGGTCCGTTTCCCGCCCCTGCCCGTAGGC CGTGCGCGTCCCGCCGGTGCGCGGCGTTCAGCCCGCCGCCGCT -фрагмент ДНК плазмиды pIJ 699, включающий гены резистентности к тиострептону, биомицину и канамицину. Пятым аспектом изобретения является рекомбинатная плазмидная ДНК pULAD300 для экспрессии SAF-полипептида, содержащая следующие конструктивные элементы: -последовательность ДНК из Streptomyces griseus ATCC 10137 размером 1 кб, включающую кодирующий SAF-полипептид фрагмент ДНК и промотор гена SAF следующей структуры: AGATCTCCTCGTCCCACCGGCTGTCGAAGCTCCGCGCCTACAGCGCCATCGACTTCG ACCGGGCGAAATAGGAA GCGGCCGGCGACAAAACGGGGAGGGGCGGGAAACGGTGGTCCGTTTCCCGCCCCTGCCCGTAGGCCGTGCGCGTCCCGCCGGTG CGCGGCGTTCAGC CCGCCGCCGCT -фрагмент ДНК плазмиды pUC 19, включающий промотор гена lac Z. Шестым аспектом изобретения является штамм грибов Streptomyces Lividans, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК pULAD3. Седьмым аспектом изобретения является способ экспрессии SAF-полипептида, заключающийся в том, что клетки микроорганизма трансформируют фрагментом ДНК, кодирующим SAF-полипептид, культивируют трансформированные клетки в подходящей питательной среде и выявляют экспрессию SAFполипептида. Эти и другие объекты изобретения описаны более подробно в следующем ниже описании. Фрагмент ДНК от штампа АТСС 10137 Streptomyces griseus. кодирующий ген saf (фактор активации вторичного метаболизма), который включен в обычный механизм управления по меньшей мере пятью энзимами, выделяемыми клетками вида S. Lividans и S. coelicolor. Этот saf-ген присутствует у всех испытывавшихся Streptomyces, что позволяет предположить важную роль, которую этот ген играет в метаболизме. Действительно, фрагмент ДНК, содержащий ген, подобный гену за, клонировался заявителем из Streptomyces griseus IMR 3570, штамма, продуцирующего кандицидин. У некоторых Streptomyces. например, S. Lividans и S. Lactamdurans модель гибридизации предполагает, что за-ген присутствует в хромосомной ДНК в нескольких копиях. Ниже следует первый пример гена, вовлеченного в продуцирование внеклеточных энзимов и споруляции у Streptomyces. Ген saf кодирует полипептид из 113 аминокислот (SAF-полипептид); исследование транскрипциитрансляции ин витро у Е. coli показало, что образуется белок правильного размера, около 15000 дальтон, SAF-полипептид имеет сильный положительный заряд (18 положительно заряженных аминокислот) и не демонстрирует состава, характерного для лидерного пептида или трансмембранного белка и поэтому представляется маловероятным непосредственное действие на экспрессию протеина. Положительно заряженный белок может легко взаимодействовать с ДНК, действительно, в SAF-полипептиде наблюдается ДНК-связывающая область, типичная для нескольких регуляторных протеинов (Ann. Rew. Biochem. 53:293-321, 1984). Неожиданно было обнаружено, что saf-промотор более эффективен, чем природный промотор внеклеточных энзимов. Например, ген амилазы выдает больше амилазы, когда safпромотор заменяет природный амилазный промотор. Таким образом, saf-промотор может быть использован для повышения экспрессии любого эндогенного полипептида или белка вместо белкового природного промотора. SAF-полипептид обладает плейотропным действием, т. е. оказывает воздействие более чем в одном направлении на внеклеточные энзимы, на продуцирование пигмента и на дифференциацию. В соответствии с изобретением, достигается повышенное производство эндогенных (внеклеточных) протеинов. Более широко saf-ген и соответствующий полипептид могут быть использованы для увеличения экспрессии у Streptomyces выбранных гетерологичных протеинов путем инсерции гена, кодирующего желаемый протеин в подходящий сайт расщепления гена, кодирующего внеклеточный энзим, экспрессия которого повышается SAF, или его части, трансформируя Streptomyces содержащего saf-ген с рекомбинированным геном, и культурируя трансформированные бактерии для их выделения выбранного протеина или его части. Предпочтительно, гетерологичная ДНК под контролем saf-промотора, инсертируется (интегрируется) в хромосомную ДНК и совместно с ней инсертируется вектор экспрессии, содержащей ДНК, кодирующую SAF-полипептид. Вектор экспрессии не требуется интегрировать в хромосомную ДНК. Сообщалось о плейотропных генах, воздействующих на биосинтез антибиотиков и дифференциацию у Streptomyces. Ген a fsB. который позитивно управляет продуцированием А-фактора, актинородина и продиогиозина у Streptomyces coeiicolor и Streptomyces Lividans клонировались из S. coeiicolor A3/2/ (Horinouchi и др., J. Bacteriol. 165:1238-1248,1983). Ген saf отличается от а fsB и, действительно, они оказывают противоположное действие на производство актинородина. Общим у них является то, что их аминокислотные последовательности типичны для ДНК-связывающих протеинов. Оба гена saf и а fsB имеют промоторы без -10 и -35 последовательностей согласования и связаны потенциальными трансляционными регуляторными сигналами (факторами), сильным стволом и петлевыми структурами, которые могут действовать в качестве транскрипционных терминаторов (Horinouchi и др., J. Bacterioi. 166:257-259, 1986). Если транскрипция образует очень стабильную петлю, то связывание рибосом сделается невозможным. Такие "ослабляющие" механизмы контроля генной экспрессии были найдены для управляемого контроля генов резистентности к антибиотикам у Streptomyces (Horinouchi и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. США, 77:7079-7083, 1980). Поскольку ген saf может рассматриваться как "главный" ген, который включает разнообразие генов для экскреции энзимов, его экспрессия, вероятно, строго контролируется в клетке. Все энзимы, стимулируемые saf-геном, участвуют в разложении сложных полимеров и поэтому мы полагаем, что этот ген является частью общей регуляторной системы, вовлеченной в поиск альтернативных источников питания, как предполагается также у Bacillus (Henner и др., J. Bacteriol. 176:296-300,1988). Краткое описание иллюстраций Фиг. 1. Карты рестрикции фрагментов хромосомной ДНК от S. qriseus ATCC 10137 клонов в Bgl II сайте IJ702, которые несут генетический детерминат суперпродуцирования щелочной фосфатазы. Фиг. 2. Анализ (Саузерн-гибридизацией) гомологии между 1 кб Bgl II фрагментом plJ AD3 и геномной ДНК других видов Streotomyces. А) фрагменты ДНК, полученные BamHI перевариванием геномных ДНК (полосы 2-7). В) Гибридизация ДНК, показанных на панели А, с фрагментом величиной 1 кб в качестве образца (зонда). Полосы: 1. ДНК, переваренная Hind III с получением фрагментов размерами 23, 9.59, 6.88, 4.29, 2.28, 1.94 и 0.58 кб; 2. S. lactamdurans: 3. S acnmvcini: 4. S. coelicolor 1157: 5. S. griseus 2212: 6. S. gnseus 3570: 7. S. Lividans 1326. Фиг. З Опыты по испытанию протеазной (А), амилазной (В) и липазной (С) активности S. Lividans. трансформированных plJ 702 (слева) и трансформированных pULAD3 (справа). Фиг. 4 Эффект дозировки гена на экспрессию saf-гена. Продуцирование протеазы (А) и ималазы (В) S. Lividans. трансформированными plJ 702 (слева) S. Lividans. трансформированными pULAD3 (в середине) и S. Lividans. трансформированными pULAD3 (справа). Фиг. 5 Обрезка ("тримминг") saf-гена 1 кб Bgl II. Фрагмент pULAD3 использовался в качестве исходного материала. Продуцирование внеклеточного энзима для всех плазмидных конструкций измерялось на чашках с твердой средой, как указано в описании, означает продуцент дикого типа, два, три или четыре креста указывают различные степени суперпродуцирования. Короткие открытые стрелки показывают локализацию и направление транскрипции гена тирозиназы (меl) в плазмиде plJ 702. Закрытые кружки показывают промотор mel-гена; открытые (светлые) кружки представляют активность предполагаемого по часовой стрелке промотора plJ 702, а открытые квадратики показывают saf-промотор. Направление транскрипции показано стрелками. ORFI соответствует рамке считывания saf, выведенной из данных по нуклеотидной последовательности, (см. фиг. 6). Фиг. 6 Нуклеотидная последовательность 1 кб Bgl II фрагмента pULADS и выведенная аминокислотная последовательность продукта saf-гена. Подчеркнут второй кодон предполагаемой АТГ-инициации. Инвертированные комплементарные повторные последовательности показаны сходящимися стрелками. Волнистая линия показывает аминокислотную последовательность, подобную ДНК-связывающим областям известных ДНК-связывающих протеинов. Показаны подходящие сайты рестрикции. Нуклеотиды пронумерованы, начиная от сайта Bgl II (номера справа). Фиг. 7 Сравнение области из выведенной аминокислотной последовательности saf-генного продукта с ДНК-связывающими областями в известных ДНК-связывающих протеинов. Данные взяты у Pabo и Sauer, Ann. Rev. Biochem. 53:293-321,1984 и Horihouchi и Beppu, Genetics of Industrial Microorganisms p. 41, изд. Плива, Загреб, Югославия, 1986. Фиг. 8 Повторные нуклеотидные последовательности "вверх" и "вниз" от sаf-гена. Фиг. 9 Повторные группы нуклеотидов, присутствующие в saf-гене. Фиг. 10 Плазмида plJ 702. Фиг. 11 На фиг. 11 А и В показаны полная последовательность нуклеотидов, выведенной последовательности аминокислот амилазного гена S. griseus. Полагают, что разрез BstEll является оптимальным местом сшивания чужеродного гена. Фиг. 12 Стратегия, используемая при клонировании а-амилазного гена штамма 1MRV 3570 S. griseus с применением плазмиды plJ 699. Фиг. 13 Серия графиков, показывающая продуцирование а-амилазы на чашках различными плазмидами в зависимости от времени, с различным составом сред: (D) MM+крахмал (1%)+тио ( ) MM I мМР+крахмал (1%)+тио (g) MM без фосфата+крахмал (1%)+тио (n) MM+крахмал(1%)+тио+IRIG Нижняя панель с правой стороны показывает оценки продуцирования плазмиды pULVD10 в сравнении с pULTVI, S. Lividans и pULTV100 в вышеописанных средах в наилучшей продуцентной среде (см. фиг. 6а) S. Lividans (plJ 699) в MM без фосфата+1% крахмала + тио: /h/ pULTVI в вышеописанных средах; /-/ pULTV100 в вышеописанных средах; и /D/ pULVD10 в ММ IмМР+1% крахмала+тио. Фиг. 14 Схематически представляет конструкцию рекомбинантной клетки Streptomyces содержащей хромосомный ген, продуцирующий синтез-протеин, включающий молекулу CRF и плазмиды, содержащие ДНК, кодирующую SAF-полипелтид. Описание предпочтительных выполнений Описанную здесь работу осуществляли с применением следующих материалов и методов. Штамм бактерий и плазмиды. В этом исполнении использовались штаммы Streptomyces и Е. coli. которые приведены в Таблице 1. Плазмиды и фаги показаны в Таблице 2. Среды и условия культивирования. Штаммы Streptomyces выращивали в R2YE, минимальной среде (MM), TSB (Дифко) или YEME, с добавлением 34% сахарозы и 5 мМ MgCl2 (Hopwood и др., Genetic Manipulation of Streptomyces. Лабораторный учебник, изд. John Innes Foundation. Норвич, Великобритания, 1985). Штамм Streptomyces выращивали в тройных перегороженных фляжках при 28°С в ротационном шейкере при его вращении со скоростью 220 об/мин. Штамм Е. coli выращивали в Бульоне Luria (LB) (см. Миллер и др. EXPERIMENTS in Mollecular genetic стр. 433, Cold Spring Harbor Lab. Нью-Йорк, 1972) или Агаре Luria (LA) при 37°С. Чашечные опыты с энзимами. Исследование Streptomyces на щелочную фосфатазу проводили в среде РРММ (ММ) без глюкозы, содержащей пониженный уровень (1мМ) фосфатазы, с добавлением 30 мкг/мл 5бром-4-хлор-3-индолил-фосфат-р-толуидина (ХР). Колонии, продуцировавшие щелочную фосфатазу, были синие, а неспособные ее произвести, были белые. Для Е. coli использовали среду ВХР, которая содержит (на литр): 10 г бактопектона, 12 г основания Трисма, 10 г соли, 20 г агара Дифко, с рН 7,5 и 40 мкг (мл ХР). Амилазная активность колоний Streptomyces испытывалась на ММ (без глюкозы) с добавлением 1% крахмала. После 3 дней роста; чашки обрабатывали парами йода. Эрны просветления вокруг колоний возникают вследствие разложения крахмала. Липазную активность измеряли путем выращивания Streptomyces в ММ, с добавлением 2% (вес/об.) оливкового масла, 0,5 (вес/об.) Твин 80 и 0,5% (вес/об) Твин 20. После 20 дней роста в чашки выливали по 1 мл IM CaCl2. Продуцирование липазы наблюдали в виде преципитата Са2+ - жирная кислота-комплекса (Odera Ferment. Technol. 64:363-371, 1986). Протеазную активность испытывали в MM (без глюкозы) с добавлением 0,5% казеина и 10 мМ СаСl2. Энзимную активность определяли как зоны осветления вокруг колоний. Активность на агаразу S. coelicolor испытывали в ММ без глюкозы с заполнением чашек Грамм-йодным раствором. Бетагалактизидазную наблюдали в виде синего окрашивания колоний, растущих на ММ без глюкозы с добавлением X-gal (30 мкг/мл) и IRTG (10 мкг/мл). Выделение ДНК. Общая (вся) ДНК из Streptomyces приготавливались, как описано (Hopwood и др. Лабораторный учебник, см. Выше). Плазмидную ДНК из Streptomyces или Е. coli выделяли по методу Кизера (Kieser и др. Plasmid 12:19-36,1984). Процедуры клонирования. 10 мкг хромосомной ДНК штамма АТСС 10137 S. griseus и 0,5 мкг plJ 702 полностью переваривали Bgl I! и лигировали в течение 12 часов при 14°С с использованием Т4 ДНКлигазы. Лигационную смесь использовали непосредственно для трансформирования. Субклонирование фрагментов ДНК проводили путем переваривания 1-2 мкг ДНК плазмид с адекватным рестрикционным энзимом (энзимами), а продукты реакции разделяли гелевым электрофорезом в агарозе с низкой температурой плавления (LMPA). Требуемые нити ДНК экстрагировали с использованием методом с СТАВ (Langridge и др. Anal. Biochem. 103:264-272, 1980). Методы трансформирования. Штаммы Streptomyces трансформировали, как описано Хопвудом и др. в Лабораторном Учебнике (см. выше). После трансформирования, протопласты помещали на среду R2YE и оставляли регенировать в течение 15-20 часов при 30°С. Затем 1 мл водного раствора тиострептона (300 мкг/мл) наливали в чашки, сушили 1 или 2 часа и инкубировали в течение 2 или 3 дней. Трансформанты реплицировали на среду РРММ, содержащую тиострептон (50 мкг/мл) и ХР (30мкг/мл). Трансформированиe Е. coli осуществляли согласно Cohen и др. (Ргос. Natl. Acad. Sci США 69:21102114, 1972). Транформанты подвергали селекции на чашках, содержащих ампициллин (200 мкг/мл). В случае необходимости, в LA чашки добавляли X-gal (36 мкг/мл) и IPTG (10 мкг/мл). Исследование гибридизации. Перенос ДНК с агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизацию проводили, как описано Хопвудом и др. в Лабораторном Учебнике (см. выше). 7,2 кб Bgl II фрагмент плазмиды pULAD1 и 1 кб фрагмент Bgl II из плазмиды pULAD3 использовали в качестве зондов. Гибридизацию осуществляли при 70°С в течение 24 часов. Фильтры промывали дважды по 30 мин. В 2 г SSC, 0,1% SDS и затем еще два раза снова по 30 мин. в 0,2 г SSC и 0,1% SDS при 70°С. Анализ нуклеотидной последовательности. Нуклеотидную последовательность определяли методом терминации цепи по Зангеру (Sanger и др. Ргос. Natl. Acad. Sci. США 74:5463-5467, 1977). Фрагменты ДНК субклонировались в М13тр10 и М13тр11 для получения инсерта в любой ориентации. Лигационные смеси трансферцировали в компетентные клетки штамма JM103 Е._coli и белые (гемолитические) бляшки сeкверинировали для селекции инсертов. В обеих нитях осуществляли секвенирование с использованием Amerisham International pie. (Великобритания) и "Секвеназы" (Биохимическая корпорация Соединенных Штатов) - наборы для анализа. Все фрагменты секвенировали с использованием dGTP, но dITP при необходимости также использовали, вместо dGTP. Реакционные смеси разделяли на 6%-ном или 8%-ном полиакримидных секвенирующих гелях, которые затем переносили на рентгеновскую пленку авторадиографии. Клонирование промоторов. Фрагменты с активностью по инициации транскрипции отбирали с использованием плазмиды мультикопирования промотора-зонда plJ 486 (Ward и др. Mol. Gen. Genet. 203:468-478, 1986). Трансформанты с резистентностью к канамицину (Км) выделяли путем реплицирования колоний на ММ, содержащей 15 мкг/мл Км. Транскрипция-трансляция ин витро. Плазмиды pULAD300 и pUC19 транскрибировали и транслировали с использованием набора лабораторных средств для направленной трансляции прокариотической ДНК (из Amerіsham Int. Pie. (L) 358) -метионин использовали в качестве радиоактивной метки. Для анализа меченых протеинов использовали 12,5% полиакриамидные гели, содержащие додецил-сульфат натрия. Варианты выполнения изобретения Нижеследующее подробное описание иллюстрирует изобретение. Продуцирование щелочной фосфатазы различным Streptomyces. Испытывалось в нескольких твердых средах продуцирование щелочной фосфатазы десяти разных штаммов Streptomyces (список см. в Табл. 1). S. griseus IMRV3570 и S. griseus ATCC 10137 оказались лучшими продуцентами во всех испытывавшихся средах. Лучшей твердой средой для продуцирования щелочной фосфатазы была PRMM. (содержащая 30 мкг/мл ХР). В этой среде S. griseus IMRV 3570 и S. griseus ATCC 10137 демонстрируют темно-синее окрашивание после 48 часов роста. S. Lividans 1326 и S. Coelicolor Jl 2280 были плохими продуцентами щелочной фосфатазы: через 20 часов роста на PRMM. содержащей ХР, наблюдали только светло-голубое окрашивание. Клонирование гена, вовлеченного в продуцирование щелочной фосфатазы. Общая ДНК от штамма ATCC 10137 S. griseus переварились Bgl II, лигировались к переваренному Bgl II plJ 702 и лигационную смесь вводили путем трансформации в протопласты. S. Lividans 1326. Трансформанты реплицировались на PRMM, содержащую тиострептон (50 мкг/мл) и ХР (30 мкг/мл). Очень темно-синяя колония была обнаружена среди 2.800 меланин-негативных трансформантов S. Lividans. Эта темно-синяя колония содержала производное plJ 702, несущее 7.2 кб Bgl II инсерт: названный pULAD1 (см. Фиг. 1). Плазмида pULAD1 - S. Lividans была нестабильной и при трансформировании вызывала белые и синие колонии. Все синие колонии, содержавшие исходный pULAD1 и белые, содержащие дефектную форму (с делецией) плазмиды pULAD1, далее не исследовали. Поскольку, нестабильность могла быть вызвана большим размером инсерта в такой плазмиде, как plJ 702, которая известна своей некоторой нестабильностью, то 7.2 кб инсерт субклонировали в 5 кб Bgl II фрагмент плазмиды plJ 699 (Kieser и др., Gene. 65:83-91, 1988). Были получены две плазмиды pULADI 00 и pULADI 01, с инсертом, ориентированным в противоположных направлениях. Обе плазмиды были стабильны и ген экспрессировался в обоих ориентациях в S. Lividans. Локализация SAF-гена 7.2 кб Bgl II фрагмент частично переваривали с помощью a fsB и лигировали к Вgl II - переваренной plJ 702. Лигационную смесь трансформировали в протопласты S Lividans. и трансформанты реплицировали на PRMM, содержащую ХР. Плазмидную ДНК выделяли из нескольких синих колоний. Были изучены подробно четыре небольшие плазмиды pULAD2, pULAD3, pULAD16 и pULAD8, несущие детерминант продуцирования щелочной фосфатазы; эти плазмиды были стабильны, будучи ретрансформированы в протопласты S. Lividans -и несли инсерты размером 2.4, 1. 2.1 и 1.9 кб. (фиг. 1), соответственно. Плазмида pULAD3 имела самый маленький инсерт размером 1 кб, который мог быть вырезан обратно с помощью Bgl II. Будучи введенным в S. Lividans pULAD3 повышал продуцирование щелочной фосфатазы, как pULAD2 и pULAD3 депонирован с депозитарным номером 1-659 19.05.89 в Национальной коллекции Культур Микроорганизмов, 28-я ул. Доктора Ру, Т75724 Paris, Cedex 15, France, согласно Будапештскому Договору и Правилу 28 ЕРС. Гибридизация эромосомной ДНК нескольких Streptomyces Общую ДНК из штамма АТСС 10137 S. qriseus. переваренную ВамНl или Bgl II, гибридизировали к 7.2 кб Bgl II фрагменту pULAD1, меченному "ник-трансляцией" с (32 р) dCTP. Гомологичный этому зонду 7.2 кб Bgl II фрагмент присутствовал в ДНК штамма АТСС 10137 S. griseus. переваренный Bgl Il, как ожидалось. Там имелся (в этом фрагменте) внутренний сайт ВамЕНl, которыЙ приводил к двум четким полосам гибридизации (размером 7.9 кб и 9.4 кб), когда общую ДНК переваривали ВамНl. Для выяснения, тот ли это ген присутствовал в других Streptomyces, общую ДНК от S. acrivucini. S. coelicolor 1157, S. griseus 2212, S. griseus 3570, S. Lividans 1326 и S. lactamgurans NRRL 3802 переваривали ВамНl и гибридизировали с 1 кб Bgl II фрагментом pULAD3 в качестве зонда. Гибридизацию с 9.5 кб обычной полосой наблюдали у первых четырех штаммов перечисленных выше, тогда как у ДНК S. Lividans и S. lactamdurans наблюдали 4 и 5 слабых полос гибридазации соответственно (см. Фиг. 2). В дополнение также наблюдали гибридизацию с ДНК S. Albus G. S. Coelicolor Л 2280, S. chavuligerus NRRL 3585 и S. fradiae АТСС 10475. Дальнейших попыток характеризировать полосы гибридизации не делалось. Некомплементарность pho-мутантов Е. coli. Была сделана попытка установить комплементарность Е. coli pho А-мутантов Е15 и А 1046, когда мы клонировали структурный ген щелочной фосфатазы от штамма АТСС 10137 S. griseus. 7.2 кб Bgl II фрагмент от pULADI и 1 кб Bgl II фрагмент от pULAD3 субклониовали раздельно в обеих ориентациях в ВамНI-переваренной pUC 19. Все эти плазмидные конструкции проверялись в клетках Е. coli M103 и затем использовались для трансформирования Е. coli E15 (Sartiy и др. J. Bacteriol, 145:288-292,1981) и Е. coli A 1046, в В-ХР не было обнаружено никаких синих колоний, позволяющих предположить, что полный структурный ген щелочной фосфатазы не присутствует в 7.2 кб фрагменте S. Griseus, или что этот ген не экспрессируется в Е. соli Структурный ген щелочной фосфатазы pho А или Bacillus Licheniformis (Huller, J. Bacteriol, 158:978-982,1984) не гибридизировался с клонированным 1 км фрагментом (данные не приведены). В дополнение, pho (регуляторный) Е. coli мутант Н2 (Kreuzer и др., Genetics 81:459-468, 1975) не был комплементирован ни с 1 кб Bgl II фрагментом pULAD3, ни 7.2 Вgl II фрагментом pULAD1. Суперпродуцирование других внеклеточных энзимов Когда pULAD3 использовался для ретрансформации протопластов S. Lividans, то наблюдалась ясная отложенная (т.е. с задержкой) пигментация и споруляция. Эти плейотропные эффекты стимулировали нас к изучению роли этого гена в секреции белка или в контрагенной экспрессии. Как показано на Фиг. 3 некоторые внеклеточные энзимы, включающие амилазу, протеазу и липазу, суперпродуцировали S. Lividans. трансформированным с помощью pULAD3 . Продуцирование бета-галактозидазы также увеличивалось, начавшись примерно на 24-30 часов ранее, чем у нетрансформированного S. соlicolor. Благодаря плейотропным эффектам клонированного гена на внеклеточные энзимы, продуцирование пигмента и на дифференцирование, этот ген был назван saf. (т. е. фактор активизации вторичного метаболизма). Эффект дозирования гена Количество копий plJ 702 оценивают порядка 100-200 на хромосому. Хотя точное количество копий pULAD3 не было определено: интенсивность обеих полос plJ 702 и pULAD3 не предполагала наличие сходного количества копий. С целью изучения эффекта дозировки гена мы субклонировали 1 кб Bgl II фрагмент pULAD3 в сайт ВамНl плазмиды plJ 61 с малым количеством копий (от 3 до 4 копий на клетку) (см. Хопвуд и др., Лабораторный Учебник). Эта новая плазмида была названа pULAD30. На Фиг. 4 показано, что Продуцирование внеклеточных энзимов S. Lividans. трансформированными pULAD30, отчетливо понижается по сравнению с .S_ Lividans. несущими pULAD3. В дополнение, S. Lividans. несущие pULAD30, продемонстрировали сходное пигментное Продуцирование и модель споруляции как и нетрансформированные S. Lividans. Экспрессия в Е. coli и тримминг гена Хотя рhо-мутанты Е. coli не комплементировались saf-геном, мы наблюдали, что 1 кб Bgl II инсерт pULAD3, будучи субклонирован в одном направлении в pUC19 (плазмида, названная pULAD300), экспрессировал Е. coli: вызывая ненормальную морфологию при росте на твердой среде, но не экспрессировал при инсерции его в обратном направлении (плазмида pULAD302). Плазмида pULAD300 содержит ORF (см. ниже) вниз от lacZ промотора. Эти результаты предполагают, что saf-ген экспрессируют в Е. coli от lacZ промотора, присутствующего в pUC 19. PULAD300. Исследования транскрипции-трансляции в Е. coli (с плазмидой pULAD300) проводились также ин витро, и продукты реакции в 12.5%-ный полиакриленидный гель. Полоса мол. весом в 15000 присутствовала на дорожке, соответствующей pULAD300, и отсутствовала в контрольной дорожке pUC19. Для точной локации saf-гена было решено продолжать расщепление 1 кб фрагмента плазмиды pULAD300. В этих попытках использовалось существование уникальных сайтов разреза для энзимов рестрикции Sstl (nt 216), Kph (nt 648) и SalGI (nt 9S8) внутри 1 кб фрагмента. Различные суб-фрагменты из 1 кб инсерта pULAD300 клонировали на первой стадии в plJ 2921, производное pUC18, содержащее модифицированный полилинкер, фланкировали Bgl II сайтами (см. Фиг. 10) и затем высвобождали с помощью Bgl II липкие концы и клонировали в Bgl ll-переваренной plJ 702. Продуцирование щелочной фосфатазы, амилазы и протеазы изучали у Streptomyces Lividans со всеми плазмидными конструкциями. Результаты этих исследований показаны схематично на Фиг. 5 и из интерпретации этих результатов можно вывести следующие заключения: 1. 1 кб фрагмент, содержит полный saf-ген, включающий его собственный промотор, поскольку он был экспрессирован на сходном уровне в обеих ориентациях плазмиды plJ 702 (плазмиды pULAD3 и pULAD4). 2. Этот saf-ген, вероятно, расположен в 648-нуклеотидном Bgl ll-Kpnl фрагменте (плазмиды pULAD5 и pULAD6). 3. Фрагмент Sstl-Kpnl (4S2 нуклеотида) вероятно, содержит генетический детерминант для суперпродуцирования внеклеточного энзима, но, кажется, теряет свою область промотора, поскольку он экспрессировался только в одной ориентации (плазмида pULAD14 и pULAD10), но не в противоположной (плазмиды pULAD9 и pULAD13). 4. 215-нуклеотидный фрагмент Bgl II - Sstl содержит область промотора saf-гена. 5. Все эффекты на внеклеточные энзимы и на дифференциацию сохранились и терялись вместе, указывая этим, что за эти действия на все энзимы ответственен единственный генетический продукт. 6. Неожиданным оказалось отсутствие экспрессии фрагмента Sstl-Kpnl (saf-ген без промотора), происходившего от промотора тирозиназы mel-гена присутствующего в plJ 702, который тем не менее экспрессировался в противоположном направлении (по часовой стрелке). Это открытие подразумевает, что имеется фрагмент с промоторной активностью, расположенный перед mel-геном, у Bgl II клонирующего сайта (Gil и Hopwood, GENE, 25:119-132, 1983). Возможность функционального ОРГ в обратном направлении (из KpnI-Sstl) была отброшена по нескольким причинам: А. Такой ORF не был обнаружен при анализе нуклеотидной последовательности. В. Если бы такой ORF существовал, то ясно, что он нес бы свой собственный промотор, поскольку фрагмент Bgl II - Kpnl экспрессировался в обеих направлениях (плазмиды pULAD5 и pULAD6). Кроме того, выглядит бессмысленным, чтобы KpnI-фрагмент, который бы нес промотор в зоне Kpnl, мог экспрессироваться только в одном направлении. С. Экспрессия в Е. соli всегда происходит так, что промотор lacZ - перед предполагаемым ORF, и никогда - в обратном направлении. Промоторная активность ORFl фрагмента верхнего участка ДНК Чтобы установить существование промотора в Bgl II - Sstl фрагменте, из предыдущих экспериментов можно сделать вывод, что этот фрагмент несет ген, который кодирует аминоглизидфосфотрансферазу (hео) без его промотора. Экспрессия этого гена делает S. Lividans резистентным к канамицину и неомицину. Когда этот фрагмент был субклонирован в plJ 485 (с Sstl концом: ближайшим к heo-гену), то была создана плазмида plJ 484:218. Наблюдали, что S. Lividans. трансформированная plJ 488:216, растет в MM с содержанием канамицина более 100 мкг/мл, тогда как S. Lividans. трансформированный plJ 488, не рос на ММ с добавлением канамицина в количестве 5 мг/мл. Эти результаты показывают, что такой фрагмент имел промоторную активность, и поддерживают предполагаемый ORF. Другие рассуждения, которые выведены из нуклеотидной последовательности вероятного ORF, включает: 1. Ген saf окружен двумя областями с инвентированными и комплементанными повторными последовательностями, которые могут образовывать в мРНК очень стабильные связи G=-38.4 Ккал в присутствии гена saf (нуклеотиды nt 637-697) (Фиг. 8). 2. Секвенированный фрагмент содержит высокий G+С промент, что естественно у генов Streptomvces. 3. Перед геном saf между ATG (nt 219) и повторными структурами вверху, имеется очень интересная нуклеотидная область: в ней есть три пары повторных нуклеотидов: каждый с 7 нт (см. Фиг. 9). Весьма похоже, что эта область, особенно промоторная зона, играет очень важную роль в регуляции экспрессии гена saf. 4. Следует упомянуть о том, что SAF-протеин содержит 18 суммарных положительных зарядов. Исходя из теоретических положений, это предполагает существование значительно большей аффиности к ДНК. Даже в выведенной аминокислотной последовательности можно было наблюдать очень похожую область к областям ДНК-связывающим протеинов. (Pabo и Sauer, 1984) (Фиг. 7). Нуклеотидная последовательность saf-гена Нуклеотидная последовательность всего 1 кб Bgl II инсерта pULAD 2 была определена с использованием плазмиды pULAD300 в качестве исходного материала. Поскольку М13mр10 и М13mр11 не имеют Крnl сайта, фрагменты с Kpnl-концами сначала субклонировались в pUC19 и затем высвобождались в виде EcoRI-Hind III фрагментов и вводились в mр10 и mр11, переваренных EcoRl и Hind llI. Полная нуклеотидная последовательность активной области показывает ORFI из 339 нуклеотидов, которые кодируют предполагаемый SAF-полипептид (фиг. 6). Имеется только одна возможная открытая рамка считывания, содержавшая Bgl ll-Kpnl фрагмент, начиная от ATG кодона инициации у нт 183 и заканчиваясь TGA стоп-кодоном у нт 524 (ORFI на фиг. 5 и 6). Поскольку Sstl-Kpnl инсерт, содержащийся в плазмиде pULAD14, показал более низкую степень активности, чем плазмиды, также содержавшие верхнюю область Sstl сайта (pULAD3, pULAD4, pULAD5 и pULAD6), и очень вероятно, что ATG нт 219 также в рамке с предположительной рамкой считывания saf может действовать как кодон инициации в pULAD10 и pULAD14. Никакие другие альтернативные триплеты инициации невозможны, а поскольку TGA кодон терминации существует выше первого ATG. Длинная инвертированная повторная область, которая может образовывать очень стабильную стебель (ствол) и петлевую структуру (G = -53.6 Ккал) присутствует выше от saf-гена, от нт 90 до нт 135. Другая, с дефисом, инвертированная повторная последовательность наблюдалась вниз по ходу от терминаторного типлета ORFI, простираясь от нт 637 до 697 (G=-38.4 Ккал). Ген saf имеет высокое G+С содержание (76.3%) и маркированы гены (Hopwood и др., Regulation of Gene Expression, 25 Years on, издательство Кембриджского Университета, стр. 251-276, 1986). Промоторная активность фрагмента ДНК вверх от ORFI Поскольку плазмиды, не имевшие фрагмента Bgl II - Sstl (от нт 1 до нт 216), экспрессировались только в одной ориентации (плазмиды pULAD9 и pULAD13), кажется вероятным, что ORFI промотор был расположен в этом фрагменте. Присутствие последовательности инициации транскрипции в этой области было подкреплено путем субклонирования этого фрагмента в промотор-зондовую плазмиду plJ 486 (Sstl и др., Mol. Gen. Genet. 203:468-476, 1986), которая несла беспромоторный ген аминокликозидфосфоротрансферазы (heo). Экспрессия этого гена придает S. Livindans устойчивость к канамицину и неомицину. Bgl II - Sstl фрагмент субклонировали в plJ 486 (Sstl конец проксимально к heo-гену) с получением плазмиды, названной plJ 486:216. S. Livindans трансформированный plJ 486:216 мог расти на ММ, содержащей более 100 мкг/мл канамицина, тогда как S. Livindans. несущий plJ 486, не растет на ММ с содержанием 5 мкг/мл канамицина. Этот результат показывает, что фрагмент Вgl II - Sstl обладает промоторной активностью. Однако нуклеотидной гомологией с другими промоторами Streptomyces не было выявлено типичного "консенсуса" областей -10 или -35. (Hopwood и др., Regulation of Gene Expression, 25 Years on, Изд. Кембриджского Университета, стр. 251-276,1986). Клонирование гена амилазы Теперь была объяснена дефинитивная последовательность амилазного гена (аму) S. griseus IMRV 3570. Полная последовательность нуклеотидов и выведенная последовательность аминокислот амилазного гена S. griseus показана на фиг. 11. Протеин с лидерным пептидом имеет 566 аминокислот (от нт 318 до нт 2155, оба включительно), что соответствует РМ 59,713 D. Плазмида pULA1, содержащая весь а-амилазный ген, была сконструирована путем переваривания ДНК S. griseus IMRV 3570, с выделением фракций размером от 3 до 9 кб и лигированием к Bgl II-переваренной plJ 699. После скрининга на аамилазную активность pULA1 плазмиду подвергали селекции на содержание всего а-амилазного гена. Эта конструкция плазмиды pULTU дана на фиг. 12. Другим путем получения плазмиды с целым геном аамилазы является конструирование ее из двух фрагментов поменьше. Среди плазмид, полученных клонированном всей библиотеки ДНК S. griseus имеется такие плазмиды, которые содержат частичный ген, начиная с 5'- конца и такие, у которых частичный ген начинается с 3'-конца. Из названного первым можно получить 1.3 кб фрагмент BamHI-SacI, который включает 5'-конец гена и из последнего можно выделить 1.2 кб Sacl-Sall фрагмент, включающий 3'-конец этого гена. Оба фрагмента затем могут быть соеденены с plJ 2921, обработанной S all- BamHI, с получением плазмиды с интактным нативным геном а-амилазы (pULTU200). Повышенная активность saf-промотора С целью испытать экспрессию гена saf под контролем разных промоторов изучали продуцирование амилазы штаммов 1186 S. Livindans. Этот saf ген помещали под контроль разных промоторов и продуцирование амилазы сравнивали с ее продуцированием с использованием нативного промотора (Раму). Испытанные промоторы были от гена saf (P saf), от гена резистентности к канамицину (Рhео), от генов синтетазы РАВА (Рраб) и от гена бета-галактозизадазы Е. Соli (Piac). Плазомида pULTU 220, содержащая ген амилазы без промотора, была получена лигированием фрагмента EcoRI-Bgl II, выделенного из pULTU200, к плазмиде р С18, переваренной EcoRl-BaMHI, EcoRI-Hind III, фрагмент из pULTU220 был лигирован непосредственно к промоторам saf. pab или Кмг (резистентности к канамицину) генов с получением pULTD10, pULVAl и pULTU80 плазмид соответственно, pULTU150, содержание промотор lac, были получены непосредственно путем Hind III переваривания pULTU220 и лигирования к 5 кб Hind III фрагменту plJ 699. Исследование продуцирования полученных плазмид проводилось на чашках с ММ+крахмал (1%)+тиострептон, ММ (1 мМ Р)+крахмал (1%)+ тиострептон, ММ без фосфата+крахмал+тио-стрептон и MM+крахмал(1%)+тиострептон+IPTG. В качестве контроля использовали плазмиды plJ 699. pULTU100 (см. Фиг. 6а) и pULTU1. Относительное измерение продуцирования амилазы осуществляли оценкой площади кольца вокруг каждой колонии при окрашивании ростовой среды йодом (I2). Графики продуцирования различными конструкциями представлены на Фиг. 13. За исключением контроля, наиболее высокое продуцирование было достигнуто в среде ММ (1 мМ Р)+крахмал+тиострептон. Ясно видно, пик продуцирования был получен pULTD10 (которая имеет промотор safгена) - 1482 кв. мм по сравнению с 1335 кв. мм другого наивысшего продуцента pULTU150, которая несет Plac-промотор, при инкубировании в течение 114 часов. На Фиг. 13 (нижняя панель, справа) оценки продуцирования pULTDIO представлены в сравнении с контролем в наилучших известных условиях для каждого типа конструкции. Увеличение продуцирования pULTD10 по сравнению с нативным pULTU1 является довольно значительным: 1482 кв. мм по сравнению 1165 кв. мм. Таким образом, промотор saf-гена может быть использован в качестве заменителя других, нативных промоторов для улучшения экспрессии различных эндогенных полипептидов и протеинов StreptomyceS. Подобным образом, если инсертируют чужеродную ДНК, ожидается, что промотор saf-гена обеспечивает подобные улучшенные результаты с амилазой, как было продемонстрировано. Экспрессия чужеродного полипептида или протеина Для экспрессии чужеродного полипептида или протеина, чужеродную ДНК предпочтительно инсертируют в подходящий сайт распознавания эндогенный ген, предпочтительно ген, кодирующий внеклеточный энзим, так, чтобы обеспечить секрецию чужеродного полипептида или протеина. Когда этим геном является ген амилазы, то подходящим сайтом распознавания является сайт BStEII (см. Фиг. 11). Чужеродную ДНК инсекритруют предпочтительно таким путем, чтобы сохранить секрецию сигналов настолько, насколько возможно, их гена внеклеточного энзима. Поскольку эти сигналы расположены главным образом на лидерной последовательности, в отношении гена амилазы имеется свидетельство, что терминальный карбоксильный конец также важен для секреции. Таким образом, может быть лучше всего создать сшитый белок инсерцией чужеродной ДНК в эндогенную ДНК, чем удалять транскрипционную часть эндогенной ДНК и заменять ее чужеродной ДНК. Известно, что saf-ген контролирует продуцирование внеклеточных энзимов в хромосомной ДНК. Предположительно, в хромосомной ДНК имеются последовательности распознавания, которые узнают SAF-полипептид и вызывают увеличение производства внеклеточного энзима. Сочетание гена saf с геном амилазы на плазмиде не вызывает повышенного производства амилазы. Таким образом, предпочтительно следует помещать чужеродный протеин, оперативно связанный последовательностью секреции эндогенного внеклеточного энзима, который может контролироваться SAF и, предпочтительно, далее оперативно связанный с saf-промотором, (в отсутствие нативного промотора), в хромосомную ДНК как в противоположность плазмиде. Этим путем продуцирование чужеродного полипептида а или протеина может быть еще более увеличено нативным SAF. В другом предпочтительном выполнении, saf-ген инсертируют посредством плазмиды, в те же организмы, в которых чужеродная ДНК была инсертирована в хромосомную ДНК. Это обеспечит повышенную секрецию чужеродного полипептида или протеина. Фрагменты ДНК могут клонироваться в хромосомную ДНК Streptomyces посредством любого из известных бактериофаговых векторов для Streptomyces, такого как Æ С31 или R4 (Chater и др., "Gene Cloning in Streptomyces" в книге "Gene Cloning in Organism Other Than E. coli", изданной в Берлине, изд. Шпрингер 1982, стр. 87-95).Диаграмма на Фиг. 14 показывает предпочтительную технологию для получения чужеродного протеина, в этом случае CRF от штамма КС400 Streptomyces, это - Æ С31 производное, которое не имеет сайта связывания - (att) и имеет С+ген. См. Chater К. Г. и др. в "Gene" 26:67-78 (1983), С+ген кодирует репрессор, необходимый для поддержания лизоненного состояния. Сайт att в фаге дикого типа управляет присоединением фага к ДНК клетки-хозяина и управляет освобождением оттуда. Без att сайта этот фан не может быть интегрирован в хромосому-хозяина, пока в нее не клонирован гомологичный фрагмент ДНК. Для этой цели может быть использован любой эндогенный ген в штамме-хозяине, и, таким образом, он просто обозначается как "ген X" на Фиг. 14. Фаг Æ 31 КС400 обработан известными технологиями (см. Хопвуд, Лабораторный Учебник) для инсерции гомологичного фрагмента гена (ген X) так же как гена, включающего saf промотор и ген эндогенной а-амилазы с геном для СРГ, оперативно связанного к и в рамке считывания с геном а-амилазы. После заражения штамма-хозяина Streptomyces. предпочтительно штамма S. coelicolor A3(2) (доступного из коллекции Института John Innes, Norwich, Великобритания), этим фагом: вся фаговая ДНК будет инсертирована в хромосомную ДНК клетки-хозяина, начиная у гомологичного гена, X, предпочтительно, с использованием рекомбинации Кэмпбел-типа. Как указывалось, все конкретные методики для осуществления этих процедур находятся в пределах знаний специалиста в этой области, так что такая инсерция может быть осуществлена без лишнего экспериментирования. Эти клетки с инсеритрованным хромосомным геном затем обрабатываются для включения плазмиды pULAD3. Такие клетки будут экспрессировать SAF-полипептид, который в свою очередь, увеличит секрецию а-амилазы хромосомным геном. Присутствие saf-промотора на этом гене будет более увеличивать секрецию а-амилазы. Эта а-амилаза в виде секрета будет содержать присоединенную к ней молекулу CRF, которая может быть легко отделена соответствующим ферментным перевариванием. В то время как а-амилазный ген Streptomyces был проиллюстрирован конкретными примерами, следует учитывать, что с целью повышения экспрессии посредством применения saf-промотора, используемый ген для любого полипептида или белка, продуцируемых видами Streptomvces. может быть модифицирован путем удаления нативного промотора и замены его saf-промотором. Сходным образом, чужеродный полипептид или протеин может быть инсертирован в любой такой эндогенный ген. Предпочтительно, однако, чтобы выбранный селекцией эндогенный ген был и геном, который экспрессирует протеин через клеточную стенку и в культурную среду, в этом случае важно поддержать сигнальную последовательность секреции. Наилучшие результаты будут получены, если выбираемый селекцией ген для инсерции его в чужеродный ген является тем, который контролируется SAF; а инсерция осуществляется в хромосомную ДНК, предпочтительно, с одновременной инсерцией плазмиды, содержащей saf-ген. В то время, как CRF был упомянут особо, следует понимать, что последовательность чужеродной ДНК, производной не от Streptomyces, кодирующей протеин или полипептид, в частности, эукариотического или вирусного происхождения. Примерами таких эукариотических и вирусных последовательностей ДНК являются последовательности, кодирующие лейкоцитарный интерферон животных и человека (IFN-a), фибробластовый интерферон (IFN-b) и иммунный интерферон (IFN-g), человеческий инсулин, человеческого и животного ростового и других гормонов, таких как кортикотропин-освобождающий фактор (CRF), сывороточного альбумина человека и различные факторы крови человека, и плазминогенные сердцевины и поверхности вируса гепатита В, FMD вирусные антигены и другие человеческие, животные и вирусные липептиды и протеины. В то время как предпочтителен saf-промотор, продуцирование чужеродного полипептида или протеина будет далее увеличено путем трансформирования клетки-хозяина экспрессионным вектором, содержащим saf-ген. Этот экспрессионный вектор может находится в плазмиде ДНК этой клетки. Таким образом, может быть использован эндогенный или любой другой промотор, и при этом будет получена секреция чужеродного полипептида или протеина. Предыдущее описание конкретных выполнении настолько полно раскрывает общую сущность изобретения, что другие смогут с применением общих знаний в этой области легко модифицировать и/или приспосабливать изобретение для различных его применений в виде конкретных выполнении, не отходящих от общей концепции, и поэтому такие адаптации и модификации включаются в значение и объем раскрытых выполнений. Следует также учесть, что фразеология и терминология данного описания использована не с целью ограничения, а лишь для большей ясности. Таблица 1 Бактериальные штаммы Обозначение штамма соотв. характеристика ссылка на источник S. griseusATCC 10137 дикий тип АТСС S. griseusJI 2212 дикий тип Jl S. griseus IMRV 3570 дикий тип IMRU S. lividansJI 1326 дикий тип JI S. acrimuciniJI 2236 дикий тип JI S. coelicolor Jl 2280 CysE24. Pabal, strl JI S. coelicolor Jl 1157 дикий тип JI S. clavuliquerus NRRL 3585 дикий тип NRRL S. lactamdurange NRRL 3802 дикий тип NRRL S. albus G дикий тип JI E. coli E15 phoA8 CGSC г E. coli AW1046 pho A, pho С, tsz: :th5, leu, Kah 1 E. coli H2 (Е. Coli CGSC 5259) phob 52, pho 35 CGSC E.coli J M103 phoAB, laczM 15 2 1: Коллекция микроорганизмов Института John innes, Великобритания, NR 4 UH, Norwich, Coleny Lane. ATCC: Американская коллекция типов культур IMRV: Уаксмановский Институт микробиологии и Рутгеровский Университет, США, штат Нью-Джерси, г. Нью-Брунсвик. NRRL Исследовательские Лаборатории Северного Региона, Пеория, штат Иллинойс, США. CGSC: Центр генетического фонда E._coli Таблица 2 Плазмиды и фаги Обозначение Соответствующие характеристики Источник + plJ 702 тиострептоновая резистентность и мeлaнин 3 plJ 699 резистентность к тиострептону, биомицину и канамицину 4 резистентность к тиострептону и неомицину 5 резистентность к тиострептону и saf-ген без промоторов 6 plJ61 plJ 486 pULAD серия векторы Streptomuces и Е. Colt несущие saf-ген и/или смежные Заявка последовательности pIJ486::216 pUC19 plJ 2921 M13mp10 и mp11 plJ 486, несущий область saf-промотора Заявка la , lacZpzoZ' 7 + + la , lacZ pZOZ' см. Фиг. 10 фаги для генерирования одноцепочечной ДНК 8 pULTUI200 векторы Streotomuces, несущие ген амилазы Заявка pULTV220 вектор Streotomuces. несущий ген амилазы без промотора Заявка PULVD10 вектор Streptomuces, несущий ген амилазы с saf-промотором Завка pULVAl вектор Streptomuces. несущий ген амилазы с раb-промотором Заявка PULTV80 вектор Streptomuces несущий ген амилазы с Км -промотором г Заявка (резистентности к канамицину) pULTVl150 вектор Streptomuces несущий ген амилазы с lac-промотором Заявка Количественное определение белка-носителя (амилазы) в культурном бульоне (супернатанты) культур Streptomuces Lividans. трансформированных различными плазмидами. Мы использовали три разных метода определения количества секретированного протеина: 1. Спектроденсиметрия полос белка в гелях SDS-PaGE, окрашенных серебром, или фотонегативов (пленок) в тех же гелях, используя спектроденситомер Шимадзу. 2. Анализ количеств различных протеинов с использованием HPLC, оснащенной колонкой С8 Аквапор РП-300 (200 х 4.6 нм Лаборатории Браунли США). 3. Анализ посредством HPLC. оснащенной молекулярным ситом (гель-фильтрацией) колонны ProteibPak 300 SW. РЕЗУЛЬТАТЫ Споры S. Lividans (pULTU100), S. Lividans (pULVD1) и S. Lividans (pULTU80) инокулировали в среду Лешевалье 1% крахмала. Максимальная амилазная активность была получена соответственно при 36. 60, 60 час. ферментации этих спор. Общий протеин во внеклеточной жидкости (супернатанте) был определен количество методом Бродфорда. 5 мкг протеина из каждого бульона переносили в SDS-PAGE и окрашивали серебром. 1. Спектроденситометрия проводилась на полосах в SDS-PAGE (10% акриламида) супернатантов S. Lividans (pULTU100 (5 мкг протеина). S. Lividans (pULVD10), (5 мкг протеина), и S. Lividans (pULTU80) (5 мкг протеина). 2. HPLC в колонне Аквапор РП-300 Протеиналы элюировали 50 мМ уксусной кислоты-ацетатаммониевым буфером и градиентом метанола; 0-20 мин. 0% метанола, 30-35 мин. 100% метанола, 45 мин. 0% метанола. Амилаза элюируется 100%-ным метанолом на 33-34 минутах. Результаты показаны в Таблице 3. 3. HPLC в Protein-Pak 300 SW Супернатанты культурных бульонов тех же самых конструкций как указано выше были предварительно диализованы и концентрированы лиофилизацией. Протеины элюировали уксусно-кислотным-аммонийацетатным буфером со скоростью потока 0,5 мл/мин. Амилаза элюирует в виде пика с центром на 21-22 минутах Таблица 3 макс. специф. Активность а-амилаза (%) конц.белка в супернатанте "Аквапор' HPLC (ед. на мкг сух. Веса) а-амилазн. прот.(мг/л) Ши "Protein "р-р" мадзу Pak" HPLC Шим. (%) "Акв" PULTV 100 25(36ч) 143 58% 40% 49.6 82.9 57.2 7 PULVD10 450(60ч) 965 86.03% 70.5% 84.2 849.5 680 81 pULTV 80 430(60ч) 662 88.6 5 27696 Фиг. 1 Фиг. 2 12 27696 Фиг. 3 13 27696 Фиг. 4 14 27696 Фиг 5. 15 27696 Фиг.6 16 27696 Фиг. 6 (прод.) 17 27696 Фиг. 6 (прод.) 18 27696 Фиг. 6 (прод.) 19 27696 Фиг. 7 20 Фиг. 9 27696 22 Фиг. 8 27696 Фиг. 10 22 27696 Фиг.11 23 27696 Фиг.11 (прод.) 24 27696 Фиг.11 (прод.) 25 27696 Фиг.11 (прод.) 26 27696 Фиг.11 (прод.) 27 27696 Фиг.11 (прод.) 28 27696 Фиг.11 (прод.) 29 27696 Фиг.11 (прод.) 30