Ізольоване антитіло, що специфічно зв’язується з рецептором фактора росту фібробластів-3 та фармацевтична композиція, що містить зазначене антитіло

Реферат: Винахід належить до ізольованого антитіла або його фрагмента, що специфічно зв'язується з людським FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc). Також винахід належить до фармацевтичної композиції, що містять згадане антитіло для лікування раку. UA 101681 C2 (12) UA 101681 C2 UA 101681 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей винахід належить до галузі імунології та лікування раку. Конкретніше, цей винахід спрямовується на людське антитіло, що зв'язується з рецептором фактора росту фібробластів-3 (FGFR-3) (послідовність SEQ ID NO:11). FGFR є також відомим як CD333, ACH, CEK2, HSFGFR3EX та JTK4. Було показано, що FGFR-3 є залученим до розвитку раку, у тому числі множинної мієломи, карциноми сечового міхура та уротеліальної клітинної карциноми. Зв'язування ліганду FGFрецептора індукує димеризацію та аутофосфорилування рецептора, наслідком чого є активація ефекторних молекул у прямому напрямку. Передача сигналів FGFR-3 є здатною до регулювання широкого діапазону клітинних активностей, наприклад, проліферації, диференціації, міграції, виживання/апоптозу, регуляції цитоскелету і цитокінів та ендоцитозу/екзоцитозу. Гіперактивація передачі сигналів FGFR-3 була визнана важливим явищем, що забезпечує пухлинним клітинам можливість росту та перевагу виживаності і, тим самим, сприяє злоякісному розвитку пухлини. Непроцесований FGFR-3 має дві сплайсовані форми, які позначаються як FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc), що отримані через альтернативні екзони, які кодують третій IgG-подібний домен FGFR-3. FGFR-3 також має добре задокументовані мутантні форми, отримані через помилки у процесі реплікації або трансляції ДНК. Приймаючи до уваги активну роль шляху передачі сигналів FGFR-3 у широкому діапазоні захворювань, у тому числі раку, існує потреба у механізмі регуляції цього шляху. Були описані антитіла проти FGFR-3, що блокують зв'язування ліганду (Rauchenberger, R. et al., J. Biol. Chem. 2003 Oct 3; 278(40):38194-205). Були описані антитіла проти FGFR-3, що зв'язують як форми дикого типу, так і мутантні форми FGFR-3 (Martinez-Torrecuadrada, J., et al., Clin. Cancer Res. 2005 Sep 1;11(17):6280-90; Trudel S., et al., Blood 2006 May 15;107(10):4039-46). Були описані антитіла проти FGFR-3, що пригнічують опосередковану лігандом активацію передачі сигналів FGFR-3 і пригнічують опосередкований FGFR-3 ріст пухлин (Trudel S., et al., Blood 2006 May 15; 107(10):4039-46). Були описані антитіла проти FGFR-3, що посилюють протипухлинні ефекти цисплатину у разі введення у формі комбінованої терапії (Deevi, D. et al., AACR 2007 Oct. 21-24; Wang, W., et al., EORTC 2008 Oct. 22-26). Однак у цій галузі існує потреба у антагоністі антитіла, що є сприйнятливим до однієї або декількох активностей з числа наведених далі: є високоспецифічним до обох сплайсованих форм FGFR-3, (FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc)), інтерналізує FGFR-3 і, за варіантом, якому віддають перевагу, також індукує деградацію FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc) або їхніх мутантних форм, а також посилює терапевтичну ефективність та звертає хіміорезистентність у разі застосування у комбінації з цитотоксичним хімічним препаратом. На додаток до цього, згадане антитіло, за варіантом, якому віддають перевагу, є також активним по відношенню до мутантних форм FGFR-3, блокує зв'язування лігандів FGF з FGFR-3, пригнічує індуковані лігандами шляхи передачі сигналів FGFR-3, пригнічує опосередковані FGFR-3 клітинні активності або пригнічує ріст пухлин in vitro та in vivo. Антитіло за цим винаходом задовольняє цим потребам. Згадане антитіло є високоспецифічним до обох сплайсованих форм FGFR-3, (FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc)), інтерналізує FGFR-3 і, за варіантом, якому віддають перевагу, також індукує деградацію рецептора у разі зв'язування рецепторів FGFR-3 або мутантних рецепторів у клітинах, посилює терапевтичну ефективність та звертає хіміорезистентність у разі застосування у комбінації з цитотоксичним хімічним препаратом, а також є активним по відношенню до мутантних форм FGFR-3, блокує зв'язування лігандів FGF з FGFR-3, пригнічує індуковані лігандами шляхи передачі сигналів FGFR-3, пригнічує опосередковані FGFR-3 клітинні активності та пригнічує ріст пухлин in vitro та in vivo. Цей винахід стосується ізольованого антитіла, що специфічно зв'язується з людськими FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc). За варіантом, якому віддають перевагу, згаданим антитілом є людське антитіло, що має KD -8 приблизно 1 × 10 Μ або менше при кімнатній температурі (20-25 °C). За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло специфічно зв'язується з доменом 2 (послідовність SEQ ID NO:12) людського FGFR-3. За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло за цим винаходом, що специфічно зв'язується з людським FGFR-3(IIIb) та FGFR-3(IIIc), містить CDRH1, що має послідовність GYMFTSYGIS (послідовність SEQ ID NO:1), CDRH2, що має послідовність WVSTYNGDTNYAQKFQG (послідовність SEQ ID NO:2), CDRH3, що має послідовність VLGYYDSIDGYYYGMDV (послідовність SEQ ID NO:3), CDRL1, що має послідовність GGNNIGDKSVH (послідовність SEQ ID NO:4), CDRL2, що має послідовність LDTERPS 1 UA 101681 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (послідовність SEQ ID NO:5) та CDRL3, що має послідовність QVWDSGSDHW (послідовність SEQ ID NO:6). За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло може містити амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWV STYNGDTNYAQKFQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYY DSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS (послідовність SEQ ID NO:7) та амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTE RPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHWFGGGTKLTVLG (послідовність SEQ ID NO:8). За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло може містити амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYMFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWV STYNGDTNYAQKTQGRVTVTTDTSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCARVLGYY DSIDGYYYGMDVWGQGTTVTVSS (послідовність SEQ ID NO:7) або амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга QSVLTQPPSLSVAPGKTATFTCGGNNIGDKSVHWYRQKPGQAPVLVMYLDTE RPSGIPERMSGSNFGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHWFGGGTKLTVLG (послідовність SEQ ID NO:8). Константна ділянка важкого ланцюга антитіла може бути від людського IgGl або FGFR-3зв'язувального фрагмента антитіла. За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло містить важкий ланцюг, що має послідовність SEQ ID NO:9, і легкий ланцюг, що має послідовність SEQ ID NO:10. За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло містить важкий ланцюг, що має послідовність SEQ ID NO:9, і легкий ланцюг, що має послідовність SEQ ID NO:10, або FGFR-3-зв'язувальний фрагмент антитіла. Згадане антитіло може також містити два важкі ланцюги, що мають послідовність SEQ ID NO:9, і два легкі ланцюги, що мають послідовність SEQ ID NO:10. За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло містить два важкі ланцюги, що мають послідовність SEQ ID NO:9, і два легкі ланцюги, що мають послідовність SEQ ID NO:10, або FGFR-3-зв'язувальний фрагмент антитіла. Згадане антитіло може містити нейтралізуючий людський FGFR-3-зв'язувальний фрагмент. За аспектом, якому віддають перевагу, цей винахід спрямовується на ізольоване антитіло або його фрагмент, де згадане антитіло конкурує за зв'язування з екстрацелюлярним доменом FGFR-3 у твердофазному імуноферментному конкурентному аналізі з конкуруючим антитілом, -8 де згадане конкуруюче антитіло зв'язує FGFR-3 з KD приблизно 110 Μ або менше при кімнатній температурі (20-25 °C). Цей винахід також стосується антитіла, що зв'язується з мутантними формами FGFR-3. Цей винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить згадане антитіло або фрагмент і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цей винахід також стосується продукту, який містить антитіло або фрагмент і додатковий протираковий препарат для лікування у комбінації для одночасного, роздільного або послідовного застосування у терапії. За іншим аспектом цього винаходу, згадане антитіло або фрагмент є призначеним для застосування як лікарський препарат. За іншим аспектом цього винаходу, згадане антитіло або фрагмент є призначеним для застосування при лікуванні раку. За іншим аспектом цього винаходу, згадане антитіло або фрагмент є призначеним для застосування як лікарський препарат, де раком є рак сечового міхура або множинна мієлома. За іншим аспектом цього винаходу, згадане антитіло або фрагмент є призначеним для лікування раку разом з іншим препаратом. Згадане антитіло або фрагмент за цим винаходом може вводитись хворому одночасно, роздільно або послідовно з ефективною кількістю іншого препарату. Згаданий винахід може бути виконаним у вигляді фармацевтичної композиції, яка містить сполуку разом з фармацевтично прийнятним носієм та факультативно інші терапевтичні інгредієнти. Цей винахід також стосується способу лікування раку у хворого, що включає введення згаданому хворому ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Раком може бути рак сечового міхура або множинна мієлома. За іншим аспектом згаданий винахід включає спосіб лікування раку у хворого, що включає одночасне, роздільне або послідовне введення згаданому хворому ефективної кількості антитіла за цим винаходом та іншого препарату. Згаданим іншим препаратом може бути цисплатин. 2 UA 101681 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповідним чином, антитіло за цим винаходом зв'язується з природними або мутантними формами FGFR-3 та індукує деградацію FGFR-3, є здатним до пригнічення пухлин шляхом впливу на пухлинні клітини, а також на стромальні компоненти, має широку терапевтичну цінність при лікуванні раку. Термін "антитіло" охоплює імуноглобулінові молекули, що складаються з 4 поліпептидних ланцюгів, двох ідентичних важких (Н) ланцюгів і двох ідентичних легких (L) ланцюгів, які взаємозв'язуються за допомогою дисульфідного зв'язку. Індивідуальні ланцюги можуть укладатись у домени, що мають однакові розміри (110-125 амінокислот) та однакові структури, але різні функції. "Ізольованим антитілом" є антитіло, яке (1) було частково, значною мірою або повністю очищеним з суміші компонентів; (2) було ідентифікованим та відокремленим та/або виділеним з компоненту його природного середовища; (3) є моноклональним; (4) є вільним від інших білків від того ж самого виду; (5) експресується клітиною від іншого виду; або (6) не зустрічається у природі. Контамінуючими компонентами його природного середовища є матеріали, які можуть перешкоджати діагностичному або терапевтичному застосуванню згаданого антитіла і можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. Прикладами ізольованого антитіла є антитіло, очищене афінним шляхом, антитіло, продуковане гібридомою або іншою лінією клітин in vitro, або людське антитіло від трансгенної миші. Термін "моноклональне антитіло", що застосовують у цьому описі, означає антитіло, яке одержали з популяції по суті гомогенних антитіл, наприклад, індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є по суті ідентичними за виключенням можливих природних мутацій або незначних посттрансляційних варіацій, які можуть бути присутніми. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і спрямовуються проти поодиноких ділянок детермінанти у молекулі антигену (відомої також як антигенна детермінанта або епітоп). На додаток до цього, на відміну від препаратів традиційних (поліклональних) антитіл, які, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних антигенних детермінант, кожне моноклональне антитіло спрямовується проти однієї антигенної детермінанти на антигені. Означення "моноклональне" вказує на характер антитіла, як на одержане з по суті однорідної популяції антитіл, і не може вважатись таким, що потребує продукування згаданого антитіла будь-яким конкретним способом. Термін "людське антитіло", що застосовують у цьому описі, охоплює антитіла, що мають варіабельні та константні ділянки, що відповідають людським зародковим імуноглобуліновим послідовностям, як описано у Kabat et al., Chothia et al. та Martin, supra. Людське антитіло за цим винаходом може включати амінокислотні залишки, що не кодуються людськими зародковими імуноглобуліновими послідовностями (наприклад, мутації, введені неспецифічним або сайтспецифічним мутагенезом in vitro або соматичною мутацією in vivo), наприклад, у гіперваріабельних ділянках (CDRs). Людське антитіло може мати щонайменше одне положення, замінене на амінокислотний залишок, наприклад, амінокислотний залишок, що стимулює активність, який не кодується людською зародковою імуноглобуліновою послідовністю. Однак термін "людське антитіло", що застосовують у цьому описі, не охоплює антитіла, у яких послідовності CDR, які були одержані з зародкової лінії ссавців іншого виду, наприклад, миші, були пересаджені на людські каркасні послідовності. Словосполучення "рекомбінантне людське антитіло" охоплює людські антитіла, які одержують, експресують, створюють або ізолюють рекомбінантними способами, наприклад, антитіла, експресовані за допомогою рекомбінантного вектору експресії, трансфектованого до клітини-хазяїна, антитіла, ізольовані з бібліотеки рекомбінантних, комбінаторних людських антитіл, антитіла, ізольовані з тварини, що є трансгенною за людськими імуноглобуліновими генами або антитіла, одержані, експресовані, створені або ізольовані будь-якими іншими способами, що залучають сплайсування послідовностей людських імуноглобулінових генів до інших послідовностей ДНК. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні та константні ділянки, одержані з людських зародкових імуноглобулінових послідовностей. Легкий ланцюг може містити одну варіабельну ділянку (що скорочено позначається у цьому описі як VL) та/або одну константну ділянку (що скорочено позначається у цьому описі як CL). Легкі ланцюги антитіл є легкими ланцюгами типу каппа (κ) або легкими ланцюгами типу лямбда (λ). Скорочення VL, що застосовують у цьому описі, охоплює як варіабельні ділянки легких ланцюгів типу каппа (Vκ), так і легких ланцюгів типу лямбда (Vλ). Важкий ланцюг може також містити одну варіабельну ділянку (що скорочено позначається у цьому описі як VH) та/або, у залежності від класу або ізотипу антитіла, три або чотири константні ділянки (СН1, СН2, СН3 та СН4). У людей згаданими ізотипами є IgA, IgD,IgE, IgG та IgM, де IgA та IgG додатково підрозділяються на підкласи або підтипи (IgA1-2 та IgG1-4). 3 UA 101681 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід охоплює антитіла будь-якого з вищезгаданих класів або підкласів. Людський IgG є переважним ізотипом для антитіл за цим винаходом. Кожна з VL та VH містить три ділянки, які називають гіперваріабельними ділянками або ділянками, що обумовлюють комплементарність (CDRs), які підтримуються менш варіабельними ділянками, які називають каркасними ділянками (що скорочено позначаються у цьому описі як FR). Амінокислоти конкретної гіперваріабельної ділянки або домену позначаються за номенклатурою Кеботу (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)) або за номенклатурою Chothia (С. Chothia and A.M. Lesk, J. Mol. Biol. 196 (4): 901-917 (1987)) чи номенклатурою Martin, (Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133). Кожна VH та VL складається з трьох гіперваріабельних ділянок (CDRs) та чотирьох каркасних ділянок (FRs), які, у напрямку від аміно-кінця до карбоксильного кінця, розміщуються у такому порядку: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Частина антитіла, що складається з VL та VH, позначається як Fv (варіабельний фрагмент) і представляє собою антигензв'язувальний центр антитіла. Одноланцюговий Fv (scFv) представляє собою фрагмент антитіла, що містить VL та VH на одному поліпептидному ланцюзі, де N-кінець одного домену та С-кінець іншого домену з'єднуються гнучким лінкером (дивись, наприклад, патент США № 4,946,778 (Ladner et al.); WO 88/09344, (Huston et al.). Зв'язувальні характеристики фрагментів є такими ж самими або порівняними із зв'язувальними характеристиками цілого антитіла. Придатні фрагменти антитіла включають будь-який фрагмент, що містить достатню частину гіперваріабельної ділянки (тобто ділянки, що обумовлює комплементарність) для специфічного зв'язування, та який достатньо споріднений для пригнічення росту клітин. Такі фрагменти можуть, наприклад, містити один або обидва Fabфрагменти чи Р(аb')2-фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, фрагменти антитіла містять усі шість гіперваріабельних ділянок цілого антитіла, хоча включаються також функціональні фрагменти, що містять менше ніж усі згадані ділянки, наприклад, три, чотири або п'ять гіперваріабельних ділянок. Фрагментами, яким віддають перевагу, є одноланцюгові антитіла або Fv-фрагменти. Фрагментами, яким віддають більшу перевагу, є бівалентні фрагменти. Одноланцюговими антитілами є поліпептиди, що містять щонайменше варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга з або без взаємозв'язувального лінкера. Таким чином, Fv-фрагменти містять антигензв'язувальний центр антитіла повністю. Ці ланцюги можуть продукуватись у бактеріальних або еукаріотних клітинах. Fab (фрагмент, який зв'язує антиген) означає фрагменти антитіла, що містять VL CL VH СН1 ділянки. Фрагменти, які одержують шляхом простого папаїнового розщеплення, позначаються як Fab і не містять шарнірної ділянки важкого ланцюга. Шляхом пепсинового розщеплення одержують різні Fabs, що містять шарнірну ділянку важкого ланцюга. Такі фрагменти з непошкодженими міжланцюговими дисульфідними зв'язками позначають як F(ab')2, у той час як один Fab'-фрагмент одержують у тому разі, коли дисульфідні зв'язки не зберігаються. Р(аb')2фрагменти мають більшу авідність до антигену, порівняно з моновалентними Fab-фрагментами. Fc (фрагмент, що кристалізується) є позначенням частини або фрагменту антитіла, що містить спаровані константні домени важкого ланцюга. У антитіла IgG, наприклад, Fc містить домени СН2 та СН3. Fc антитіла IgA або IgM додатково містить домен СН4. Fc пов'язують із зв'язуванням Fc-рецептора, активацією комплементопосередкованої цитотоксичності та антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC). Для таких антитіл, наприклад, як IgA та IgM, які представляють собою комплекси численних IgG-подібних білків, утворення комплексу потребує константних доменів фрагмента Fc. Шарнірна ділянка відокремлює Fab- та Fc-фрагменти антитіла із забезпеченням взаємної рухливості Fabs та рухливості відносно Fc, а також включає численні дисульфідні зв'язки для ковалентного зв'язування двох важких ланцюгів. Таким чином, антитіло за цим винаходом охоплює (але ними не обмежується) природні антитіла, людські антитіла, рекомбінантні людські антитіла, моноклональні антитіла, фрагменти розщеплення, бівалентні фрагменти, наприклад, (Fab')2, моновалентні фрагменти, наприклад, Fab, одноланцюгові антитіла Fv (scFv), однодоменні антитіла, мультивалентні одноланцюгові антитіла, діатіла, триатіла і т.п., що специфічно зв'язуються з антигенами. Антитіла за цим винаходом є специфічними до FGFR-3. Специфічність антитіла означає вибіркове розпізнання антитілом конкретної антигенної детермінанти антигену. Згадане антитіло може демонструвати як видову, так і молекулярну селективність або може бути селективним лише відносно молекули і зв'язуватись з FGFR-3 більше ніж одного виду. Антитіло 4 UA 101681 C2 5 10 15 20 25 за цим винаходом може зв'язуватись з людським, мишачим, пацючим, собачим та/або кролячим FGFR-3. За варіантом, якому віддають перевагу, згадане антитіло зв'язується з людським FGFR-3. Були розроблені формати антитіл, що зберігають зв'язувальну специфічність, але також мають інші характеристики. Антитіло за цим винаходом може бути, наприклад, моноспецифічним, біспецифічним або мультиспецифічним. Біспецифічними антитілами (BsAbs) є антитіла, що мають дві різні антигензв'язувальні специфічності або два різних антигензв'язувальних центри. Мультиспецифічні антитіла мають більше двох різних антигензв'язувальних специфічностей або центрів. У разі, якщо антитіло має більше однієї специфічності, розпізнані антигенні детермінанти можуть пов'язуватись з одним антигеном або більше ніж з одним антигеном. Специфічність антитіл проти FGFR-3 може бути визначеною, виходячи із афінності та/або авідності. Афінність, представлена константою дисоціації антигену з антитілом у стані рівноваги (KD), визначає силу зв'язування між антигенною детермінантою та антигензв'язувальним центром антитіла. Авідність є критерієм сили зв'язування між антитілом та антигеном. Авідність пов'язується як з афінністю між антигенною детермінантою та її антигензв'язувальним центром, так і з валентністю антитіла, що означає кількість антигензв'язувальних центрів конкретної антигенної детермінанти. Антитіла, як правило, зв'язуються з константою дисоціації (KD) від -5 -11 приблизно 10 моль/л до приблизно 10 моль/л (наприклад, KD