Модифіковане моноклональне антитіло людини, що специфічно зв’язується з рецептором подібного до інсуліну фактора росту і людини (igf-ir)

1. Модифіковане моноклональне антитіло людини, що специфічно зв’язується з рецептором подібного до інсуліну фактора росту І людини (IGFIR), яке містить важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність варіабельної ділянки, яка відповідає амінокислотним залишкам в позиціях з 20 до 144 SEQ ID NO: 3, і легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність варіабельної ділянки, яка відповідає амінокислотним залишкам в позиціях з 23 до 130 SEQ ID NO: 5. C2 2 (19) 1 3 85058 4 бета субодиниці (95-кДа трансмембранний білок, з Беручи до уваги ролі, які IGF-I і IGF-IR мають в трансмембранними і цитоплазматичними доменатаких порушеннях, як рак, й інших проліферативми). IGF-IR належить до сімейства рецепторів фаних порушеннях, коли IGF-I і/або IGF-IR надекспктора росту тирозинкінази [Ullrich et al., Cell 61: ресовані, і ролі, які дуже малі кількості IGF-I і IGF203-212, 1990] і є структурно подібним до рецепIR мають в порушеннях, коли або IGF-I і/або IGFтора інсуліну [Ullrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, IR недоекспресовані, бажана генерація антитіл до 1986]. IGF-IR спочатку синтезується у вигляді проIGF-IR, які можуть застосовуватися або для інгібурецепторного поліпептиду з єдиним ланцюгом, вання, або для стимуляції IGF-IR. Такі антитіла який проходить обробку за допомогою глікозилюописані, наприклад, в [WO 02/05359, опублікованій вання, протеолітичного розщеплення і ковалентно11 липня 2002]. Текст даної публікації, включаючи го зв'язування для збирання в зрілий 460-кДа гевсі описані послідовності, включений в даний опис теротетрамер, що містить дві альфа-субодиниці і як посилання. IGFlR антитіла також описані в [WO дві бета-субодиниці. Бета субодиниця (субодини03/100008, опублікованій 4 грудня 2003, WO ці) має ліганд-активовану тирозинкіназну актив03/106621, опублікованій 24 грудня 2003, і WO ність. Ця активність включена в сигнальні шляхи, 03/59951, опублікованій 24 липня 2003]. що опосередковують дію ліганду, які включають Даний винахід надає модифіковане моноклоавтофосфорилування бета-субодиниці і фосфональне антитіло людини або його антигензв'язуварилування субстратів IGF-IR. льну частину, в якій щонайменше одна амінокисЗначною мірою роль IGF-I і/або IGF-IR в підлотна послідовність, що пройшла соматичну тримці пухлинних клітин in vitro і in vivo є очевидмутацію, перетворюється в ембріональну амінокиною. Рівні IGF-IR є підвищеними в пухлинах легень слотну послідовність. Переважно, заміщений за[Kaiser et al., J. Cancer Res. Clin Oncol. 119 665лишок міститься у варіабельній області антитіла, і, 668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161більш переважно, заміщений залишок міститься в 1173, 1993, Macauley et al., Cancer Res., 50: 2511каркасній області варіабельної області. 2517, 1990], грудей [Pollak et al., Cancer Lett. 38: Переважно антитіло людини або антигензв'я223-230, 1987; Foekens et al., Cancer Res. 49: 7002зувальна частина згідно з даним винаходом спе7009, 1989; Cullen et al., Cancer Res. 49: 7002цифічно зв'язуються з рецептором подібного до 7009, 1990, Arteaga et al., J. Clin. Invest. 84: 1418інсуліну фактора росту І (IGF-IR). 1423, 1989], простати і товстої кишки [RemaoleВ одному варіанті здійснення послідовність Bennet et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 609-616, варіабельної області легкого ланцюга антитіла 1992; Guo et al., Gastroenterol. 102: 1101-1108, включає три каркасні мутації реверсованих (звер1992]. Розрегульована експресія IGF-I в епітелії нених) зворотно в амінокислотну послідовність, що простати приводить до неоплазії у трансгенних кодується геном лінії ембріона А30. У переважномишей [DiGiovanni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA му варіанті здійснення варіабельна область легко97: 3455-60, 2000]. Крім того, IGF-I, мабуть, є аутого ланцюга містить амінокислотні номери від 23 до кринним стимулятором гліом людини [Sandberg130 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 5. У Nordqvist et al., Cancer Res. 53: 2475-2478, 1993], в навіть більш переважному варіанті здійснення легтой час як IGF-I стимулює ріст фібросарком, які кий ланцюг антитіла людини містить амінокислотні надекспресують IGF-IR [Butler et al., Cancer Res. номери від 23 до 236 SEQ ID NO: 5. 58: 3021-27, 1998]. Додатково, особи з "високими В іншому варіанті здійснення винаходу послінормальними" рівнями IGF-I мають підвищений довність варіабельної області важкого ланцюга ризик до звичайних ракових захворювань в порівантитіла містить дві каркасні мутації, повернені нянні з особами з рівнями IGF-I в "низькому норзворотно в амінокислотну послідовність, що кодумальному" діапазоні [Rosen et al., Trends ється геном лінії ембріона DP-35. У переважному Endocrinol. Metab. 10: 136-41, 1999]. Для огляду варіанті здійснення варіабельна область важкого ролі, яку відіграє взаємодія IGF-I/IGF-I рецептора в ланцюга містить амінокислотні номери від 20 до рості різних пухлин людини, [див. Macaulay, Br. J. 144 SEQ ID NO: 3. У навіть більш переважному Cancer, 65: 311-320, 1992]. варіанті здійснення важкий ланцюг антитіла людиТеплове обмеження є найбільш ефективним і ни містить амінокислотні номери від 20 до 470 відтворюваним впливом для збільшення тривалоSEQ ID NO: 3 і легкий ланцюг містить амінокислості життя у різних видів тварин, включаючи ссавтні номери від 23 до 236 SEQ ID NO: 5. ців. Воно також є найбільш сильнодіючим, з широУ ще одному варіанті здійснення у важкому ким спектром дії режимом запобігання раку в ланцюгу антитіла винаходу відсутній кінцевий ліекспериментальних моделях канцерогенезу. Клюзин. Зокрема, винахід відноситься до антитіла, в човим біологічним механізмом, що лежить в основі якому важкий ланцюг містить амінокислотні номебагатьох його сприятливих ефектів, є шлях подібри від 20 до 469 SEQ ID NO: 3, і легкий ланцюг ного до інсуліну фактора росту-1 [Hursting et al., містить амінокислотні номери від 23 до 236 SEQ ID Annu. Rev. Med. 54:131-52, 2003]. NO: 5. У [ЕР0629240В1] наводиться посилання на Винахід також відноситься до фармацевтичної перетворення послідовності антитіла за допомокомпозиції для лікування раку, де фармацевтична гою рекомбінантної ДНК-технології в ембріональну композиція містить модифіковане антитіло людини послідовність в спробі знизити імуногенність при даного винаходу в поєднанні з антинеопластичвведенні пацієнту. [WO02/066058A1] відноситься ним, хіміотерапевтичним або протипухлинним задо антитіл, направлених на EGF рецептор (HERl), собом і фармацевтично прийнятним носієм. які модифікують іншим чином для зменшення їх Винахід також відноситься до способу лікувансхильності викликати імунну відповідь. ня раку у людини за допомогою антитіла людини, 5 85058 6 що включає в себе стадію введення людині кількотіла 2.12.1fx показана вище, ніж послідовність лінії сті антитіла, ефективної для лікування вказаного ембріона. Сигнальні послідовності показані курсираку. В одному варіанті здійснення винахід відновом, a CDR підкреслені. Область константного ситься до лікування, що включає в себе стадію домену починається з амінокислотних залишків введення антинеопластичного, протипухлинного, TVAA і відповідає амінокислотним залишкам, що антиангіогенного або хіміотерапевтичного засобу в починаються від 131 в лінії ембріона і що продовпоєднанні з антитілом даного винаходу. жуються до кінця послідовності. Каркасні (FR) муВинахід також відноситься до способу лікувантації мають місце при амінокислотних залишках ня пацієнта, що потребує такого лікування, антиті43, 125, і 129. лом шляхом введення пацієнту ефективної кількоФіг.5 показує, що антитіло проти IGF-IR сті антитіла. В одному варіанті здійснення винахід 2.12.1fx інгібує зв'язування IGF-I з 3T3-IGF-IR клівідноситься до лікування, що включає в себе статинами. дію введення антинеопластичного, протипухлинФіг.6А і 6В показують здатність антитіла ного, антиангіогенного або хіміотерапевтичного 2.12.1fx блокува ти опосередковану IGF-I активацію засобу в поєднанні з антитілом даного винаходу. IGF-IR, як показано по зменшеному рецепторВинахід також відноситься до виділеного поліасоційованому фосфорилуванню тирозину нуклеотиду, який містить послідовність нуклеїнової (Фіг.6А), і здатність антитіла 2.12.1fx індукува ти кислоти, яка кодує важкий ланцюг або його антинизхідну регуляцію IGF-IR на клітинах (Фіг.6В). гензв'язувальну частину, або легкий ланцюг або Фіг.7 показує, що антитіло проти IGF-IR його антигензв'язувальну частину антитіла даного 2.12.1fx знижує рівень IGF-IR в 3Т3-IGF-IR п ухливинаходу. В одному варіанті здійснення винаходу нах. винахід також надає спосіб лікування пацієнта, що Фіг.8А і 8В показують, що антитіло проти IGFпотребує цього, за допомогою ефективної кількості IR інгібує ріст пухлини 3Т3-IGF-IR in vivo окремо молекули нуклеїнової кислоти, що кодує важкий (Фіг.8А) або в поєднанні з адріаміцином (Фіг.8В). і/або легкий ланцюг або їх антигензв'язувальні Фіг.9 показує співвідношення між рівнями в сичастини антитіла проти IGF-IR. роватці антитіла проти IGF-IR 2.12.1fx і низхідною Винахід надає вектор, що містить виділену регуляцією IGF-IR протягом часу в 3T3-IGF-IR пухмолекулу нуклеїнової кислоти і клітини-хазяїна, що линах. містить вектор. Винахід додатково містить клітинуФіг.10A і 10В показують, що антитіло проти хазяїна, яка продукує антитіло, що має такі ж аміIGF-IR 2.12.1fx інгібує ріст пухлини CoIo 205 in vivo нокислотні послідовності, як і зрілі важкі і легкі лаокремо (Фіг.10A) або в поєднанні з 5нцюги 2.12.1fx. фтордезоксіуридином (5-FU) (Фіг.10В). Винахід також надає спосіб рекомбінантного Фіг.11 показує фармакокінетичну оцінку одноотримання і культивування антитіла, що кодується кратної внутрішньовенної ін'єкції антитіла проти молекулою нуклеїнової кислоти. IGF-IR 2.12.1fx мавпам Cynomolgus. Винахід також відноситься до діагностичних Всі патенти, патентні публікації й інші наведені способів для діагностики наявності або розташупосилання включені в даний опис як посилання у вання тканини, що експресує IGF-IR, з викорисвсій їх повноті. танням антитіла проти IGF-IR. Якщо не вказано інакше в даному описі, науФіг.1 показує послідовність ДНК, що кодує вакові і технічні терміни, що використовуються в жкий ланцюг антитіла 2.12.1fx, що включає послізв'язку з даним винаходом, будуть мати значення, довність, яка кодує сигнальну послідовність, що які звичайно є зрозумілими для рядових фахівців в використовується для експресії зрілого антитіла даній галузі. Крім того, якщо по контексту не потрі(SEQ ID NO: 1). бно інакше, одиничні терміни будуть включати Фіг.2 показує послідовність ДНК, що кодує легмножини і множинні терміни будуть включати одикий ланцюг антитіла 2.12.1fx, що включає послідоничні. У загальному випадку, номенклатури, що вність, яка кодує сигнальну послідовність, що вивикористовуються в зв'язку з методами і культукористовується для експресії зрілого антитіла рами клітин і тканин, в молекулярній біології, іму(SEQ ID NO: 2). нології, мікробіології, генетиці, хімії білка і нуклеїФіг.3 показує вирівнювання амінокислотної понових кислот і гібридизації, описаних в даному слідовності важкого ланцюга антитіла 2.12.1fx описі, є добре відомими і такими, що звичайно (SEQ ID NO: 3) з такою ж послідовністю лінії ембвикористовуються в даній галузі. Способи і методи ріона DP-35 (3-11)/D3-3/JH6 (SEQ ID NO: 4). Поданого винаходу загалом здійснюються відповідно слідовність антитіла 2.12.1fx показана вище, ніж до загальноприйнятих способів, добре відомих в послідовність лінії ембріона. Сигнальні послідовданій галузі, і описані в різних загальних і більш ності показані курсивом, a CDR підкреслені. Обконкретних посиланнях, які цитуються і обговорюласть константного домену починається з амінокиються по всьому даному опису, якщо не вказано слотних залишків ASTK і відповідає інакше. [Див., наприклад., Sambrook et al. амінокислотним залишкам, що починаються від Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold 148 в лінії ембріона і що продовжуються до кінця Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, послідовності. Каркасні (FR) мутації мають місце N.Y. (1989) і Ausubel et al., Current Protocols in при амінокислотних залишках 21 і 116. Molecular Biology, Greene Publishing Associates Фіг.4 показує вирівнювання амінокислотної по(1992), і Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory слідовності легкого ланцюга антитіла 2.12.1fx Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold (SEQ ID NO: 5) з такою ж послідовністю лінії ембSpring Harbor, N.Y. (1990), які включені в даний ріона А30/Jk1 (SEQ ID NO: 6). Послідовність антиопис як посилання]. Ферментативні реакції і мето 7 85058 8 ди очищення здійснюють відповідно до описів виефекторну функцію. Легкі ланцюги класифікують робника, як звичайно прийнято в даній галузі або як k і l легкі ланцюги. Важкі ланцюги класифікують як описано в даному описі. Номенклатури, що вияк m, D, g, a або e, і визначають ізотип антитіла як користовуються в зв'язку з цим, і лабораторні меIgM, IgD, Ig G, IgA і IgE, відповідно. У легких і важтодики і методи аналітичної хімії, синтетичної орких ланцюгах, варіабельні і константні області об'ганічної хімії і медичної і фармацевтичної хімії, єднані областю "J" з приблизно 12 або більше аміописані в даному описі, є добре відомими і звинокислот, з важким ланцюгом, що також включає чайно застосовуваними в даній галузі. Стандартні область "D" з приблизно 10 або більше амінокисметоди застосовуються для хімічного синтезу, хілот. [Див. загалом, Fundamental Immunology Ch. 7 мічного аналізу, фармацевтичних препаратів, (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, (включено як отримання готових форм, доставки і лікування посилання у всій повноті для всіх цілей)]. Варіабепацієнтів. льні області кожної пари легкий/важкий ланцюг Потрібно розуміти, що наступні терміни, якщо утворюють ділянку зв'язування антитіла таким не вказано інакше, мають наступні значення: чином, що інтактний імуноглобулін має дві ділянки Термін "поліпептид" охоплює природні або зв'язування. штучні білки, білкові фрагменти і поліпептидні Ланцюги імуноглобуліну представляють таку ж аналоги білкової послідовності. Поліпептид може загальну структур у з відносно консервативних карбути мономерним або полімерним. касних областей (FR), об'єднаних трьома гіперваНепептидні аналоги звичайно застосовують в ріабельними областями, також званими областяфармацевтичній промисловості як ліки з властивоми, що визначають комплементарність або CDR. стями, аналогічними властивостям матричного CDR з двох ланцюгів кожної пари вирівняні за допептиду. Ці типи непептидного з'єднання називапомогою каркасних областей, що дозволяють зв'яють "міметиками пептиду" або "пептидоміметиказуватися з конкретним епітопом. Від N-кінця до Сми". [Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); кінця як легкий, так і важкий ланцюги містять доVeber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans мени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), які включені в Віднесення амінокислот до кожного домену знаходаний опис як посилання]. Такі сполуки часто роздиться відповідно до визначень [Kabat Sequences робляють за допомогою комп'ютеризованого моof Proteins of Immunological Interest (National лекулярного моделювання. Міметики пептидів, які Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 і 1991)), є стр уктурно подібними до терапевтично корисних або Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); пептидів, можна застосовувати для отримання Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]. еквівалентного терапевтичного або профілактич"Анти тіло" відноситься до інтактного імуноглоного ефекту. Загалом, пептидоміметики є структубуліну. Ан тигензв'язувальні частини можуть прорно схожими із зразковим поліпептидом (тобто дукуватися методами рекомбінантної ДНК або за поліпептидом, який має необхідну біохімічну власдопомогою ферментативного або хімічного розтивість або фармакологічну активність), таким як щеплення інтактних антитіл. Антигензв'язувальні антитіло людини, але має один або більше пептичастини включають, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, дних зв'язків, необов'язково заміщений зв'язком, dAb і фрагменти областей, що визначають комвибраним з групи, що складається з: -CH2NH-, плементарність (CDR), антитіла з єдиним ланцюCH2S-, -CH2-CH2-, -СН=СН-(цис і транс), -COCH2-, гом (scFv), химерні антитіла, діатіла і поліпептиди, CH(OH)CH2- і CH2SO-, за допомогою способів, які містять щонайменше частину імуноглобуліну, добре відомих в даній галузі. Систематичне заміяка є достатньою для надання специфічного зв'ящення однієї або більше амінокислот консенсусної зування антигену з поліпептидом. послідовності D-амінокислотою того ж типу (наFab фрагмент являє собою моновалентний приклад, D-лізин замість L-лізину) можна також фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і застосовувати для отримання більш стабільних CH І; a F(ab')2 фрагмент являє собою бівалентний пептидів. Крім того, напружені пептиди, що містять фрагмент, що містить два Fab фрагменти, зв'язаконсенсусну послідовність або варіацію, по суті них дисульфідним містком в шарнірній області; Fd ідентичну консенсусній послідовності, можуть бути фрагмент складається з доменів VH і CH1; Fv отримані способами, відомими в даній галузі [Rizo фрагмент складається з доменів VL і VH єдиного and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), плеча антитіла; і dAb фрагмент [Ward et al., Nature включений в даний опис як посилання]; наприклад, 341:544-546, 1989] складається з домену VH. шляхом додавання залишків внутрішнього цистеїАнтитіло з єдиним ланцюгом (scFv) являє сону, здатних до утворення внутрішньомолекулярних бою антитіло, в якому області VL і VH спарені з дисульфідних місточків, які циклізують пептид. утворенням моновалентних молекул через синте"Імуноглобулін" являє собою тетрамерну мотичний лінкер, який дозволяє їм бути отриманими лекулу. У природному імуноглобуліні кожен тетрау вигляді білка з єдиним ланцюгом [Bird et al., мер складений з двох ідентичних пар поліпептидScience 242:423-426, 1988 and Huston et al., Proc. них ланцюгів, кожна пара має один "легкий" Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988]. Діатіла (приблизно 25кДа) і один "важкий" ланцюг (приявляють собою бівалентні, біспецифічні антитіла, близно 50-70кДа). Амінокінцева частина кожного в яких домени VH і VL експресуються на єдиному ланцюга включає варіабельну область з приблизланцюгу поліпептиду, але з використанням лінкено 100-110 або більше амінокислот, спочатку відра, який є дуже коротким для забезпечення спароповідальних за розпізнавання антигену. Карбоксивування між двома доменами на тому ж ланцюгу, кінцева частина кожного ланцюга визначає таким чином, примушуючи домени спарюватися з константну область, спочатку відповідальну за комплементарними доменами іншого ланцюга і 9 85058 10 створюючи дві ділянки зв'язування антигену [див., нення активуюче антитіло додають в присутності наприклад, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. IGF-I або IGF-II. В іншому переважному варіанті USA 90:6444-6448, 1993, and Poljak, R. J., et al., здійснення активність активуючого антитіла виміStructure 2:1121-1123, 1994]. Одна або більше рюють по визначенню кількості автофосфорилуCDR можуть бути включені в молекулу або ковавання тирозину IGF-IR. лентно, або нековалентно, щоб отримати з неї Фрагменти або аналоги антитіл можуть бути імуноадгезин. Імуноадгезин може включати CDR у легко отримані фахівцями в даній галузі, слідуючи вигляді частини більш великого поліпептидного керівництву даного опису. Переважні аміно- і карланцюга, може ковалентно зв'язувати CDR з іншим бокси-кінці фрагментів або аналогів знаходяться поліпептидним ланцюгом, або може включати поруч з межами функціональних доменів. СтруктуCDR нековалентно. CDR дозволяє імуноадгезину рні і функціональні домени можуть бути ідентифіспецифічно зв'язуватися з конкретним антигеном, ковані шляхом порівняння даних нуклеотидної що представляє інтерес. і/або амінокислотної послідовностей із загальноАнтитіло може мати одну або більше ділянок доступними або приватними базами даних послізв'язування. Якщо існує більше однієї ділянки зв'ядовностей. Переважно, способи комп'ютеризовазування, ділянки зв'язування можуть бути ідентичного порівняння застосовуються для ідентифікації ними одна одній або можуть бути різними. Напризображень послідовності або передбачених білкоклад, природний імуноглобулін має дві ідентичні вих конформаційних доменів, які знаходяться в ділянки зв'язування, антитіло з єдиним ланцюгом інших білках відомої структури і/або функції. Відомі або Fab фрагмент мають одну ділянку зв'язування, способи ідентифікації білкових послідовностей, які в той час як "біспецифічне" або "біфункціональне" складаються у відому трьохмірну структуру. [Bowie антитіло має дві різні ділянки зв'язування. et al. Science 253:164 (1991)]. "Виділене антитіло" являє собою антитіло, яке Термін "поверхневий плазмонний резонанс", (1) не є асоційованим з природно-асоційованими як використовується в даному описі, відноситься компонентами, що включають інші природнодо оптичного явища, яке дозволяє провести аналіз асоційовані антитіла, які супроводжують його в в режимі реального часу біоспецифічних взаємойого природному стані, (2) є вільним від інших білдій за допомогою виявлення змін концентрацій ків з тих самих видів, (3) експресується клітинами білка в матриці біосенсора, наприклад, використорізних видів або (4) не зустрічається в природі. вуючи систему ВІАсоге [Pharmacia Biosensor AB, Приклади виділених антитіл включають антитіло Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.]. Для додатпроти IGF-IR, яке являє собою виділене антитіло, кових описів [див. Jonsson, U., et al. (1993) Ann. очищене афінним методом з використанням IGFBiol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) IR, антитіло проти IGF-IR, яке було синтезоване Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) гібридомою або іншими клітинними лініями in vitro, J. MoI. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. і антитіло людини проти IGF-IR, отримане від (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]. трансгенних мишей Термін "Koff" відноситься до уявної константи Термін "антитіло людини" включає всі антитішвидкості дисоціації антитіла з комплексу антитіла, які мають одну або більше варіабельних і конло/антиген. стантних областей, отриманих з послідовностей Термін "Kd" відноситься до константи дисоціаімуноглобуліну людини. У переважному варіанті ції конкретної взаємодії антитіло-антиген. здійснення всі з варіабельних і константних домеЯк використовується в даному описі, двадцять нів отримані з послідовностей імуноглобуліну люзагальновідомих амінокислот і їх скорочення віддини (повністю антитіло людини). Ці антитіла моповідають загальноприйнятому використанню. жуть бути о тримані різними шляхами, як описано [Див. Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. нижче. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, "Нейтралізуюче антитіло" або "інгібіторне анSunderland, Mass. (1991)), які включені в даний титіло" являє собою антитіло, яке інгібує зв'язуопис як посилання]. Стереоізомери (наприклад, Dвання IGF-IR з IGF-I, коли надлишок антитіла проамінокислоти) двадцяти загальновідомих амінокити IGF-IR знижує кількість IGF-I, зв'язаного з IGF-IR слот, неприродних амінокислот, таких як a-, aна щонайменше приблизно 20%. У переважному дизаміщені амінокислоти, N-алкіламінокислоти, варіанті здійснення антитіло знижує кількість IGF-I, молочної кислоти та інших амінокислот, що не є зв'язаного з IGF-IR на щонайменше 40%, більш загальновідомими, можуть також бути прийнятнипереважно, 60%, навіть більш переважно, 80% або ми компонентами поліпептидів даного винаходу. навіть більш переважно, 85%. Зниження зв'язуПриклади амінокислот, що не є загальновідомими, вання може бути виміряне будь-якими засобами, включають: 4-гідроксипролін, g-карбоксиглутамат, відомими рядовому фа хівцеві в даній галузі, наe-Ν,Ν,Ν-триметиллізин, e-Ν-ацетиллізин, Оприклад, як вимірюють в аналізі конкурентного фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формілметіонін, 3зв'язування in vitro. метилгістидин, 5-гідроксилізин, s-N-метиларгінін й "Активуюче антитіло" являє собою антитіло, інші подібні амінокислоти і імінокислоти (наприяке активує IGF-IR на щонайменше приблизно клад, 4-гідроксипролін). В позначенні поліпептиду, 20% при додаванні до клітини, тканини або органіщо використовується в даному описі, напрям лівозму, що експресують IGF-IR. У переважному варіруч являє собою напрям до аміно-кінця, а напрям анті здійснення антитіло активує активність IGF-IR праворуч є напрямом у бік карбокси-кінця, у відпона щонайменше 40%, більш переважно, 60%, навідності зі стандартним використанням і домовлевіть більш переважно, 80% або навіть більш переністю. важно, 85%. У більш переважному варіанті здійс 11 85058 12 Термін "полінуклеотид", як на нього посилаеукаріотів, загалом, такі контрольні послідовності ються в даному описі, означає полімерну форму включають промотори і послідовність закінчення нуклеотидів з щонайменше 10 основ по довжині, транскрипції. Мають на увазі, що термін "контроабо рибонуклеотидів або дезоксинуклеотидів, або льні послідовності" включає, як мінімум, всі компомодифіковану форму якого-небудь типу нуклеотиненти, чия присутність є істотною для експресії і ду. Термін включає форми ДНК з одним і двома процесингу, і може також включати додаткові комтяжами. поненти, чия присутність є благоприємною, наприТермін "виділений полінуклеотид", як викорисклад, лідерні послідовності і послідовності клітин, товується в даному описі, буде означати полінукщо зливаються. леотид геномного, кДНК, або синтетичного похоМають на увазі, що термін "вектор", як викоридження, або деяку їх комбінацію, який внаслідок стовується в даному описі, відноситься до молесвого походження "виділеного полінуклеотиду" (1) кули нуклеїнової кислоти, здатної до транспорту не є асоційованим з всім або частиною полінуклеще однієї нуклеїнової кислоти, з якою вона була отиду, в якому "виділений полінуклеотид" виявлепов'язана. Один тип вектора являє собою "плазміний в природі, (2) функціонально зв'язаний з поліду", яка відноситься до кругової двотяжевої петлі нуклеотидом, з яким він не зв'язаний в природі або ДНК, в яку можуть бути ліговані додаткові сегмен(3) не присутній в природі у вигляді частини більш ти ДНК. Ще один тип вектора являє собою вірусвеликої послідовності. ний вектор, в якому додаткові сегменти ДНК моТермін "природні нуклеотиди", на який посижуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори лаються в даному описі, включає дезоксирибонукздатні до автономної реплікації в клітині-хазяїні, в леотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані яку вони залучені (наприклад, бактерійні вектори, нуклеотиди", на який посилаються в даному описі, що мають бактерійне походження реплікації і епівключає нуклеотиди з модифікованими або замісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприщеними цукровими групами і т.п. Термін "олігонукклад, неепісомальні вектори ссавців) можуть бути леотидні зв'язки", на який посилаються в даному інтегровані в геном клітини-хазяїна при введенні в описі, включає олігонуклеотидні зв'язки, такі як клітину-хазяїна, і за допомогою цього реплікуються фосфоротіоат, фосфородитіоат, фосфороселенопоряд з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори ат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фоздатні направляти експресію генів, з якими вони сфоранілідат, фосфороамідат і т.п. [див. наприфункціонально пов'язані. Такі вектори іменуються клад, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 в даному описі "векторами рекомбінантної експре(1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 сії (або просто, "векторами експресії"). Загалом, (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); вектори експресії, що застосовуються в методах з Zon et al. Anti-Cancer Drag Design 6:539 (1991); Zon рекомбінантною ДНК, часто знаходяться у вигляді et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical плазмід. У даному описі терміни "плазміда" і "векApproach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford тор" можуть застосовуватися взаємозамінно, оскіUniversity Press, Oxford England (1991)); Stec et al. льки плазміда є найбільш загальною формою векU.S. Patent No. 5151510; Uhlmann and Peyman тора, що використовується. Однак мають на увазі, Chemical Reviews 90:543 (1990), розкриття яких що винахід включає такі інші форми векторів ексвключені, таким чином, як посилання]. Олігонуклепресії, як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси отид може включати мітку для виявлення, якщо дефектної реплікації, аденовіруси і аденопотрібно. асоційовані віруси), які виконують еквівалентні "Функціонально пов'язані" послідовності вклюфункції. чають як послідовності контролю експресії, які є Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або суміжними з геном, що представляє інтерес, так і просто "клітина-хазяїн"), як використовується в послідовності контролю експресії, які діють в trans даному описі, призначений для позначення клітиабо на відстані для контролю гена, що представни, в яку впроваджений вектор рекомбінантноїляє інтерес. Термін "послідовність контролю ексекспресії. Потрібно розуміти, що такі терміни відпресії", як використовується в даному описі, відноносяться не тільки до конкретної окремої клітини, ситься до полінуклеотидних послідовностей, які але також до потомства такої клітини. Оскільки в необхідні для здійснення ефекту на експресію і подальших поколіннях можуть відбуватися деякі процесинг кодуючих послідовностей, до яких вони модифікації внаслідок або мутації, або впливів ліговані. Послідовності контролю експресії вклюнавколишнього середовища, таке потомство може, чають відповідні транскрипційні, ініціаційні термінасправді, не бути ідентичним батьківській клітині, наційні промоторні і енхансерні послідовності; сигале все ще включене в об'єм обсягу терміну "клінали ефективного процесингу PHK, такі як сигнали тина-хазяїн", як використовується в даному описі. сплайсингу і поліаденілювання; послідовності, які Посилання на послідовність нуклеїнової кисстабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовнослоти охоплює її комплемент, якщо не вказано інті, які посилюють ефективність трансляції (тобто акше. Таким чином, потрібно розуміти, що посиконсенсусну послідовність Козака); послідовності, лання на молекулу нуклеїнової кислоти, яка має які збільшують стабільність білка; і, при бажанні, конкретну послідовність, охоплює її комплементапослідовності, які посилюють секрецію білка. Прирну нитку з її комплементарною послідовністю. рода таких контрольних послідовностей відрізняЯк використовується в даному описі, терміни ється в залежності від організму хазяїна; у прока"мітка" або "мічені" відноситься до впровадження ріотів такі контрольні послідовності загалом ще однієї молекули в антитіло. В одному варіанті включають промотор, рибосомальну ділянку зв'яздійснення мітка являє собою маркер, що виявлязування і послідовність закінчення транскрипції; у ється, наприклад, впровадження радіоактивно 13 85058 14 міченої амінокислоти або приєднання до поліпепгалузі. Загалом, клас і підклас антитіла може бути тиду біотинільних фрагментів, які можуть бути вивизначений з використанням антитіл, які є специявлені за допомогою маркірованого авідину (нафічними для конкретного класу і підкласу антитіла. приклад, стрептавідину, що містить Такі антитіла є комерційно доступними. Клас і підфлуоресцентний маркер або ферментативну актиклас можуть бути визначені за допомогою ELISA, вність, які можуть бути виявлені за допомогою опвестерн-блоту, а також інших методів. Альтернатичних або колориметричний методів). У ще однотивно, клас і підклас можуть бути визначені секвему варіанті здійснення мітка або маркер можуть нуванням всіх або частини константних доменів бути терапевтичними, наприклад, кон'югатом ліків важких і/або легких ланцюгів антитіл, порівнянням або токсином. Різні способи мічення поліпептидів і їх амінокислотних послідовностей з відомими аміглікопротеїнів відомі в галузі техніки і можуть занокислотними послідовностями різних класів і підстосовуватися. Приклади міток для поліпептидів класів імуноглобулінів і визначенням класу і підвключають, але не обмежуються ними, наступні: класу антитіла. радіоактивні ізотопи або радіонукліди (наприклад, Винахід також надає антитіло проти IGF-IR, 3 H, 14C, 15N, 35S, 90 Y, "Tc, 111In, 125I, 131I)' флуоресяке містить варіабельні послідовності, що кодуцентні мітки (наприклад, FITC, родамін, лантанідні ються геном к людини. У переважному варіанті люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, здійснення варіабельні послідовності кодуються пероксидаза хрону, b-галактозидаза, люцифераза, сімейством генів або Vk А27, А30 або O12. У пелужна фосфатаза), хемілюмінесцентні маркери, реважному варіанті здійснення варіабельні послібіотинільні групи, заздалегідь визначені поліпепдовності кодуються геном Vk А30 людини. У більш тидні епітопи, розпізнавані повторним репортером переважному варіанті здійснення легкий ланцюг (наприклад, лейцинові зипперні парні послідовносмістить три каркасні мутації, звернених назад до ті, ділянки зв'язування для повторних антитіл, доамінокислотної послідовності, що кодується лінією мени зв'язування металів, мітки епітопів), магнітні послідовності ембріона. засоби, такі як хелати гадолінію, токсини, такі як SEQ ID NO 1 надає послідовність ДНК важкого токсини коклюшу, таксол, цитохалазин В, граміциланцюга 2.12.1fx. SEQ ID NO 2 надає послідовдин D, бромід етидію, еметин, мітоміцин, етопоність ДНК легкого ланцюга 2.12.1fx. SEQ ID NO 3 зид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, надає амінокислотну послідовність важкого ландоксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіцюга 2.12.1fx. SEQ ID NO 4 надає амінокислотну он, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1послідовність лінії ембріона DP-35. SEQ ID NO 5 дегідротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, надає амінокислотну послідовність легкого ланцютетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їх га 2.12.1fx і SEQ ID NO 6 надає амінокислотну поаналоги або гомологи. В деяких варіантах здійсслідовність лінії ембріона A30/Jk1. Показані послінення мітки приєднуються за допомогою спейсердовності належать зрілим попередникам антитіл, них плечей різної довжини для зниження потенякі включають сигнальну послідовність. ційного стеричного утр уднення. В одному варіанті здійснення антитіло проти Термін "засіб" використовується в даному опиIGF-IR містить послідовності варіабельної області, сі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних що кодуються сімейством генів людини VH DP-35, сполук, біологічної макромолекули або екстракту, DP-47, DP-70, DP-71 або VIV-4 /4.35. У переважноотриманого з біологічного матеріалу. Термін "фаму варіанті здійснення послідовність варіабельної рмацевтичний засіб або ліки", як використовується області є похідною гена людини VH DP-35. У більш в даному описі, відноситься до хімічної сполуки переважному варіанті здійснення важкий ланцюг або композиції, здатних до індукції бажаного терамістить дві каркасні мутації, звернені назад до аміпевтичного ефекту при належному введенні пацієнокислотної послідовності, що кодується послідонту. Інші хімічні терміни в даному описі використовністю лінії ембріона. вуються відповідно до загальноприйнятого Надані молекули нуклеїнової кислоти, що козастосування в даній галузі, як продемонстровано дують антитіло проти IGF-IR винаходу. в McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms [Parker, В одному варіанті здійснення молекула нуклеS., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985), включеїнової кислоти, що кодує варіабельну область легному в даний опис як посилання]. кого ланцюга є похідною гена А30, А27 або O12 Термін "антинеопластичний засіб" використоVk. У переважному варіанті здійснення легкий лавується в даному описі для позначення засобів, які нцюг є похідним гена А30 Vk. У ще одному перемають функціональну властивість інгібування розважному варіанті здійснення молекула нуклеїнової витку або прогресування неоплазма у людини, кислоти, що кодує легкий ланцюг, містить об'єднуособливо, злоякісного (ракового) пошкодження, ючу область, отриману з Jk1, Jk2 або Jk4. такого як карцинома, саркома, лімфома або лейВинахід також надає молекулу нуклеїнової кикемія. Інгібування метастаз часто є властивістю слоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоантинеопластичних засобів. ти, яка кодує амінокислотну послідовність варіаАнтитіло може являти собою молекулу IgG, бельної області легкого ланцюга 2.12.1fx. IgM, IgE, Ig A або IgD. У переважному варіанті здійВинахід також надає молекулу нуклеїнової киснення антитіло являє собою IgG і є підтипом слоти, що кодує варіабельну область важкого лаIgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. У більш переважному нцюга (VH), яка є похідною гена DP-35, DP-47, DPваріанті здійснення антитіло проти IGF-IR являє 71 або VIV-4/4.35 VH, переважно гена DP-35 VH. У собою підклас IgG2. ще одному переважному варіанті здійснення моКлас і підклас антитіл проти IGF-IR може бути лекула нуклеїнової кислоти, що кодує VH, містить визначений будь-яким способом, відомим в даній об'єднуючу область, отриману з JH6 або JH5, 15 85058 16 більш переважно, JH6. Винахід також надає молеУ ще одному варіанті здійснення молекула нукулу нуклеїнової кислоти, що містить послідовність клеїнової кислоти, що кодує або важкий ланцюг нуклеїнової кислоти, яка кодує амінокислотну поантитіла проти IGF-IR, або його антигензв'язуваслідовність варіабельної області важкого ланцюга льний домен, або легкий ланцюг антитіла проти 2.12.1fx. IGF-IR або його антигензв'язувальний домен, може Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує або бути виділена з тварини, що не є людиною і не є кожний, або обидва цілі важкий і легкий ланцюги мишею, яка експресує гени імуноглобуліну людини антитіла людини, або їх варіабельні області, може і була імунізована антигеном IGF-IR. В іншому вабути отримана з будь-якого джерела, яке продукує ріанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти антитіло людини. Способи виділення мРНК, що може бути виділена з клітини, що продукує антитікодує антитіло, добре відомі в даній галузі техніки. ло проти IGF-IR, отриманої від нетрансгенної тва[Див., наприклад, Sambrook et al.]. мРНК може зарини або від пацієнта-людини, яка продукує антистосовуватися для отримання кДНК при використіла проти IGF-IR. Способи виділення мРНК з танні в полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) або клітин, що продукують антитіло проти IGF-IR, мокДНК-клонуванні генів антитіла. В одному варіанті жуть здійснюватися стандартними методами, з здійснення винаходу молекули нуклеїнової кисловикористанням методів клонування і/або ампліфіти можуть бути отримані з гібридоми, яка експрекації з використанням ПЛР і методів створення сує антитіло проти IGF-IR, як описано вище, перебібліотек, і скринування з використанням стандарважно гібридоми, яка як один з її партнерів для тних методик для отримання молекул нуклеїнової гібридизації має клітину трансгенної тварини, яка кислоти, що кодують важкі і легкі ланцюги проти експресує гени імуноглобуліну людини, такої як IGF-IR. Молекули нуклеїнової кислоти можуть застоXENOMOUSEÔ , нелюдської трансгенної тварини миші або нелюдської трансгенної тварини, що не є совува тися для рекомбінантної експресії великих кількостей антитіл проти IGF-IR, як описано нижче. мишею. IGF-IR антитіла можуть застосовуватися, Молекули нуклеїнової кислоти можуть також зазагалом, до антитіл людини винаходу, на відміну стосовуватися для отримання антитіл з єдиним від інших антитіл, специфічних IGF-IR. ланцюгом, імуноадгезинів, діатіл, антитіл, що заМолекула нуклеїнової кислоти, що кодує цілий важкий ланцюг антитіла проти IGF-IR, може бути знали мутації, і похідних антитіла, як описано далі нижче. побудована гібридизацією молекули нуклеїнової В іншому варіанті здійснення молекули нуклеїкислоти, що кодує варіабельний домен важкого нових кислот винаходу можуть використовуватися ланцюга або її антигензв'язувальний домен, з коняк зонди або ПЛР-праймери для конкретних послістантним доменом важкого ланцюга. Аналогічно, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує легкий довностей антитіла. Наприклад, зонд молекули нуклеїнової кислоти може використовуватися в ланцюг антитіла проти IGF-IR, може бути побудодіагностичних способах або ПЛР-праймер молекувана гібридизацією молекули нуклеїнової кислоти, ли нуклеїнової кислоти може використовуватися що кодує варіабельний домен легкого ланцюга, для ампліфікації областей ДНК, які можуть бути або її антигензв'язувального домену з константним доменом легкого ланцюга. Молекули нуклеїнової використані, між іншим, для виділення послідовностей нуклеїнових кислот для застосування в прокислоти, що кодують ланцюг VH і VL, можуть бути дукуванні варіабельних доменів антитіл проти IGFперетворені в гени антитіла повної довжини, за IR антитіла. У переважному варіанті здійснення допомогою впровадження їх у вектори експресії, молекули нуклеїнових кислоти являють собою що вже кодують константні області важкого ланцюга і легкого ланцюга, відповідно, таким чином, олігонуклеотиди. У більш переважному варіанті здійснення олігонуклеотиди беруться з високоващо сегмент VH функціонально зв'язується з сегріабельних областей важкого і легкого ланцюгів ментом (сегментами) константної області важкого антитіла, що представляє інтерес. ланцюга (CH) у векторі, і сегмент VL функціональВинахід надає вектори, що містять молекули но зв'язується з сегментом константної області легкого ланцюга (CL) у векторі. Альтернативно, нуклеїнової кислоти винаходу, які кодують важкий ланцюг або його антигензв'язувальну частину. молекули нуклеїнової кислоти, що кодують ланцюВинахід також надає вектори, що містять молекули ги VH або VL, перетворюють в гени антитіла понуклеїнової кислоти винаходу, які кодують легкий вної довжини, за допомогою зв'язування, наприланцюг або його антигензв'язувальну частину. клад, лігуванням молекули нуклеїнової кислоти, що кодує ланцюг VH, в молекулу н уклеїнової кисВинахід також надає вектори, що містять молекули нуклеїнової кислоти, що кодують гібридизовані лоти, що кодує ланцюг CH, використовуючи станбілки, модифіковані антитіла, фрагменти антитіла і дартні методи молекулярної біології. Того ж реїх зонди. зультату можна досягнути, використовуючи Для експресії антитіл або частини антитіл вимолекули нуклеїнової кислоти, що кодують ланцюги VL і CL. Послідовності генів константних обласнаходу, ДНК кодуючу частковий або повноланцюговий легкий і важкий ланцюги, отримані як описатей важкого і легкого ланцюгів людини відомі в но вище, вставляють у вектори експресії таким даній галузі. [Див., наприклад, Kabat et al., чином, що гени функціонально зв'язуються з Sequences of Proteins of Imrmmological Interest, 5th транскрипційними і трансляційними контрольними Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991]. Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують важкі і/або легкі ланпослідовностями. Вектори експресії включають плазміди, ретровіруси, косміди, YAC, епісоми, цюги повної довжини, можуть далі експресуватися отримані з EBV, і т.п. Ген антитіла лігований у векз клітини, в яку вони були впроваджені, і може бутор таким чином, що транскрипційні і трансляційні ти виділене антитіло проти IGF-IR. 17 85058 18 контрольні послідовності у векторі виконують їх лікацію вектора в клітині-хазяїні (наприклад, похофункцію призначення регуляції транскрипції і дження реплікації) і виборні маркерні гени. трансляції гена антитіла. Вектор експресії і контВиборний маркерний ген полегшує селекцію клірольні послідовності експресії вибирають так, щоб тин-хазяїнів, в які був введений вектор [див., навони були сумісні з клітиною-хазяїном, що викориприклад, патенти США №№ 4399216, 4634665 і стовується для експресії. Ген легкого ланцюга ан5179017]. Наприклад, звичайно виборні маркерні титіла і ген важкого ланцюга можуть бути вставлегени надають резистентність до ліків, таких як ні в окремий вектор. У переважному варіанті G418, гігроміцин або метотрексат, клітині-хазяїну, здійснення обидва гени вставлені в той самий век в яку був введений вектор. Переважні виборні матор експресії. Гени антитіла вставляють у вектор ркерні гени включають ген дигідрофолатредуктази експресії стандартними способами (наприклад, (DHFR) (для застосування в dhfr-клітині-хазяїні з лігуванням комплементарних рестрикційних сайтів селекцією/ампліфікацією метотрексатом) і ген пео на фрагмент гена антитіла і вектор, або лігуван(для селекції G418). ням дефосфорильованого кінця, якщо відсутні Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують рестрикційні сайти). важкий ланцюг або його антигензв'язувальну часЗручний вектор являє собою вектор, який котину і/або легкий ланцюг або його антигензв'язудує функціонально ,повну послідовність CH або вальну частину антитіла проти IGF-IR винаходу, і CL імуноглобуліну людини, з відповідними сайтавектори, що містять ці молекули нуклеїнової кисми рестрикції, сконструйованими таким чином, що лоти, можуть застосовува тися для трансформації будь-яка послідовність VH або VL може бути легко відповідної клітини-хазяїна. Трансформацію можвставлена і експресована. У таких векторах звина здійснювати будь-яким відомим способом ввечайно відбувається сплайсинг між донорним сайдення полінуклеотидів в клітину-хазяїна. Способи том сплайсу у вставленій області J і акцепторним введення гетерологічних полінуклеотидів в клітини сайтом сплайсу, що передує області C людини, а ссавців добре відомі в даній галузі і включають також в сплайсових областях, які знаходяться в опосередковану декстраном трансфекцію, осаCH екзонах людини. Поліаденілювання і обрив дження фосфа том кальцію, опосередковану політранскрипції відбуваються по природним хромобреном трансфекцію, злиття протопластів, електсомним сайтам в низхідному потоку областей коропорацію, інкапсулювання полінуклеотидів в дування. Рекомбінантний вектор експресії може ліпосоми, болюсну ін'єкцію і пряму мікроін'єкцію також кодувати сигнальний пептид, який полегшує ДНК в ядра. Додатково, молекули нуклеїнової киссекрецію ланцюга антитіла з клітини-хазяїна. Ген лоти можуть бути введені в клітини ссавців за доланцюга антитіла може бути клонований у вектор помогою вірусних векторів. Способи перетворення таким чином, що сигнальний пептид зв'язується в клітин добре відомі в даній галузі. [Див., наприкаркасі з амінокінцем ланцюга гена антитіла. Сигклад, патенти США №№ 4399216, 4912040, нальний пептид може являти собою імуноглобулі4740461 і 4959455 (які включені в даний опис як новий сигнальний пептид або гетерологічний сигпосилання)]. нальний пептид (тобто сигнальний пептид з Клітинні лінії ссавців, доступні як хазяїни для неімуноглобулінового білка). експресії, добре відомі в даній галузі і включають У доповнення до генів ланцюга антитіла, ребагато які іморталізовані клітинні лінії, доступні від комбінантні вектори експресії винаходу несуть American Type Culture Collection (ATCC). Дані лінії регуляторні послідовності, які контролюють ексвключають, між іншим, клітини яєчника китайськопресію генів ланцюга антитіла в клітині-хазяїні. го хом'яка (CHO), NSO, клітини SP2, клітини HeLa, Фахівці в даній галузі оцінять, що дизайн вектора клітини нирки малюка хом'яка (BHK), клітини нирки експресії, включаючи вибір регуляторних послідомавпи (COS), клітини гепатоцелюлярної карциновностей, може залежати від таких чинників, як вими людини (наприклад, Hep G2), клітини А549, бір клітини-хазяїна для трасформації, рівень ексклітини 3Т3 і ряд інших клітинних ліній. Клітинипресії бажаного білка і т.д. Переважні регуляторні хазяїни ссавців включають клітини людини, миші, послідовності для експресії клітини-хазяїна у ссавщура, собаки, мавпи, свині, кози, бика, коня і хоців включають вірусні елементи, які направляють м'яка. Клітинні лінії, що представляють конкретну високі рівні експресії білка в клітинах ссавців, такі перевагу, вибирають за допомогою визначення, які як промотори і/або енхансери, отримані з ретровіз клітинних ліній мають високі рівні експресії. Інші русних LTR, цитомегаловіруса (CMV) (такі як CMV клітинні лінії, які можуть бути використані, являють промотор/енхансер), Simian Virus 40 (SV40) (такі як собою клітинні лінії комах, такі як Sf9 клітини, кліSV40 промотор/енхансер), аденовіруса, (напритини амфібій, бактеріальні клітини, рослинні клітиклад, основний пізній промотор аденовіруса ни і грибні клітини. Коли вектори рекомбінантної (Ad MЛP)), поліоми і сильні промотори ссавців, такі експресії, що кодують важкий ланцюг або його як промотори природних імуноглобуліну і актину. антигензв'язувальну частину, легкий ланцюг і/або Для додаткового опису вірусних регуляторних його антигензв'язувальну частину, вводять в кліелементів і їх послідовностей [див., наприклад, тини-хазяїни ссавців, антитіла продукуються шляпатент США № 5168062 на ім'я Stinski, патент хом культивування клітин-хазяїнів протягом періСША №4510245 на ім'я Bell et al. і патент США оду часу, достатнього для забезпечення експресії №4968615 на ім'я Schaffner et al.]. антитіла в клітинах-хазяїнах, або, більш переважУ доповнення до генів ланцюга антитіла і рено, секреції антитіла в культуральне середовище, гуляторних послідовностей, рекомбінантні вектори в якому вирощують клітини-хазяїни. Антитіла моекспресії винаходу можуть нести додаткові посліжуть бути витягн уті з культурального середовища довності, такі як послідовності, які регулюють реп 19 85058 20 з використанням стандартних способів очищення лику рогату худобу або коней. Трансгенна тварибілка. на, що не є людиною, експресує вказані Додатково, експресія антитіл винаходу (або поліпептиди, що кодуються, в крові, молоці, сечі, інших їх фрагментів) з продукуючих клітинних ліній слині, сльозах, слизу й інши х рідинах організму. може бути посилена з використанням ряду відоРекомбінантні антитіла людини в доповнення мих методів. Наприклад, система експресії гена до антитіл проти IGF-IR, розкритих в даному описі, глутамінсинтетази (GS система) являє собою заможуть бути виділені скринінгом бібліотеки рекомгальний підхід для посилення експресії за деяких бінантних комбінаторних антитіл, переважно фаумов. GS система обговорюється повністю або гової дисплейної бібліотеки scFv, отриманої з вичастково в зв'язку з [Європейськими патентами користанням кДНК VL і VH людини, отриманими з №№ 0216846, 0256055, і 0323997 і Європейською мРНК лімфоцитів людини. Методології отримання і патентною заявкою №89303964.4]. скринінгу таких бібліотек відомі в даній галузі. ІсЙмовірно, антитіла, експресовані різними клінують комерційно доступні набори для формувантинними лініями або в трансгенних тваринах, буня фагових дисплейних бібліотек [наприклад, дуть мати різне один від одного глікозилювання. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Однак всі антитіла, що кодуються молекулами catalog no. 27-9400-01; and Stratagene SurfZAP нуклеїнової кислоти, надані в даному описі, або (фаговий дисплейний набір, catalog no. 240612)]. що містять амінокислотні послідовності, представІснують також інші способи і реагенти, які можуть лені тут, є частиною даного винаходу, незалежно використовува тися для формування і скринінгу від глікозилювання антитіл. дисплейних бібліотек антитіл [див., наприклад, Винахід також надає трансгенних тварин, що Ladner et al. патент США № 5223409; Kang et al. не є людьми, що містять одну або більше молекул PCT Publication No. WO 92/18619; Dower et al. PCT нуклеїнової кислоти за винаходом, які можуть бути Publication No. WO 91/17271; Winter et al. PCT використані для продукування антитіл за винахоPublication No. WO 92/20791; Markland et al. PCT дом. Антитіла можна продукувати і витягува ти з Publication No. WO 92/15679; Breitling et al. PCT тканини або рідин організму, таких як молоко, кров Publication No. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT або сеча, кіз, корів, коней, свиней, щурів, мишей, Publication No. WO 92/01047; Garrard et al. PCT кроликів, хом'яків або інших ссавців. [Див., наприPublication No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) клад, патенти США №№ 5827690, 5756687, Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. 5750172 і 5,741,957]. Як описано вище, трансгенні Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) тварини, що не є людьми, які містять ділянки імуScience 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature ноглобуліну людини, можуть бути отримані імуні(1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J зацією IGF-IR або його частиною. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. MoI. Biol. В іншому варіанті здійснення трансгенних тва226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624рин, що не є людьми, отримують введенням однієї 628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA або більше молекул нуклеїнової кислоти за вина89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology ходом в тварину за допомогою стандартних транс9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid генних методів. Див. Hogan, вище. Трансгенні кліRes 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) Proc. тини, що використовуються для отримання Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982]. трансгенних тварин, можуть являти собою ембріоУ переважному варіанті здійснення, для видінальні стовбурові клітини або соматичні клітини. лення антитіл проти IGF-IR людини з бажаними Трансгенні нелюдські організми можуть бути хихарактеристиками, антитіло людини проти IGF-IR, мерними, нехимерними гетерозиготами і нехимеряк описано в даному документі, спочатку викорисними гомозиготами. [Див., наприклад, Hogan et al., товують для вибору послідовностей важкого і легManipulating the Mouse Embryo: A Laboratory кого ланцюгів людини, що мають схожу активність Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); зв'язування по відношенню до IGF-IR, застосовуюJackson et al., Mose Genetics and Transgenics: A чи способи імпринтингу епітопів, описані в Practical Approach, Oxford University Press (2000); [Hoogenboom et al., PCT Publication No. WO and Pinkert, Transgenic Animal Technology: A 93/06213]. Бібліотеки антитіл, що використовуютьLaboratory Handbook, Academic Press (1999)]. У ще ся в даному способі, переважно являють собою одному варіанті здійснення трансгенні нелюдські бібліотеки scFv, отримані і скриновані, як описано організми можуть мати націлені розрив і заміщенв [McCafferty et al., PCT Publication No. WO ня, які кодує важкий ланцюг і/або легкий ланцюг, 92/01047, McCafferty et al, Nature (1990) 348:552що представляє інтерес. У переважному варіанті 554; і Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734]. здійснення трансгенні тварини містять і експресуБібліотеки scFv антитіл переважно скринують, виють молекули нуклеїнової кислоти, що кодують користовуючи IGF-IR людини як антиген. важкий і легкий ланцюги, які зв'язуються специфіЯк тільки вибирають початкові сегменти VL і чно з IGF-IR, переважно IGF-IR людини. В іншому VH, проводять експерименти "змішування і спароваріанті здійснення трансгенні тварини містять вування", в яких різні пари спочатку вибраних сегмолекули нуклеїнової кислоти, що кодують модиментів VL і VH піддають скринінгу на зв'язування з фіковане антитіло, таке як антитіло з єдиним ланIGF-IR, для вибору переважних парних комбінацій цюгом, химерне антитіло або гуманізоване антитіVL/VH. Додатково, для подальшого поліпшення ло. Антитіла проти IGF-IR можуть бути отримані у якості антитіла сегменти VL і VH переважних пар будь-якої трансгенної тварини. У переважному VL/VH можуть бути піддані випадковій мутації, певаріанті здійснення тварини, що не є людьми, явреважно в області CDR3 VH і/або VL, в способі, ляють собою мишей, щурів, вівців, свиней, кіз, веаналогічному способу соматичної мутації in vivo, 21 85058 22 відповідальному за афінне дозрівання антитіл в У ще одному варіанті здійснення можуть бути процесі природної імунної відповіді. Таке афінне отримані гібридне антитіло або імуноадгезин, які дозрівання in vitro може завершуватися ампліфімістять все або частину антитіла проти IGF-IR, кацією областей VH і VL з використанням ПЛРпов'язані з іншим поліпептидом. У переважному праймерів, комплементарних VH CDR3 або VL варіанті здійснення тільки варіабельні області анCDR3, відповідно, які праймери "вводять проколютитіла проти IGF-IR пов'язані з поліпептидом. В ванням" разом з довільною сумішшю чотирьох іншому переважному варіанті здійснення VH донуклеотидних основ в певних положеннях, таким мен антитіла проти IGF-IR зв'язаний з першим почином, що отримані в результаті продукти ПЛР ліпептидом, в той час як VL домен антитіла проти кодують сегменти VH і VL, в які вводять випадкові IGF-IR зв'язаний з другим поліпептидом, який асомутації в області VH і/або VL CDR3. Ці сегменти, ціюється з першим поліпептидом способом, в якощо зазнали випадкової мутації VH і VL можуть му VH і VL домени можуть взаємодіяти один з одпройти повторний скринінг на зв'язування з IGF-IR. ним з утворенням ділянки зв'язування антитіла. У Після скринінгу і виділення антитіла проти IGFще одному переважному варіанті здійснення VH IR винаходу з дисплейної бібліотеки рекомбінантдомен відділяється від VL домену за допомогою них імуноглобулінів, н уклеїнова кислота, що кодує лінкера, таким чином, що домени VH і VL можуть вибране антитіло, може бути витягн ута з дисплейвзаємодіяти один з одним. VH-лінкер-VL антитіло ної упаковки (наприклад, з фагового генома) і субдалі зв'язуються з поліпептидом, що представляє клонована в інші вектори експресії за допомогою інтерес. Гібридне антитіло застосовне для напрастандартних рекомбінантних ДНК-методів. За бавлення поліпептиду до IGF-IR-експресуючої клітижанням, з нуклеїновою кислотою можна далі прони або тканини. Поліпептид може являти собою вести подальші маніпуляції для створення інших терапевтичний засіб, такий як токсин, фактор росформ антитіла винаходу, як описано нижче. Для ту або інший регуляторний білок, або може бути експресії рекомбінантного антитіла людини, видідіагностичним засобом, таким як фермент, який леного скринінгом комбінаторної бібліотеки, ДНК, може бути легко візуалізований, такий як пероксищо кодує антитіло, клонують в рекомбінантний даза хрону. Крім того, можуть бути створені гібривектор експресії і вводять в клітину-хазяїна ссавдні антитіла, в яких два (або більше) антитіла з ців, як описано вище. єдиним ланцюгом зв'язані одне з іншим. Це є коКлас антитіла проти IGF-IR, отриманого як рисним, якщо бажано створити двовалентне або описано вище, може бути переключений з іншим. полівалентне антитіло на єдиному поліпептидному В одному аспекті винаходу молекулу нуклеїнової ланцюгу, або якщо бажано створити біспецифічне кислоти, яка кодує VL або VH, виділяють, викорисантитіло. товуючи способи, добре відомі в даній галузі, таДля створення антитіла з єдиним ланцюгом ким чином, що вона не включає ніяких послідовно(scFv), VH- і VL-кодуючі фрагменти ДНК функціостей нуклеїнової кислоти, що кодують CL або CH. нально зв'язують з ще одним фрагментом, що коМолекулу н уклеїнової кислоти, що кодує VL або дує гнучкий лінкер, наприклад, що кодує амінокисVH, далі функціонально зв'язують з послідовністю лотну послідовність (Gly4-Ser)3, так, що нуклеїнової кислоти, що кодує CL або CH з різних послідовності VH і VL можуть бути експресовані у класів молекули імуноглобуліну. Цього можна довигляді примикаючого білка з єдиним ланцюгом, з сягнути, використовуючи вектор або молекулу нуобластями VL і VH , об'єднаними гнучким лінкером клеїнової кислоти, які містять ланцюг CL або CH, [див. наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423як описано вище. Наприклад, антитіло проти IGF426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA IR, яке спочатку являло собою IgM, може бути пе85:5879-5883; McCafferty et al, Nature (1990) ремкнене на клас IgG. Додатково, перемикання 348:552-554]. Антитіло з єдиним ланцюгом може класів може застосовуватися для перетворення бути моновалентним, якщо використовують тільки одного підкласу IgG в іншій, наприклад, з IgGl в єдині VH і VL, бівалентним, якщо використовують IgG2. Переважний спосіб отримання антитіла видві VH і VL або полівалентним, якщо використовунаходу, що містить необхідні ізотипи, включає в ють більше двох VH і VL. себе стадії виділення нуклеїнової кислоти, що коУ ще одному варіанті здійснення інші модифідує важкий ланцюг антитіла проти IGF-IR і н уклеїковані антитіла можуть бути отримані з викориснову кислоту, що кодує легкий ланцюг антитіла танням молекул нуклеїнової кислоти, що кодують проти IGF-IR, отримання варіабельної області анти-IGF-IR. Наприклад, "Kappa bodies" [Ill et al., важкого ланцюга, лігування варіабельної області Protein Eng 10: 949-57 (1997)], "Minibodies" [Martin важкого ланцюга з константним доменом важкого et al., EMBO J 13: 5303-9 (1994)], "Diabodies" ланцюга необхідного ізотипу, експресії легкого [Holhger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)], ланцюга і лігованого важкого ланцюга в клітині і або "Janusins" [Traunecker et al., EMBO J 10: 3655збору антитіла проти IGF-IR з необхідним ізоти3659 (1991) і Traunecker et al. "Janusin: new пом. molecular design for bispecific reagents" Int. J. Можна використовувати молекули нуклеїнової Cancer Suppl. 7:51-52 (1992)] можуть бути отримані кислоти, описані вище, для генерації похідних анз використанням стандартних методів молекуляртитіла, застосовуючи методи і способи, відомі ряної біології, слідуючи рекомендаціям опису. довому фахівцеві в даній галузі. Відповідно до Антитіло або частина антитіла по винаходу винаходу, один або більше амінокислотних залишможуть бути дериватизовані або зв'язані з ще одків, що зазнали мутації у вибраних положеннях, нією молекулою (наприклад, іншим пептидом або далі заміняють відповідним залишком лінії ембріобілком). Загалом, антитіла або їх частини деривана. тизують таким чином, що на зв'язування IGF-IR не 23 85058 24 чинить несприятливий вплив дериватизація або помогою рентгенівського випромінювання або інмічення. Відповідно мають на увазі, що антитіла і ших діагностичних методів. Додатково, радіоактичастини антитіл по винаходу включають як інтактвна мітка може використовуватися терапевтично ні, так і модифіковані форми антитіл проти IGF-IR як токсин для ракових клітин або пухлин. Приклалюдини, як описано в даному документі. Наприди міток для поліпептидів включають, але не обклад, антитіло або частина антитіла по винаходу межуються ними, наступні радіоізотопи або радіоможуть бути функціонально пов'язані (за допомонукліди: 3H, 14C, 15N, 35S, 90 Y, 99 Tc, 111In, 1251, 131 I. гою хімічного зв'язування, генетичного злиття, неАнтитіло проти IGF-IR може також бути дериковалентної асоціації або іншим чином) з одним ватизоване хімічною групою, такою як поліетиленабо більше іншими молекулярними об'єктами, тагліколь (PEG), метильна або етильна група або кими як інше антитіло (наприклад, біспецифічне вуглеводна група. Дані групи можуть бути застосоантитіло або діатіло), засіб виявлення, цитотоксивні для поліпшення біологічних характеристик анчний засіб, фармацевтичний засіб і/або білок або титіла, наприклад, для збільшення часу напівжитпептид, які можуть опосередковувати асоціацію тя в сироватці або для збільшення зв'язування з антитіла або частини антитіла разом з іншою мотканиною. лекулою (такою як центральна область стрептавіВинахід також відноситься до фармацевтичної дину або полігістидинова мітка). композиції для лікування гіперпроліферативного Один тип дериватизованого антитіла отримупорушення у ссавця, яка містить терапевтично ють поперечним зшиванням двох або більше анефективну кількість сполуки винаходу і фармацевтитіл (одного типу або різних типів, наприклад, для тично прийнятний носій. В одному варіанті здійсстворення біспецифічних антитіл). Відповідні кроснення вказана фармацевтична композиція призналінкери включають такі, які є гетеробіфункціональчена для лікування раку, такого як рак мозку, ними, маючи дві чітко помітні реакційноздатні грулегені, сквамозних клітин, сечового міхура, шлунпи, розділені відповідним спейсером (наприклад, ка, підшлункової залози, молочної залози, голови, м-малеімідобензоїл-N-гідроксисукцинімідним ефішиї, нирковий, нирки, яєчника, простати, колорекром), або гомобіфункціональними (наприклад, тальний, стравоходу, гінекологічний або щитовиддисукцинімідилсуберат). Такі лінкери доступні від ної залози. Пацієнти, які можуть зазнавати лікуPierce Chemical Company, Rockford, Ill. вання сполукою винаходу у відповідності зі Інший тип дериватизованого антитіла являє способами даного винаходу, включають, наприсобою мічене антитіло. Застосовні засоби виявклад, пацієнтів, яким діагностовані множинна мієлення, за допомогою яких антитіло або частина лома, рідка пухлина, рак печінки, порушення тимуантитіла за винаходом можуть бути дериватизовасу, аутоімунне захворювання, опосередковане Тні, включають флуоресцентні сполуки, включаючи клітинами, ендокринологічне порушення, ішемія, флуоресцеїн, ізотіоціанат флуоресцеїну, родамін, нейродегенеративне порушення, рак легені, рак 5-диметиламін-1-нафталінсульфонілхлорид, фікокісток, рак підшлункової залози, рак шкіри, рак гоеритрин, лантанідні люмінофор і т.п. Антитіло молови і шиї, шкірна або внутрішньоочна меланома, же також бути мічене ферментами, які застосовні рак матки, рак яєчника, рак прямої кишки, рак анальної області, рак шлунка, рак ободової кишки, рак для виявлення, такими як пероксидаза хрону, bмолочної залози, гінекологічні пухлини (наприклад, галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза, саркоми матки, карцинома фалопієвих тр уб, карглюкозоксидаза і т.п. Коли антитіло мічене фермецинома ендометрію, карцинома шийки матки, карнтом, що виявляється, його виявляють шляхом цинома піхви або карцинома вульви), хвороба Хододавання додаткових реагентів, які фермент використовує для отримання продукту реакції, який джкіна, рак стравоходу, рак тонкого кишечника, рак ендокринної системи (наприклад, рак щитовидної можна розпізнати. Наприклад, коли присутня пезалози, паращитовидної залози або наднирників), роксидаза хрону, додавання пероксиду водню і саркоми м'яких тканин, рак уретри, рак пеніса, рак діамінобензидину приводить до забарвленого простати, хронічна або гостра лейкемія, солідні продукту реакції, який є таким, що виявляється. Антитіло може також бути мічене біотином і виявпухлини у дітей, лімфоцитозні лімфоми, рак сечового міхура, рак нирок або уретри (наприклад, калене шляхом непрямого вимірювання зв'язування рцинома клітин нирок, карцинома ниркового таза) авідину або стрептавідину. Анти тіло може бути або неоплазми центральної нервової системи (намічене магнітним засобом, таким як гадоліній. Анприклад, первинна лімфома ЦНС, пухлини хребта, титіло може також бути мічене заздалегідь визначеними поліпептидними епітопами, розпізнаванигліоми стовбура мозку або аденома гіпофіза). В іншому варіанті здійснення вказана фармами за допомогою вторинного репортера цевтична композиція відноситься до неракових (наприклад, парні зипперні послідовності лейцину, гіперпроліферативних порушень, таких як, без сайти зв'язування для вторинних антитіл, домени обмеження, рестеноз після ангіопластики і псоріаз. зв'язування металу, епітопні мітки). У деяких варіантах здійснення мітки приєднують за допомогою У ще одному варіанті здійснення винахід відноситься до фармацевтичної композиції для лікуванспейсерних плечей різної довжини для зниження ня ссавця, яке вимагає активації IGF-IR, де фарможливого стеричного утр уднення. мацевтична композиція містить терапевтично Антитіло проти IGF-IR може також бути мічене ефективну кількість активуючого антитіла винахорадіоактивно міченою амінокислотою. Радіоактивна мітка може використовуватися як для діагносду і фармацевтично прийнятного носія. Фармацевтичні композиції, що містять активуючі антитіла, тичних, так і терапевтичних цілей. Наприклад, раможуть застосовуватися для лікування тварин, діоактивна мітка може використовуватися для яким не вистачає достатньої кількості IGF-I або виявлення пухлин, що експресують IGF-IR, за до 25 85058 26 IGF-II, або можуть застосовуватися для лікування бажаним інгредієнтом з його отриманого раніше остеопорозу, крихкості або порушень, при яких стерильно-фільтрованого. Потрібну текучість розссавець секретує дуже мало активного гормону чину можна підтримувати, наприклад, за допоморосту або нездатний реагувати на гормон росту. гою використання покриття, такого як лецитин, Антитіло проти IGF-IR винаходу може бути підтримкою необхідного розміру частинок у разі введене в фармацевтичні композиції, прийнятні дисперсії і застосування поверхнево-активних редля введення суб'єкту. Звичайно фармацевтична човин. Пролонгована абсорбція ін'єкційних компокомпозиція містить антитіло винаходу і фармацевзицій може бути надана за допомогою включення тично прийнятний носій. Як використовується в в композицію засобу, який затримує абсорбцію, даному описі, "фармацевтично прийнятний носій" наприклад, солей моностеарату і желатину. включає будь-який і всі розчинники, дисперсійні Антитіло даного винаходу можна вводити різсередовища, покриття, антибактерійні і протигрибними способами, відомими в даній галузі, хоч для кові засоби, ізотонічні засоби і засоби, що сповільбагатьох терапевтичних застосувань переважним нюють абсорбцію, і подібні, які є фізіологічно сумішляхом/способом введення є внутрішньоочересними. Приклади фармацевтично прийнятних винний, підшкірний, внутрішньом'язовий, внутрішносіїв включають один або більше з води, фізіолоньовенний або інфузійний. Як буде оцінено досвігічного розчину, забуференого фосфатом фізіолодченим фахівцем в даній галузі, шля х і/або спосіб гічного розчину, декстрози, гліцерину, етанолу і введення буде змінюватися в залежності від бат.п., а також їх поєднання. У багатьох випадках жаних результатів. В одному варіанті здійснення переважно включати в композицію ізотонічні засоантитіло даного винаходу може бути введене у би, наприклад, цукор, поліспирти, такі як маніт, вигляді однократної дози або може бути введене у сорбіт, або хлорид натрію. Фармацевтично прийнвигляді множинних доз. ятні речовини, такі як зволожувальні або мінорні У деяких варіантах здійснення активна сполукількості допоміжних речовин, таких як зволожувака може бути отримана разом з носієм, який буде льні або емульгуючі засоби, консерванти або бузахищати сполук у проти швидкого вивільнення, фери, які збільшують термін зберігання або ефекнаприклад, в готовій формі з вивільненням, що тивність антитіла або частини антитіла. контролюється, що включає імплантати, черезшкіКомпозиції даного винаходу можуть бути рні пластири і мікрокапсульовані системи доставпредставлені у вигляді безлічі форм. Дані форми ки. Можуть застосовуватися біодеградовані, біовключають, наприклад, рідкі, напівтверді і тверді сумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, дозовані форми, такі як рідкі розчини, (наприклад, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, ін'єкційні та інфузійні розчини), дисперсії або суполіортоефіри і полімолочна кислота. Багато які спензії, таблетки, пілюлі, порошки, ліпосоми і суспособи отримання таких готових форм запатенпозиторії. Переважна форма залежить від признатовані або загалом відомі досвідченим фахівцям в ченого способу введення і терапевтичного даній галузі. [Див., наприклад, Sustained and застосування. Типові переважні композиції знахоControlled Release Drug Delivery Systems, J. R. дяться у вигляді ін'єкційних або інфузійних розчиRobinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]. нів, таких як композиції, аналогічні тим, що застоДодаткові активні сполуки можуть також бути совуються для пасивної імунізації людей іншими введені в композицію. У деяких варіантах здійсантитілами. Переважним способом введення є нення антитіло проти IGF-IR винаходу спільно парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, складають в композицію і/або спільно вводять з підшкірний, внутрішньоочеревинний, внутрішньоодним або більше додатковими терапевтичними м'язовий). У переважному варіанті здійснення анзасобами, такими як хіміотерапевтичний засіб, титіло вводять шляхом внутрішньовенної інфузії антинеопластичний засіб або протипухлинний заабо ін'єкції. У ще одному переважному варіанті сіб. Наприклад, антитіло проти IGF-IR може бути здійснення антитіло вводять шляхом внутрішньоспільно складене в композицію і/або спільно ввем'язової або підшкірної ін'єкції. дене з одним або більше додатковим терапевтичТерапевтичні композиції звичайно повинні буним засобом. Дані засоби включають, без обмети стерильними і стабільними в умовах виробницження, антитіла, які зв'язують інші мішені тва і зберігання. Композиція може бути складена у (наприклад, антитіла, які зв'язують один або більвигляді розчину, мікроемульсії, дисперсії, ліпосоми ше факторів росту або цитокінів, їх рецептори кліабо іншої впорядкованої структури, прийнятної для тинної поверхні або IGF-I), IGF-I-зв'язувальні білки, високої концентрації ліків. Стерильні ін'єкційні розантинеопластичні засоби, хіміотерапевтичні засочини можуть бути отримані введенням антитіла би, протипухлинні засоби, антисмислові олігонукпроти IGF-IR в необхідній кількості у відповідний леотиди проти IGF-IR або IGF-I, пептидні аналоги, розчинник з одним інгредієнтом або поєднанням які блокують активацію IGF-IR, розчинний IGF-IR інгредієнтів, перерахованих вище, як потрібно, з і/або один або більше хімічних засобів, які інгібуподальшою стерилізацією фільтруванням. Загають вироблення або активність IGF-I, які відомі в лом, дисперсії отримують введенням активної даній галузі, наприклад, октреотид. Для фармацесполуки в стерильне середовище, яке містить освтичної композиції, що містить активуюче антитіло, новне дисперсійне середовище й інші необхідні антитіло проти IGF-IR може бути введене до склаінгредієнти з перерахованих вище. У разі стерильду композиції разом з фактором, який збільшує них порошків для отримання стерильних ін'єкційпроліферацію клітин або запобігає апоптозу. Такі них розчинів, переважними способами отримання фактори включають фактори росту, такі як IGF-I, є вакуумне сушіння і ліофілізація, які дають пороі/або аналоги IGF-I, які активують IGF-IR. Такі комшок активного інгредієнта разом з додатковим бінаційні терапії можуть вимагати більш низького 27 85058 28 дозування антитіла проти IGF-IR, а також засобів, Приблизний необмежувальний інтервал для що спільно вводяться, таким чином, уникаючи мотерапевтично або профілактично ефективної кільжливих токсичностей або ускладнень, пов'язаних з кості антитіла або частини антитіла винаходу старізними монотерапіями. В одному варіанті здійсновить 0,1-100мг/кг, більш переважно, 0,5-50мг/кг, нення присутні антитіло і один або більше додатбільш переважно, 1-20мг/кг і навіть більш перевакових терапевтичних засобів. жно, 1-10мг/кг. Слід зазначити, що значення дозуФармацевтичні композиції винаходу можуть вання можуть змінюватися з типом і тяжкістю ставключати "терапевтично ефективну кількість" або ну, що підлягає полегшенню. Потрібно далі "профілактично ефективну кількість" антитіла або розуміти, що для будь-якого конкретного пацієнта частини антитіла винаходу. Термін "терапевтично конкретні режими дозування повинні регулюватися ефективна кількість" відноситься до кількості, ефепротягом часу відповідно до індивідуальної потрективної при дозуванні і протягом періодів часу, би і професійною думкою особи, що здійснює ввенеобхідних для досягнення бажаного терапевтичдення або що спостерігає за введенням композиного результату. Терапевтично ефективна кільції, і інтервали дозування, наведені в даному кість антитіла або частини антитіла може змінюваописі, є тільки для прикладу, і мають на увазі, що тися відповідно до чинників, таких як стан вони не обмежують об'єм і практику заявленої захворювання, вік, стать і маса пацієнта, і здатнокомпозиції. В одному варіанті здійснення терапевсті антитіла або частини антитіла викликати бажатично або профілактично ефективну кількість анну відповідь у пацієнта. Терапевтично ефективна титіла або його антигензв'язувальної частини ввокількість також є кількістю, при якій будь-які токсидять нарівні з одним або більше додаткових чні або такі, що погіршують стан, ефекти антитіла терапевтичних засобів. або частини антитіла компенсуються з лишком У ще одному аспекті винахід відноситься до терапевтично сприятливими ефектами. Термін введення антитіла проти IGF-IR винаходу для лі"профілактично ефективна кількість" відноситься кування раку в дозі менш ніж 300мг в місяць. до кількості, ефективної при дозуванні і протягом Інший аспект даного винаходу надає набори, періодів часу, необхідних для досягнення бажанощо містять антитіла проти IGF-IR і фармацевтичні го профілактичного результату. Звичайно, оскільки композиції, що містять дані антитіла. Набір може профілактична доза застосовується для пацієнтів включати, в доповнення до антитіла або фармаперед захворюванням або на його ранній стадії, цевтичної композиції, діагностичні або терапевтипрофілактично ефективна кількість буде меншою, чні засоби. Набір може також включати інструкції ніж терапевтично ефективна кількість. для застосування в діагностичному або терапевРежими дозування можуть бути відрегульовані тичному способі. У переважному варіанті здійсдля забезпечення оптимальної бажаної відповіді нення набір включає антитіло або його фармацев(наприклад, терапевтичної або профілактичної тичну композицію і діагностичний засіб, який може відповіді). Наприклад, можна вводити одиничний застосовуватися в способі, описаному нижче. У ще болюс, декілька розділених доз можна вводити одному переважному варіанті здійснення набір протягом часу або доза може бути пропорційно включає антитіло або його фармацевтичну компознижена або збільшена, як вказано особливостями зицію і один або більше терапевтичних засобів, терапевтичної ситуації. Фармацевтична композитаких як додатковий антинеопластичний засіб, ція, що містить антитіло або що включає комбінапротипухлинний засіб або хіміотерапевтичний заційну терапію, що містить антитіло, і один або бісіб, який може застосовуватися в способі, описальше додаткових терапевтичних засобів, може ному нижче. бути складена для однократної або множинних Даний винахід також відноситься до фармацедоз. Особливо переважно складати парентеральні втичних композицій для інгібування патологічного композиції у вигляді одиничної дозованої форми росту клітин у ссавця, які містять кількість сполуки для простоти введення і однорідності дозування. винаходу в поєднанні з кількістю хіміотерапевтичОдинична дозована форма, як використовується в ного засобу, де кількості сполуки, солі, сольвату даному описі, відноситься до фізично дискретних або проліків і хіміотерапевтичного засобу разом є одиниць, придатних у вигляді одиничного дозуефективними при інгібуванні патологічного росту вання для ссавців пацієнтів, що підлягають лікуклітин. Багато які хіміотерапевтичні засоби в цей ванню; кожна одиниця містить заздалегідь визначас відомі в даній галузі. В одному варіанті здійсчену кількість активної сполуки, розраховану для нення хіміотерапевтичні засоби вибирають з групи, отримання бажаного терапевтичного ефекту в що складається з інгібіторів мітозу, алкілуючих зв'язку з необхідним фармацевтичним носієм. засобів, антиметаболітів, інтеркалюючих антибіоСпецифікація одиничних дозованих форм винахотиків, інгібіторів факторів росту, інгібіторів клітинду диктується і напряму залежить від (а) унікального циклу, ферментів, інгібіторів топоізомераз, них характеристик активної сполуки і конкретного засобів проти виживання, модифікаторів біологічтерапевтичного або профілактичного ефекту, що ної відповіді, антигормонів, наприклад антиандродосягається, і (b) обмежень, властивих даній галузі генів, і засобів проти ангіогенезу. отримання композицій, таких як активна сполука Засоби проти ангіогенезу, такі как інгібітори для лікування чутливості у пацієнтів. Особливо ММР-2 (матрикс-металопротеїнази 2), інгібітори застосовна готова форма являє собою 5мг/мл анММР-9 (матрикс-металопротеїнази 9), і інгібітори титіла проти IGF-IR в буфері з 20мМ цитрату наCOX-II (циклооксигенази II), можуть застосовуватрію, рН 5,5, 140мМ NaCl і 0,2мг/мл полісорбату тись в поєднанні із сполукою винаходу. Приклади 80. застосовних інгібіторів COX-II включають CELEBREXÔ (алекоксиб), валдекоксиб і рофекок 29 85058 30 сиб. Приклади застосовних інгібіторів матриксних (4-пдроксикарбамоїлтетрагідропіран-4металопротеїназ описані в [WO 96/33172 (опублііл)аміно]пропіонова кислота; гідроксіамід 3-екзо-3кованій 24 жовтня 1996), WO 96/27583 (опубліко[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфоніламіно]-8ваній 7 березня 1996), Європейскій патентній заоксабіцикло[3.2.1]октан-3-карбонової кислоти; гідявці No. 97304971.1 (поданій 8 липня 1997), роксіамід 3-ендо-3-[4-(4Європейскій патентній заявці No. 99308617.2 (пофтор фенокси)бензолсульфоніламіно]-8даній 29 жовтня 1999), WO 98/07697 (опубліковаоксабіцикло[3.2.1]октан-3-карбонової кислоти; і ній 26 лютого 1998), WO 98/03516 (опублікованій гідроксіамід (R) 3-[4-(429 січня 1998), WO 98/34918 (опублікованій 13 фтор феноксерпня 1998), WO 98/34915 (опублікованій 13 серси)бензолсульфоніламіно]тетрагідрофуран-3пня 1998), WO 98/33768 (опублікованій 6 серпня карбонової кислоти; і фармацевтично прийнятні 1998), WO 98/30566 (опублікованій 16 липня 1998), солі і сольвати вказаних сполук. публікації Європейської патентної заявки 606046 Сполука винаходу може також застосовувати(опублікованій 13 липня 1994), публікації Європейся разом з інгібіторами сигнальної трансдукції, ської патентной заявки 931788 (опублікованій 28 такими як засоби, які можуть інгібувати відповіді липня 1999), WO 90/05719 (опублікованій 31 травEGF-R (рецептор епідермального фактора росту), ня 1990), WO 99/52910 (опублікованій 21 жовтня такі як EGF-R антитіла, EGF антитіла, і молекули, 1999), WO 99/52889 (опублікованій 21 жовтня які є інгібіторами EGF-R; інгібітори VEGF (фактор 1999), WO 99/29667 (опублікованій 17 червня росту судинного ендотелію), такі як VEGF рецеп1999), міжнародній заявці No. PCT/IB98/01113 (потори і молекули, які можуть інгібувати VEGF; і інгіданій 21 липня 1998), Європейскій патентній заявбітори еrbВ2 рецептора, такі як органічні молекули ці No. 99302232.1 (поданій 25 березня 1999), патеабо антитіла, які зв'язуються з рецептором erbВ2, нтній заявці Великобританії номер 9912961.1 наприклад, HERCEPTINÔ (Genentech, Inc.). Інгібі(поданій 3 червня 1999), попередній патентній затори EGF-R описані, наприклад в [WO 95/19970 явці США No. 60/148464 (поданій 12 серпня 1999), (опублікованій 27 липня 1995), WO 98/14451 (опупатенті США 5863949 (виданому 26 січня 1999), блікованій 9 квітня 1998), WO 98/02434 (опублікопатенті США 5861510 (виданому 19 січня 1999) і ваній 22 січня 1998) і патенті США 5747498 (видапублікації Європейскої патентної заявки 780386 ному 5 травня 1998)], і такі речовини можуть (опублікованій 25 червня 1997), всі з яких включені застосовуватися в даному винаході, як описано в в даний документ у всій їх повноті як посилання]. даному документі. Засоби, що інгібують EGFR Переважними інгібіторами MMP являються ті, які включають, але не обмежуються ними, моноклоне демонструють артралгію. Більш переважними є нальні антитіла С225 і анти-EGFR 22Mab (ImClone ті, які селективно інгібують ММР-2 і/або ММР-9 по Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell відношенню до інших матрикс-металопротеїназ Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (т.е MMP-1, ММР-3, ММР-4, ММР-5, ММР-6, ММР(Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. і Merck 7, ММР-8, MMP-10, MMP-11, ММР-12 і ММР-13). KgaA) і сполуки ZD-1834, ZD-1838 і ZD-1839 Деякими конкретними прикладами інгібіторів MMP, (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGPзастосовних у даному винаході, є AG-3340, RO 3275166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 3555, RS 13-0830 і сполуки, перераховані в насту(Cephalon), лефлуномід (Pharmacia/Sugen), CIпному списку: 1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 гідроксикарбамоїлциклопентил)аміно]пропіонова (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim кислота; гідроксіамід 3-екзо-3-[4-(4GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), фтор фенокси)бензолсульфоніламіно]-8RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer оксабіцикло[3.2.1]октан-3-карбонової кислоти; гідIngelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 роксіамід (2R,3R) 1-[4-(2-хлор-4(Ventech Research), токсин злиття EGF (Seragen фторбензилокси)бензолсульфоніл]-3-гідрокси-3Inc.), D AB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 метилпіперидин-2-карбонової кислоти; гідроксіамід (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 4-[4-(4(INSERM), LFM-Al2 (Parker Hughes Cancer Center), фтор фенокWHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GWси)бензолсульфоніламіно]тетрапдропіран-4282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) і EGF-R карбонової кислоти; 3-[[4-(4Vaccine (York Medical/Centro de Immunologia фтор фенокси)бензолсульфоніл]-(1Molecular (СІМ)). Ці та інші засоби, які інгібують гідроксикарбамоїлциклобутил)аміно]пропіонова EGF-R, можуть застосовуватися в даному винахокислота; гідроксіамід 4-[4-(4ді. хлорфенокІнгібітори VEGF, наприклад, SU-5416 і SUси)бензолсульфоніламіно]тетрапдропіран-46668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) і NX-1838 карбонової кислоти; гідроксіамід (R) 3-[4-(4(NeXstar) можна також об'єднувати із сполуками хлорфенокданого винаходу. Інгібітори VEGF описані, наприси)бензолсульфоніламіно]тетрагідропіран-3клад, в [WO 99/24440 (опублікованій 20 травня карбонової кислоти; гідроксіамід (2R,3R) 1-[4-(41999), міжнародній заявці PCT РСТ/ІВ99/00797 фтор-2-метилбензилокси)бензолсульфоніл]-3(поданій 3 травня 1999), WO 95/21613 (опублікогідрокси-3-метилпіперидин-2-карбонової кислоти; ваній 17 серпня 1995), WO 99/61422 (опублікованій 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(12 грудня 1999), патенті США 5834504 (виданому пдроксикарбамоїл-1-метилетил)аміно]пропіонова 10 листопада 1998), WO 98/50356 (опублікованій кислота; 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]12 листопада 1998), патенті США 5883113 (вида 31 85058 32 ному 16 березня 1999), патенті США 5886020 (витегафур, доксифлуридин, кармофур, цитарабін, даному 23 березня 1999), патенті США 5792783 октофосфат, еноцитабін, S-1, гемцитабін, флуда(виданому 11 серпня 1998), WO 99/10349 (опублірабін і капецитабін; кованій 4 березня 1999), WO 97/32856 (опублікоантибіотики: актиноміцин D, доксорубіцин, даваній 12 вересня 1997), WO 97/22596 (опубліковаунорубіцин, неокарциностатин, блеоміцин, пеплоній 26 червня 1997), WO 98/54093 (опублікованій 3 міцин, мітоміцин C, акларубіцин, пірарубіцин, епігрудня 1998), WO 98/02438 (опублікованій 22 січня рубіцин, циностатин, стималамер і ідарубіцин. 1998), WO 99/16755 (опублікованій 8 квітня 1999) і протипухлинні засоби, отримані з рослин: вінкWO 98/02437 (опублікованій 22 січня 1998), всі з ристин, вінбластин, віндешин, етопозид, собузокяких включені в даний опис у всій їх повноті як сан, доцетаксел, паклітаксел і вінорелбін; посилання]. Інші приклади деяких конкретних інгікоординаційні сполуки платини: цисплатин, біторів VEGF, застосовних в даному винаході, явкарбоплатин, недаплатин і оксаліплатин; ляють собою ІМ862 (Cytran Inc.); і ангіозим, синтепохідні камптотецину: іринотекан, топотекан і тичний рибозим від Ribozyme і Chiron. Ці та інші камптотецин; інгібітори VEGF можуть бути використані в даному інгібітор тирозинкінази: гефітиніб; винаході, як описано в даному документі. засоби проти CD20: ритуксимаб, тоситумомаб Інгібітори рецептора ErbВ2, такі як GW-282974 і тіуксетан ібритумомаба; (Glaxo Wellcome рlс), і моноклональні антитіла ARінтерферони: інтерферон альфа, інтерферон 209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) і 2В-1 (Chiron) альфа-2а, інтерферон альфа-2b, інтерферон бета, можуть, крім того, бути об'єднані із сполуками виінтерферон гамма-1a і інтерферон гамма-n1; находу, наприклад, такими, як вказано в [WO модифікатори біологічної відповіді: хрестин, 98/02434 (опублікованій 22 січня 1998), WO лентинан, сизофіран, піцибаніл і убенімекс; і 99/35146 (опублікованій 15 липня 1999), WO інші протипухлинні засоби: мітоксантрон, 199/35132 (опублікованій 15 липня 1999), WO аспарагіназа, прокарбазин, дакарбазин, гідрокси98/02437 (опублікованій 22 січня 1998), WO карбамід, пентостатин і третиноїн. 97/13760 (опублікованій 17 квітня 1997), WO Додатково, антитіло винаходу може поєднува95/19970 (опублікованій 27 липня 1995), патенті тися з протираковими засобами ексемкетан, едоСША 5587458 (виданому 24 гр удня 1996) і патенті текарин (J-107088) і SU11248. США 5877305 (виданому 2 березня 1999), які всі Антитіло проти IGF-IR може використовувативключені в даний опис у всій їх повноті як посися для виявлення IGF-IR в біологічному зразку in лання]. Інгібітори рецепторів ErbВ2, застосовні в vitro або in vivo. Антитіло проти IGF-IR може застоданому винаході, також описані в ;попередній пасовува тися в загальноприйнятому імунологічному тентній заявці США No. 60/117341, поданій 27 січаналізі, що включає, без обмеження, ELISA, RIA, ня 1999, і попередній патентній заявці США No. FACS, тканинну імуногістохімію, вестерн-блот або 60/117346, поданій 27 січня 1999, які обидві вклюімуноосадження. Антитіло проти IGF-IR винаходу чені у всій їх повноті в даний опис як посилання'. може використовуватися для виявлення IGF-IR від Інгібіторні сполуки рецептора erbВ2 і речовини, людей. В іншому варіанті здійснення антитіло проописані у вищезазначених заявках PCT, патентах ти IGF-IR може використовуватися для виявлення США і попередніх заявках США, а також інші споIGF-IR від приматів Старого Світу, таких як мавпи луки і речовини, які інгібують рецептор erbВ2, моcynomolgus і rhesus, шимпанзе і макак. Винахід жуть застосовуватися разом із сполуками даного надає спосіб для виявлення анти-IGF-IR в біологівинаходу відповідно до даного винаходу. чному зразку, що включає в себе контактування Антитіло винаходу може також застосовуватибіологічного зразка з антитілом проти IGF-IR винася з антитілами CTLA-4, такими як описано в [паходу і виявлення антитіла, зв'язаного з анти-IGFтенті США 6682736], включаючи антитіло, що має IR, для виявлення IGF-IR в біологічному зразку. В послідовність антитіла 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, одному варіанті здійснення антитіло проти IGF-IR 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 безпосередньо мітять міткою, що виявляється. У або 12.9.1.1. Антитіло може також застосовуватися ще одному варіанті здійснення антитіло проти IGFз антитілами CD40, такими як описано в IR (перше антитіло) є неміченим, а друге антитіло [WO03040170, опублікованій 15 травня 2003], або інша молекула, які можуть зв'язувати антитіло включаючи антитіло, що має послідовність антитіпроти IGF-IR, є міченим. Як добре відомо фахівцела 3.1. 1,3. 1.1Н-А78Т, 3.1. 1H-A78T-V88A-V97A, ві в даній галузі, друге антитіло вибирають так, що 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Нвоно здатне специфічно зв'язувати конкретні види С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, і клас першого антитіла. Наприклад, якщо антитіло 23.29.1 або 24.2. проти IGF-IR являє собою IgG людини, тоді втоАнтитіла можуть також бути об'єднані з засоринне антитіло може являти собою антитіло проти бами проти інтегрину, такими як антитіла проти IgG людини. Інші молекули, які можуть зв'язуватиінтегрину. ся з антитілами, включають, без обмеження, Білок Деякі конкретні приклади засобів, з якими анА і Білок G, які обидва є промислово доступними, титіло може бути об'єднане, включають наступні: наприклад, від Pierce Chemical Co. алкілуючі засоби: N-оксид гірчичного азоту, Відповідні мітки для антитіла або вторинні циклофосфамід іфосфамід, мелфалан, бусулфарозкриті вище і включають різні ферменти, простенмітобронітол, карбоквон, тіотепа, ранімустин, тичні групи, флуоресцентні речовини, люмінесценнімустин і темозоломід; тні речовини, магнітні засоби і радіоактивні речоантиметаболіти: метотрексат, 6вини. Приклади прийнятних ферментів включають меркаптопурин, рибозид, меркаптопурин, 5-FU, пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, b 33 85058 34 галактозидазу або ацетилхолінестеразу; приклади бути масштабовані для високопродуктивного прийнятних комплексів з простетичною групою скринінгу для тестування великої кількості сполук включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин; або для активації або інгібування IGF-IR. приклади прийнятних флуоресцентних речовин Антитіло проти IGF-IR винаходу можна також включають умбеліферон, флуоресцеїн, ізотіоціавикористовува ти для визначення рівнів IGF-IR в нат флуоресцеїну, родамш, дихлортриазиніламін тканині або клітинах, отриманих з тканини. У перефлуоресцеїну, дансилхлорид або фікоеритрин; важному варіанті здійснення тканина являє собою приклад люмінесцентної речовини включає люміхвор у тканину. У більш переважному варіанті здійнол; приклад магнітного засобу включає гадоліній; снення тканина являє собою пухлину або її біоі приклади відповідної радіоактивної речовини псію. У переважному варіанті здійснення способу включають 125l, 131I, 35S або 3H. тканину або її біопсію вирізають у пацієнта. ТканиВ альтернативному варіанті здійснення IGF-IR ну або біопсію далі використовують в імуноаналізі можна аналізувати в біологічному зразку з допомодля визначення, наприклад, рівнів IGF-IR, рівнів гою конкурентного імуноаналізу, використовуючи IGF-IR на поверхні клітин, рівнів фосфорилювання стандарти IGF-IR, мічені речовиною, що виявлятирозину IGF-IR або локалізації IGF-IR способами, ється, і немічене антитіло проти IGF-IR. У цьому обговореними вище. Спосіб можна застосовувати аналізі біологічний зразок, мічені стандарти IGF-IR для визначення пухлинної експресії IGF-IR на виі антитіло проти IGF-IR об'єднують і визначають сокому рівні. кількість міченого стандарту IGF-IR, зв'язаного з Описаний вище діагностичний спосіб можна неміченим антитілом. Кількість IGF-IR в біологічзастосовувати для того, щоб визначити, чи ексному зразку зворотно пропорційна кількості мічепресує пухлина високі рівні IGF-IR, що може вказуного стандарту IGF-IR, зв'язаного з антитілом провати на те, що пухлина буде добре реагувати на ти IGF-IR. лікування антитілом проти IGF-IR. Діагностичний Можна застосовувати імуноаналізи, розкриті спосіб можна також застосовувати для того, щоб вище для ряду цілей. В одному варіанті здійснення визначити, чи є пухлина потенційно раковою, якщо антитіло проти IGF-IR можна використовувати для вона експресує високі рівні IGF-IR, або доброякісвиявлення IGF-IR в клітинах в клітинній культурі. У ною, якщо вона експресує низькі рівні IGF-IR. Крім переважному варіанті здійснення антитіло проти того, діагностичний спосіб може також застосовуIGF-IR можна застосовувати для визначення рівня ватися для того, щоб визначити, чи приводить фосфорилювання тирозину, авто фосфорилюванлікування антитілом проти IGF-IR (див. нижче) до ня тирозину IGF-IR і/або кількості IGF-IR на клітинекспресії пухлиною більш низьких рівнів IGF-IR ній поверхні після обробки клітини різними сполуі/або експресії більш низьких рівнів автофосфориками. Даний спосіб можна використовувати для лювання тирозину, і, таким чином, може застосотестування сполук, які можуть застосовуватися вуватися для того, щоб визначити, чи є лікування для активації або інгібування IGF-IR. У даному успішним. Загалом, спосіб визначення того, чи способі один зразок клітини обробляють сполукою знижує антитіло проти IGF-IR фосфорилювання протягом періоду часу, що тестується, в той час як тирозину, включає в себе стадії вимірювання рівня ще один зразок залишають необробленим. Якщо фосфорилювання тирозину в клітині або тканині, треба провести вимірювання автофосфорилюванщо представляє інтерес, інкубації клітини або тканя тирозину, клітини лізують і вимірюють фосфонини з антитілом проти IGF-IR або його антигензрилювання тирозину IGF-IR, використовуючи імув'язувальною частиною, потім повторного вимірюноаналіз, описаний вище, або як описано раніше з вання рівня фосфорилювання тирозину в клітині використанням ELISA. Якщо вимірюють загальний або тканині. Можна вимірювати фосфорилювання рівень IGF-IR, клітини лізують і вимірюють загальтирозину IGF-IR або інших білків. Діагностичний ний рівень IGF-IR, використовуючи один з імуноспосіб можна також застосовувати для визначення аналізів, описаних вище. того, що тканина або клітина не експресують доПереважним імуноаналізом для визначення сить високі рівні IGF-IR або досить високі рівні акфосфорилювання тирозину IGF-IR або для вимітивованого IGF-IR, які можуть мати місце у разі рювання загальних рівнів IGF-IR є ELISA або Весхворих з нанізмом, остеопорозом або діабетом. терн-блот. Якщо вимірюють тільки рівень IGF-IR Діагноз того, що рівні IGF-IR або активний IGF-IR є на поверхні клітин, то клітини не лізують і вимірюдуже низькими, міг би застосовуватися для лікують рівні IGF-IR на поверхні клітин, використовуювання активуючими антитілами проти IGF-IR, IGF-I чи один з імуноаналізів, описаних вище. Переважабо іншими терапевтичними засобами для підвиний імуноаналіз для визначення рівнів IGF-IR на щення рівнів або активності IGF-IR. поверхні клітин включає стадії мічення білків повеНа основі здатності антитіла даного винаходу рхні клітин міткою, що виявляється, такою як біорегулювати по низхідній IGF-IR на периферичних тин або 125I, імуноосадження IGF-IR антитілом пролімфоцитах, може використовуватися "стратегія ти IGF-IR і потім виявлення міченого IGF-IR. Ще біомаркерів" для реєстрації експресії IGF-IR на один переважний імуноаналіз для визначення лоциркулюючій пухлині і/або нормальних клітинах від калізації IGF-IR, наприклад, рівнів на поверхні кліпацієнтів, яких лікують антитілом винаходу. Ін ші тин, полягає у використанні імуногістохімії. Спосоантитіла, такі як антитіла, описані в [WO 02/05359, би, такі як ELISA, RIA, Вестерн-блот, опублікованій 11 липня 2002], також можуть викоімуногістохімія, мічення інтегральних мембранних ристовуватися. Ці клітини можуть включати, але білків поверхні клітин і імунопреципітація, є добре не обмежуються ними, CD19+ клітини і можуть відомими в даній галузі. Див., наприклад, Harlow також включати всі білі кров'яні клітини, такі як and Lane, вище. Крім того, імуноаналізи можуть моноцити, гранулоцити і лімфоцити. 35 85058 36 Антитіло даного винаходу можна також застотить важкий ланцюг, легкий ланцюг або їх антигенсовува ти in vivo для локалізації тканин і органів, які зв'язувальну область. експресують IGF-IR. У переважному варіанті здійВ іншому переважному варіанті здійснення анснення антитіло проти IGF-[R можна застосовуватитіло проти IGF-IR може бути введене пацієнту, ти для локалізації IGF-IR-експресуючих пухлин. який експресує невідповідно високі рівні IGF-I, наСпосіб включає в себе стадії введення антитіла приклад, у разі порушення, при якому активність проти IGF-IR або його фармацевтичної композиції IGF-IR є шкідливою. Як використовується в даному пацієнту, що потребує такого діагностичного тесту, описі, мають на увазі, що термін "порушення, при і візуалізаційного аналізу пацієнта для визначення якому активність IGF-IR є шкідливою", включає локалізації IGF-IR-експресуючих тканин. Візуалізазахворювання і інші порушення, при яких продеційний аналіз добре відомий в медичній галузі і монстрована присутність високих рівнів IGF-IR у включає, без обмеження, рентгенівський аналіз, пацієнта, що страждає від порушення, або підомагнітно-резонансну томографію (MRI) або комзрюється, що воно є або відповідальним за патоп'ютерну томографію (CE). В іншому варіанті здійфізіологію порушення, або є чинником, який роснення способу від пацієнта отримують біопсію, бить внесок в погіршення порушення. Відповідно, щоб визначити, чи експресу є тканина, що предпорушення, при якому високі рівні активності IGFставляє інтерес, IGF-IR в більшій мірі, ніж при проIR є шкідливими, являє собою порушення, при ходженні пацієнтом візуалізаційного аналізу. У якому очікується, що інгібування активності IGF-IR переважному варіанті здійснення антитіло проти полегшить симптоми і/або прогресування поруIGF-IR може бути мічене детектованим засобом, шення. Такі порушення можуть підтверджуватися, який може бути візуалізований у пацієнта. Напринаприклад, за допомогою збільшення рівнів IGF-IR клад, антитіло може бути мічене контрастним зана поверхні клітин або збільшеним автофосфорисобом, таким як барій, який можна застосовувати люванням тирозину IGF-IR в уражених клітинах для рентгенівського аналізу, або магнітним контабо тканинах пацієнта, що страждає від порушенрастним засобом, таким як хелат гадолінію, який ня. Збільшення рівнів IGF-IR може бути виявлене, можна застосовувати для MRI або CE. Інші засоби наприклад, з використанням антитіла проти IGFмічення включають, без обмеження, радіоізотоп, IR, як описано вище. такий як 99Tc. У ще одному варіанті здійснення В одному аспекті антитіло проти IGF-IR викоантитіло проти IGF-IR буде неміченим і буде візуристовують для лікування неракових станів, при алізоване шляхом введення другого антитіла або яких високі рівні IGF-I і/або IGF-IR асоційовані з іншої молекули, яка детектується і яка може зв'янераковим станом або захворюванням. В одному зувати антитіло проти IGF-IR. варіанті здійснення спосіб включає в себе стадію У ще одному варіанті здійснення винахід навведення антитіла проти IGF-IR пацієнту з неракодає спосіб інгібування активності IGF-IR шляхом вим патологічним станом, викликаним або ускладвведення антитіла проти IGF-IR даного винаходу неним високими рівнями IGF-I і/або рівнями або пацієнту, що потребує цього. Антитіло даного виактивністю IGF-IR. У переважному варіанті здійснаходу можна застосовувати терапевтично. В іннення нераковий патологічний стан являє собою шому переважному варіанті здійснення IGF-IR є акромегалію, гігантизм, псоріаз, атеросклероз, людським, і пацієнт є людиною. Альтернативно, рестеноз гладкої мускулатури кровоносних судин пацієнт може бути ссавцем, який експресує IGF-IR, або невідповідну мікросудинну проліферацію, таку з яким антитіло проти IGF-IR перехресно реагує. як виявляють у вигляді ускладнення діабету, осоАнтитіло може бути введене ссавцеві, що не є бливо на очі. У більш переважному варіанті здійслюдиною, який експресує IGF-IR, з яким антитіло нення антитіло проти IGF-IR сповільнює протіканперехресно реагує (тобто примату або мавпам ня неракового патологічного стану. У більш cynomolgus або резус), для ветеринарних цілей переважному варіанті здійснення антитіло проти або як тваринна модель захворювання людини. IGF-IR з упиняє або обертає щонайменше часткоТакі тваринні моделі можуть бути корисними для во, нераковий патологічний стан. оцінки терапевтичної ефективності антитіла даноУ даній галузі відомо, що експресія IGF-I на го винаходу. високому рівні може приводити до різних звичайУ переважному варіанті здійснення антитіло них ракових захворювань. У більш переважному проти IGF-IR може бути введене пацієнту, який варіанті здійснення антитіло проти IGF-IR вводять має пухлину, яка експресує IGF-IR. Пухлина може пацієнту з раком простати, гліомою або фібросарявляти собою солідну пухлину або може бути некомою. У навіть більш переважному варіанті здійссолідною пухлиною, такою як лімфома. У більш нення спосіб викликає зупинку аномальної проліпереважному варіанті здійснення антитіло проти ферації при раку або відсутність збільшення маси і IGF-IR може бути введене пацієнту, який має пухоб'єму, або зменшення маси і об'єму. лину, що експресує IGF-IR, яка є раковою. У навіть В одному варіанті здійснення вказаний спосіб більш переважному варіанті здійснення антитіло відноситься до лікування раку, такого як рак мозку, проти IGF-IR вводять пацієнту з пухлиною легені, сквамозних клітин, сечового міхура, шлунка, підмолочної залози, простати або ободової кишки. У шлункової залози, молочної залози, голови, шиї, високій мірі переважному варіанті здійснення спостравоходу, простати, колоректальний, легені, сіб не приводить до збільшення пухлини в масі і нирковий, нирки, яєчника, гінекологічний або щиоб'ємі або до зменшення в масі і об'ємі. У ще одтовидної залози. Пацієнти, які можуть підлягати ному варіанті здійснення спосіб викликає інтерналікуванню сполукою винаходу за способами данолізацію IGF-IR на пухлині. У переважному варіанті го винаходу, включають, наприклад, пацієнтів, здійснення антитіло являє собою 2.12.1fx або місяким діагностовані множинна мієлома, рідка пух 37 85058 38 лина, рак печінки, порушення тимусу, аутоімунне тивне порушення, таке як рак або пухлина. В одзахворювання, опосередковане Т-клітинами, ендоному аспекті винахід відноситься до способу лікукринологічне порушення, ішемія, нейродегенеравання гіперпроліферативного порушення у ссавця, тивне порушення, рак легені, рак кісток, рак підщо включає в себе введення вказаному ссавцеві шлункової залози, рак шкіри, рак голови і шиї, терапевтично ефективної кількості сполуки винашкірна або внутрішньоочна меланома, рак матки, ходу в поєднанні з протипухлинним засобом, вибрак яєчника, рак прямої кишки, рак анальної облараним з групи, що складається з, але не обмежуюсті, рак шлунка, рак ободової кишки, рак молочной чись ними, інгібіторів мітозу, алкілуючи х засобів, залози, гінекологічні пухлини (наприклад, саркоми антиметаболитів, інтеркалюючих засобів, інгібітоматки, карцинома фалопієвих труб, карцинома рів факторів росту, інгібіторів клітинного циклу, ендометрію, карцинома шийки матки, карцинома ферментів, інгібіторів топоізомерази, модифікатопіхви або карцинома вульви), хвороба Ходжкіна, рів біологічної відповіді, антигормонів, інгібіторів рак стравоходу, рак тонкого кишечника, рак ендокінази, інгібіторів матриксної металопротеази, закринної системи (наприклад, рак щитовидної залособів генетичної терапії і антиандрогенів. У більш зи, паращитовидної залози або наднирників), сарпереважному варіанті здійснення антитіло може коми м'яких тканин, рак уретри, рак пенісу, рак бути введене разом з антинеопластичним засопростати, хронічна або гостра лейкемія, солідні бом, таким як адріаміцин або таксол. В іншому пухлини у дітей, лімфоцитозні лімфоми, рак сечопереважному варіанті здійснення антитіло або вого міхура, рак нирок або уретри (наприклад, какомбінаційну терапію вводять нарівні з променерцинома ниркових клітин, карцинома ниркового вою терапією, хіміотерапією, фотодинамічною тетаза) або неоплазми центральної нервової систерапією, хірургією або іншою імунотерапією. У ще ми (наприклад, первинна лімфома ЦНС, пухлини одному іншому переважному варіанті здійснення хребта, гліоми стовбура мозку або аденоми гіпофіантитіло вводять разом з іншим антитілом. Наприза). клад, антитіло проти IGF-IR може бути введене Антитіло може бути введене однократно, але разом з антитілом або іншим засобом, про яких більш переважно його вводять багато разів. Антивідомо, що вони інгібують пухлину або проліфератіло може бути введене від трьох разів на добу до цію ракових клітин, наприклад, антитіло або засіб, одного разу кожні шість місяців. Введення може які інгібують erbВ2 рецептор, EGF-R, CD20 або мати місце по режиму, такому як три рази на добу, VEGF. двічі на добу, один раз на добу, один раз на кожні Спільне введення антитіла разом з додаткодва дні, один раз кожні три дні, один раз на тижвим терапевтичним засобом (комбінаційна терадень, один раз на кожні два тижні, один раз на пія) охоплює введення фармацевтичної композикожен місяць, один раз на кожні два місяці, один ції, що містить антитіло проти IGF-IR, і раз на кожні три місяці і один раз на кожні шість додаткового терапевтичного засобу і введення місяців. Антитіло може бути введене пероральним, двох або більше роздільних фармацевтичних коммукозальним, букальним, інтраназальним, інгаляпозицій, однієї, яка містить антитіло проти IGF-IR, і ційним, внутрішньовенним, підшкірним, внутрііншої (інших), що містить додатковий терапевтичшньом'язовим, парентеральним, внутрішньопухний засіб (засоби). Додатково, незважаючи на те, линним або місцевим шляхом. Антитіло може бути що спільне введення або комбінаційна терапія введене на ділянку, віддалену від ділянки пухлини. загалом означає, що антитіло і додаткові терапевАнтитіло можна також вводити безперервно через тичні засоби вводять в один і той же час, воно тамінінасос. Антитіло може бути введене один раз кож охоплює випадки, в яких антитіло і додаткові щонайменше двічі або щонайменше протягом петерапевтичні засоби вводять в різний час. Наприріоду часу, поки стан лікується, полегшується або клад, антитіло може бути введене один раз на виліковується. Антитіло, загалом, будуть вводити кожні три дні, в той час як додатковий терапевтичтак довго, поки пухлина існує, при умові, що антиний засіб вводять один раз на добу. Альтернативтіло викликає зупинку росту пухлини або раку, або но, антитіло може бути введене перед або після зменшення маси і об'єму. Антитіло, загалом, булікування порушення додатковим терапевтичним дуть вводити як частину фармацевтичної композасобом, наприклад, після невдалої терапії пацієнзиції, як описано вище. Дозування антитіла буде та додатковим засобом. Аналогічно, введення анзагалом складати в інтервалі 0,1-100мг/кг, більш титіла проти IGF-IR може здійснюватися перед або переважно, 0,5-50мг/кг, більш переважно, 1-20мг/кг після променевої терапії, фотодинамічної терапії і навіть більш переважно, 1-10мг/кг. Концентрація або хірургії. антитіла в сироватці може бути виміряна будьАнтитіло і один або більше додаткових тераяким способом, відомим в даній галузі. Антитіло певтичних засобів (комбінаційна терапія) можуть можна також вводити профілактично для запобібути введені один раз, двічі або щонайменше прогання раку або пухлини, що мають місце. Це може тягом періоду часу, поки стан лікується, полегшубути особливо корисним для пацієнтів з "високим ється або виліковується. Переважно, комбінаційну нормальним" рівнем lGF-I внаслідок того, що для терапію вводять багато разів. Комбінаційна тераданих пацієнтів показаний більш високий ризик пія може бути введена від трьох разів на добу до розвитку звичайних раків. Див. M. Rosen et al., виодного разу кожні шість місяців. Введення може ще. мати місце по режиму, такому як три рази на добу, У ще одному аспекті антитіло проти IGF-IR двічі на добу, один раз на добу, один раз кожні два можна спільно вводити разом з іншими терапевтидні, один раз кожні три дні, один раз на тиждень, чними засобами, такими як антинеопластичні ліки один раз на кожні два тижні, один раз кожний міабо молекули, пацієнту, який має гіперпроліферасяць, один раз кожні два місяці, один раз кожні три 39 85058 40 місяці і один раз кожні шість місяців, або може здійснення молекули нуклеїнової кислоти вводять вводитися безперервно через мінінасос. Комбінатаким чином, щоб вони стабільно інтегрувалися в ційна терапія може вводитися пероральним, мукохромосому В клітин, оскільки дані клітини спеціалізальним, букальним, інтраназальним, інгаляційзуються на продукуванні антитіл. У переважному ним, внутрішньовенним, підшкірним, варіанті здійснення попередники В клітин трансфівнутрішньом'язовим, парентеральним, внутрішкують або інфікують ex vi vo і ретрансплантують ньопухлинним або місцевим шляхом. Комбінаційна пацієнту, що цього потребує. У ще одному варіанті терапія може вводитися на ділянці, віддаленій від здійснення попередники В клітин або інших клітин ділянки пухлини. Комбінаційну терапію, загалом, інфікують in vivo, використовуючи вірус, відомий будуть вводити так довго, поки пухлина існує, при для інфікування типу клітин, що представляють умові, що антитіло викликає зупинку росту пухлини інтерес. Типові вектори, що застосовуються для або раку, або зменшення маси і об'єму. генної терапії, включають ліпосоми, плазміди або У ще додатковому варіанті здійснення антитівірусні вектори, такі як ретровіруси, аденовіруси і ло проти IGF-IR мітять радіоактивною міткою, імуадено-асоційовані віруси. Після інфікування або in нотоксином або токсином, або гібридним білком, vi vo або ex vivo, рівні експресії антитіла можна що містить токсичний пептид. Антитіло проти IGFреєструвати шля хом відбору зразка від пацієнта, IR або антитіло проти IGF-IR з гібридним білком що проходить лікування, і застосування будь-якого направляє радіоактивну мітку, імунотоксин, токсин імуноаналізу, відомого в даній галузі і що обговоабо токсичний пептид до пухлини або ракової клірюється в даному описі. тини, що експресує IGF-IR. У переважному варіанУ переважному варіанті здійснення спосіб генті здійснення радіоактивну мітку, імунотоксин, токної терапії включає в себе стадії введення ефексин або токсичний пептид інтерналізують після тивної кількості виділеної молекули нуклеїнової того, як антитіло проти IGF-IR зв'яжеться з IGF-IR кислоти, що кодує важкий ланцюг або його антигена поверхні пухлини або ракової клітини. нзв'язу вальну частину антитіла людини або його У ще одному аспекті антитіло проти IGF-IR частину і що експресує молекулу н уклеїнової кисможе бути використане терапевтично, щоб індукулоти. У ще одному варіанті здійснення спосіб генвати апоптоз конкретних клітин у пацієнта, що цьоної терапії включає в себе стадії введення ефекго потребує. У багатьох випадках клітини, націлені тивної кількості виділеної молекули нуклеїнової на апоптоз, являють собою ракові або пухлинні кислоти, що кодує легкий ланцюг або його антигеклітини. Таким чином, в переважному варіанті нзв'язу вальну частину антитіла людини або його здійснення винахід надає спосіб індукування апопчастину і що експресує молекулу н уклеїнової кистозу шляхом введення терапевтично ефективної лоти. У більш переважному способі спосіб генної кількості антитіла проти IGF-IR пацієнту, що цього терапії включає в себе стадії введення ефективної потребує. У переважному варіанті здійснення анкількості виділеної молекули нуклеїнової кислоти, титіло являє собою 2.12.1fx, або містить важкий що кодує важкий ланцюг або його антигензв'язуланцюг, легкий ланцюг або його антигензв'язувавальну частину антитіла людини або його частину, льну область. і ефективної кількості виділеної молекули нуклеїУ ще одному аспекті винахід надає спосіб ввенової кислоти, що кодує легкий ланцюг або його дення активуючого антитіла проти IGF-IR пацієнту, антигензв'язувальну частину антитіла людини або що потребує цього. В одному варіанті здійснення його частину і що експресує молекулу нуклеїнової активуюче антитіло або фармацевтичну композикислоти. Спосіб генної терапії може також включацію вводять пацієнту, що потребує цього, в кількоти в себе стадію введення інших протиракових сті, ефективній для збільшення активності IGF-IR. засобів, таких як таксол, тамоксифен, 5-FU, адріаУ більш переважному варіанті здійснення активуміцин або СР-358,774. юче антитіло здатне відновити нормальну активНомери ID послідовностей заявки: ність IGF-IR. У ще одному переважному варіанті SEQ ID NO 1: Послідовність ДНК, що кодує здійснення активуюче антитіло може бути введене важкий ланцюг антитіла 2.12.1fx, що включає попацієнту, що має невеликий ріст, невропатію, змеслідовність, що кодує сигнальну послідовність, що ншення м'язової маси або остеопороз. В іншому використовується для експресії зрілого антитіла. переважному варіанті здійснення активуюче антиSEQ ID NO 2: Послідовність ДНК, що кодує летіло може бути введене разом з одним або більше гкий ланцюг антитіла 2.12.1fx, що включає послііншими чинниками, які збільшують проліферацію довність, що кодує сигнальну послідовність, що клітин, запобігають апоптозу або збільшують активикористовується для експресії зрілого антитіла. вність IGF-IR. Такі чинники включають фактори SEQ ID NO 3: Амінокислотна послідовність росту, такі як IGF-I, і/або аналоги IGF-I, які активуважкого ланцюга антитіла 2.12.1fx. ють IGF-IR. У переважному варіанті здійснення SEQ ID NO 4: Амінокислотна послідовність ліантитіло являє собою 2.12.1fx, або містить важкий нії ембріона DP-35. ланцюг, легкий ланцюг або його антигензв'язуваSEQ ID NO 5: Амінокислотна послідовність льну частину. легкого ланцюга антитіла 2.12.1fx. Молекули нуклеїнової кислоти даного винахоSEQ ID NO 6: Амінокислотна послідовність ліду можуть бути введені пацієнту, що потребує цьонії ембріона А30/Jk1. го, за допомогою генної терапії. Ця терапія може Для кращого розуміння даного винаходу предбути або in vi vo або ex vi vo. У переважному варіаставлені наступні приклади. Ці приклади служать нті здійснення молекули нуклеїнової кислоти, що тільки в ілюстративних цілях, і їх не треба розглякодують як важкий ланцюг, так і легкий ланцюг, дати як такі, що обмежують об'єм винаходу будьвводять пацієнту. У більш переважному варіанті яким чином. 41 85058 42 Приклад І: Отримання гібридоми, що продукує ланцюга антитіла 2.12.1fx (SEQ ID NO: 3) з такою антитіло проти IGF-IR ж послідовністю лінії ембріона DP-35 (3-11)/D3Антитіло винаходу отримують, відбирають і 3/JH6 (SEQ ID NO: 4). Послідовність антитіла аналізують таким чином: 2.12.1fx показана вище, ніж послідовність лінії ембріона. Сигнальні послідовності показані курсивом, Мишей XENOMICEÔ у віці від восьми до десяa CDR підкреслені. Область константного домену ти тижнів імунізують внутрішньоочеревинно або в починається з амінокислотних залишків ASTK і їх задні подушечки ступень або позаклітинним доменом IGF-IR людини (10мкг/доза/миша) або 3Т3відповідає амінокислотним залишкам, що починаються від 148 в лінії ембріона і що продовжуються IGF-IR або 300.19-IGF-IR клітинами, які являють до кінця послідовності. Каркасні (FR) мутації масобою дві трансфіковані клітинні лінії, які експреють місце при амінокислотних залишках 21 і 116. сують IGF-IR людини на своїх плазматичних мемФіг.4 показує вирівнювання амінокислотної побранах (10x106 клітин/доза/миша). Дану дозу повторюють від п'яти до семи разів протягом періоду слідовності легкого ланцюга антитіла 2.12.1fx (SEQ ID NO: 5) з такою ж послідовністю лінії ембвід трьох до восьми тижнів. За чотири дні перед ріона А30/Jk1 (SEQ ID NO: 6). Послідовність антигібридизацією миші отримують кінцеву ін'єкцію тіла 2.12.1fx показана вище, ніж послідовність лінії позаклітинного домену IGF-IR людини в PBS. Лімембріона. Сигнальні послідовності показані курсифоцити селезінки і лімфатичних вузлів від імунізованих мишей гібридизують з клітинною лінією невом, a CDR підкреслені. Область константного домену починається з амінокислотних залишків секреторної мієломи P3-X63-Ag8.653 і піддають TVAA і відповідає амінокислотним залишкам, що селекції HAT, як описано раніше [Galfre and починаються від 131 в лінії ембріона і що продовMilstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981]. Гібридожуються до кінця послідовності. Каркасні (FR) муму, 2.12.1, яка продукує моноклональні антитіла, специфічні для IGF-IR, вибирали для подальшого тації мають місце при амінокислотних залишках 43, 125 і 129. дослідження і депонували в Американській КолекПриклад II: Опосередковане антитілом блокуції Типових Культур (ATCC), 10801 University вання зв'язування IGF-I/IGF-IR Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 12 грудня Експерименти ELISA проводять для кількісної 2000 з наступним номером депозиту: Гібридома Депозит No. оцінки здатності антитіла винаходу інгібува ти зв'язування IGF-I з IGF-IR в аналізі на клітинній основі. 2.12.1 РТА-2792 IGF-IR-трансфіковані NIH-3T3 клітини (5(104/мл) Дана гібридома, і інші, що продукують антитівміщують в 100мкл DMEM з високим вмістом глюла, специфічні для IGF-IR, описані в [WO 02/05359, кози в середовищі, доповненому L-глутаміном опублікованій 11 липня 2002]. Текст цієї публікації, включаючи всі описані послідовності, включений в (0,29мг/мл), 10% інактивованою теплом FBS і 500мкг/мл кожного з генетицину, пеніциліну і стредану заявку як посилання. птоміцину, в 96-ямкові планшети з U-подібним Дві каркасні мутації у важкому ланцюгу і три дном. Планшети інкубують при 37°C, 5% CO2 прокаркасні мутації в легкому ланцюгу антитіла 2.12.1 тягом ночі для забезпечення прикріплення клітин. коректували назад до лінії ембріона для отримання антитіла 2.12.1fx. Середовище декантують з планшетів і заміняють на 100мкл свіжого середовища на ямку. Для тесВсі зміни для проведення 2.12.1fx мутацій тування антитіло розбавляють в аналітичному проводили, використовуючи набір QuikChange середовищі (DMEM з високим вмістом глюкози в Site-Directed Mutagenesis (StratageneÔ ), шляхом середовищі, доповненому L-глутаміном, 10% інакотримання плазміди з ділянкою-мішенню для мутивованою теплом FBS, 200мкг/мл BSA і тації денатурацією плазміди і відпалу олігонуклео500мкг/мл кожного з генетицину, пеніциліну і стретидних праймерів, що містять бажану мутацію. птоміцину) до бажаної кінцевої концентрації. Всі Нетяжева-витісняюча дія ДНК-полімерази Pfu зразки роблять при потрійному повторі. Планшети Turbo використовували для розширення впроваінкубують при 37°С протягом десяти хвилин. [ 125I]дження мутагенних праймерів, що приводить до IGF-I розбавляють до концентрації 1мкКі/мл в анакругових тяжів з однонитковим точковим розривом. літичному середовищі і додають 50мкл на ямку Обробка метильованої, що не зазнала мутації бапланшета. Як контроль фонової радіоактивності тьківської ДНК-матриці Dpnl супроводжулася перехолодний IGF-I додають до кінцевої концентрації творенням кругової з точковим розривом dsДНК в 100нг/мл. Планшети інкубують протягом 10 хвилин надкомпетентні клітини XL1Blue. Після перетвопри 37°C і середовище декантують за допомогою рення надкомпетентні клітини XL1Blue ремонтують м'якого блотингу на паперові рушники і промиванточкові розриви в плазміді, що пройшла мутацію. ням двічі аналітичним середовищем. Клітини лізуПлазміди, що містять мутації, відбирають і посліють додаванням 50мкл 0,1N NaOH, 0,1% SDS і довність підтверджують. планшети струшують протягом п'я ти хвилин при Фіг.1 показує послідовність ДНК, що кодує вакімнатній температурі. Зразки переносять в сцинжкий ланцюг антитіла 2.12.1fx, що включає послітиляційний планшет, додають 150мкл OptiPhase довність, що кодує сигнальну послідовність, що Supermix і сигнал зчитують, використовуючи лічивикористовується для експресії зрілого антитіла льник Wallace Micro-Beta. (SEQ ID NO: 1). Фіг.2 показує послідовність ДНК, У таблиці І і на Фігурі 5 показані результати що кодує легкий ланцюг антитіла 2.12.1fx, що цього експеримента, здійсненого з антитілом дановключає послідовність, яка кодує сигнальну посліго винаходу. Даний експеримент демонструє, що довність, що використовується для експресії зрілоантитіло винаходу специфічно інгібує зв'язування го антитіла (SEQ ID NO: 2). Фіг.3 показує вирівню[125I]-IGF-I з клітинами, що надекспресують IGF-IR. вання амінокислотної послідовності важкого 43 85058 44 NaVO4) додають в кожну ямку і змішують піпетуТаблиця І ванням. 100мкл лізату переносять з кожної ямки в кожну ямку захватного планшета для ELISA, отриманого, як описано вище, і інкубують при акуратМоноклональне антитіло IC50 ному струшуванні протягом двох годин при кімнат2.12.1fx 0,4мкг/мл ній температурі. ELISA разом з антитілами проти фосфотироПриклад III: Опосередковане антитілом інгібузину (pTYR) вання фосфорилювання IGF-IR, що індукується Клітинний лізат видаляють перевертанням IGF-I планшетів, п'ятикратним промиванням планшетів Експерименти ELISA проводять для визначенпромивальним буфером і блотингом надмірної ня здатності антитіла даного винаходу блокува ти рідини на паперові рушники. Додають 100мкл IGF-I-опосередковану активацію IGF-IR. IGF-IpTYR-специфічного антитіла (HRP-PY54) на ямку і опосередковану активацію IGF-IR виявляють по розбавляють в блокувальному буфері до концентзниженому рецептор-асоційованому фосфорилюрації 0,2мкг/мл. Клітини інкубують стр ушуванням ванню тирозину. планшетів протягом 30 хвилин при кімнатній темОтримання планшетів для ELISA пературі. Планшети п'ятикратно промивають проЗахватні планшети для ELISA отримують домивальним буфером і здійснюють блотинг на падаванням 100 мкл блокувального буфера (3% биперові рушники. чачого сироваткового альбуміну [BSA] в TrisЗв'язування антитіла HRP-PY54 виявляють забуференому фізіологічному розчині [TBS]) в кошляхом додавання 100мкл на ямку розчину субжну ямку 96-ямкових планшетів ReactiBind, покристрату TMB пероксидази (Kirkegaard & Perry) і інтих білком G (Pierce). Планшети інкубують струкубацією при струшуванні по мірі прояву кольору шуванням протягом 30 хвилин при кімнатній (приблизно 2-10 хвилин). Реакцію прояву кольору температурі. Пан-специфічне антитіло кролика зупиняють додаванням 100мкл на ямку зупиняюSC-713 проти IGF-IR (Santa Cruz) розбавляють в чого розчину TMB (Kirkegaard & Perry). Планшети блокувальному буфері до концентрації 5мкг/мл. струшують протягом 10 секунд при кімнатній тем100мкл розбавленого антитіла додають до кожної пературі для змішування розчину і кількісно оціямки. Планшети інкубують при струшуванні протянюють за допомогою вимірювання при OD450нм . гом 60-90 хвилин при кімнатній температурі. У таблиці II і на фігурі 6А показані результати Планшети промивають п'ять разів промивальним цього експеримента з антитілом винаходу. Резульбуфером (TBS+0,1% Tween 20) і буфер, що залитати цього експеримента демонструють здатність шився, блотують на паперові рушники. Ці планшеантитіла даного винаходу блокувати IGF-Iти не дозволяють висушувати перед додаванням опосередковану активацію IGF-IR, як показано по лізату. зниженому рецептор-асоційованому фосфорилюОтримання лізату з клітин, що експресують ванню тирозину. Крім того, ці результати можуть IGF-IR застосовуватися для кількісної оцінки відносної IGF-IR-трансфіковані NIH-3T3 клітини активності антитіла даного винаходу. (5(104/мл) вміщують в 100мкл ростового середовища (DMEM з високим вмістом глюкози в середоТаблиця II вищі, доповненому L-глутаміном (0,29мг/мл), 10% інактивованою теплом FBS, і 500мкг/мл кожного з Моноклональне антитіло ІС50 (мкг/мл) генетицину, пеніциліну і стрептоміцину) в 962.12.1fx 0,42 ямкові планшети з U-подібним дном. Планшети інкубують при 37°C, 5% CO2 протягом ночі, щоб дозволити клітинам прикріпитися. Середовище Приклад IV: Видова перехресна реактивність декантують з планшетів і заміняють 100мкл свіжоантитіла винаходу го ростового середовища на ямку. Для тестування Для визначення видової перехресної реактивпотенційні антитіла проти IGF-IR розбавляють до ності антитіла винаходу проводять декілька експеп'ятикратної бажаної кінцевої концентрації в росриментів, що включають імунопреципітацію, опотовому середовищі і додають 25мкл на ямку. Всі середковану антитілом блокування індукованого зразки роблять при потрійному повторі. Планшети IGF-I фосфорилювання і FACS аналіз. інкубують при 37°С протягом однієї години. КлітиДля проведення експериментів по імунопрени стимулюють 25мкл/ямку 600нг/мл IGF-I (отриципітації клітини вміщують в D MEM з високим вміманому в ростовому середовищі) і інкубують при стом глюкози в середовищі, доповненому Lкімнатній температурі протягом 10 хвилин. Сереглутаміном (0,29мг/мл), 10% шактивированою тепдовище декантують переворотом планшетів і пролом FBS і 500мкг/мл кожного з генетицину, пеніциводять м'я кий блотинг на паперові рушники. Приліну і стрептоміцину до 50% злиття в колбах Т25. липлі клітини лізують додаванням 50мкл буфера Додають 100мкл антитіла винаходу в забуфередля лізису (50мМ HEPES, рН 7,4, 10мМ EDTA, ному фізіологічному розчині Хенкса (HBSS, Gibco 150мМ NaCl, 1,5мМ MgCl2, 1,6мМ NaVO4, 1% Triton BRL) при концентрації 1мкг/мл. Планшети інкубуX-100, 1% гліцерину) і доповнюють безпосередньо ють протягом 30 хвилин при 37°С в інкубаторі і перед застосуванням однією таблеткою інгібітора далі стимулюють клітини IGF-I при 100нг/мл протяпротеази, вільного від EDTA [Roche Molecular гом 10 хвилин при кімнатній температурі. Клітини Sciences] на 50мл). Клітини струшують протягом 5 лізують в буфері RIPA (Harlow and Lane, вище) і хвилин при кімнатній температурі. 200мкл буфера проводять імунопреципітацію IGF-IR 2мкг пандля розбавлення (50мМ HEPES, рН 7,4, 1,6мМ специфічного антитіла SC-713 проти IGF-IR (Santa 45 85058 46 Cruz) з кульками агарози з білком А протягом 1 50мМ HEPES, рН 7,4, 10мМ EDTA, 150мМ NaCl, години при 4°С. Кульки гранулюють і промивають 1,5мМ MgCl2, 1,6мМ NaVO4, 1% Triton X-100, 1% три рази PBS/T (PBS+0,1% Твін-20) і потім кип'я гліцерину. Загальний рівень IGF-IR в клітинних екстрактах визначають вестерн-блот аналізом, тять в 40мкл буферу Леммлі, що містить 5% bΜΕ. використовуючи пан-специфічне SC-713 антитіло Зразки, отримані, як описано вище, далі аналіпроти IGF-IR (Santa Cruz). Див. Фіг.6В. Обробка зують Вестерн-блотингом 12мкл кожного зразка клітин MCF7 антитілом винаходу приводить до 60завантажують на доріжку 4-10% градієнтних 70-процентного низхідного регулювання IGF-IR NovexÔ гелів, через які пропускають MES буфер протягом 1-2 годин. (NovexÔ ). Через гелі пропускають 150V протягом 1 Приклад VI: Ефекти антитіла винаходу на IGFгодини або 200V протягом приблизно 30 хвилин. IR in vi vo Гель переносять на мембрану в буфері для переЕксперимент проводять для визначення того, несення NovexÔ з 10% метанолом або протягом чи будуть ефекти антитіла винаходу на IGF-IR, ночі при 100мА, або протягом 1-1,5 годин при описані в попередніх прикладах, мати місце in vivo. 250мА. Мембрані дають повністю висохти і блокуПухлини індукують у бестимусни х мишей відповідють при кімнатній температурі TBS (забуферений но до опублікованих способів [V.А. Pollack et al, Tris фізіологічний розчин, рН 8,0), що містить "Inhibition of epidermal growth factor receptorSuperblock (Pierce Chemical Co.). Додають антитіassociated tyrosine phosphorylation in human ло SC713 для блотингу IGF-IR (Santa Cruz) або carcinomas with CP-358,774: Dynamics of receptor антитіло до фосфотирозину для виявлення імуноinhibition in situ і antitumor effects in athymic mice," J. преципітованого IGF-IR або фосфо-IGF-lR відповіPharmacol. Exp. Ther. 291:739-748 (1999)]. Коротко, дно. IGF-IR-трансфіковані NIH-3T3 клітини (5(106) ввоДаний експеримент проводять з антитілом видять ін'єкцією підшкірно безтимусним мишам находу на клітинах від багатьох тварин. Антитіло (пи/пи) у віці 3-4 тижнів разом з 0,2мл препарату здатне зв'язувати IGF-IR людини, але не собаки і Matrigel. Ми шей далі ін'єкують антитілом винаходу миші. Дані експерименти вказують, що антитіла є внутрішньоочеревинно після встановлених утвовисокоспецифічними. рених пухлин (тобто приблизно 400мм 3). Визначення видової перехресної афінності анЧерез 24 години пухлини екстрагують, гомогетитіл винаходу нізують і визначають рівень IGF-IR. Для визначенFACS аналіз проводять для визначення афіння рівнів IGF-IR антитіло SC-713 розбавляють в ності антитіла винаходу до IGF-IR від інших тваблокувальному буфері до кінцевої концентрації в рин, конкретно, мавп Старого Світу, описаних вимкг/мл і 100мкл додають в кожну ямку планшета ще. Аліквоти клітин людини і мавп (cynomolgus) Reacti-Bind, покритого козячими антитілами проти (5(105) інкубують протягом 1 години на льоду із кролика (GAR) (Pierce). Планшети інкубують при збільшенням концентрацій біотинільованих антитіл кімнатній температурі протягом 1 години при проти IGF-IR винаходу. Зразки інкубують 30 хвиструшуванні і далі п'ятикратно промивають промилин на льоду зі стрептавідин-кон'югованим RPE вальним буфером. Зразки пухлини зважують. (фікоеритрином). Зв'язування вимірюють проточ12,5мкл екстракту пухлини розбавляють буфером ною цитометрією і аналізують за гістограмами індля лізису до кінцевого об'єму, що дорівнює тенсивності флуоресценції (F12-H) в залежності 100мкл. Зразок по 100мкл додають до кожної ямки від кількості клітин (Counts), використовуючи про96-ямкового планшета. Планшети інкубують при грамне забезпечення CellQuest. Зв'язування (Kd) кімнатній температурі при струшуванні протягом 1розраховують для кожного антитіла по графіках 2 годин і далі промивають п'ятикратно промивальзалежності середньої інтенсивності флуоресценції ним буфером. 100мкл HRP-PY54 або біотинільовід концентрації антитіла. У більшості експерименваного антитіла проти IGF-IR в блокувальному тів зв'язування вимірюють в клітинах, що культибуфері додають до кожної ямки і інкубують при вуються MCF-7 і культури клітин тканини кімнатній температурі при струшуванні протягом cynomolgus. Виснаження антитіла регулюють по 30 хвилин. Планшети п'ятикратно промивають вимірюванню зв'язування в діапазоні концентрацій промивальним буфером і виявляють. Планшети клітин. виявляють зондуванням з допомогою HRP-PY54 Вищезазначений FACS аналіз здійснюють для шляхом додавання 100мкл мікроямкового субтестування здатності антитіла винаходу зв'язува ти страту TMB на ямку і прояв кольору зупиняють клітини людини і cynomolgus. Спостерігають полододаванням 100мкл 0,9М H2SO4. Сигнал кількісно винне максимальне зв'язування (Kd), що дорівнює оцінюють шляхом струшування протягом 10 се0,1мкг/мл для всіх клітинних ліній, що тестуються. кунд і вимірювання OD450nm. Сигнал нормалізують Приклад V: Низхідне регулювання рецептора до загального білка. Планшети, зондовані антитіIGF-I лом проти IGF1R, виявляють, додаючи 100мкл Для дослідження того, чи може антитіло винастрептавідину-HRP, розбавленого в блокувальноходу індукувати низхідне регулювання IGF-IR на му буфері, в кожну ямку, інкубуючи при кімнатній клітинах, MCF7 клітини вміщують в планшети з температурі при струшуванні протягом 30 хвилин і середовищем DMEM/F12, доповненим Lдалі продовжуючи, як описано для HRP-PY54. глутаміном (0,29мг/мл), 10% інактивованою тепСпостерігають, що вн утрішньоочеревинна ін'єлом FBS, пеніциліном і стрептоміцином до 50% кція антитіла винаходу приводить до інгібування злиття в колбах Т75. Ан титіло винаходу додають активності IGF-IR, як вимірюють по зниженню білка до клітин до кінцевої концентрації, що дорівнює IGF-IR (Фігура 7). Крім того, дане інгібування є чут1мкг/мл. Планшети інкубують протягом встановлеливим до дози введеного ін'єкцією антитіла (Фігура них годин при 37°С в інкубаторі і далі лізують в 47 85058 48 7). Ці дані демонструють, що антитіло винаходу (вн.очер.) або 100мг/кг 5-фтордезоксіуридину (5здатне націлюватися на IGF-IR in vivo таким самим FU, вн.в.), або у вигляді єдиного засобу або в почином, який спостерігають in vitro. єднанні, як описано в прикладі VII. На Фігурі 10A і Приклад VII: Інгібування росту (TGI) 3T3/IGF-IR Фігурі 10В показані розміри пухлини по відношенклітинних пухлин ню до різних обробок з плином часу. Експеримент Антитіло винаходу тестують для визначення демонструє, що обробка разом з антитілом проти того, чи буде воно функціонувати для інгібування IGF-IR, що дається один раз, інгібує клітинний ріст пухлинного росту. П ухлини індукують, як описано колоректального раку людини, коли її надають у вище (приклад VI), і коли утворяться встановлені вигляді єдиного засобу, і посилює ефективність 5пухлини, що пальпуються (тобто 250мм 3, в межах FU, відомого пухлинного інгібітора. 6-9 днів), мишей обробляють однократною 0,20мл Приклад X: Фармакокінетика антитіла проти дозою антитіла шляхом внутрішньоочеревинної IGF-IR in vi vo ін'єкції. Розмір пухлини вимірюють циркулями ВеДля оцінки фармакокінетики антитіла проти рньє по двох діаметрах кожен третій день і розраIGF-IR, мавпам cynomolgus вводять ін'єкцією внутховують об'єм, використовуючи формулу (довжирішньовенно 5мг/кг антитіла в ацетатному буфері. Сироватку збирають від мавп в різні часові відмітна´[ширина]2)/2, з використанням способів, ки і визначають концентрації антитіла проти IGF-IR встановлених Geran, et al., "Protocols for screening chemical agents and natural products against animal протягом періоду до десяти тижнів. Для кількісної оцінки функціональних рівнів антитіла в сироватці, tumors and other biological systems," Cancer позаклітинний IGF-IR людини (IGF-I-sR, R&D Chemother. Rep. 3:1-104. Systems, Catalog # 391GR) зв'язують з 96Слідуючи аналізу антитілом винаходу, спостеямковими планшетами. Сироватку мавпи (розбаврігають, що однократна обробка антитілом нарізно інгібує ріст IGF-IR-трансфікованих NIH-3T3 клітинлена між 1:100 і 1:15000) додають до аналітичних планшетів таким чином, щоб кожний зразок знахоно-індукованих пухлин (Фігура 8A). Крім того, в дився в лінійному інтервалі стандартної кривої, і комбінаційних дослідженнях з однократною дозою інкубують в умовах, при яких будь-яке антитіло 7,5мг/кг адріаміцину, що вводиться внутрішньопроти IGF-IR буде зв'язуватися з IGF-l-sR. Після венно, спостерігають, що введення однократної дози антитіла посилює ефективність адріаміцину, промивання планшетів до планшетів додають мічене антитіло проти IgG людини і інкубують при відомого інгібітора пухлинного росту. Поєднання умовах, в яких антитіло проти IgG людини буде адріаміцину з антитілом винаходу демонструє зазв'язуватися з антитілом проти IGF-IR. Планшети тримку росту на 7 днів в порівнянні з обробкою далі промивають і проявляють, і для кількісної оціантитілом або адріаміцином окремо (Фігура 8В). Приклад VIII: Взаємозв'язок рівнів антитіла з нки кількості антитіла проти IGF-IR застосовують контрольну стандартну криву і лінійну регресію. На низхідною регуляцією IGF-IR Фігурі 11 показана концентрація антитіла в сироПухлини індукують у голих мишей, як описано ватці з плином часу. Експеримент демонструє, що в прикладі VI. Мишей далі обробляють 125мкг анчас напівжиття (t1/2) антитіла проти IGF-IR станотитіла шля хом внутрішньоочеревинної ін'єкції, як описано в прикладі VI. Пухлини екстрагують і рівні вить 6,1 дня і має об'ємний розподіл (Vdss), що дорівнює 0,054 (л/кг). IGF-IR вимірюють з допомогою ELISA. Фігура 9 Всі публікації і патентні заявки, що цитуються показує рівні антитіла в сироватці і рівні рецептора в цьому описі, включені в нього як посилання, як IGF-IR з плином часу. Експеримент демонструє, якби кожна окрема публікація або патентна заявка що IGF-IR регулюється по низхідній антитілом і що ступінь інгібування IGF-IR пропорційний дозі по були конкретно і окремо вказані для включення як посилання. Незважаючи на те, що вищенаведений відношенню до концентрації антитіла в сироватці. винахід був описаний в деяких деталях за допомоПриклад IX: Інгібування росту клітин колорекгою ілюстрації і прикладу для цілей ясності розутальних пухлин міння, для рядових фа хівців в даній галузі буде Пухлини індукують у голих мишей, як описано в прикладі VI, за винятком того, що використовуочевидне в світлі рекомендацій даного винаходу, що можуть бути зроблені деякі зміни і модифікації ють клітини CoIo 205 (ATCC CCL 222). Клітини без відступу від суті або об'єму правового захисту CoIo 205 являють собою клітини колоректальної прикладеної формули винаходу. аденокарциноми людини. Мишей з встановленими підшкірними пухлинами розміром приблизно 250мм 3 обробляють різними кількостями антитіла 49 85058 50 51 85058 52 53 85058 54 55 85058 56 57 85058 58 59 85058 60