Вакцина, що містить альфа-токсоїд c. perfringens

Реферат: UA 98099 C2 (12) UA 98099 C2 Винахід належить до вакцин, які містять альфа-токсоїди С. perfringens, їх антигенних фрагментів, інактивованих антигенних фрагментів альфа-токсинів С. perfringens або будь-якої їх комбінації. Винахід також описує способи застосування таких вакцин для захисту тварин від клостридіальних захворювань, способів одержання таких вакцин. UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка не є попередньою заявкою. Пріоритет у ній заявлено згідно з Розділом 35 Кодексу США §119(е) на основі попередньої заявки США №60/672,289, поданої 18 квітня 2005 року, зміст якої повністю включений до неї як посилання. Галузь техніки Заявлений винахід стосується вакцин, які містять альфа-токсоїди типу С.perfringens, фрагменти їх антигенів, інактивовані фрагменти антигенів альфа-токсоїдів та їх комбінації. Також цей винахід стосується способів застосування цих вакцин для захисту тварин від захворювань, що викликаються клостридіями. Цей винахід також стосується способів одержання таких вакцин. Рівень техніки Clostridium perfringens (C. perfringens) є анаеробною бактерією, яка у природі зустрічається у ґрунті, в продуктах розкладу органічних речовин, а також у складі нормальної мікрофлори кишечника ссавців, включно з людиною. С.perfringens також є етіологічним агентом для ряду клостридійних захворювань у домашніх тварин, що мають господарську цінність. С.perfringens продукує ряд токсинів, які викликають патогенні процеси у тварин, включно з альфа-токсином, бета-токсином, бета-2-токсином, іпсилон-токсином, тета-токсином, му-токсином, дельтатоксином, йота-токсином, каппа-токсином і лямбда-токсином. Більше того, С.perfringens кодує інші біологічно активні речовини, які викликають патологічні процеси, такі як гіалуронідаза, кисла фосфатаза, протеаза, колагеназа, сульфатаза і нейрамінідаза. Різні штами С.perfringens позначаються як біотипи А-Е залежно від спектру токсинів, які продукує та чи інша бактерія [Justin et al., Biochemistry 41:6253-6262 (2002); McDonel, PHARMACOLOGY OF BACTERIAL TOXINS; F Dorner and J Drews (eds.) Pergamon Press, Oxford (1986)]. Спочатку таке типування ґрунтувалось на серологічних аналізах нейтралізації, що проводились на мишах або морських свинках. У недавньому часі у молекулярних методиках типування використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), націлену на генетичні послідовності, які кодують один із чисельних токсинів С.perfringens. Було встановлено, що інтестинальний клостридіоз у коней пов'язаний з високими концентраціями С.perfringens типу А у кишечнику. Уражені коні мають сильно виражений водянистий стул і високі показники смертності. Також було встановлено, що С.perfringens типу А пов'язаний з шлунково-кишковими захворюваннями у молочних та відгодовуваних поросят, при цьому симптоми включають слабко виражений некротичний ентерит і атрофію кишечник ворсинок [Songer, CHn. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. Для клостридійних захворювань, що викликаються С.perfringens, характерна раптова смерть добре відгодованих птахів з конфлюентними фіброзно-некротичними змінами ("ефект махрового рушника") у тонкій кишці (тонкокишкові форми), і/або викликаний С.perfringens гепатит з холангіогепатитом, або фіброзний некроз у печінці. Уражені птахи швидкими темпами втрачають тонус, страждають на діарею і від зневоднення. Смертність становіть від 2 % до 50 %. Патологія печінки призводить до того, що тушка такого забитого птаха визнається непридатною. Некротичний ентерит (НЕ) є одним із прикладів клостридійного кишкового захворювання, збудником якого є С.perfringens, і з яким пов'язані значні економічні збитки у птаховиробництві. Це захворювання особливо поширене серед нелітаючих курчат-бройлерів віком від 2 до 10 тижнів, хоча воно також було зафіксоване у індиків і курей-несушок, які утримуються в клітках. Некротичний ентерит загалом виникає у домашніх птахів або як вторинне захворювання, або у випадку, коли нормальна мікрофлора кишечника зазнає змін, які сприяють аномальній проліферації патогенних С.perfringens. Кількісна перевага безсимптомних некротичних ентеритів невідома, так як вогнища інфекції можуть вивчатися лише шляхом огляду після смерті тварини. Проте, свідчення про погане засвоєння їжі і втрату ваги пов'язували саме із безсимптомним захворюванням [Lovland and Kadhusdal, Avian Path. 30:73-81 (2001) ]. Фактори, що сприяють некротичному ентериту, як у випадку природних епідемій, так і в експериментальних моделях, включають: (а) кокцидіоз, (б) міграцію личинок паразитів, (в) призначення кормів з високим вмістом риби або борошна і (г) імунодепресивні захворювання. Крім того, некротичний ентерит може бути експериментально відтворений шляхом: (і) включення в раціон тварин кормів, заражених С.perfringens, (ii) призначення тваринам рослинних культур перорально або у складі корму, або (ііі) інтрадуоденального призначення тваринам бульйонних культур, вільних від бактерій неочищених токсинів. С.perfringens типу А або С - це два біотипи, які викликають некротичний ентерит у свійських птахів, при цьому альфа-токсин є найпоширенішим із виявлених токсинів [Wages and Opengart, th Necrotic Enteritis, crop: 781-785, In: Disease of Poultry, 11 ed., (eds., Saif et al.), Iowa State Press, Ames, IA (2003)]. Насправді більше ніж 90 % виділених С.perfringens, отриманих від сорока двох 1 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфікованих типом А птахів, продукували летальний альфа-токсин разом з сиалідазою, а також тета і му-токсини [Daube et al., AJVR 54:496-501 (1996)]. Крім того, ентеротоксин, який продукується С.perfringens типу А, був виявлений у курей з некротичним ентеритом і вважається таким, що може відігравати певну роль у кишкових захворюваннях [Niilo, Can. J. Comp. Med 42:357-363 (1978)]. Нещодавно стало відомо, що С.perfringens типу А або типу С можуть кодувати ген cpb2 [Gilbert et al., Gene 203:56-73 (1997)] і експресувати свій продукт, бета 2 токсин. Спостерігався тісний зв'язок між експресією бета 2 токсину і ентеритом у новонароджених поросят. [Bueschel et al., Vet Micro 94:121-129 (2003)]. Також було встановлено, що бета-2-токсин також виступає патогенним фактором в ентериті у коней і великої рогатої худоби. Bueschel et al., див. вище, також повідомляли про те, що 37,2 % з трьох тисяч двадцяти ізольованих С.perfringens кодували бета-2-токсин, а у випадку з виділеними С.perfringens типу А, 35,1 % кодували бета-2токсин. Зразок з обмеженою кількістю (n=5) ізольованих пташиних С.perfringens типу А був приблизно на 35 % позитивним щодо генотипу срb2, і 40 % цих бактерій також експресували бета-2-токсин. Крім того, з допомогою ПЛР, Engstrom et al., [Vet Micro 94225-235 (2003)] виявили, що 12 % виділених у курей з гепатитом С.perfringens також були позитивними щодо генотипу срb2. Також було виявлено, що С.perfringens типу А виступають в ролі патогенів у курей, які викликають акумулювання рідини у легованій моделі кишечної петлі [Niilo, Appl. Micro. 28:889-891 (1974)]. Існуючі на сьогодні спроби контролювати С.perfringens ґрунтуються на заходах санітарного контролю і додаванні антибіотиків у тваринні корми. Клостридійний компонент захворювання є добре чутливим до антибіотика і загалом добре пригнічується з допомогою добавок антибіотиків у корми, а також іонофорних лікарських засобів та засобів проти кокцидозу. Проте, антибіотики є дорогими і є предметом постійно зростаючого занепокоєння у зв'язку з розвитком резистентності у бактерій. Вакцинація також стала важливим заходом боротьби з цими захворюваннями у свійських тварин, оскільки протікання багатьох викликаних С.perfringens захворювань є швидкоплинним і часто має летальний кінець. Наприклад, патент США №4,292,307 описує одну "універсальну" мультивалентну вакцину, одержану з токсоїдів С.perfringens типу А, типу В і типу D, яка додатково містить токсоїди з СІ.Oedematiens і токсоїд СІ.septicum. Крім того, на ринку мають місце вакцини, які часто є багатовалентними і містять інактивовані клітини, токсини або їх комбінації [див., Songer, CHn. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. Вакцинація худоби жіночої статі також може створювати пасивний захист у їх новонароджених. Пасивний захист новонароджених ссавців від патогенних клостридійних інфекцій полягає у передачі специфічного антитіла у формі колостральних антитіл. Наприклад, Сміт і Матсуока (Smith and Matsuoka) [Am. J. Vet. Res. 20:91-93 (1959)] використовували інактивовану вакцину для прививання вагітних овець і виявили, що молоді ягнята мали переданий від матерів захист від іпсилон-токсину С.perfringens. Пасивний імунітет у молодих ссавців, як правило, триває від 2 до 3 тижнів [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. На відміну від ссавців, пасивний імунітет у птахів має кілька очевидних недоліків, найпомітнішим з яких є повна відсутність материнських антитіл, які отримуються з молоком. Хоча пасивний імунітет є одним із пояснень цього зв'язку, Неіеr та ін., [Avian Diseases 45:724732 (2001)] засвідчували, що відсоток виживання курей був значно вищим у зграях норвезьких бройлерів, які мали більш високий титр специфічних природних материнських антитіл проти альфа-токсину С.perfringens, ніж у птахів, у яких цей титр був нижчим. Крім того, Lovland et al. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] навели результати, які відповідали середньому пасивному захисту потомства курей, які були привиті вакцинами на основі токсоїдів С.perfringens типу А або типу С, порівняно з потомством непривитих курей. До цього часу забезпечення захисту від С.perfringens в комерційному масштабі розцінювалось як нездійсненна задача, окрім випадків, коли материнські антитіла проти більшості, якщо не всіх патологічних компонентів, якіпродукуються бактеріями С.perfringens, присутні у посівному матеріалі. Наприклад, вакцинація матки продуктом, який не містить ентеротоксин, забезпечує лише частковий захист поросят, тоді як антитіло анти-епсилон токсину у кіз захищає козенят від смерті внаслідок токсемії, але не від смерті внаслідок ентероколіту [Songer, Clin. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. Дійсно, незважаючи на класифікацію вражаючої кількості даних щодо різних біотипів С.perfringens і їх відповідних токсинів і хвороботворних біоактивних речовин, захворювання, які викликаються клостридіями, у продовольчих тварин досі залишаються серйозною економічною проблемою для фермерів. Тому існує потреба у створенні додаткових засобів захисту худоби 2 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 від патологічних ефектів С.perfringens. Зокрема, залишається потреба в отриманні безпечної і ефективної вакцини проти С.perfringens для свійських птахів. Крім того, існує потреба в одержанні простої вакцини проти С.perfringens, яка може призначатися самкам, зокрема маткам і/або вагітним самкам худоби, внаслідок чого буде забезпечено пасивний захист їх потомства. Посилання на будь-яке джерело не повинно тлумачитись як те, що це джерело становить частину "рівня техніки" щодо цієї заявки. Короткий виклад суті винаходу Цей винахід стосується вакцини проти С.perfringens, яка містить альфа-токсоїд С.perfringens і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент альфа-токсину С.perfringens, і/або будь-яку їх комбінацію в якості антигену. Цей винахід також стосується вакцин, які по суті містять альфа-токсоїд С.perfringens одного типу і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент альфа-токсину С.perfringens, і/або будь-яку їх комбінацію в якості антигену. Переважно від одної до двох доз 0,25-0,6 мл вакцини згідно з цим винаходом є достатніми для того, щоб індукувати щонайменше чотири антитоксичні одиниці (А.О.) антитіла проти альфа токсину на мл антисироватки тварини (наприклад, курки), вакцинованої зазначеною вакциною. Відповідно до одного такого варіанту визначення антитоксичних одиниць (А.О.) антитіла проти альфа-токсину на мл антисироватки тварини, вакцинованої зазначеною вакциною, здійснюють через шість-сім тижнів після імунізації. Відповідно до одного з варіантів разова доза вакцини є достатньою, щоб індукувати щонайменше 4 антитоксичні одиниці (А.О.) антитіла проти альфатоксину на мл антисироватки вакцинованої тварини, тоді як відповідно до альтернативного варіанту потрібні дві дози вакцини. Відповідно до одного варіанту антиген має 2 або більше одиниці сумарної активності (TCP). Відповідно до одного такого варіанту така тварина є птахом. Відповідно до одного з варіантів таким птахом є курка. Відповідно до ще одного варіанту такий птах є індиком. Відповідно до одного варіанту антиген отриманий з клітин С.perfringens типу А, наприклад, альфа-токсоїда С.perfringens типу А. Відповідно до ще одного варіанту антиген отриманий з клітин С.perfringens типу С, наприклад, інактивного антигенного фрагмента альфа-токсину С.perfringens Типу С. Відповідно до ще одного варіанту антиген отриманий з С.perfringens Типу В. Відповідно до ще одного варіанту антиген отриманий з С.perfringens Типу D. Відповідно до ще одного варіанту антиген отриманий з С.perfringens Типу Е. Відповідно до ще одного варіанту вакцина містить антиген, одержаний з підтипу С.perfringens. Відповідно до одного варіанту вакцина згідно з цим винаходом містить антиген, який є антигеном С.perfringens одного типу, за умови, що у такій вакцині присутній лише один тип антигену С.perfringens. Відповідно до одного варіанту цього типу С.perfringens є Типом А. У взаємопов'язаному варіанті С.perfringens є типом С. Відповідно до одного варіанту антиген є альфа-токсоїдом. Відповідно до одного з варіантів цього типу такий альфа-токсоїд містить супернатант альфа-токсоїда С.perfringens. Відповідно до специфічного варіанту вакцина містить супернатант альфа-токсоїда С.perfringens одного типу, типу А. У одній із вакцин згідно з цим винаходом антиген є альфа-токсоїдом альфа-токсину, який у природі кодується клітиною С.perfringens. У ще одній вакцині згідно з цим винаходом антиген представляє собою рекомбінантний поліпептид, а саме поліпептид, що кодується генетично маніпульованим геном. Відповідно до одного такого варіанту рекомбінантний поліпептид є альфа-токсоїдом, в якому ферментні ділянки відповідного альфа-токсину були генетично видалені або змінені, але при цьому були збережені один або більше антигенних епітопів. Відповідно до одного з варіантів антиген входить до складу цілої клітини. Відповіднодо ще одного варіанту антиген входить до складу безклітинного препарату. Відповідно до ще одного варіанту антиген є альфа-токсоїдом в супернатанті альфа-токсоїда С.perfringens. Відповідно до одного з варіантів цього типу супернатант альфа-токсоїда С.perfringens також є без клітинним препаратом. Відповідно до ще одного аспекту цього винаходу вакцина також може містити множину антигенів, що може призвести до продукування антитіл з різними специфічностями при їх призначенні тварині. Не всі такі антитіла повинні забезпечувати захист від захворювання. Відповідно до одного такого варіанту такі антигени також одержані з С.perfringens. Таким чином, вакцина згідно з винаходом може містити різні інші активні або інактивовані патогенні фактори разом з альфа-токсоїдом. Тому відповідно з цим винаходом такий альфатоксоїд може поєднуватися з іншими клостридіальними і неклостридіальними клітинами, токсоїдами і екстрактами, а також інактивними антигенними фрагментами альфа-токсину. Одна така багатовалентна вакцина згідно з винаходом містить альфа-токсоїд С.perfringens і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент 3 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 альфа-токсину С.perfringens, і/або будь-яку їх комбінацію, а також додатково містить вірусний антиген і/або бактеріальний антиген, і/або паразитарний антиген. Відповідно до одного з варіантів цього типу вірусним джерелом антигену є вірус інфекційного бурситу. Відповідно до ще одного варіанту вірусним джерелом антигену є вірус інфекційного бронхіту. Відповідно до ще одного варіанту вірусним джерелом антигену є реовірус. Відповідно до ще одного варіанту вірусним джерелом антигену є вірус псевдочуми птахів. Відповідно до ще одного варіанту бактеріальним джерелом антигену є Е.соlі. Відповідно до ще одного варіанту бактеріальним джерелом антигену є Salmonella. Відповідно до ще одного варіанту бактеріальним джерелом антигену є Campylobacter. Відповідно до ще одного варіанту паразитарним джерелом антигену є Еіmеrіа. Відповідно до одного з варіантів цього типу антиген, який використовується у вакцині, є частиною мерозоїту Еіmеrіа, ооцисти Еіmеrіа або їх суміші. Відповідно до спорідненого варіанту природним хазяїном паразита є птах. Відповідно до одного з варіантів цього типу паразитом є Еіmеrіа, природним хазяїном паразита - курка. Багатовалентна вакцина згідно з цим винаходом також може містити один або більше з наступних антигенів: бета-токсин С.perfringens, бета-2-токсин С.perfringens, ентеротоксин С.perfringens, епсилон-токсин С.perfringens, йота-токсин С.perfringens, каппа-токсин С.perfringens, лямбда-токсин С.perfringens, тета-токсин С.perfringens, геморагічний токсин С.sordellii, летальний токсин С.sordellii, А токсин С.difficile, В токсин С.difficile, альфа-токсин С.septicum, альфа-токсин С.novyi і бета-токсин С.novyi. В одному із варіантів багатовалентна вакцина згідно з винаходом містить альфа-токсоїд С.perfringens і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент альфа-токсину С.perfringens, і/або будь-яку їх комбінацію, а також додатково містить один або більше вірусний антиген вірусу інфекційного бурситу, і/або вірусу інфекційного бронхіту і/або реовірусу, і/або вірусу псевдочуми птахів, і/або бактеріальні антигени з Е.соlі і/або Salmonella, і/або Campylobacter, і/або паразитарний антиген з Еіmеrіа. Відповідно до альтернативного варіанту багатовалентна вакцина згідно з винаходом по суті містить альфа-токсоїд С.perfringens одного типу і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент альфа-токсину С.perfringens, і/або будь-яку їх комбінацію. Відповідно до спорідненого варіанту вакцина додатково містить вірусний антиген і/або бактеріальний антиген, і/або паразитарний антиген, як описано в цій заявці. Вакцина згідно з цим винаходом також може містити ад'ювант. Одним із популярних ад'ювантів для тварин є гідроксид алюмінію. Альтернативний ад'ювант може складатися з емульсії вода-в-маслі разом з антигеном. У конкретній вакцині цього типу емульсію вода-в-маслі одержують з 70 % фази масла і 30 % водної фази. Відповідно до ще одного варіанту ад'ювантом не є гідроксид алюмінію. Відповідно до одного такого варіанту вакцину, яка містить ад'ювант, відмінний від гідроксиду алюмінію, призначають птахам. Відповідно до одного з варіантів вакцина містить альфа-токсоїд С.perfringens, ад'ювант і один або більше захисний антиген, рекомбінантний або природний, отриманий з вірусів, бактерій і/або бактеріального екстракту. Відповідно до ще одного аспекту цей винахід стосується способів забезпечення активного імунітету у птаха шляхом його вакцинації вакциною згідно з винаходом. Відповідно до одного з варіантів доза вакцини для забезпечення такого активного імунітету становить приблизно від 0,05 до 0,1 мл. Відповідно до одного варіанту таким птахом є індик. Відповідно до ще одного варіанту таким птахом є курка. Відповідно до ще одного варіанту таким птахом є фазан. Цей винахід також стосується способу призначення багатовалентної вакцини згідно з винаходом птаху з метою його захисту від ряду захворювань. Цей винахід також стосується способів забезпечення пасивного імунітету у потомства самки тварини (наприклад, вагітної самки), який полягає у призначенні вакцини згідно з винаходом самці тварини (наприклад, матері) перед народженням її потомства. Відповідно до одного варіанту такою самкою є самка птаха, і вакцину призначають самці птаха перед відкладенням яєць, в яких знаходиться потомство. У такий спосіб її потомству передається пасивний імунітет. Відповідно до одного варіанту таким птахом є курка. Відповідно до ще одного варіанту таким птахом є індик. Відповідно до ще одного варіанту таким птахом є фазан. Відповідно до одного з варіантів спосіб забезпечує пасивний імунітет до захворювань, які викликаються клостридіями, у потомства вакцинованої тварини. В одному з таких способів таким затоварюванням, що викликається клостридіями, є клостридіальний ентерит. У одному із способів цього типу таким клостридіальним ентеритом є некротичний ентерит. Відповідно до ще одного способу захворюванням, що викликається клостридіями, є холангіогепатит. Відповідно до ще одного варіанту спосіб забезпечує пасивний імунітет до захворювань, що викликаються 4 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клостридіями, у потомства вакцинованої тварини, а також забезпечує захист від гангренозного дерматиту, сепсису і/або гепатиту. Відповідно до одного варіанту спосіб забезпечення пасивного імунітету у потомства самки тварини полягає у призначенні багатовалентної вакцини самці тварини для захисту її потомства від ряду захворювань. Відповідно до одного з варіантів цього типу самка тварини належить до сімейства свійських птахів, і її потомство захищене від ряду хвороб птахів. Відповідно до одного з варіантів доза вакцини, що забезпечує розвиток пасивного імунітету у потомства самки тварини, становить приблизно 0,25 мл. Відповідно до ще одного варіанту така доза вакцини становить приблизно 0,4 мл. Відповідно до ще одного варіанту доза вакцини становить приблизно 0,6 мл. У варіанті, наведеному далі в якості прикладу, доза вакцини становить приблизно 0,5 мл. Цей винахід також стосується способу одержання вакцини, яка містить альфа-токсоїд С.perfringens, згідно з винаходом. Один із таких способів полягає у вирощуванні клітини С.perfringens у середовищі культури з одержанням певної кількості культивованих клітин, які секретують альфа-токсин С.perfringens в клітинне середовище. Після цього одержують альфатоксоїд С.perfringens шляхом інактивації секрету альфа-токсину. Більшість культивованих клітин видаляють із клітинного середовища з одержанням супернатанта альфа-токсоїда С.perfringens. Відповідно до одного з варіантів способу концентрацію супернатанта альфа-токсоїда С.perfringens встановлюють на рівні, достатньому, щоб індукувати щонайменше чотири антитоксичні одиниці (А.О.) антитіла проти альфа-токсину на мл антисироватки тварини (наприклад, курки), яка була вакцинована однією або двома дозами 0,25-0,6 мл. такої вакцини. Відповідно до одного такого варіанту процес концентрування включає діафільтрування через буферний розчин з метою видалення домішок з низькою молекулярною масою. Спосіб одержання вакцини, яка містить альфа-токсоїд С.perfringens, згідно з винаходом може додатково включати змішування супернатанта альфа-токсоїда С.perfringens з ад'ювантом. Відповідно до одного такого варіанту супернатант альфа-токсоїда С.perfringens змішують з емульсією вода-в-маслі. Відповідно до одного такого варіанту емульсію вода-в-маслі одержують з 70 % масляної фази і 30 % водної фази. Клітини С.perfringens, які використовуються у способі, можуть бути клітинами, одержаними з одного типу С.perfringens. Відповідно до одного такого варіанту клітинами С.perfringens є клітини С.perfringens типу А. Відповідно до альтернативного варіанту такими клітинами С.perfringens є клітини С.perfringens типу С. Зазначені та інші аспекти цього винаходу будуть більш зрозумілими з посиланням на наведений далі детальний опис винаходу. Детальний опис винаходу Цей винахід стосується унікальних вакцин проти С.perfringens, які є одночасно безпечними і ефективними для профілактики захворювань, які викликаються клостридіями у тварин. Відповідно до одного з варіантів в результаті призначення вакцини згідно з винаходом самці тварини відбувається її імунізація, а також виробляються антитіла, які можуть пасивним шляхом передаватися до її майбутнього потомства. Відповідно до одного варіанту цей винахід стосується вакцини, яка містить специфічну мінімальну кількість альфа-токсоїда С.perfringens одного типу, яка є ефективною проти шкідливих інфекцій С.perfringens. Відповідно до одного з варіантів вакцина містить безпечну і імунологічно ефективну комбінацію альфа-токсоїда згідно з винаходом і фармацевтично прийнятного ад'юванта. Вакцини згідно з цим винаходом можуть використовуватися для запобігання будь-якому стану або захворюванню, в якому бере участь С.perfringens. Такі захворювання включають клостридіальні захворювання. Відповідно до одного варіанту клостридіальним захворюванням є клостридіальний ентерит. Тому відповідно до одного з варіантів цей винахід стосується вакцин, які є ефективними для профілактики клостридіального ентериту у свійських птахів, відомого як некротичний ентерит. З допомогою вакцин згідно з винаходом можна також запобігати іншим синдромам, які включають, але не обмежуються цим переліком, клостридіальний гепатит, холангеогепатит і гангренозний дерматит. Як описано у цьому винаході вакцина, яка містить спеціально визначену мінімальну кількість альфа-токсоїда (а саме яка має спеціально визначений мінімальний TCP), отриманого з С.perfringens одного типу, захищає потомство вакцинованої самки, ураженої клостридіальними захворюваннями, такими як некротичний ентерит, незалежно від того, чи контрольний С.perfringens експресує будь-які додаткові летальні токсини. Цей винахід також описує вакцину, яка викликає специфічну мінімальну реакцію на анти-альфа токсин у вакцинованої самки, яка також захищає потомство такої вакцинованої самки, ураженої клостридіальними захворюваннями, незалежно від того, чи природний С.perfringens експресує будь-які додаткові 5 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 летальні токсини. Вакцини згідно з цим винаходом також можуть призначатися у поєднанні з прийнятним ад'ювантом. Як показано на прикладах далі, в результаті вакцинації курей вакциною, отриманою з ізоляту інактивованих С.perfringens типу А, який експресує альфа-токсин, а не відповідний бета2-токсин, несподівано мала місце пасивна імунізація потомства курей віком три тижні під дією штаму С.perfringens, який експресував як альфа-токсин, так і бета-2-токсин. До цього часу не існувало доказів щодо перехресного захисту від цих двох відмінних токсинів. Тому цей винахід стосується відносно простих вакцин, здатних стимулювати специфічну мінімальну кількість анти-альфа токсинів і завдяки цьому запобігати клостридіальним захворюванням, наприклад некротичному ентериту, незалежно від того, які інші токсини може експресувати контрольний штам С.perfringens. В дійсності, незалежно від множини токсинів та інших біологічно активних протеїнів, які виробляються С.perfringens і які, як відомо, мають патогенну дію на тварин, і чисельних зауважень в літературі щодо ролі цих різних токсинів та інших протеїнів в патології некротичного ентериту, унікальні вакцини, описані в цій заявці, забезпечують як сильно виражену імунну реакцію на С.perfringens у вакцинованих курей-бройлерів, так і пасивний імунітет у народженого у них потомства. Хоча цей винахід повністю незалежний від будь-якої теорії або моделі, результати, описані в цій заявці, відповідають тому, що альфа-токсин С.perfringens є антигенним компонентом, що одночасно є необхідним і достатнім для захисту від некротичного ентериту. Тоді як бета, бета 2 і ентеротоксини можуть бути критичними для патології некротичного ентериту, наведені у цій заявці результати відповідають тому, що такий альфа-токсоїд є єдиним необхідним токсоїдом для вакцини проти некротичного ентериту. Крім того, так як продукування альфа-токсину загалом найвище в штамах типу А, зокрема в якості джерела альфа-токсину С.perfringens використовуються штами С.perfringens типу А. Однак, також можуть успішно використовуватись інші типи С.perfringens, зокрема у випадках, коли застосовувалась генетична модифікація для підвищення рівнів продукування альфа-токсину в таких інших типах. У цьому описі наведені далі терміни мають нижчевказані значення: У цьому описі "захисний антиген" означає антиген, який призводить до продукування специфічних антитіл, які забезпечують захист від інфекції і/або захворювання у тварини, вакцинованої таким антигеном, і/або у її потомства. Вакцина, яка містить такий захисний антиген називається "імунологічно ефективною". У цьому описі термін "антигенний фрагмент" відносно конкретного протеїну означає фрагмент такого протеїну, який є антигенним. Наприклад, антигенний фрагмент альфа-токсину або альфа-токсоїду є фрагментом антигенного альфа-токсину або альфа-токсоїду. У цьому описі антигенним фрагментом альфа-токсину або альфа-токсоїду може бути будь-який фрагмент альфа-токсину або альфа-токсоїду, відповідно включно з великими фрагментами, яким до протеїну з повним ланцюгом не вистачає всього лише однієї амінокислоти. Відповідно до одного з варіантів антигенний фрагмент альфа-токсину або альфа-токсоїду містить від 6 до 120 амінокислотних залишків. Крім того, антигенний фрагмент певного альфа-токсину може бути одержаний з рекомбінантного джерела, з протеїну, виділеного з натуральних джерел, або з допомогою хімічного синтезу Крім того, антигенний фрагмент може бути одержаний внаслідок протеолітичного розщеплення альфа-токсину, альфа-токсоїду або його фрагмента, через рекомбінантну експресію або альтернативно він може бути утворений de novo, наприклад, через реакцію пептидного синтезу. У цьому описі "інактивний антигенний фрагмент" альфа-токсину С.perfingens означає антигенний фрагмент альфа-токсину С.perfingens, який містить щонайменше один антигенний епітоп, але не має достатньої каталітичної активності альфа-токсину, яка б робила його шкідливим. Такі інактивні антигенні фрагменти можуть використовуватися окремо або альтернативно можуть включатися до складу злитих протеїнів. У цьому описі термін "альфа-токсоїд" вживається на позначення будь-якого інактивного альфа-токсину (наприклад, наприклад альфа-токсин з повним ланцюгом), але ніяким чином не обмежує конкретні засоби інактивації альфа-токсину для одержання альфа-токсоїда. Такі інактивуючі методики включають: (і) хімічні методики, які видозмінюють вихідний протеїн, наприклад, обробку формальдегідом або глутаральдегідом; (іі) фізичні методи, такі як нагрівання; (ііі) ензиматичні методи, які змінюють протеїн, такі як протеаза, яка розщеплює токсин на фрагменти; (iv) рекомбінантні методи, такі як генна інженерія гену альфа-токсину для видалення або зміни ензиматичних ділянок протеїну, при яких зберігається один або більше антигенний епітоп (див., наприклад, патент США 5,817,317, зміст якого повністю включений до цього опису як посилання); і/або комбінації будь-якої із вказаних методик. 6 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У цьому описі "супернатант альфа-токсоїда" С.perfingens означає розчин, який містить інактивований альфа-токсин С.perfingens, в якому щонайменше більшість з клітин, які продукували такий токсин, були видалені (а саме більше, ніж 70 % клітин були видалені, а відповідно до одного з варіантів більше 90 % клітин). Відповідно до одного з варіантів інактивований альфа-токсин С.perfingens виділявся у середовище культури клітинами С.perfingens, які додавались до середовища культури і/або культивувались/вирощувались у ньому, і після цього інактивувався. Відповідно до ще одного варіанту інактивований альфатоксин С.perfingens містить альфа-токсин С.perfingens, зв'язаний з клітинами, який був вивільнений в результаті лізису клітин і після цього інактивований. Способи одержання "супернатанта альфа-токсоїда" ніяким чином не обмежуються будь-якою конкретною методикою видалення клітин або клітинного дебрісу із розчину, і включають центрифугування, колонкову хроматографію, ультрафільтрування і т.д. У цьому описі "безклітинний" розчин означає розчин, в якому з культури було видалено більше 90 % клітин. Способи одержання "безклітинного" розчину ніяким чином не обмежуються будь-якою конкретною методикою видалення клітин або клітинного дебрісу із розчину, і включають центрифугування, колонкову хроматографію, ультрафільтрування і т.ін. У цьому описі термін "С.perfringens одного типу" вживається для посилання на один із типів С.perfringens, наприклад типу А або типу В, або Типу С і т.д., на відміну від багатотипних бактерій, наприклад типу А і типу В і С. Тому клітина, супернатант, композиція, препарат, вакцина і т.д., які містять альфа-токсоїд "С.perfringens одного типу" є клітиною, супернатантом, композицією, препаратом, вакциною і т.д., яка містить альфа-токсоїд лише цього одного конкретного типу С.perfringens і не містить альфа-токсоїда будь-якого С.perfringens іншого типу. З іншого боку, такі клітини, супетрнатанти, композиції, препарати, вакцини і т.ін. можуть містити інші не-альфа-токсоїдні компоненти, включно з іншими токсоїдами С.perfringens і/або ад'ювантами, і/або імуномодуляторами і т.д. У цьому описі "антитоксична одиниця" або "А.О." антитіла проти альфа-токсину на мл антисироватки взаємозамінно використовується разом з терміном одиниці "тесту на нейтралізацію анти-альфа-токсину" або одиниць "ТНТ" і визначається здатністю сироватки нейтралізувати токсичні ефекти альфа-токсину в біоаналізі на мишах. У цьому тесті відому кількість альфа-токсину, яка визначається міжнародними стандартами [Фармакопея ЄС 5.0.: 01/2005:0088, стор. 803-804] змішують з серійними розведеннями сироватки, взятої у вакцинованих тварин. Суміш інкубують протягом однієї години при кімнатній температурі і після цього вприскують мишам внутрішньовенно. Миші виживають у тому випадку, якщо токсин повністю нейтралізований сироваткою, в іншому випадку вони помирають. Антитоксична одиниця або титр визначається як одиниця, що відповідає найвищому ступеню розведення сироватки, при якому був нейтралізований токсин. У цьому описі термін "Сумарна активність" позначається скороченням "TCP" і визначається як описано у Batty [Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Chapter 8, Volume 5A (1971), ed. JR Norris and DW Ribbons]. У цьому аналізі певний об'єм такого супернатанта альфатоксоїда вводять у взаємодію з відомою кількістю антитоксичних одиниць. Після завершення необхідного інкубаційного періоду, який дозволяє антитоксину і альфа-токсоїду зв'язатися, наприклад, однієї години при кімнатній температурі, додають відому кількість альфа-токсину. Після цього залишковий вільний антитоксин протягом необхідного проміжку часу зв'язується з альфа-токсином, наприклад протягом однієї години при кімнатній температурі. Після цього визначають кількість вільного альфа-токсину шляхом додавання до розчину субстрату з метою визначення ензиматичної активності альфа-токсину. Придатні субстрати включають еритроцити (зокрема еритроцити вівці) і лецитин. Після цього такий альфа-токсоїд може бути кількісно описаний з допомогою розрахунків на основі показників встановленої ензиматичної активності. Чим вища кількість альфа-токсоїда в аналізованому розчині, тим вищою є визначена ензиматична активність. Терміни "тип" і "біотип" використовуються як синонімічні і вживаються на позначення певного фенотипу С.perfringens залежно від експресії різних генів токсинів. Clostridium perfringens поділяється на типи, виходячи з продукування чотирьох основних токсинів: альфа, бета, іпсилон і йота. С.perfringens типу А продукує альфа-токсин; Тип В продукує альфа, бета і епсилон-токсини; Тип С продукує альфа і бета-токсини, Тип D продукує альфа і епсилонтоксини, Тип Е продукує альфа і йота-токсини. Було описано 17 екзотоксинів С.perfringens. Класифікація біотипів С.perfringens ґрунтується на продукуванні деяких або всіх одаткових клостридійних токсинів і/або ферментів. Наприклад, ентеротоксигенний патотип С.perfringens типу А може продукувати тета і му-токсини, а не тільки альфа-токсин. 7 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цьому описі багатовалентна вакцина означає вакцину, яка містить два або більше різних антигени. Відповідно до одного з варіантів багатовалентна вакцина стимулює імунну систему реципієнта щодо двох або більше різних патогенів. Терміни "ад'ювант" і "імуностимулятор" використовуються як синонімічні і визначаються як одна або більше речовина, яка стимулює імунну систему. У цьому контексті ад'ювант використовується для посилення імунної реакції на один або більше вакцинні антигени. Ад'ювант може призначатися тварині-мішені перед призначенням вакцини, разом з нею або після призначення вакцини. Ад'юванти згідно з цим винаходом можуть бути одержані з ряду джерел, включно з природними джерелами, з рекомбінантних джерел і/або можуть бути синтезовані хімічним шляхом і т.д. Приклади хімічних сполук, які використовуються як ад'юванти, включають, але не обмежуються цим переліком, сполуки алюмінію, метаболізовані і неметаболізовані масла, блок-полімери, ІСКОМ (імуностимулючі комплекси), вітаміни і мінерали (включно з і не обмежуючись цим переліком: вітамін Е, вітамін А, селен і вітамін В12), Quii А (сапоніни) і CARBOPOL®. Додаткові приклади ад'ювантів, які іноді згадуються як імуностимулятори, включають компоненти клітинних стінок бактерій і грибів (наприклад, ліпополісахарид, ліпопротеїни, глікопротеїни, мурамілпептиди, бета-1,3/1,6-глюкани), різні комплексні вуглеводи рослинного походження (наприклад, глікани, ацеманнани), різні протеїни і пептиди тваринного походження (наприклад, гормони, цитокіни, ко-стимулюючі фактори) і нові нуклеїнові кислоти, отримані з вірусів та інших джерел (наприклад, двониткова РНК, CpG). Крім того, будь-яке число комбінацій вищезгаданих речовин може створити ефект ад'юванта, а тому може бути ад'ювантом згідно з цим винаходом. У цьому описі "анти-альфа токсин" означає антитіло (моноклональне або поліклональне), яке зв'язується з альфа-токсином. Антитіла проти альфа-токсину можуть визначатися з допомогою ТНТ-аналізу як описано вище. Альтернативно, антитіла можуть визначатися за їх здатністю блокувати гемолітичний ефект альфа-токсину. В аналізі інгібування гемолізу відому кількість альфа-токсину, достатню для того, щоб він виступив каталізатором повного лізису даного препарату, що містить еритроцити вівці, змішують з серійними розведеннями сироватки і інкубують протягом однієї години при температурі 36±2 °C. Після цього суміш інкубують з 0,5 % еритроцитів вівці протягом трьох годин при 36±2 °C. Коли антитіло зв'язується з альфатоксином, такий токсин не здатний гемолізувати еритроцити. Титр визначають за відповідністю найвищому ступеню розведення сироватки, при якому не відбувається гемоліз. У подібному аналізі здатність антитіл, зв'язаних з альфа-токсином, інгібувати фосфоліпазну активність може вимірюватись на основі визначення найвищого ступеня розведення антисироватки, яке блокує ферментне розщеплення лецитину. У цьому описі термін "поліпептид" використовується як синонімічний терміну "протеїн" і додатково також охоплює пептиди. Тому у цьому описі поліпептид означає полімер, що складається з двох або більше амінокислот, зв'язаних пептидними зв'язками. Поліпептиди згідно з цим винаходом включають натуральні протеїни, рекомбінантні протеїни, хімічно синтезовані протеїни, фрагменти будь-яких натуральних, рекомбінантних або хімічно синтезованих протеїнів; а також злиті протеїни, які містять будь-які натуральні, рекомбінантні і/або хімічно синтезовані протеїни, і/або будь-які їх фрагменти. Переважно термін поліпептид використовують на позначення полімера, який містить двадцять або більше амінокислотних залишків, з'єднаних між собою пептидними зв'язками, тоді як термін пептид використовується на позначення полімера, який складається з від двох до двадцяти амінокислотних залишків, з'єднаних між собою пептидними зв'язками. "Гетерологічна нуклеотидна послідовність" у цьому описі означає нуклеотидну послідовність, яка рекомбінантними методами приєднується до нуклеотидної послідовності, що кодує протеїн згідно з винаходом, наприклад альфа-токсин згідно з винаходом, або кодує його фрагмент (наприклад, інактивний антигенний фрагмент), з утворенням нуклеїнової кислоти, яка не утворюється природним шляхом. Такі нуклеїнові кислоти можуть кодувати злиті протеїни. Крім того, у цьому описі гетерологічна нуклеотидна послідовність необов'язково має бути єдиною неперервною нуклеотидною послідовністю, і може включати ряд перервних нуклеотидних послідовностей, які були поєднані з нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид згідно з винаходом або його частину. Гетерологічна нуклеотидна послідовність може містити некодуючі послідовності, включно із сайтами рестрикції, регуляторними сайтами, промоутерами і подібними. Відповідно до ще одного варіанту гетерологічний нуклеотид може функціонувати як засіб виявлення нуклеотидної послідовності згідно з винаходом. Цей винахід стосується гетерологічних нуклеотидних послідовностей, які у їх поєднанні з нуклеотидними послідовностями, що кодують поліпептид згідно з винаходом або його фрагмент, потрібні і достатні для кодування всіх злитих протеїнів згідно з винаходом. 8 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цьому описі вакциною, "яка по суті містить" альфа-токсоїд С.perfringens одного типу і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент відповідного альфа-токсину, є вакцина, яка містить імунологічно ефективну кількість альфатоксоїда С.perfringens одного типу і/або антигенний фрагмент альфа-токсоїда С.perfringens, і/або інактивний антигенний фрагмент відповідного альфа-токсину, для захисту від захворювань, що викликаються клостридіями, але не містить імунологічно ефективну кількість будь-якого іншого антигена, який захищає від захворювань, що викликаються клостридіями, такого як інший антиген С.perfringens, або альфа-токсин альтернативного типу С.perfringens, альфа-токсоїд або його фрагмент. Такі вакцини можуть додатково містити антигени, пов'язані з іншими захворюваннями, такі як вірусні антигени вірусу інфекційного бурситу, реовірусу і вірусу псевдочуми птахів; бактеріальні антигени з Е.coli, Salmonella і Campylobacter, а також паразитарні антигени, такі як антигени з Eimeria. У цьому описі термін "приблизно" у поєднанні з конкретною дозою означає, що доза коливається в межах двадцяти відсотків від зазначеної величини. Наприклад, доза приблизно 0,5 мл може становити від 0,4 мл до 0,6 мл. Виділення С.perfrinaens типу А Виділені бактерії С.perfringens, такі як С.perfringens типу А, можуть бути отримані із зразків калу і/або шкребків з кишок інфікованих тварин. Такі зразки/шкребки можуть висіватися штрихом на планшетах з кров'яним агаром, інкубуватися в анаеробних умовах при температурі 35±1 °C протягом 24-48 годин, а колонії, які нагадують С.perfringens типу А виділяють окремо. Для їх ідентифікації в якості виділених бактерій С.perfringens типу А відібрані колонії можуть додатково аналізуватись на встановлення наявності у них біохімічних ознак, властивих С.perfringens типу А, включно з генетичним кодом. Присутність гену альфа-токсину у виділеному матеріалі може бути визначена з допомогою генетичного аналізу, наприклад з допомогою ПЛР. Експресія альфа-токсину може бути виявлена з допомогою його активності лецитинази в ході аналізу з використанням яєчного жовтка і/або еритроцитолізу з використанням еритроцитів вівці. Відповідно до одного з варіантів виділені бактерії С.perfringens, які експресують значну кількість альфа-токсину, використовують для приготування вакцини згідно з цим винаходом. Вибраний виділений матеріал С.perfringens може вирощуватися в анаеробних умовах у живильному бульйоні протягом 4-24 годин. Отримана культура може бути інактивована, наприклад, з допомогою формаліну, який концентрують і примішують до такої вакцини. Токсини С.perfrinaens Альфа-токсин - Альфа-токсин продукується всіма типами С.perfringens. Альфа-токсин є поліфункціональною фосфоліпазою С, яка може розчеплювати лецитин, утворюючи фосфорилхолін і дигліцерид. Виявилось, що при внутрішньовенному призначенні альфа-токсин є смертельним для мишей. Альфа-токсин також має яскраво виражені гемолітичні властивості. Проте, чутливість еритроцитів може значною мірою змінюватися залежно від виду тварини, яка є джерелом еритроцитів. Альфа-токсин також викликає агрегацію тромбоцитів, лізис тромбоцитів, лейкоцитів і інших клітин тіла, а також зумовлює посилення проникності судин. Бета-токсин - Бета-токсин продукується С.perfringens типів В і С. Бета-токсин відповідальний за запалення кишечника і значне руйнування його слизової оболонки, а також за інгібування моторики кишечника. Бета-токсин є протеїном з молекулярною масою 35 кДа, який значно більш чутливий до протеолітичних ферментів, таких як трипсин, порівняно з іншими токсинами С.perfringens. Було встановлено, що бета-токсин є смертельним для тварин, при цьому найбільш чутливими до нього є миші, а найменш чутливими - кури. Бета-2-токсин - Бета-2-токсин був відкритий найпізніше серед усіх токсинів С.perfringens. Незважаючи на подібність їх назв, амінокислотні послідовності бета-2-токсину і бета-токсину не є гомологічними. Література свідчить про очевидний зв'язок між бета-2-токсином і некротичним ентеритом у деяких тварин [Garmory et al., Epidemiol. Infect. 124:61-67 (2000), Herholz et al., J. Clin. Morco, Feb:358-361 (1999)]. Бета-2-токсин має молекулярну масу 28 кДа. Було виявлено, що бета-2-токсин є смертельним для мишей і цитотоксичним щодо деяких клітинних ліній, включно з заокругленням клітин і лізисом без впливу на актиновий цитоскелет [Manteca et al., Vet. Microb. 86:191-202 (2002), Schotte et al., J. Vet Med В 51:423-416 (2004), Gilbert et al., Gene 203:65-73 (1997)]. Ентеротоксин - Ентеротоксин як правило продукується штамами С.perfringens типу А. Традиційно присутність ентеротоксину використовували для вирізнення штамів, з якими пов'язані кишковів захворювання, з-поміж штамів, з якими пов'язана газова гангрена тканин. Штами, які викликають газову гангрену, як правило не містять ентеротоксин. Ентеротоксин є теплочутливим протеїном з молекулярною масою 34 кДа. Смертельна доза для мишей 9 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 становить приблизно 10 мікрограм. Первинна взаємодія ентеротоксину націлена на утворення пор у клітині-хазяїні, внаслідок чого змінюється проникність клітини, інгібується макромолекулярний синтез, відбувається розпад цитоскелету і нарешті лізис [див., Songer, CHn. Micro. Rev, 9(2):216-234 (1996)]. Ентеротоксин повністю змінює чистий перенос у клітинах кишечника. Епсилон-токсин - Епсилон-токсин продукується С.perfringens типів В і D. Епсилон-токсин синтезується як протоксин, який перетворюється ендогенним трипсином у надзвичайно сильнодіючий нейротоксин. При внутрішньовенному призначенні епсилон-токсин може бути смертельно небезпечним для мишей. Епсилон-токсин є високоафінним з нервовою тканиною і викликає проникність судин. Епсилон-токсин також викликає проникність стінок кишечника, що призводить до того, що великі молекули, включно з самим іпсилон-токсином, можуть потрапляти у кровотік. Після цього епсилон-токсин через кровотік потрапляє до головного мозку, де він порушує баланс осмотично активних речовин. Порушення осмотичного балансу у мозку виявляється в нейрологічних симптомах, які спостерігаються в ураженої тварини перед смертю. Каппа-токсин - Каппа-токсин є колаген-гідролізуючим ферментом, який продукується С.perfringens типів A, D, Е і деякими типами В і С. Каппа-токсин має молекулярну масу 80 кДа і є смертельним для мишей. Внутрішньовенне призначення каппа-токсину миші призводить до смерті через одну годину внаслідок інтенсивного крововиливу у легенях. Тета-токсин - Більшість штамів С.perfringens продукують тета-токсин. Тета-токсин представляє собою протеїн з молекулярною масою 74 кДа, який відповідає за наявність прозорих зон гемолізу, які спостерігаються довкола колоній на планшетах з кров'яним агаром. Очищений тета-токсин є вкрай смертельно небезпечним для мишей і убиває останніх за лічені хвилини. Тета-токсин інгібується деякими стероїдами, при цьому найпотужнішим інгібітором є холестерин. Пасивний імунітет Цей винахід стосується вакцини, яка містить безпечний і імунологічно ефективний препарат з мінімальною кількістю антигену згідно з винаходом, наприклад альфа-токсоїду, для вакцинації самок тварин, зокрема маток і/або вагітних самок, які можуть передати ефект вакцини своєму новонародженому потомству. Така передача імунітету від матері до потомства називається "пасивним імунітетом". Пасивний імунітет може набуватися inter alia через споживання колоструму, як це має місце у ссавців, або через поглинання антитіла у кровотік через яєчний жовток, як це має місце у свійських птахів. Крім того, як описано у цій заявці, свійська птиця може засвоювати антитіла in ovo, що призводить до підвищення рівня циркулювання системних антитіл. Як проілюстровано у цій заявці, шляхом пасивного передання специфічної кількості антиальфа-токсину новонародженій тварині захищає новонароджених від вірулентної загрози Clostridium perfringens. Обсяг захисту, як описується далі, виявися абсолютно несподіваним, так як до цього часу вважалось, що кишечник має бути наповнений антитілами для того, щоб забезпечити достатній захист від перорального зараження С.perfringens типу А. Так само досить несподіваним є те, що існує паралель між передачею імунітету слизової через перенос материнських антитіл внаслідок споживання колоструму новонародженими ссавцями та поглинанням материнських антитіл в яйці. Як показано далі щодо курей, антитіла проти альфатоксину абсорбуються кров'ю in ovo. Крім того, цей винахід свідчить про те, що індукування специфічного визначеного мінімального титру антитіла проти альфа-токсину у потоку крові курки є достатнім для захисту вакцинованого потомства такої курки від інфікування С.perfringens типу А, яке експериментально здійснюється через кілька тижнів після народження такого потомства. Активний імунітет Цей винахід стосується вакцинації курчат (наприклад, курчат бройлерів) і/або індичат для забезпечення активного імунітету проти некротичного ентериту, некротичного дерматиту і гангренозного дерматиту. Курчата і/або індичата проходять вакцинацію на ранніх стадіях життя, приблизно у перший день свого життя або трохи пізніше (протягом першого тижня життя) однією чи двома дозами вакцини. Належні дози вакцини для досягнення активного імунітету можуть становити приблизно від 0,05 мл до 0,5 мл. Відповідно до одного з варіантів доза вакцини становить приблизно від 0,05 мл до 0,1 мл. Клітинна культура Clostridium perfringens виділяє альфа-токсин в середовище в процесі росту. Після інактивації і видалення щонайменше більшості клітин із живильного середовища залишковий розчин становить супернатант альфа-токсоїду. Як правило, такі клітини видаляють для того, щоб 10 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зменшити кількість інородних антигенів у вакцині, які в іншому випадку могли б сприяти підвищенню реактивності і ослабленню імунної реакції. Однак, там також присутня визначена кількість зв'язаного з клітинами альфа-токсину. Тому антиген альфа-токсину може бути виділений з клітин і/або середовища у концентрованій або неконцентрованій формі. С.perfringens може вирощуватись у будь-якій придатній посудині, включно з пробірками, пляшками, колбами або механічними біореакторами. Під час росту може відслідковуватися ферментація для того, щоб зібрати матеріал в біореакторі, коли продукування альфа-токсину досягло свого піку. Традиційні методики включають афінну хроматографію, гель-електрофорез (система PHAST, і т.д.),імунологічні аналізи, аналізи активності гемолізину і лецитинази. Рідка клітинна культура або клітинний екстракт можуть бути інактивовані формальдегідом (0,1-2,0 %) або формальдегідом і з нагріванням. Інші хімічні речовини, які використовуються для денатурування протеїну і можуть використовуватись в цьому винаході, влючають, але не обмежуються цим переліком: Глутаральдегід, фенол, різні детергенти, такі як Тритон Х-100, додецилсульфат натрію (ДСН) і спирти. Під час інактивації може регулюватися кількість залишкового формальдегіду для того, щоб підтримувати оптимальний рівень токсичності. Традиційні методики визначення вмісту вільного формальдегіду наведені у Європейській Фармакопеї (01/2005:20418) або 9 CFR (113.100). Також існують подібні методики для визначення рівнів інших типів інактивантів токсинів. У деяких випадках альфа-токсин навмисне недостаньо детоксикують на цьому етапі з метою мінімізації денатурування епітопів, що є важливим для розвитку антитоксинів, а після цього додатково обробляють з метою детоксикаціх на більш пізній стадії процесу. Також можуть використовуватися інші придатні хімічні або біологічні агенти, здатні інактивувати токсин, такі як глутаральдегід, фенол, різні детергенти, такі як Тритон Х-100, додецилсульфат натрію (ДСН) і спирти. Одержаний альфа-токсоїд може зберігатися протягом певного проміжку часу перед будьякою додатковою обробкою без згубних наслідків. Як правило, оптимальним є зберігання при температурі 2-8 °C. Однак, інактивовані клостридіальні токсоїди є надзвичайно стійкими і також можуть зберігатися при більш високих температурах. У випадку зберігання протягом строків більше 6 місяців і при температурі вище 8 °C може бути доцільним здійснення повторної перевірки активності токсоїда з допомогою тесту на сумарну активність (TCP) або з допомогою іншого імунологічного аналізу для визначення імуногенної стабільності токсоїда. Клітини можуть бути видалені з інактивованого клітинного середовища центрифугуванням і/або фільтруванням з одержанням токсоїдного супернатанта. Видалення клітин служить зниженню реактивності тканини, яка може викликатись клітинними компонентами, тоді як видалення інородних антигенів з препарату сприяє тому, щоб імунна реакція була зосереджена на токсоїдному компоненті вакцини. Інактивоване середовище культури може бути концентроване з допомогою ряду методик, включно з ультрафільтрацією (переважно з використанням мембранних ультрафільтрів з відсіченням по молекулярній масі не більше 30,000) або ліофілізацією. Процес концентрування може включати діафільтрацію через водний розчин (наприклад, забуферений фосфатним буфером сольовий розчин) з метою видалення з препарату домішок з низькою молекулярною масою. Концентрована рідина може бути повторно оброблена один або більше раз формальдегідом і/або нагріватися, доки відповідний аналіз не підтвердить, що рідина не має залишкової токсичності. Такі аналізи включають біоаналіз на мишах, що полягає у вприскуванні такої рідини миші і спостереженні за дією, яку вона має на мишу, або ж у визначенні активності гемолізину або активності лецитинази і т.ін. Перед перемішуванням може бути необхідно відрегулювати рівень рН розчину для забезпечення оптимального зв'язування з ад'ювантами, емульгування маслами і/або стабільності розчину. Ізоелектрична точка (рі) альфа-токсину приблизно становить 5.5 [Smith et rd al., The Pathogenic Anaerobic Bacteria, (3 Ed.) Charles Thomas Publishers, стор. 116 (1984)]. Зміна рН токсоїдного розчину змінить чистий заряд протеїну, що є корисним для посилення зв'язування з деякими ад'ювантами, такими як алюмінієві ад'юванти. рН також може встановлюватися на рівні, який забезпечує підвищення стабільності такого альфа-токсоїда для його зберігання упродовж тривалого часу. Наприклад, протеїни з більшою ймовірністю випадуть в осад з розчину при їх "рі", але зазвичай зберігають стабільність при рН на одну одницю вище або нижче цього значення. Нуклеїнові кислоти, які кодують поліпептиди згідно з цим винаходом Нуклеїнова кислота, така як кДНК, що кодує поліпептид згідно з цим винаходом, може використовуватись для генерування рекомбінантних бактеріальних клітин-хазяїв, які експресують протеїн і/або антиген згідно з винаходом, наприклад альфа-токсин. Такі 11 UA 98099 C2 5 10 15 рекомбінантні клітини-хазяї можуть бути інактивовані, тобто перетворені у бактерини і використовуватися в імуногенних композиціях, таких як вакцини. Крім того, одержання і/або конструювання нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид згідно з цим винаходом, включно з нуклеїновою кислотою, що кодує альфа-токсин згідно з винаходом або його інактивний антигенний фрагмент, може сприяти продукуванню альфа-токсину, альфатоксоїду або їх фрагментів. Альфа-токсин, альфа-токсоїд і/або їх антигенні фрагменти використовуються для виготовлення вакцин згідно з винаходом. Відповідно, цей винахід також охоплює конструкти нуклеїнових кислот, які забезпечують експресію і виділення протеїнів і/або антигенних фрагментів згідно з винаходом. Послідовності таких нуклеїнових кислот і відповідні рекомбінантні протеїни антигенів, які використовуються в цьому аспекті винаходу добре відомі фахівцям у цій галузі. Короткий перелік антигенів, що можуть використовуватись у вакцинах згідно з винаходом, разом з їх вхідним номерами в GenBank, а також посилання на наукові публікації, в яких описані їх амінокислотні послідовності, наведені нижче. Приклади антигенів, які можуть використовуватись у вакцинах ДЖЕРЕЛО Антиген С.PERFRINGENS ВХІДНИЙ No. альфа-токсин САА58246 бета-2-токсин NP_150010 ентеротоксин ВАЕ79112 епсилон-токсин ААА23236 йота-токсин САА51959 каппа-токсин NP_561089 лямбда-токсин САА35187 тета-токсин NP_561079 С.DIFFICILE А токсин A37052 В токсин 1 Saint-Joanis et al., Моl. Gen. Genet. 219 (3):453-460 (1989) Steinthorsdottir et al., FEMS Microbiol. Lett. 130 (2-3): 273-278(1995) Shimizu etai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (2):996-1001 Miyamoto et al., J. Bacteriol. 188(4):15851598(2006) Havard et al., FEMS Microbiol. Lett. 97:7782(1992) Perelle et al., Infect. Immun. 61 (12):51475156(1993) Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (2):996-1001 Saint-Joanis et al., Моl. Gen. Genet. 219 (3):453-460 (1989) Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (2):996-1001 САА35186 бета-токсин ПУБЛІКАЦІЯ CAA43299 Wren et al., FEMS Microbiol. Lett. 70:1-6(1990) von Eichel-Streiber et al., Моl. Gen. Genet. 233: (1-2), 260-268 (1992) С.SEPTICUM альфа-токсин AAB32892 allard et al., Infect. Immun. 63 (1):340344(1995) С.NOVYI альфа-токсин AAB27213 all et al., Infect. Immun. 61 (7):912-2918(1993) 1 Послідовності, наведені у цих публікаціях, включені у цей опис шляхом посилання 20 25 30 Нуклеїнові кислоти, які кодують антигени протеїнів, що можуть використовуватися у вакцинах згідно з винаходом, можуть додатково містити гетерологічні нуклеотидні послідовності. Для експресії рекомбінантного протеїну згідно з винаходом у клітині-хазяїні може бути сконструйовано вектор експресії, який містить відповідну кДНК. Таким чином, винахід включає вектори експресії, які містять нуклеїнові кислоти, що кодують рекомбінантні протеїни згідно з винаходом, включно з його варіантами. Внаслідок виродження нуклеотидних кодуючих послідовностей, на практиці у цьому винаході можуть використовуватись інші нуклеотидні послідовності, які кодують по суті ту ж саму амінокислотну послідовність, що і нуклеїнова кислота, яка кодує поліпептид згідно з винаходом. Такі послідовності включають, але не обмежуються цим переліком, алельні гени, гомологічні гени з інших штамів і/або гени, змінені внаслідок заміщення різних кодонів, які 12 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодують один і той самий амінокислотний залишок у послідовності, таким чином забезпечуючи непомітні зміни. Також включаються клітини-хазяї, які містять вектори експресії згідно з винаходом. Одними із традиційно використовуваних в якості клітин-хазяїв є клітини Е.соlі. Загальні методики клонування кислот кДНК і експресії їх відповідних рекомбінантних rd протеїнів вже були описані [див. Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A laboratory Manual, 3 edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor L.I. (2000)]. Крім того, для модифікування нативного альфа-токсину згідно з винаходом може використовуватись будь-яка методика мутагенезу, відома в цій галузі техніки, яка включає, але не обмежується цим переліком, in vitro сайт-направлений мутагенез [Hutchinson et al, J. Biol. Chem., 253:6551 (1978); Zoller and Smith, DNA, 3:479-488 (1984); Oliphant et al., Gene, 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83710 (1986); Wang and Malcolm, BioTechniques 26:680-682 (1999), зміст яких повністю включений до цієї заявки як посилання. Також для сайт-направленого мутагенезу можуть використовуватися ТАВ@ лінкери (Pharmacia), і т.ін. і методики ПЛР [див. Higuchi, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, стор. 61-70 (1989)]. Поліпептиди згідно з винаходом Цей винахід включає ізольовані і/або рекомбінантні поліпептиди, включно з альфатоксинами і альфа-токсоїдами згідно з винаходом, варіантами їх штамів, інактивними антигенними фрагментами і їх злитими протеїнами. Крім того, поліпептиди, які містять змінені послідовності, в яких функціонально еквівалентні амінокислотні залишки заміщені залишками, присутніми в амінокислотних послідовностях дикого типу, внаслідок чого об'єм цього винаходу охоплює консервативні амінокислотні заміщення. Наприклад, один або більше такий амінокислотний залишок у послідовності може бути заміщений іншою амінокислотою з подібного полярністю, яка виступає як його функціональний еквівалент, внаслідок чого має місце непомітна перебудова ланцюга. Замісники амінокислоти у послідовності можуть бути вибрані серед інших членів класу, до якого належить така амінокислота. Наприклад, неполярні амінокислоти включають аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метионін. Полярні нейтральні амінокислоти включають гліцин, серин, треонін, цистеїн, тірозин, аспарагін і глутамін. Позитивно заряджені (основі) амінокислоти включають аргінін і лізин. Негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають аспарагінову і глютамінову кислоту. Особливо переважними консервативними замінами амінокислот є наступні заміни: (a) Lys на Arg або навпаки, внаслідок чого підтримується позитивний заряд; (b) Glu на Asp або навпаки, внаслідок чого може підтримуватися негативний заряд; (c) Ser на Thr або навпаки, внаслідок чого зберігається вільна група -ОН; (d) Gin на Asn або навпаки, внаслідок чого зберігається вільна група Nhb; і (e) lie на Leu або на Val або навпаки, які є приблизно еквівалентними гідрофобними кислотами. Всі поліпептиди згідно з цим винаходом, включно з антигенними фрагментами, можуть бути частиною злитого протеїну. Відповідно до специфічного варіанту злитий поліпептид експресується у прокаріотичних клітинах. Такий злитий протеїн може використовуватися, наприклад, для підвищення антигенності антигену або його фрагмента з метою зниження або зняття токсичності, не позбавляючи його властивостей антигена, або для виділення антигену згідно з винаходом. Виділенню злитого протеїну в останньому випадку може сприяти використання афінної колонки, яка є специфічною щодо протеїну /пептиду, злитого з антигеном. Такі злиті протеїни включають гібридний протеїн з глутатіон-S-трансферазою (GST), гібридний протеїн з протеїном, що зв'язується з мальтозою (МВР), FLAG-теговий злитий протеїн або полігістидин-теговий злитий протеїн. Специфічні лінкерні послідовності, такі як Ser-Gly лінкер, також можуть бути частиною такого злитого протеїну. Насправді експресія злитого поліпептиду може сприяти стабільній експресії і/або очищенню на основі властивостей злитого партнера. Таким чином, очищення рекомбінантних поліпептидів згідно з винаходом може бути спрощене через використання злитих протеїнів, які мають афінні теги. Наприклад, GST зв'язується з глутатіоном, кон'югованим з твердою підкладинковою матрицею, МВР зв'язується з мальтозною матрицею, а полігістидинхелати зв'язуються з Niхелатною підкладинковою матрицею [див. Hochuli et al., Biotechnology 6:1321-1325 (1998)]. Такий злитий протеїн може елююватися із специфічної матриці з використанням відповідних буферів або обробки протеазою, специфічною щодо сайту розщеплення, яка була отримана методами генної інженерії між альфа-токсином і, наприклад, його гібридним партнером. 13 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Альтернативно, альфа-токсин може поєднуватися з маркерним протеїном, таким як зелений флуоресцентний протеїн [Waldo et al., Nature Biotech. 17:691-695 (1999); патент США No. 5,625,048 і WO 97/26333, зміст яких включений до цієї заявки як посилання]. Альтернативно або додатково можуть використовуватись інші стадії колонкової хроматографії (наприклад, гелева хроматографія, іонообмінна, афінна хроматографія і т.ін.) для очищення натуральних або рекомбінантних поліпептидів згідно з винаходом (див. нижче). У багатьох випадках на таких стадіях колонкової хроматографії використовують ВЕРХ або аналогічні методики замість класичних методик, що ґрунтуються на визначенні густини. Крім того, поліпептиди згідно з винаходом, включно з альфа-токсинами і їх інактивними антигенними фрагментами, можуть бути хімічно синтезовані [див. наприклад, Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y., стор. 382, Grant, ed. (1992)]. Загальні методики очищення поліпептидів Загалом первинні стадії очищення поліпептиду згідно з винаходом можуть включати засолювання або висолювання, наприклад, в процесі фракціонування в сульфаті амонію, фракціонування з видаленням розчинника, наприклад, осадженням етанолу. Крім того, високошвидкісне ультрацентрифугування може використовуватись або окремо, або у поєднанні з іншими методиками екстрагування. Загалом ефективні стадії вторинного виділення або очищення включають твердофазну абсорбцію з використанням кальцій-фосфатного гелю, гідроксиапатиту або зв'язування у твердій фазі. Зв'язування у твердій фазі може здійснюватися через утворення іонних зв'язків з іонообмінником, таким як діетиаламіноетил (DEAE) або діетил [2-гідроксипропіламіноетил (QAE) SEPHADEX, або целюлоза; або з катіон обмінником, таким як карбоксиметил (CM) або сульфопропіл (SP) SEPHADEX, або целюлоза. Альтернативні засоби твердофазного зв'язування включають застосування гідрофобних взаємодій, наприклад застосування твердої підкладинки, такої як фенліСефароза і високосольовий буфер; афінно- зв'язане імунозв'язування з використанням, наприклад, антитіла альфа-токсину, зв'язаного з активованою підкладинкою. Інші твердофазні підкладинки включають підкладинки, які містять специфічні барвники або лектини і т.д. Додаткова методика твердофазної підкладинки, яку часто використовують на завершальному етапі процедури очищення, ґрунтується на відсіканні розміру з допомогою таких матеріалів, як гелі SEPHADEX і SEPHAROSE. Альтернативно можуть використовуватися методики стиснення або центрифугування мембран з використанням мембранних фільтрів для відсіювання по розміру. Часто обидві ці методики використовуються одночасно. Відділення твердофазної підкладинки загалом здійснюють серійно з допомогою низькошвидкісного центрифугування або з допомогою колонкової хроматографії. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), включно з рідинною експрес-хроматографією (РЕХ), на сьогодні є найпоширенішими методиками рідинної хроматографії. Методики відсіювання розміру також можуть реалізуватися з допомогою низькошвидкісного центрифугування. Крім того, можуть використовуватися методики пропускання за розміром, такі як методики гель-електрофорезу. Такі методики загалом здійснюють в пробірках, на пластинках або з допомогою капілярного електрофорезу. Практично на всіх стадіях очищення поліпептидів використовують буферний розчин. Окрім випадків, коли зазначено інше, загалом використовують буферні солі у концентрації 25-100 ммоль. Слабкоконцентрований буфер загалом має концентрацію 5-25 ммоль. Висококонцентровані буфери загалом мають концентрації буферного агента від 0,1 до 2,0 моль. Типові буфери пропонуються у більшості біохімічних каталогів і включають класичні буфери, такі як Тріс, пірофосфат, моно фосфат і дифосфат, а також буфери Гуда, такі як Mes, Хепес, Mops, Трицин і Ches [Good et al., Biochemistry, 5:467 (1966); Good and Izawa, Meth. Enzymol., 4B:53 (1972); і Fergunson and Good, Anal. Biochem., 104:300 (1980)]. Матеріали для виконання всіх цих методик доступні в ряді комерційних каналів, таких як Sigma Chemical Company в Сент-Луїс, Міссурі. Компоненти вакцини Альфа-токсоїд С.perfringens: В конкретних варіантах втілення винаходу бажано, щоб вакцина для тварин містила мінімальну кількість такого альфа-токсоїду, необхідну для захисту від некротичного ентериту. Було встановлено, що такий рівень відповідає 2 Сумарним одиницям активності (TCP) на дозу за певних умов, які вказані далі. Одиниці TCP встановлені з урахуванням міжнародних стандартів [Batty, Toxin-Antitoxin Assay, Methods in Microbiology, Chapter 8, Volume 5A (1971) ed. JR Norris and DW Ribbons], і вакцини згідно з винаходом можуть бути легко отримані з бажаною активністю. Якщо вакцина додатково містить імуномодулятори, 14 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 можуть використовуватися менше ніж 2 TCP навіть за цих умов. У будь-якому випадку бажано, щоб вакцина вивільняла 4 або більше антитоксичні одиниці на мл сироватки у тварини. Чисельний опис Альфа-токсоїда: Загалом бажано визначити таку кількість альфа-токсоїда, яка б забезпечувала оптимальний його рівень у вакцині. Однією із традиційних методик є тест на сумарну активність (TCP). У цьому аналізі певний об'єм такого супернатанта альфа-токсоїда взаємодіє з відомою кількістю антитоксичних одиниць. Після завершення відповідного інкубаційного періоду, необхідного для завершення зв'язування антитоксину і альфа-токсоїда, наприклад 0,5-2 годин, додають відому кількість альфа-токсину. Після цього залишковий вільний антитоксин залишають на відповідний період, необхідний для зв'язування з альфатоксином. Після цього визначають кількість вільного альфа-токсину з допомогою додавання до розчину субстрату для активності фосфоліпази С альфа-токсину. Придатні субстрати включають еритроцити (зокрема еритроцити вівці) і лецитин. Кількість такого альфа-токсоїда може бути після цього визначення на основі обчислення показників активності фосфоліпази С. Чим більша кількість альфа-токсоїда в аналізованому розчині, тим більші показники активності фосфоліпази С, які визначаються в ході цього аналізу. Альтернативно визначення кількості альфа-токсоїда можливе без визначення активності фосфоліпази С, наприклад може використовуватися будь-який аналіз зв'язування з конкурентним антитілом, включно із стадією хроматографії, твердофазним імуноферментним аналізом (ELISA), або аналізом конкурентного зв'язування з допомогою обладнання Віасоге або подібного. Додаткові антигенти: Клостридіальні захворювання часто супроводжуються іншими інфекціями, тому додавання інших клостридійних токсоїдів може додатково зменшити патологію і прояв клінічних ознак. Необмежуючий перелік прикладів таких клостридійних токсоїдів організмів, які спричиняють гастроентерити, включно з токсоїдами С.perfringens, і які можуть додаватися до вакцини згідно з винаходом для покращення її активності відносно змішаних інфекцій, включають: бета-токсин С.perfringens, бета-2-токсин, тета-токсин, епсилон-токсин, ентеротоксин, каппа-токсин, лямбда-токсин і йота-токсин; геморагічний токсин С.sordellii (НТ) і летальний токсин (LT), токсини С.difficile А і В; альфа-токсин С.septicum; альфа (А) і бета (В) токсини С.novyi. Антигени інших бактерій, вірусів, грибів або паразитів також можуть входити до складу вакцин згідно з винаходом. Такі антигени включають інші токсини або токсоїди, бактерії і/або екстракти бактерій; гриби і/або екстракти грибів; віруси і/або вірусні протеїни; і/або паразити або паразитарні протеїни. Придатні вірусні, бактеріальні і паразитарні антигени з інших джерел відомі з рівня техніки. Необмежуючий перелік прикладів таких бактеріальних організмів включає: Escherichia coli, Camplobacter spp., Pasteurella spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Chlamydia, Erysipelas spp. Pasteurella, Bordetella і Ornithobacterium. Необмежуючий перелік прикладів відповідних токсинів включає: грам-негативні бактерії ліпополісахариду (LPS), який, як відомо посилює імунну реакцію вакцин, а отже покращує продукування антитоксинів проти альфа-токсину С.perfringens і мікотоксинів. Необмежуючий перелік прикладів придатних вірусів включає: коронавірус, ротавірус, астровірус, ентеровірус-подібний вірус, торовірус, аденовірус, Реовірус, бімавірус, вірус Герпса, параміксовірус, пікорнавірус, вірус хвороби Марекса, вірус геморагічного ентериту і вірус псевдочуми птахів. Необмежуючий перелік прикладів паразитів включає: Coccidia, наприклад різновиду Eimeria, і Cryptosporidia, [див., заявка США 2004/0018215А1, зміст якої повністю включений до цього опису через посилання]. Ад'юванти Ад'юванти також використовуються для покращення імунної реакції і/або підвищення стабільності вакцинних препаратів. Ад'юванти традиційно описуються як неспецифічні стимулятори імунної системи, але також вони можуть використовувались для впливу на певний механізм-мішень імунної системи. До вакцини може додаватися одна або більше сполук, які мають цю активність. Тому певні вакцини згідно з винаходом додатково містять ад'ювант. Приклади хімічних сполук, які можуть використовуватись як ад'юванти, включають, але не обмежуються цим переліком, сполуки алюмінію (наприклад, гідроксид алюмінію), метаболізовані і неметаболізовані масла, мінеральні масла, включно з похідними маннід олеату в розчині мінерального масла (наприклад, MONTANIDE ISA 70 від Seppic SA, Франція), і легкі мінеральні масла, такі як DRAKEOL 6VR, блокполімери, ІСКОМ (імуностимулюючі комплекси), вітаміни і мінерали (включно, але не обмежуючись цим переліком, з такими вітамінами, як: вітамін Е, вітамін А, селен і вітамін В12), а також CARBOPOL®. 15 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інші придатні ад'юванти, які іноді згадувались як імуностимулятори, включають, але не обмежуються цим переліком: цитокіни, фактори росту, хемокіни, супернатанти клітинних культур лімфоцитів, моноцити, клітини лімфоїдних органів, клітинні препарати і/або рослинні екстракти, бактерії або паразити (Staphylococcus aureus або ліпосахаридні препарати) або мітогени. Загалом ад'ювант призначають одночасно з антигеном згідно з винаходом. Однак, ад'юванти альтернативно можуть призначатися протягом двотижневого періоду до вакцинації або протягом певного періоду після вакцинації, а саме протягом періоду, коли антиген, наприклад, альфа-токсоїд, перебуває в тканинах. Приготування вакцин Методики приготування вакцин згідно з цим винаходом також описані в цій заявці. Відповідно до одного варіанту отримання вакцини передбачає змішування безпечної і імунологічно ефективної комбінації антигену згідно з винаходом, наприклад, супернатанту альфа-токсоїда С.perfringens одного типу, і фармацевтично прийнятного ад'юванта. Кількість альфа-токсоїда може визначатися як така, що містить щонайменше 2 одиниці сумарної активності (TCP) на дозу вакцини. Такий супернатант альфа-токсоїда може концентруватися для зменшення необхідної дози для отримання щонайменше 4.0 антитоксичних одиниці (А.О.) на мл антисироватки вакцинованої тварини. Додавання інших фармацевтично прийнятних імуномодулюючих агентів може зменшити TCP до менше ніж 2 одиниці на дозу, за умови, що вакцинація все ще буде забезпечувати необхідні 4.0 А.О. антитіла анти-альфа токсину на мл антисироватки вакцинованої тварини. Відповідно до деяких варіантів альфа-токсоїд С.perfringens додатково очищують від такого супернатанта альфа-токсоїдів з допомогою таких методик, як концентрування, ультрафільтрація, хроматографія, центрифугування та ін. Призначення вакцин Вакцини можуть призначатися у формі рідин, емульсій, сухих порошків і/або ультра подрібненого порошку парентерально, внутрішньовенно, інтраперитонеально, інтрадермально, скарифікацією, підшкірно, внутрішньом'язово або можуть прививатися через слизову оболонку, наприклад, перорально, інтраназально у вигляді аерозолю, у формі очних крапель, призначенням in ovo або імплантації у формі ліофілізованого порошку. Тварини Термін "тварина" вживається на позначення видів тварин, які можуть інфікуватися патогенними бактеріями, і відповідно до одного з варіантів такою твариною є людина. Придатні тварини також включають диких тварин, домашніх тварин (наприклад, м'ясних, молочних, масляних порід, птахів, пушних тварин і/або тих, що забезпечують шкіри і вовну), в'ючних тварин, піддослідних тварин, домашніх тварин, а також тих, які були вирощені для зоопарків або в зоопарках, в дикій природі і/або цирках. Відповідно до одного з варіантів твариною згідно з винаходом є сільськогосподарська тварина. В контексті цього винаходу термін "сільськогосподарська" тварина включає всіх тварин, які розводяться з метою їх споживання (наприклад, індики, курчата-бройлери) або для отримання від них продуктів харчування (наприклад, дійні корови, кури-несушки та подібні) для людей і/або інших тварин. Необмежуючий перелік таких тварин включає птахів, таких як свійські птахи, а саме курей, індиків, гусей, качок, страусів і т.д., жуйних тварин (наприклад, велику рогату худобу, дійних корів, буйволів), овечих (наприклад, кіз або овець), свиней (наприклад, свиноматок, кабанів або відгодовуваних свиней), а також кінського сімейства (наприклад, коней) і т.д. Відповідно до ще одного варіанту твариною є домашня тварина. У контексті цього винаходу під терміном "домашня" тварина маються на увазі домашні коти (котячі), собаки (псові), кролики, коні (кінське сімейство), гризуни (наприклад, морські свинки, білки, щури, миші, піщанки і хом'яки), примати (наприклад, мавпи) і птахи, такі як голуби, горлиці, папуги, довгохвості папуги, ари, канарки і подібні. Також вважається, що інші тварини також можуть зазнавати дії вакцин згідно з винаходом, а саме сумчасті (такі як кенгуру), рептилії (такі як черепахи, що вирощуються в неволі), перната дичина, лебеді, безкілеві птахи, а також інші домашні тварини, які мають господарське значення. Наведені далі приклади ілюструють винахід, але не обмежують встановленого ним об'єму правової охорони. Приклади Приклад 1 Ефективність вакцини у курей-бройлерів, які пройшли вакцинацію підшкірно Резюме 16 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 В результаті підшкірної вакцинації курей-бройлерів вакциною, яка містить альфа-токсоїд С.perfringens одного типу (тип А), викликається (і) імуногенна реакція у вакцинованих курейбройлерів, (іі) значна кількість антитіл проти альфа-токсоїду в яйцях вакцинованих курейбройлерів, і (ііі) пасивний захист народженого у таких вакцинованих курей-бройлерів потомства. Матеріали Альфа-токсоїд С.рerfringens типу А: Альфа-токсоїд С.perfringens типу А одержують наступним чином: культуру С.perfringens типу А вирощують в анаеробних умовах у великомасштабному біореакторі (5000 л) при температурі 37 °C±2. Під час ферментації додають гідроксид натрію з метою підтримання рН 7,8±2. Під час ферментації також додають вуглеводи (декстрин) (до 1 % мас/об.) для сприяння росту. Культурі дають підрости протягом 36 годин. В кінці періоду росту у реактор додають розчин формальдегіду до досягнення кінцевого рівня, що не перевищує 0,5 %. Клітини видаляються центрифугуванням, і отриманий супернатант фільтрують через фільтр для глибокої фільтрації з розміром пор в діапазоні від 0,25 до 2,0 мкм. В цьому процесі температуру підтримували на рівні 5 °C±3°С. Після цього інактивований супернатант культури діафільтрують і концентрують у 10-30 раз з допомогою ультрафільтрації з використанням фільтрів з відсіканням молекулярної маси не вище 20,000. Концентрований супернатант зберігають при температурі 2-8 °C для майбутнього включення до складу вакцин. Перед змішуванням концентрований супернатант аналізують на активність з допомогою тесту на сумарну активність (TCP), описаного вище. Активність кожної групи токсоїдів визначається в одиницях TCP на мл. Вакцина: Супернатант, який містить інактивований альфа-токсоїд С.perfringens типу А використовують у вигляді емульсії вода-в-маслі, яка містить 4 сумарних одиниці активності (TCP) на мл. Емульсію одержують з 70 % масляної фази і 30 % водної фази. Масляну фазу одержують наступним чином: Мінеральне масло 89,20 % Діапазон 80 10,00 % Бензиловий спирт 0,75 % Триетаноламін 0,05 %. Водну фазу одержують наступним чином: Токсоїд С.perfringens типу А + сольовий розчин 88 % 33 % Tween 80/сольовий розчин 12 % Загалом 30 % водної фази повільно додають до 70 % масляної фази і емульгують з використанням гомогенізатора Сільверсона. (Також можуть використовуватися інші встановлені гомогенізатори). Тривалість гомогенізації залежить від об'єму емульсії і визначається в'язкістю, розміром частинок, а також стабільністю емульсії, протягом щонайменше трьох днів при 37 °C. До водної фази додають гентаміцин для забезпечення кінцевої концентрації до 30 мкг/мл серійного об'єму. До водної фази додають тімеросол для забезпечення кінцевої концентрації до 0,01 % серійного об'єму. Вакцинація: Курчат жіночої статі вакцинують підшкірно 0,5 мл на дозу готової вакцини. Першу дозу вакцини призначають на 14-му тижні, а другу дозу призначають на 20-му тижні життя. Двадцять курчат жіночої статі вакцинують вищеописаною готовою вакциною, яка містить 1 TCP на дозу. Другу групу з двадцяти курчат вакцинують готовою вакциною, яка містить 2 TCP на дозу. Третю групу курчат використовують як контрольну групу, яка не вакцинується. У кожну групу вводиться 2-3 півні для запліднення яєць. Пасивний імунітет Яйця відбираються у вакцинованих і контрольних курей віком 32, 52 і 65 тижнів. Курчат, які вилуплюються з таких яєць, використовують для оцінки пасивного захисту. Результати наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Число вилуплених курчат, які використовувались у відповідні моменти часу Вік курки 32 тижні 52 тижні 65 тижнів Виведені курчата у вакцинованій групі 9 30 14 17 Виведені курчата у контрольній групі 9 20 18 UA 98099 C2 5 10 15 20 25 30 Курчатам призначають безмедикаментозну дієту з високим вмістом протеїнів протягом перших двох тижнів, а потім переводять на нормальну дієту до завершення випробувань. Кожному птаху перорально призначають вірулентний С.perfringens типу А, який експресує як 7 альфа-токсин, так і бета-2-токсин. Введена доза містить колонію чисельністю від 6,3×10 до 8 6,3×10 , яка формує одиниці на мл, в дозі 3 мл. Птахам призначають вакцину протягом трьох послідовних днів на 18 або 19 день життя. Через два дні після дня останнього призначення вакцини птахів забивають і вивчають на предмет виявлення вогнищ некротичного ентериту. Результати ефективності у потомства курей окремо наведені у Таблицях 2-4 із зазначенням статусу вакцинації матері, а також обсягу поширення у неї вогнищ некротичного ентериту, якщо такі мають місце, відповідно до нижченаведеної оціночної шкали. У Таблиці 2 наведені результати для курчат від курей віком 32 тижні, у Таблиці 3 наведені результати для курчат від курей віком 52 тижні, у Таблиці 4 наведені результати для курчат від курей віком 65 тижнів. У Таблиці 5 наведені усереднені дані для курчат від курей, які вакцинувались 2 TCP на дозу. Як видно з результатів, потомство вакцинованих курей отримало суттєвий захист від бактерій порівняно з потомством невакцинованих курей. Шкала оцінки вогнищ некротичного ентериту (НЕ) 0 = Великі вогнища некротичного ентериту у тонкому кишечнику відсутні; кишечник має нормальну еластичність (згортається після його розтину). 1 = Тонка і відвисла стінка кишечника (кишка залишається пласкою після її розтину і не згортається назад у нормальне положення); присутній надлишковий або загуслий слиз, що покриває слизові мембрани, або фокальне чи мультифокальне почервоніння слизової оболонки, або непрохідність серозних судин. 2 = Одинична мультифокальна ділянка почервоніння і набряку стінки кишечника або декілька таких ділянок; одинична мультифокальна ділянка з виразками або некрозом слизової оболонки кишечника або декілька таких ділянок. 3 = Значні мультифокальні ділянки некрозу і виразок слизової оболонки кишечника ± сильна кровотеча або присутність шару фібрину або некротичного дебрісу на поверхні слизової (вигляд махрового рушника). 4 = Мертва тварина з великими вогнищами некротичного ентериту, оціненого на 2 або вище. Таблиця 2 Показники вогнищ некротичного ентериту у окремих курчат від курей віком 32 тижні Неінфіковані невакциновані особини контрольної групи 0 0 0 0 Середнє число = 0 Середнє значення вибірки = 0 Інфіковані невакциВакцина з 1 TCP Вакцина з 2 TCP новані особини контрольної на дозу на дозу групи 1 4 1 2 1 0 1 2 0 1 1 1 2 1 0 3 3 1 3 0 1 1 4 1 4 1 4 3 1 1 1 2,0 1,8 1,0 2,0 18 1,0 1,0 UA 98099 C2 Таблиця 3 Показники вогнищ некротичного ентериту у окремих курчат від курей віком 52 тижні Неінфіковані невакциновані особини Інфіковані невакциновані особини контрольної групи контрольної групи 0 4 0 3 0 3 0 1 0 1 2 1 1 1 2 2 2 1 1 2 2 1 2 1 1 Середнє число = 0 Середнє значення вибірки = 0 1,7 1,5 Вакцина з 2 ТСР на дозу 0 1 1 1 0 1 2 1 1 0 0 0 0 1 2 0 1 0 0 0 0 2 1 0 1 0 1 0 2 0 0,6 0,5 Таблиця 4 Показники вогнищ некротичного ентериту у окремих курчат від курей віком 65 тижнів Неінфіковані невакциновані особини Інфіковані невакциновані особини контрольної групи контрольної групи 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 3 3 2 0 19 Вакцина з 2 TCP на дозу 0 0 0 2 2 0 0 3 0 2 UA 98099 C2 Продовження таблиці 4 3 2 0 0 0 2 3 3 1,5 2,0 Середнє число = 0 Середнє значення вибірки = 0 0 0 0 0 0,6 0,0 Таблиця 5 Середнє значення вибірки по показникам у потомства курей, вакцинованих дозою 2 TCP Середнє значення вибірки щодо показників вогнищ некротичного ентериту у потомства курей Лікувальні групи Вакцинована група Контрольна група 5 10 15 20 25 32 тижні 1 2 52 тижні 0.5 1,5 65 тижнів 0 2 Титри антитіл Сироватка: Зразки крові відбирають у курей на 33-му і 78-му тижнях життя. Крові дають згорнутися протягом 2-4 годин при кімнатній температурі і після цього центрифугуванням отримують сироватку. Сироватку зберігають при температурі -10 °C або нижче до проведення аналізу на визначення титру антитіл. Титр антитіла проти альфа-токсину С.perfringens визначають з допомогою аналізу інгібування гемолізу з використанням серійних розведень і овечих еритроцитів, який здійснюється наступним чином. Серійні розведення (удвічі) здійснюють на мікротитрувальному планшеті з V-подібним дном для кожного аналізованого зразка. До кожної лунки, яка містить розведений зразок, додають відому кількість альфа-токсину. Після цього планшети інкубують протягом однієї години при температурі 36±2 °C для того, щоб утворилися комплекси антитіл, отриманих із сироватки, з альфатоксином. Після такої інкубації до лунок додають 0,5 % розчин овечих еритроцитів, і планшети інкубують протягом трьох годин при 36 °C±2 °C для того, щоб альфа-токсин, що не увійшов до складу комплексів, викликав лізис еритроцитів. Після цього планшети перевіряють на відсутність гемолізу. Найвищий ступінь розведення тестового зразка, при якому повністю відсутній гемоліз, вважається кінцевою точкою. Титри антитіл наведені у Таблицях 6-8. Яєчні жовтки: Яєчні жовтки обробляють з метою визначення титру антитіл. Яєчний жовток відділяють і змішують з комерційно доступним екстракційним буфером (Promega EGGstract System®, Каталог Promega No. G1531 і G2610, Медісон, Вісконсін). В результаті екстрагування отримують гранулят IgY, який після цього ресуспендують до первинного об'єму жовтка з допомогою забуференого фосфатним буфером сольового розчину. Екстракт яєчного жовтка отримують з щонайменше 5 яєць і перевіряють на титр антитіл з допомогою аналізу інгібування гемолізу (НІ) як описано вище. Жовтки з яєць, зібрані у курей віком 40, 52 і 65 тижнів оцінюються на титри антитіл у такий самий спосіб. Титри антитіл у яєчних жовтках наведені у Таблиці 9. Таблиця 6 Титр антитіл проти альфа-токсину С.perfringens типу А у сироватці окремих курей віком 33 тижні Вакциновані кури (2 ТСР/доза) 1024 8192 256 Кури з контрольної групи* 1 2 1 30 20 UA 98099 C2 Продовження таблиці 6 1024 1024 256 256 1024 512 64 Середнє геометричне = 588 2 2 2 2 2 1 1 Середнє геометричне ≤2 *Величини