Застосування бактерії clostridium perfringens типу c для виробництва вакцини для захисту свиней від інфекції clostridium perfringens типу а

1. Застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту повністю розвинутих свиней від інфекції Clostridium perfringens типу А. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що для виробництва згаданої вакцини додатково використовують один або більше антигенів, що походять від Escherichia coli, антитіла проти таких антигенів або генетичної інформації, що кодує такі антигени. 3. Застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту свиноматок від інфекції Clostridium perfringens типу А. 4. Застосування за п. 3, яке відрізняється тим, що для виробництва згаданої вакцини додатково використовують один або більше антигенів, що походять від Escherichia coli, антитіла проти таких антигенів або генетичної інформації, що кодує такі антигени. 5. Застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для свиноматок для захисту поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. 6. Застосування за п. 5, яке відрізняється тим, що для виробництва згаданої вакцини додатково використовують один або більше антигенів, що походять від Escherichia coli, антитіла проти таких антигенів або генетичної інформації, що кодує такі антигени. 7. Застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. 8. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що для виробництва згаданої вакцини додатково використовують один або більше антигенів, що походять від Escherichia coli, антитіла проти таких антигенів або генетичної інформації, що кодує такі антигени. UA (21) a200904648 (22) 19.11.2007 (24) 25.08.2011 (86) PCT/EP2007/062484, 19.11.2007 (31) 06124404.2 (32) 20.11.2006 (33) EP (31) 60/860,447 (32) 20.11.2006 (33) US (46) 25.08.2011, Бюл.№ 16, 2011 р. (72) ВІТВЛІТ МАРТЕН ХЕНДРІК, NL, СМЕТС ДЖОЗЕФ ФРАНЦИСКУС МАРІА, NL, РЕДХЕД КІТ, GB (73) ІНТЕРВЕТ ІНТЕРНЕШОНАЛ Б.В., NL (56) БЕКЕР М. Е. ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ. Пер. с латышского (Рига, 1974), 1978, стор. 124-126. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоула, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. — М.: Мир, 1997. — с. 568. Т. 2. Derek J. Fisher et al. Dissecting the Contributions of Clostridium perfringens Type C Toxins to Lethality in the Mouse Intravenous Injection Model, Infection and Immunity, September 2006, p. 5200-5210, Vol. 74, No. 9. SELBITZ H J ET AL: "Immunoprophylaxis of clostridioses of piglets" TIERA"RTZL PRAX, vol. 28, no. 6, November 2000 (2000-11), pages 337-340. CHERFAOUI S ET AL: "[Production of a vaccine against enterotoxemia from Clostridium perfringens strains isolated in the field]" ARCHIVES DE L'INSTITUT PASTEUR D'ALGE'RIE INSTITUT PASTEUR D'ALGE'RIE 1992, vol. 58, 1992, pages 205-224. GRECO GRAZIA ET AL: "Clostridium perfringens toxin-types in lambs and kids affected with gastroenteric pathologies in Italy" VETERINARY JOURNAL, vol. 170, no. 3, November 2005 (200511), pages 346-350. LUGINBUEHL A: "The necrotizing enteritis by Clostridium perfringens type C in piglets: Practical experience management and epidemiology." 2 (19) 1 3 Цей винахід стосується застосування бактерії Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини. Клостридії - це грампозитивні спороутворюючі анаеробні бактерії. Повсюди вважають, що клостридії - це патогени як свійських, так і диких тварин. Огляд різних видів клостридій та хвороб тварин, спричинених ними, наведено Songer, J.G. в The Clostridia; Chapter 10: Clostridial Diseases of Animals, Molecular biology and Pathogenesis, ed. Rood, J.I. et al., Academic Press Ltd (1997) ISBN 012-595020-9. З усіх відомих на цей час видів клостридій іноді вважають, що Clostridium perfringens - це найбільш широко виникаючий бактеріальний патоген, та з усіх видів клостридій він напевно є найбільш важливою причиною викликаною костридіями черевної хвороби у свійських тварин. Вид Clostridium perfringens підрозділяється на 5 типів, типи А - Е, на підставі основних токсинів, що вони виробляють. Типи А та С Clostridium perfringens та Clostridium difficile є головними черевними клостридіальними патогенами свиней. Клостридіальні черевні інфекції у свиней були більш детально описані Songer, J.G. та Uzal, F.A. (J. Vet. Diagn. Invest 17: 528-536 (2005)). Clostridium perfringens типу С інфікує свиней, велику рогату худобу, курчат, людей, овець, собак та коней. Поросята є найбільш уразливими до інфекції Clostridium perfringens типу С. У поросят віком 1-2 дні інфекція спричиняє відносний показник захворюваності від 30 до 50% та показник смертності від 50 до 100%. Більш дорослі поросята (віком 1 - 2 тижні) можуть мати більш тривалу інфекцію. Свиноматки - це звичайне джерело інфекції. Звичайний підхід до захисту поросят - це вакцинація свиноматок вакциною Clostridium perfringens типу С з метою індукувати антитіла, що передаються їхньому потомству через молозиво. Наслідком цього є високий рівень захисту поросят на той момент часу, коли вони є найбільш уразливими до зараження клостридіями. Такі вакцини засновуються на токсоїдах. Зазвичай, вони є вакцинами з детоксифікованих надосадових рідини, у яких нема жодної клітини. Токсоїдні вакцини було описано, наприклад, Springer, S. та Selbitz, H.-J. (FEMS Immun. and Medical Microbiol. 24: 333-336 (1999)). Clostridium perfringens типу А інфікують баранів, цапів, телят, курчат, свиней, коней, собак та людей. У повністю розвинутих свиней Clostridium perfringens типу А - це представник звичайної флори кишечнику. Отже, у теперішній час припускають, що на повністю розвинутих свиней шкідливо не впливає присутність Clostridium perfringens типу А у кишечнику. Проте, цей тип бактерій може спричиняти свинячий некротичний ентероколіт у новонароджених поросят та поросят, яких відняли від матері. Вакцини для захисту свиней від Clostridium perfringens 95652 4 типу А є рідкими. У цей час існує лише одна комерційно доступна (традиційно ліцензована) вакцина. Однією з причин цього може бути той факт, що, як згадувалося вище, Clostridium perfringens типу А- це член нормальної флори. Отже, можна не очікувати, що цей тип бактерій буде запускати імунну систему. Отже, можна не очікувати, що виробництво антитіл буде індукуватися проти Clostridium perfringens типу А. Якщо б антитіла індукувалися, то Clostridium perfringens типу А не вижили б у кишечнику та не були б членом нормальної флори. Іще один наслідок: можна, безсумнівно, не очікувати, що свиноматки будуть передавати будь-який захист своєму потомству через молозиво. За будь-яких причин, Clostridium perfringens типу А не індукують достатню імунну стимуляцію. Зараз несподівано визначили, що вакцини Clostridium perfringens типу С, які містять детоксифіковану культуральну надосадову рідину, є саме спроможними індукувати перехресний захист від інфекції Clostridium perfringens типу А. Більш давно, визначили, що наслідком вакцинації свиноматок культуральною надосадовою рідиною Clostridium perfringens типу С є суттєвий захист їхніх поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. Навіть ще більш дивно, визначили, що навіть свиноматки почувають себе краще після цієї вакцинації. Це є дивним, тому що зазвичай вважали, як згадувалося вище, що на повністю розвинутих свиней, таких як свиноматки, інфекція Clostridium perfringens типу А шкідливо не впливає. Це відкриття вперше довело зворотне для цього випадку. Отже, перший варіант здійснення цього винаходу стосується застосування бактерії Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту повністю розвинутих свиней від інфекції Clostridium perfringens типу А. Другий варіант здійснення цього винаходу стосується застосування бактерії Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту свиноматок від інфекції Clostridium perfringens типу А. Третій варіант здійснення цього винаходу стосується застосування бактерії Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для свиноматок для захисту поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. Четвертий варіант здійснення цього винаходу стосується застосування бактерії Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. Як буде зрозуміло фахівцеві у цій галузі, насправді застосування бактерії Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини - це спосіб, що складається з двох етапів: бактерія Clostridium perfringens типу С використовується для зростання у культуральному середовищі для отримання культуральної надосадової рідини, що 5 є основою для виробництва вакцини згідно з винаходом. Отже, інший варіант здійснення цього винаходу стосується застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту повністю розвинутих свиней від інфекції Clostridium perfringens типу А. Іще інший варіант здійснення цього винаходу стосується застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту свиноматок від інфекції Clostridium perfringens типу А. Іще інший варіант здійснення цього винаходу стосується застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для свиноматок для захисту поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. Також варіант здійснення цього винаходу стосується застосування культуральної надосадової рідини Clostridium perfringens типу С для виробництва вакцини для захисту поросят від інфекції Clostridium perfringens типу А. У межах типу токсину Clostridium perfringens типу С можна зробити розділення між тими штамами, що виробляють бета-2 токсин, та тими штамами, що його не виробляють. Приблизно 40% усіх штамів Clostridium perfringens типу С виробляють цей токсин. Визначили, що бактерія Clostridium perfringens типу С, яка виробляє токсин бета-2, є навіть більш придатною порівняно з бактерією Clostridium perfringens типу С, яка не виробляє токсин бета-2. Такі штами та їх ідентифікацію описано, наприклад, Fisher, D.J. зі співавторами (Inf. & Immun. 74: 5200-5210 (2006)). Отже, переважна форма цього варіанту здійснення стосується застосування, при якому застосовується бактерія Clostridium perfringens типу С, що виробляє токсин бета-2. Вакцини, що виробляються, як описано вище, в жодному разі не є єдиними вакцинами, що вводяться свиням у процесі комерційного свинарства. Клостридіальні вакцини часто вводяться приблизно одночасно з вакцинами проти інших свинячих патогенних організмів та вірусів. Отже, в іншому переважному варіанті здійснення вакцина, що виробляється, як описано у цьому винаході, додатково містить один або більше антигенів, що походять від свинячих патогенних організмів або вірусів, антитіла проти таких антигенів або генетичної інформації, що кодує такі антигени. Такі організми або віруси переважно вибрані з групи вірусу Pseudorabies, вірусу PRRS, вірусу грипу свиней, парвовірусу свиней, вірусу інфекційного гастроентериту, ротавірусу, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae та Actinobacillus pleuropneumoniae. Отже, більш переважна форма цього варіанту здійснення стосується вакцини, яка виробляється, 95652 6 як описано у цьому винаході, та яка додатково включає один або більше антигенів, що походять від свинячих патогенних організмів або вірусів, які вибрані з групи вірусу Pseudorabies, вірусу PRRS, вірусу грипу свиней, парвовірусу свиней, вірусу інфекційного гастроентериту, ротавірусу, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae та Actinobacillus pleuropneumoniae. Окрім інфекції Clostridium perfringens поросята часто страждають від інфекції Escherichia coli. Escherichia coli - це причина іншої суворої черевної хвороби у поросят. Отже, поросят або вагітних свиноматок часто вакцинують вакцинами Escherichia coli. Вакцини Е. coli зазвичай застосовуються на фермах, та вони є комерційно доступними. Внаслідок цього надзвичайно бажаною є комбінована вакцина, яка містить як культуральну надосадову рідину Clostridium perfringens типу С, так і вакцину Escherichia coli, тому що вона захищає від інфекції Clostridium perfringens типу С, Clostridium perfringens типу А та Escherichia coli. Отже, найбільш переважна форма цього варіанту здійснення стосується вакцини, яка виробляється, як описано у цьому винаході, та яка додатково містить один або більше антигенів, що походять від свинячого патогенного організму Escherichia coli. Цей винахід описано за допомогою наступних прикладів, які не є обмежувальними. Приклади Одержання антигену Clostridium perfrinzens типу С Стандартний штам Clostridium perfringens типу С, штам 587 (також називається CWC 1/S, від Weybridge U.K. Collection) культивували у ферментері, доки не розпочалася фаза стаціонарного росту. Культуру центрифугували та осад, що містив бактеріальні клітини, відкинули. До надосадової рідини додали формальдегід до кінцевої концентрації 0,5% в об'ємному співвідношенні для інактивації токсинів, потім концентрували шляхом ультрафільтрації та фільтрації 0,2 мкм. Приготування вакцини Вакцину отримали шляхом змішування антигену Clostridium perfringens типу С та ад'юванту на основі токоферолу. Кожна доза вакцини (2 мл) включала 20 мкл концентрованого у 17 разів концентрату культуральної надосадової рідини, що є токсоїдним антигеном Clostridium perfringens типу С. Вакцина відповідає монографії 0363 Європейської фармакопеї (вакцина Clostridium perfringens для ветеринарного застосування) стосовно безпечності та дієвості вакцин типу С. Крім того, у цьому експерименті очищені антигени Е. Coli (F4ab, F4ac, F5 та F6 з фімбріями та нестійкий до тепла токсин) додали, щоб пригнічувати можливу інфекцію Е. Coli. Ці компоненти є відомими у даній галузі, та фахівець у цій галузі 7 95652 знає, як зробити вакцину на основі цих компонентів. Альтернативно, проте, фахівець у цій галузі міг би застосовувати комерційно доступну та готову до застосування вакцину Е. Coli, таку як Porcilis Porcoli DF (яку можна отримати у Intervet Int. B.V., Wim de Korverstraat 35, Boxmeer, Нідерланди). Контрольна вакцина включає такі ж самі компоненти за винятком антигену Clostridium perfringens типу С, який не був присутнім у контрольній групі. Захист свиноматок Голландську свиноферму, на якій стався раптовий початок епідемії клінічного Clostridium perfringens типу А, вибрали для рандомізованого подвійного сліпого дослідження ефективності в 8 умовах ферми. Визначили, що ізолят Clostridium perfringens типу А з цієї ферми виробляв як токсин, так і токсин 2. Свиноматок вакцинували внутрішньом'язово (ІМ) під час вагітності приблизно за 6 та 2 тижні до народження потомства вакциною, що містила тільки антигени Е.соlі (контрольна група), або вакциною, що містила антигени Е.соlі та антиген Clostridium perfringens типу С (тестова група). Вакцини закодували кольором (2 х тестова вакцина, 1 х контрольна вакцина), щоб забезпечити виконання сліпого методу, при цьому розподілення свиноматок по групах становило приблизно 2:1 (Таблиця 1). Таблиця 1 Розміри груп Група Кількість свиноматок Контрольна Тестова 41 77 Кількість живих народжених поросят Загальна кількість поросят на свиноматку 11,6 453 12,1 904 З дня першої вакцинації та до часу віднімання від матері поросят (3-4 тижні після народження поросят) свиноматок обстежували кожні 3 дні стосовно загального стану здоров'я, прийому їжі та діареї. Щоб полегшити статистичний аналіз, застосовували систему клінічних показників (Таблиця 2). Поросят, народжених від вакцинованих свиноматок, обстежували щоденно протягом першого тижня життя, один раз на три дні після першого тижня та до віднімання від матері, а після цього щотижнево до закінчення періоду дитячого віку. Було зареєстровано показники загального стану здоров'я, споживання їжі, діареї та смертності (Таблиця 2). Таблиця 2 Система показників, що застосовувалася для свиноматок та поросят: Клінічний Поведінка показник 0 Нормальна 1 Депресивна 2 Млява 3 Вмираюча Апетит Консистенція фекалій Нормальна М'яка Нормальний Злегка відсутній апетит Значна відсутність апетиРідка ту Нема смоктання Склад фекалій Нормальний Присутність слизу Присутність слизу з кров'ю Водяниста Присутність крові з шматочками кишечника Результати Таблиця 3 Клінічні спостереження свиноматок Показник (N) Загальна поведінка Апетит Консистенція фекалій Склад фекалій Контрольна Тестова Контрольна Тестова Контрольна Тестова Контрольна Тестова 0 687 1623 597 1598 385 1564 780 1647 1 99 33 139 41 250 67 71 8 2 51 0 71 9 153 17 4 0 3 20 0 49 0 68 1 0 0 Середній 0,30 0,02 0,50 0,04 0,89 0,07 0,09 0,01 9 95652 Таблиця 3 демонструє ефект від вакцинації вакциною, що включає антигени Clostridium perfringens типу С, порівняно з вакцинацією вакциною без антигенів Clostridium perfringens типу С. Як очевидно слідує з Таблиці 3 наслідком вакцинації вакциною, що включає антигени Clostridium perfringens типу С, є дуже суттєве покращення здоров'я свиноматок. Захист потомства вакцинованих свиноматок Крім того, коефіцієнт смертності у потомства свиноматок, вакцинованих вакциною, що включала антигени Clostridium perfringens типу С, порів 10 нювали з коефіцієнтом смертності потомства свиноматок, вакцинованих вакциною без антигенів Clostridium perfringens типу С. Як очевидно слідує з Таблиці 4, коефіцієнт смертності у потомстві свиноматок, вакцинованих вакциною, що включала антигени Clostridium perfringens типу С, був суттєво нижчим порівняно з контрольною групою. Крім того, Таблиця 5 демонструє що поросята від свиноматок, вакцинованих вакциною, що включала антигени Clostridium perfringens типу С, мали суттєво більш низькі клінічні показники порівняно з контрольною групою. Таблиця 4 Щотижнева смертність у контрольному та тестовому потомстві Вік (дні) 0-6 7-13 14-21 21-27 28-34 35-41 42-48 49-55 56-62 63-70 Загальний відсоток (%) Контрольне 29 3 7 6 2 0 1 1 1 0 50(11,04) Тестове 22 3 2 1 1 0 1 1 0 0 31 (3,43) Таблиця 5 Клінічні спостереження поросят Показник (N) Загальна поведінка Апетит Консистенція фекалій Склад фекалій Висновок: дані демонструють, що наслідком вакцинації свиноматок вакциною, що містить антиген Clostridium perfringens типу С, є суттєве Комп’ютерна верстка Мацело В. 0 336 1159 426 1336 544 1419 636 1414 Контрольне Тестове Контрольне Тестове Контрольне Тестове Контрольне Тестове 1 232 271 166 125 118 48 104 70 2 137 55 128 31 71 17 31 10 3 73 11 55 4 40 12 6 1 Середній 0,93 0,28 0,77 0,13 0,49 0,08 0,24 0,06 покращення здоров'я як вакцинованих свиноматок, так і їхнього потомства під час раптового початку епідемії Clostridium perfringens типу А. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601