Модифікована ліпідом дволанцюжкова phk, яка має сильний ефект рнк-інтерференції

Реферат: Винахід належить до модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, що має високу нуклеазну стійкість і високу ефективність внутрішньоклітинного накопичення та здатна створювати чудовий ефект РНК-інтерференції. Дволанцюжкова РНК містить антисмисловий ланцюг, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну цільовій послідовності, і смисловий ланцюг, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну антисмисловому ланцюгу, дволанцюжкова РНК здатна інгібувати експресію гена-мішені, смисловий ланцюг містить ліпід, приєднаний напряму або через лінкер щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів 5'-кінцевої сторони. UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід належить до модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, яка здатна ефективно інгібувати експресію гена-мішені. Більш конкретно, даний винахід належить до модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, яка має високу стійкість до нуклеази, високу ефективність внутрішньоклітинного накопичення, і викликає чудовий ефект РНК-інтерференції. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Розробка лікарських засобів для ефективного лікування тяжковиліковних захворювань, таких як рак і СНІД, є важливою задачею в галузі медико-біологічних наук. Одним з потенційних способів вирішення даної задачі є використання генетичних ліків, які впливають тільки на специфічні гени. Особливо, як подібні генетичні ліки останнім часом багато уваги звертає на себе спосіб РНК-інтерференції (РНКі), який використовує коротку дволанцюжкову РНК довжиною в 21 нуклеотидну основу (мала інтерферуюча РНК: міРНК). Спосіб РНКі уперше описаний Fire et al. в 1998 (дивись непатентний документ 1). Згідно зі звітом Fire et al., коли гомологічна специфічній області гена, функцію якого необхідно інгібувати, дволанцюжкова РНК з приблизно 100 пар основ доставляється всередину клітин, вона розщеплюється під дією дайсера на фрагменти довжиною приблизно від 20 до 25 пар основ, і потім взаємодіє з множиною білків з утворенням комплексу РНК/білок (такий комплекс позначається як RISC: РНК-індукований інгібуючий комплекс), який зв'язується з гомологічною ділянкою мРНК, синтезованою з гена-мішені, і таким чином значно інгібує експресію гена. Однак було зазначено, що коли довга дволанцюжкова РНК з приблизно 30 пар основ або довша доставляється всередину клітин ссавців, індукується інтерферонова відповідь, яка є противірусною відповіддю, і тим самим викликається процес апоптозу. Таким чином, застосування способу РНКі відносно ссавців вважалося складним. Потім Tuschl et al. хімічним способом синтезували дволанцюжкову РНК довжиною в 21 основу, яка має виступаючі кінці на обох 3'-кінцях, і вказано, що коли така дволанцюжкова РНК напряму доставляється всередину клітин ссавців, дволанцюжкова РНК здатна специфічно до послідовності значно інгібувати експресію гена без розвитку інтерферонової відповіді (дивись непатентний документ 2). Tuschl et al. надалі синтезували короткі дволанцюжкові РНК, які складаються з дволанцюжкового фрагмента з 19 пар основ і виступаючого кінця(ів) різної протяжності на 3'- або 5'-кінцях, і вивчали їх ефекти РНКінтерференції. У результаті, спостереження показують, що міРНК довжиною в 21 основу, які мають виступаючий кінець з 2 основ на обох 3'-кінцях, виявляли дуже сильний ефект РНКінтерференції, в той час як інші типи коротких дволанцюжкових РНК не демонстрували значного ефекту РНК-інтерференції. Ґрунтуючись на даній роботі, спосіб РНК-інтерференції з використанням дволанцюжкової РНК довжиною в 21 основу, що має виступаючий кінець з 2 основ на обох 3'-кінцях, є загальновживаним. Спосіб інгібування експресії гена-мішені з використанням короткої дволанцюжкової РНК довжиною в 21 основу являє собою спосіб, який позначається в цьому документі як "міРНК спосіб", для розмежування його зі способом РНКі. Завдяки тому, що в способі міРНК використовують синтетичну РНК, отримання і зберігання зразків є порівняно легким; крім того, можуть бути отримані дуже сильні ефекти. Таким чином, спосіб міРНК привертає до себе значну увагу не тільки в галузі медико-біологічних наук, але також і в галузі біотехнологічного бізнесу. Однак даний чудовий спосіб міРНК також має проблему, яка вимагає вирішення. Як описано вище, міРНК складається з молекули РНК, вже розділеної під дією нуклеази. У порівнянні з одноланцюжковою РНК, фрагмент дволанцюжкової РНК має порівняно високу стійкість до нуклеази, що міститься в середовищі і/або клітині. Однак дволанцюжкова РНК, яка складається з 19 пар основ, майже не створює відомих ефектів РНК-інтерференції. По суті зазначено, що, будучи доставленою всередину клітин, синтетична міРНК, яка містить послідовність генамішені, хоч і створює сильний інгібуючий ефект на експресію гена протягом приблизно від 2 до приблизно 4 діб, її ефект РНК-інтерференції значно знижується надалі і практично повністю зникає через приблизно сім діб. Нещодавно було показано, що різні хімічні модифікації міРНК забезпечують синтетичні міРНК підвищеною ефективністю внутрішньоклітинного накопичення і пролонгованими високоактивними ефектами РНК-інтерференції. Наприклад, для підвищення стійкості до екзонуклеазного розщеплення, міРНК модифікують за допомогою аміногрупи, тіолової групи або ділянки без основ на кінці синтезованої міРНК. Однак відмічено, що більшість термінально модифікованих міРНК довжиною в 21 основу мають значно знижені ефекти РНК-інтерференції. Нещодавно J. Rossi et al. зазначили, що дволанцюжкова РНК з 27 пар основ створює ефект РНК-інтерференції приблизно в 100 раз більший, ніж дволанцюжкова РНК довжиною в 21 основу (дивись непатентний документ 3). Це можливо відбувається завдяки тому, що після розщеплення РНК з 27 пар основ РНКаза III-подібним ферментом дайсером на міРНК 1 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 довжиною в 21 основу, білковий комплекс RISC розпізнає міРНК таким чином, що міРНК здатна створювати ефекти з великою ефективністю. Як описано вище, завдяки тому, що РНК довжиною в 27 основ може створювати чудові ефекти РНК-інтерференції, підвищуються очікування, пов'язані з використанням такої РНК як генетичних ліків. Однак абсолютно невідомий ефективний технічний спосіб для збільшення ефекту РНК-інтерференції РНК довжиною в 27 основ. Крім того, також неясний технічний спосіб для збільшення ефекту РНК-інтерференції дволанцюжкової РНК протяжністю коротше або довше 27 основ і що має ефект РНК-інтерференції. Дволанцюжкові РНК, які мають ефекти РНК-інтерференції, як правило, сконструйовані з урахуванням виступаючих кінців. Для РНК без виступаючих кінців (тобто, які мають тупі кінці) також вивчалися їх ефекти РНК-інтерференції. Однак результати вказують на те, що ефекти РНК-інтерференції дволанцюжкової РНК затупленого на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга практично такі ж або нижчі, ніж ефекти дволанцюжкових РНК, які мають виступаючий кінець на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга (дивись непатентний документ 4). Ліпіди мають високу проникність для клітинної мембрани, і визнані практичними для доставки лікарських засобів всередину клітин. Очікується, що приєднання таких ліпідів до дволанцюжкової РНК, яка має ефект РНК-інтерференції, підвищить ефективність внутрішньоклітинного накопичення і таким чином посилить ефекти РНК-інтерференції. Однак, відомо, що якщо ліпід просто приєднаний до дволанцюжкової РНК, яка має ефект РНКінтерференції, то це різко знижує її ефект РНК-інтерференції. На відомому рівні техніки все ще необхідно сконструювати модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК, що має одночасно чудовий ефект РНК-інтерференції і практичний ефект, оснований на ліпіді. Непатентний документ 1: Fire et al., Nature, 391, 806-811 (1998) Непатентний документ 2: Tuschl et al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001) Непатентний документ 3: J. Rossi et al., Nature Biotech., 23, 222-226 (2005) Непатентний документ 4: J. T. Marques et al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2005) ОПИС ВИНАХОДУ ЗАДАЧА, ЯКА ПІДЛЯГАЄ ВИРІШЕННЮ ЗА ДОПОМОГОЮ ВИНАХОДУ Предмет даного винаходу забезпечує нову дволанцюжкову РНК, що має високу стійкість до нуклеази і високу ефективність внутрішньоклітинного накопичення, і здатна створювати чудовий ефект РНК-інтерференції. Інший предмет даного винаходу забезпечує фармацевтичну композицію, що містить нову дволанцюжкову РНК. Додатковий предмет даного винаходу забезпечує спосіб інгібування експресії гена-мішені, що містить в собі введення дволанцюжкової РНК всередину клітин для інгібування експресії гена-мішені. ЗАСОБИ ВИРІШЕННЯ ЗАДАЧІ Автори даного винаходу проводили численні дослідження для отримання описаних вище об'єктів і виявили, що, якщо ліпід приєднаний напряму або через лінкер щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів на 5'-кінці смислового ланцюга дволанцюжкової РНК, яка містить антисмисловий ланцюг, що має комплементарну цільовій послідовності в гені-мішені нуклеотидну послідовність, і смисловий ланцюг, який має комплементарну антисмисловому ланцюгу нуклеотидну послідовність, дволанцюжкова РНК здатна інгібувати експресію генамішені, то сконструйована таким чином дволанцюжкова РНК має високу нуклеазну стійкість і високу ефективність внутрішньоклітинного накопичення і створює чудовий ефект РНКінтерференції. Даний винахід став результатом подальшого вивчення, основаного на даному відкритті. Більш конкретно, даний винахід належить до наступної модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, фармацевтичних композицій, які містять нову дволанцюжкову РНК, способів інгібування експресії гена-мішені і т. д. Пункт 1. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК, яка містить антисмисловий ланцюг, що має комплементарну цільовій послідовності в гені-мішені нуклеотидну послідовність, і смисловий ланцюг, який має комплементарну антисмисловому ланцюгу нуклеотидну послідовність, причому дволанцюжкова РНК здатна інгібувати експресію гена-мішені, і смисловий ланцюг має ліпід, приєднаний напряму або через лінкер щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів на 5'-кінці. Пункт 2. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 1, тупокінцева на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, і тупокінцева або що має виступаючий кінець на 3'-кінцевій стороні смислового ланцюга. Пункт 3. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 1, що має виступаючі кінці одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга. 2 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пункт 4. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-3, в якій смисловий ланцюг складається з 21-27 нуклеотидів. Пункт 5. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 2, тупокінцева одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга, і в якій кожен зі смислового і антисмислового ланцюгів складається з 27 нуклеотидів. Пункт 6. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 2, тупокінцева одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга, і в якій кожна з смислового і антисмислового ланцюгів складається з 23 нуклеотидів. Пункт 7. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 2, тупокінцева на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, причому смисловий ланцюг складається з 25 нуклеотидів, а антисмисловий ланцюг складається з 23 нуклеотидів. Пункт 8. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 3, в якій кожен зі смислового і антисмислового ланцюгів складається з 21 нуклеотиду. Пункт 9. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-8, в якій ліпід являє собою жирну кислоту, що має від 6 до 50 атомів вуглецю. Пункт 10. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-9, в якій ліпід являє собою лауринову кислоту, стеаринову кислоту, міристинову кислоту або пальмітинову кислоту. Пункт 11. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-10, в якій ліпід приєднаний щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів на 5'-кінці смислового ланцюга через лінкер, причому лінкер представлений структурною формулою - NH-(CH2)n1- (L-4), де n1 являє собою ціле число від 1 до 40. Пункт 12. Фармацевтична композиція, що містить модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК за будь-яким з пп. 1-10 і фармацевтично прийнятну основу. Пункт 13. Застосування модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за будь-яким з пп. 1-10 для виробництва фармацевтичної композиції з метою інгібування експресії гена-мішені. Пункт 14. Спосіб інгібування експресії гена-мішені, що включає введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за будь-яким з пп. 1-10 всередину клітин для інгібування експресії гена-мішені. ЕФЕКТ ВИНАХОДУ Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за даним винаходом модифікована ліпідом на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга і внаслідок цього створює істотно збільшений ефект РНК-інтерференції. Більш конкретно, модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК має ліпід, приєднаний до специфічної ділянки РНК, і таким чином має помітно підвищену стійкість до нуклеази і ефективність внутрішньоклітинного накопичення без ослаблення процесингу дайсером або зв'язування РНК з RISC, і таким чином може значно сприяти медичному застосуванню. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за даним винаходом навіть у разі самостійного використання має чудову здатність до внутрішньоклітинної доставки. Таким чином, модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК може доставлятися всередину клітин без використання будь-яких відомих засобів для генетичної трансфекції або використання зниженої кількості відомого засобу для генетичної трансфекції. Таким чином, модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за даним винаходом здатна знижувати вираженість цитотоксичності, супроводжуючу використання відомих засобів для генетичної трансфекції, тим самим гарантуючи високий рівень безпеки для клінічних застосувань. Таким чином, експресія гена-мішені може більш ефективно інгібуватися або ослаблятися за допомогою застосування фармацевтичної композиції за даним винаходом або за допомогою застосування способу інгібування експресії гена-мішені за даним винаходом. НАЙКРАЩИЙ СПОСІБ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ У даній специфікації "тупий кінець" або "тупокінцевий" належить до кінцевої структури дволанцюжкової РНК, в якій основи в кінцевих ділянках смислового ланцюга і основи в кінцевих ділянках антисмислового ланцюга, комплементарного смисловому ланцюгу, спарені без утворення одиночного ланцюжка. "Виступаючий кінець" належить до кінцевої частини нуклеотидної послідовності, в якій знаходиться одиночний ланцюжок, що не формує подвійний ланцюжок завдяки відсутності комплементарних основ в кінцевих ділянках смислового ланцюга дволанцюжкової РНК або в кінцевих ділянках антисмислового ланцюга, комплементарного смисловому ланцюгу. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом включає смисловий ланцюг, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну цільовій послідовності в гені-мішені. 3 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ген-мішень в цьому документі належить до гена, експресію якого необхідно інгібувати за допомогою ефекту РНК-інтерференції. Ген-мішень для модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом не визначений суворо, і його можна вибирати відповідним чином згідно з передбачуваним застосуванням модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК. Цільова послідовність в гені-мішені не визначена суворо при умові, що експресію гена можна інгібувати ефектами РНК-інтерференції. Цільову послідовність можна визначати відповідним чином згідно з відомим способом, наприклад, використовуючи пошук NCBI BLAST і т. д. Наприклад, цільова послідовність може бути областю, яка складається з 19-30 основ, які йдуть за основами "АА" в області екзону, що знаходяться на відстані 50-100 основ від стартового кодону кодуючої області (ORF) гена-мішені, і містить приблизно 50 % GC. У даній області експериментально показано, що чудові ефекти РНК-інтерференції можна отримувати за допомогою ланцюжка, комплементарного такій цільовій послідовності. Наприклад, цільову послідовність можна визначати згідно з інструкціями IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.; дайсер-субстратний дизайн РНКі). Нещодавнє повідомлення показало, що дволанцюжкову РНК, яка має сильні ефекти РНК-інтерференції можна отримувати за допомогою конструювання дволанцюжкової РНК, яка містить: (i) пару А/U на 5'-кінцевій стороні антисмислового ланцюга; (ii) пару G/C на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга; і (iii) приблизно п'ять пар А/U на 5'кінцевій стороні антисмислового ланцюга; (iv) і не містить дев'ять і більше пар G/C (Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)). Якщо антисмисловий ланцюг модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом не має виступаючого кінця, то антисмисловий ланцюг складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної цільовій послідовності. Якщо антисмисловий ланцюг має виступаючий кінець на 5'-кінці і/або 3'-кінці, то антисмисловий ланцюг складається з нуклеотидної послідовності, що має нуклеотидну послідовність, комплементарну цільовій послідовності і нуклеотидну послідовність виступаючого кінця, приєднану до 5'-кінця і/або 3'-кінця комплементарної нуклеотидній послідовності. За умови досягнення ефекту РНК-інтерференції кількість нуклеотидів, що складають антисмисловий ланцюг в модифікованій ліпідом дволанцюжковій РНК за винаходом, не визначено суворо і може вибиратися відповідним чином згідно з необхідною структурою дволанцюжкової РНК. Кількість нуклеотидів звичайно складає від 21 до 27, переважно 21, 23, 25 або 27, і більш переважно 21, 23 або 27. Якщо антисмисловий ланцюг не має виступаючого кінця, то кількість нуклеотидів, які складають антисмисловий ланцюг, відповідає загальній кількості нуклеотидів, які складають комплементарну цільовій нуклеотидну послідовність. Якщо антисмисловий ланцюг має виступаючий кінець, то кількість нуклеотидів, що складають антисмисловий ланцюг, відповідає сумі кількості нуклеотидів, які складають виступаючий кінець, і кількості нуклеотидів, які складають комплементарну цільовій нуклеотидну послідовність. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом включає смисловий ланцюг, що має комплементарну антисмисловому ланцюгу нуклеотидну послідовність. Якщо смисловий ланцюг модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом не має виступаючого кінця, то смисловий ланцюг складається з нуклеотидної послідовності, комплементарної частині або всім "комплементарним цільовій послідовності нуклеотидам"антисмислового ланцюга. Якщо смисловий ланцюг має виступаючий кінець на 5'-кінці і/або 3'кінці, то смисловий ланцюг складається з: нуклеотидної послідовності, частини або всіх "комплементарних цільовій послідовності нуклеотидів" антисмислового ланцюга; і нуклеотидної послідовності виступаючого кінця, приєднаного до 5'-кінця і/або 3'-кінця комплементарного нуклеотидній послідовності смислового ланцюга. При умові досягнення ефекту РНКітерференції кількість нуклеотидів, що складають смисловий ланцюг в модифікованій ліпідом дволанцюжковій РНК за винаходом, не визначено суворо і може вибиратися відповідним чином згідно з необхідною структурою дволанцюжкової РНК. Кількість нуклеотидів звичайно складає від 21 до 27, переважно 21, 23, 25 або 27, і більш переважно 21, 23 або 27. Якщо смисловий ланцюг не має виступаючого кінця, то кількість нуклеотидів, які складають смисловий ланцюг, відповідає загальній кількості нуклеотидів, що складають комплементарну цільовій послідовності нуклеотидну послідовність. Якщо смисловий ланцюг має виступаючий кінець, то кількість нуклеотидів, які складають смисловий ланцюг, відповідає сумі кількості нуклеотидів, що складають виступаючий кінець, і кількості нуклеотидів, що складають комплементарну цільовій нуклеотидну послідовність. Нуклеотиди, що складають смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом, в основному являють собою рибонуклеотиди. Для підвищення стійкості до ферментативного розщеплення послідовність РНК може містити різні хімічно модифіковані нуклеотиди, такі як 2'-О-метил-модифіковані нуклеотиди, 2'-F 4 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифіковані нуклеотиди, LNA (замкнена нуклеїнова кислота) нуклеотиди, дезоксирибонуклеотиди або т. п. Особливо, якщо модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом має виступаючий кінець, то виступаючий кінець смислового ланцюга і/або антисмислової РНК може складатися з дезоксирибонуклеотидів. Приклади таких хімічно модифікованих нуклеотидів включають нуклеотиди з фосфат-модифікованою структурою, такі як фосфотіоат-модифікована ДНК/РНК і боранофосфат-модифікована ДНК/РНК; 2'модифіковані нуклеотиди, такі як 2'-О-Ме-модифіковані РНК і 2'-F-модифіковані РНК; модифіковані нуклеотиди, отримані за допомогою зшиття цукру молекули нуклеотиду, такі як LNA (замкнена нуклеїнова кислота) і ENA (2'-O-, 4'-C-етилен- з'єднані нуклеїнові кислоти); модифіковані нуклеотиди, що мають різні структури, такі як ПНК (пептидна нуклеїнова кислота) і морфоліннуклеотид; нуклеотиди з модифікованими основами, такі як 5-фторуридин і 5пропілуридин; і т. п. Структурно модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом не визначена суворо при умові, що смисловий і антисмисловий ланцюги гібридизовані в подвійний ланцюг. Наприклад, модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК переважно має наступну структуру: структура (А), в якій дволанцюжкова РНК тупокінцева (тобто має тупий кінець) на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга і тупокінцева або має виступаючий кінець (одноланцюжковий фрагмент) на 3'-кінцевій стороні смислового ланцюга; структура (В), в якій дволанцюжкова РНК має виступаючі кінці на 5' і 3'- на 5'-кінцевих сторонах смислового ланцюга. Структура, в якій дволанцюжкова РНК має виступаючий кінець на 3'-кінцевій стороні смислового ланцюга включає випадки, коли 3'-кінцевий фрагмент смислового ланцюга утворює виступаючий кінець, і випадки, коли 5'-кінцевий фрагмент антисмислового ланцюга утворює виступаючий кінець. Структура, в якій дволанцюжкова РНК має виступаючий кінець на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга включає випадок, коли 5'-кінцевий фрагмент смислового ланцюга утворює виступаючий кінець, і випадок, коли 3'-кінцевий фрагмент антисмислового ланцюга утворює виступаючий кінець. Для досягнення додатково посиленого ефекту РНК-інтерференції серед дволанцюжкових РНК, які можна використовувати для створення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом, особливо переважні дволанцюжкові РНК, що мають структури з (А-1) по (А-3), представлені нижче, серед тих, що мають вказану вище структуру (А), і особливо переважні дволанцюжкові РНК зі структурою (В-1), представленою нижче, серед тих, що мають вказану вище структуру (В). Структура (А-1), в якій дволанцюжкова РНК тупокінцева на обох 5'-і 3'-кінцях смислового ланцюга, і кожен зі смислових і антисмислових ланцюгів складається з 27 нуклеотидів; структура (А-2), в якій дволанцюжкова РНК тупокінцева на обох 5'- і 3'-кінцях смислового ланцюга, і кожен зі смислових і антисмислових ланцюгів складається з 23 нуклеотидів, відповідно; структура (А-3), в якій дволанцюжкова РНК тупокінцева на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, і смисловий ланцюг складається з 25 нуклеотидів, і антисмисловий ланцюг складається з 23 нуклеотидів; і структура (В-1), в якій дволанцюжкова РНК має виступаючі кінці, які складаються кожний з двох нуклеотидів на кожному 3'-кінці смислового ланцюга і 3'-кінці антисмислового ланцюга, і кожен зі смислових і антисмислових ланцюгів складається з 21 нуклеотиду. Більш конкретно, в структурах (А-1) і (А-2) смислові і антисмислові ланцюги гібридизовані без утворення виступаючих кінців. У структурі (А-3) смислові і антисмислові ланцюги гібридизовані таким чином, що дволанцюжкова РНК тупокінцева на 5'-кінці смислового ланцюга, і перші і другий нуклеотиди з 3'-кінця смислового ланцюга утворюють виступаючий кінець. Структура (В-1) така, що з першого по 19-й нуклеотиди з 5'-кінця смислового ланцюга і з третього по 21-й нуклеотиди з 3'-кінця антисмислового ланцюга гібридизовані таким чином, що перший і другий нуклеотиди з 3'-кінця смислового ланцюга і першого і другого нуклеотиду з 3'кінця антисмислового ланцюга утворюють виступаючі кінці, відповідно. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом має щонайменше один ліпід, приєднаний щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів з 5'-кінця смислового ланцюга. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом не має заміщувальних груп ні в якій іншій позиції, крім 5'-кінцевого фрагмента смислового ланцюга. Більш конкретно, заміщувальні групи не містяться в інших областях, крім 5'-кінцевого фрагмента смислового і антисмислового ланцюга, і ці області складаються з нуклеотидів. Приєднання ліпіду(ів) тільки до 5'-кінцевого фрагмента смислового ланцюга здатне підвищити ефективність внутрішньоклітинного накопичення і забезпечити виключно чудовий ефект РНК-інтерференції. Приєднаний до смислового ланцюга модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом ліпід не визначений суворо, і внаслідок цього приклади включають прості ліпіди (складні ефіри жирних кислот з різними спиртами); складні ліпіди, такі як фосфоліпіди і 5 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гліколіпіди; похідні ліпідів, такі як жирні кислоти, вищі спирти, жиророзчинні вітаміни, стероїди і вуглеводні. Для підвищення ефективності внутрішньоклітинного накопичення і ефекту РНКінтерференції, використовуваний ліпід є переважно похідним ліпіду, більш переважно жирною кислотою, що має від 6 до 50 атомів вуглецю, ще більш переважно жирною кислотою, що має від 10 до 22 атомів вуглецю, особливо переважно жирною кислотою, що має від 12 до 18 атомів вуглецю, більш конкретно, переважно лауриновою кислотою, стеариновою кислотою, міристиновою кислотою або пальмітиновою кислотою і найбільш переважно пальмітиновою кислотою. Спосіб приєднання ліпіду до смислового ланцюга для утворення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом не визначений суворо. Ліпід можна приєднувати до смислового ланцюга напряму або через лінкер. У даному винаході, лінкер, через який ліпід приєднаний до смислового ланцюга не є лінкером, що складається з нуклеїнової кислоти. Лінкер не визначений суворо за умови, що за допомогою нього можна з'єднувати ліпід і смисловий ланцюг. Наприклад, як лінкер можна використовувати лінкери, які мають наступні структури: -O-Co-O- (L-1) -NH-CO-O- (L-2) -NH-CO-NH- (L-3) -NH-(CH2)n1- (L-4) -S-(CH2)n1- (L-5) -CO-(CH2)n1-CO- (L-6) -CO-(CH2)n1-NH- (L-7) -NH-(CH2)n1-NH- (L-8) -CO-NH-(CH2)n1-NH-CO- (L-9) -C(=S)-NH-(CH2)n1-NH-CO- (L-10) -C(=S)-NH-(CH2)n1-NH-C-(=S)- (L-11) -CO-O-(CH2)n1-0-CO- (L-12) -C(=S)-O-(CH2)n1-O-CO- (L-13) -C(=S)-O-(CH2)n1-O-C-(=S)- (L-14) -CO-NH-(CH2)n1-O-CO- (L-15) -C(=S)-NH-(CH2)n1-O-CO- (L-16) -C(=S)-NH-(CH2)n1-O-C-(=S)- (L-17) -CO-NH-(CH2)n1-O-CO- (L-18) -C(=S)-NH-(CH2)n1-CO- (L-19) -C(=S)-O-(CH2)n1-NH-CO- (L-20) -C(=S)-NH-(CH2)n1-O-C-(=S)- (L-21) -NH-(CH2CH2O)n2-CH(CH2OH)- (L-22) -NH-(CH2CH2O)n2-CH2- (L-23) У вказаних вище формулах (L-4)-(L-21), n1 - це число від 1 до 40, переважно число від 2 до 20, і більш переважно число від 2 до 12. У вказаних вище формулах (L-22) і (L-23), n2 - це число від 1 до 20, переважно число від 1 до 10, і більш переважно число від 1 до 6. Лінкери в формулах (L-4)-(L-23) можуть зв'язувати смисловий ланцюг як з правого, так і з лівого боку. Переважно, специфічна ділянка смислового ланцюга (або нуклеїнова кислота в кон'югаті нуклеїнової кислоти) приєднана з правого боку до лінкерів по формулах (L-4)-(L-23), і ліпід приєднаний до їхньої лівої сторони. Ділянка приєднання ліпіду до лінкеру може вибиратися відповідним чином згідно з типами використовуваних ліпідів і лінкерів. Наприклад, якщо як ліпід використовується жирна кислота, то її можна приєднувати за допомогою складноефірного зв'язку, амідного зв'язку або подібного зв'язку, що утворюється між карбоксильною групою жирної кислоти і лінкером. Більш конкретно, якщо як ліпід використовується жирна кислота, то ліпід переважно приєднаний за допомогою заміни -OH карбоксильної групи жирної кислоти лінкером. Лінкер вибирають відповідним чином згідно з типом приєднуваного ліпіду. Якщо як ліпід використовується жирна кислота, то переважно використовувати лінкери, представлені формулою (L-4). У доповнення до вказаних вище лінкерів також застосовні інші лінкери. Внаслідок цього приклади включають лінкери подвійної дії (лінкери, які містять 2 функціональні групи), такі як Nсукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)-пропіонат, N-4-малеїнімід масляної кислоти, S-(2-піридилдитіо)цистамін, йодоацетоксисукцинімід, N-(4-малеїнімідбутилокси)-сукцинімід, N-[5-(3'малеїнімідпропіламід)-1-карбоксипентил]-імінодіоцтова кислота, N-(5-амінопентил) 6 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імінодіоцтова кислота і т. п. В смисловому ланцюгу, нуклеотид, приєднаний до ліпіду або до лінкеру, що використовується для приєднання ліпіду, не визначений суворо при умові, що це щонайменше один з перших шести нуклеотидів 5'-кінця смислового ланцюга, переважно щонайменше один з перших чотирьох нуклеотидів 5'-кінця, більш переважно перший і/або другий нуклеотиди 5'-кінця, і особливо переважно нуклеотид на 5'-кінці (перший нуклеотид 5'кінця). Ділянка приєднання смислового ланцюга до ліпіду або до лінкеру, що використовується для приєднання ліпіду, не визначена суворо. Переважно вона приєднана за допомогою заміни атома водню в гідроксильній групі залишку фосфорної кислоти специфічного нуклеотиду смислового ланцюга. Кількість ліпідів, які приєднуються модифікованою ліпідом дволанцюжковою РНК за винаходом, не визначена суворо. Наприклад, можна приєднувати від одного до трьох ліпідів, переважно, один або два ліпіди, і більш переважно, один ліпід. Модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК за винаходом можна отримувати синтезом смислового ланцюга, що має додатково щонайменше один приєднаний ліпід, і антисмислового ланцюга відповідно, і гібридизацією смислового і антисмислового ланцюгів згідно з відомими способами. Смисловий ланцюг, що має додатково приєднаний ліпід, також можна отримувати згідно з відомими способами синтезу. Модифікована дволанцюжкова РНК за винаходом може вводитися всередину клітин для інгібування або ослаблення експресії гена-мішені, і таким чином може використовуватися як фармацевтичний препарат для інгібування або ослаблення експресії гена-мішені або композиції для генної терапії, тобто, фармацевтичної композиції. Фармацевтична композиція за винаходом може випускатися в складі різних лікарських форм. Приклади лікарських форм фармацевтичної композиції за винаходом включають рідкі препарати, такі як рідини (такі як сиропи), краплі, і ін'єкційні препарати; тверді препарати, такі як таблетки, пілюлі, порошки, гранули і капсули (такі як м'які капсули); і т. п. Якщо фармацевтична композиція за винаходом являє собою рідкий препарат, то композиція може заморожуватися або зберігатися після видалення з нього води за допомогою ліофілізації і т. д. Ліофілізовані препарати і сухі сиропи і т. д. можна застосовувати у вигляді розчинів після додавання в момент застосування дистильованої води для ін'єкцій, стерильної води або т. п. Якщо фармацевтична композиція за винаходом являє собою твердий препарат, то композицію можна використовувати у вигляді розчину після додавання в момент застосування дистильованої води для ін'єкцій, стерильної води або т. п. Фармацевтична композиція може складатися тільки з модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, або при необхідності може також містити прийнятний фармацевтичний носій. Використовуваний носій не визначений суворо при умові, що він не порушує інгібуючий вплив модифікованої дволанцюжкової РНК за винаходом на експресію гена-мішені, і може вибиратися відповідним чином відповідно дозуванню. Приклади можливих носіїв включають очищену воду, водні розчини цукрів, буфери, фізіологічний розчин, водні розчини полімерів, воду, очищену від РНКази, і т. д. Якщо фармацевтична композиція за винаходом містить носій, то пропорції цих компонентів в композиції не визначені суворо при умові, що вони не порушують інгібуючий і ослаблюючий вплив модифікованої дволанцюжкової РНК за винаходом на експресію гена-мішені, і можуть вибиратися відповідним чином відповідно дозуванню. Наприклад, фармацевтична композиція за винаходом може містити модифіковану дволанцюжкову РНК в кількості від 0,001 до 50, більш переважно, від 0,01 до 10, і ще, більш переважно, від 0,1 до 1. Фармацевтична композиція за винаходом може містити носій в кількості від 50 до 99,999 мас. %, переважно, від 90 до 99,99 мас. %, і ще, більш переважно, від 99 до 99,9 мас. % від загальної маси композиції. Ген-мішень і захворювання, відносно яких застосовують фармацевтичну композицію за винаходом, не визначені суворо. Відомий взаємозв'язок між геном-мішенню і захворюванням. Тип клітини, всередину якої вводять фармацевтичну композицію за винаходом, не обмежений. Використовувана клітина може бути людською або тваринною клітиною, що не належить людині. Фармацевтичну композицію за винаходом можна використовувати in vitro або in vivo. Кількість і спосіб введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом всередину клітин такі ж, як в звичайному способі міРНК. Наприклад, якщо фармацевтична композиція за винаходом використовується для введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК всередину клітин in vitro, то можна використовувати спосіб культивування клітин в присутності відповідної кількості фармацевтичної композиції. Якщо фармацевтична композиція за винаходом використовується для введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК всередину культивованих клітин або клітин, виділених з живого організму in vitro, то модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом може вводитися в 7 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 присутності сироватки. Якщо фармацевтична композиція за винаходом використовується для введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК всередину клітин in vivo, то можна використовувати безпосередню ін'єкцію фармацевтичної композиції всередину тканини; внутрішньовенну, підшкірну, м'язову, внутрішньочеревинну, внутрішньоочну, шлунково-кишкову або зубну ін'єкцію; інгаляційне введення всередину носової порожнини, ротової порожнини, легень або т. п.; пероральне введення; трансдермальне введення через шкіру; трансмукозальне введення через слизову ротової порожнини, слизову піхви, слизову очей, слизову прямої кишки і слизову матки; і т. п. способи. Якщо використовується фармацевтична композиція за винаходом, то разом з нею може необов'язково використовуватися відомий засіб для генетичної трансфекції, що застосовується для трансфекції міРНК всередину клітин. Альтернативно, фармацевтична композиція за винаходом може містити засіб для генетичної трансфекції. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК, що міститься в фармацевтичній композиції за винаходом, навіть у разі самостійного використання має чудову здатність до трансфекції клітин. Таким чином, модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК може вводитися всередину клітин без допомоги відомого засобу для генетичної трансфекції, що використовується для трансфекції міРНК всередину клітин, або за допомогою зниженої кількості засобу для генетичної трансфекції. Можна використовувати ефективну кількість фармацевтичної композиції за винаходом, наприклад, таку кількість, що модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК вводять в кількості від 0,001 до 10 пM, переважно, від 0,001 до 1 пM, і, більш переважно, від 0,01 до 0,1 пM на клітину. Фармацевтична композиція за винаходом здатна інгібувати або ослабляти експресію генамішені і тим самим запобігати, поліпшувати або лікувати захворювання, викликане експресією гена-мішені. Даний винахід додатково належить до способу інгібування експресії гена-мішені. Спосіб інгібування експресії гена-мішені включає трансфекцію модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК всередину клітин. Ген-мішень або захворювання не визначено суворо, і, як указано вище, відомий взаємозв'язок між геном-мішенню і захворюванням. Тип клітини, всередину якої вводять модифіковану дволанцюжкову РНК за винаходом, не обмежений. Використовувана клітина може бути людською або тваринною клітиною, що не належить людині. Фармацевтичну композицію за винаходом можна використовувати in vitro або in vivo. У способі інгібування експресії гена-мішені за винаходом кількість і спосіб введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом всередину клітин такі ж, як в звичайному способі міРНК, і може вибиратися відповідним чином. Наприклад, в способі інгібування експресії гена-мішені за винаходом, для введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом всередину клітин in vitro, можна використовувати прийом культивування клітин в присутності відповідної кількості модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК. У способі інгібування експресії гена-мішені за винаходом, для введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК всередину культивованих клітин або клітин, виділених з живого організму in vitro, можна використовувати прийом введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК за винаходом всередину клітин в присутності сироватки. У способі інгібування експресії гена-мішені за винаходом, для введення модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК всередину клітин in vivo, можна використовувати описаний нижче прийом; безпосередню ін'єкцію фармацевтичної композиції всередину тканини; внутрішньовенну, підшкірну, м'язову, внутрішньочеревинну, внутрішньоочну, шлунково-кишкову або зубну ін'єкцію; інгаляційне введення всередину носової порожнини, ротової порожнини, легень або т. п.; пероральне введення; трансдермальне введення через шкіру; трансмукозальне введення через слизову ротової порожнини, слизову піхви, слизову очей, слизову прямої кишки і слизову матки; і т. п. прийоми. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом може вводитися всередину клітин за допомогою здійснення контакту ефективної кількості модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК з клітинами. Наприклад, модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК вводять в кількості від 0,001 до 10 пM, переважно від 0,001 до 1 пM, і більш переважно від 0,01 до 0,1 пM на клітину. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за винаходом навіть у разі самостійного використання має чудову здатність до трансфекції клітин. Таким чином, модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК можна вводити всередину клітин без допомоги відомого засобу для генетичної трансфекції, що використовується для трансфекції міРНК всередину клітин, або за допомогою зниженої кількості засобу для генетичної трансфекції. 8 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб інгібування експресії гена-мішені за даним винаходом може інгібувати або ослабляти експресію гена-мішені і тим самим запобігати, поліпшувати або лікувати захворювання, викликане його експресією. ПРИКЛАДИ Даний винахід детально описаний за допомогою наступних прикладів; однак він не обмежений цими прикладами. Приклад 1: Інгібуючий вплив 5' модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК на експресію гена люциферази 1. Синтез модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, направленої на ген люциферази 1-1. Послідовності смислових і антисмислових ланцюгів Конструювали дволанцюжкові РНК, які містять смислові ланцюги довжиною від 21 до 27 основ і антисмислові ланцюги довжиною від 21 до 27 основ, що мають гомологічну люциферазі Renilla послідовність і здатні інгібувати експресію гена люциферази Renilla. Такі дволанцюжкові РНК в залежності від комбінації антисмислового і смислового ланцюгів можуть утворювати різні типи подвійних ланцюгів. Дволанцюжкові РНК отримали наступні назви. "ДЛ (дволанцюжкові) РНК": повністю дволанцюжкові РНК, що не містять виступаючого кінця (одноланцюжкового фрагмента) (тобто, дволанцюжкові РНК, що мають тупі кінці на обох 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга); "Мі РНК": дволанцюжкові РНК, що мають виступаючі кінці (виступи) на їх обох кінцевих сторонах; і "ПВ (правий виступ) РНК": дволанцюжкові РНК, що мають виступаючий кінець тільки на правій стороні смислового ланцюга, якщо 5'-кінець позначений зліва. Назви різних дволанцюжкових РНК розмежовані за допомогою позначення смислового ланцюга як "A" ("A1" або "A2") і антисмислового ланцюга як "B", а також за допомогою указування кількості основ в кожній одноланцюжковій РНК, тобто в смисловому і антисмисловому ланцюгах. Через те, що конструювали два типи смислових ланцюгів, з метою класифікації кожен з них позначали як "A1" і "A2". Що стосується дволанцюжкових РНК, модифікованих ліпідом на 5'-кінцевому фрагменті смислового ланцюга, то після назви кожного смислового ланцюга ставилося позначення "Cx (х=16 або 12)". Послідовності використовуваних РНК були наступними: Смислові ланцюги: 27нт 27A1: 5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 1) 25нт 25A1: 5' -CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3' (SEQ ID NO: 2) 23нт 23A1: 5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3' (SEQ ID NO: 3) 21нт 21A1: 5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC-3' (SEQ ID NO: 4) 21нт 21A2: 5'-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3' (SEQ ID NO: 5) Антисмислові ланцюги: 27нт 27B: 5'-GUGCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 6) 25нт 27B: 5'-GCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 7) 23нт 27B: 5'-UCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 8) 21нт 27B: 5'-GUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 9) 1-2. Синтез немодифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген люциферази Використовуючи вказані вище смислові і антисмислові ланцюги, отримували різні дволанцюжкові РНК. Кожну дволанцюжкову РНК отримували за допомогою змішування еквімолярних кількостей смислового і антисмислового ланцюгів в універсальному буфері (Hayashi Kasei Co., Ltd.), нагріванням суміші при 92 °C протягом 2 хвилин і потім поступовим зниженням температури до 4 °C. Отримані різні дволанцюжкові РНК розділяли електрофорезом в 20 % поліакриламідному гелі при 250 В протягом 60 хвилин і потім підтверджували за допомогою silver staining kit (GE Health Care Bioscience). ФІГ. 1A демонструє структури немодифікованих дволанцюжкових РНК. 1-3. Синтез модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген люциферази Синтезували модифіковані ліпідом смислові ланцюги, в яких ліпід приєднували до 5'-кінця смислових ланцюгів дволанцюжкових РНК, здатних інгібувати експресію гена люциферази. У цих модифікованих ліпідом смислових ланцюгах ліпід ковалентно зв'язували через аміноалкільну групу (Аміномодифікатор C6; Glen Research), приєднану до 5'-кінця вказаних вище смислових ланцюгів. Модифіковані ліпідом смислові ланцюги синтезували за допомогою реакції в рідкій фазі ліпідної сполуки, що містить активну складноефірну групу (тут і далі позначається як "ліпідна сполука, що містить активний складний ефір"), зі смисловим ланцюгом, модифікованим за допомогою амінування 5'-кінця (Схеми реакції 1 і 2). Схема реакції 1 9 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 Специфічний спосіб синтезу описаний нижче. Амінування 5'-кінця смислового ланцюга можна здійснювати звичайним способом (фосфорамідитний спосіб синтезу) в твердофазному синтезі РНК з використанням 5'-аміномодифікатора C6 (Glen Research), щоб з його допомогою синтезувати смисловий ланцюг, модифікований аміноалкільною групою на 5'-кінці (довжиною в 21 основу). Смисловий ланцюг, модифікований аміноалкільною групою на 5'-кінці, очищений за допомогою ВЕРХ і направлений на MALDI-TOF МС-аналіз, отримували від Hayashi Kasei Co., Ltd. Отриманий в результаті модифікований аміноалкільною групою на 5'-кінці смисловий ланцюг містить -(CH2)6-NH2, приєднаний до 5'-кінця (фосфатного залишку першого нуклеотиду 5'-кінця). Концентрацію отриманої в результаті одноланцюжкової РНК визначали вимірюванням поглинання світла при 260 нм за допомогою УФ-спектрометра. Модифіковану аміноалкільною групою одноланцюжкову РНК в умовах конденсації змішували з ліпідною сполукою, що містить активний складний ефір (складний ефір N-гідроксисукциніміду пальмітинової кислоти (SigmaAldrich), або складний ефір 4-нітрофенілу лауринової кислоти (TCI)), розчинений в DMF (N, Nдиметилформамід) з отриманням модифікованого ліпідом смислового ланцюга. Після проведення реакції, реакційний розчин очищали за допомогою ВЕРХ для видалення небажаних реагентів з реакційного розчину, що містить модифікований ліпідом смисловий ланцюг. Очищення за допомогою ВЕРХ здійснювали з буфером А: 100 % 20 мМ TEAA (pH 7,0) і буфером В: 70 % CH3CN/20 мМ TEAA (pH 7,0), з лінійним градієнтом 10-100 % буфера В протягом 50 хвилин. Як колонки для очищення використовували CAP CELL (4,6×150 мм, 5 мкм; Shiseido). ФІГ. 2 демонструє приблизні результати аналітичної ВЕРХ. Очищений за допомогою ВЕРХ модифікований ліпідом смисловий ланцюг ліофілізували і розчиняли в очищеній воді, після чого за допомогою УФ-спектрального аналізу визначали концентрацію і вихід синтезу. Структурні моделі і виходи отриманих в результаті модифікованих ліпідом смислових ланцюгів були наступними: 10 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 Отримані в результаті модифіковані ліпідом смислові ланцюги об'єднували з антисмисловими ланцюгами з отриманням модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК. Дволанцюжкові РНК отримували згідно з аналогічним способом, як описано вище, і підтверджували електрофорезом в 20 % поліакриламідному гелі. ФІГ. 1B демонструє структури модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК. На ФІГ. 1B X дорівнює 16, якщо приєднане похідне пальмітинової кислоти, і X дорівнює 12, якщо приєднане похідне лауринової кислоти. 2. Стійкість модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК до ферментативного руйнування Оцінювали нуклеазну стійкість модифікованої ліпідом 27нт длРНК (ДЛ 27A1C16/27B). Спочатку модифіковану ліпідом на 5'-кінці смислового ланцюга 27нт длРНК, розведену до кінцевої концентрації 2 мкМ, інкубували при 37 °C в середовищі RPMI-1640 (Invitrogen), що містить 10 % ЕТС (Sanko Junyaku, Co., Ltd.) (кінцевий об'єм: 110 мкл). Через кожні 0 год., 0,5 год., 1 год., 2 год., 4 год., 6 год., 8 год., 12 год., 24 год. і 48 год. відбирали аліквоту об'ємом 10 мкл і вміщували всередину пробірки для зразка, що містить 2 мкл завантажувального барвника. Для зупинки подальшої реакції руйнування взятий зразок швидко ліофілізували в рідкому азоті і зберігали при -20 °C. Отриманий в результаті дослідний зразок піддавали електрофорезу в 20 % поліакриламідному гелі протягом 70 хвилин при 250 В. Потім продукт забарвлювали за допомогою silver staining kit (GE Health Care Bioscience) (умови фарбування дивись в інструкції набору) і аналізували на ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). При порівнянні встановили, що широко використовувана 21 міРНК (мі 21A2/21B) довжиною в 21 основу і немодифікована 27нт длРНК (ДЛ 27A1/27B) мають схожу нуклеазну стійкість. ФІГ. 3 показує результати електрофорезу в гелі. У результаті, 21 міРНК швидко руйнувалася в середовищі, що містить сироватку, і через приблизно 1-2 години реєструвалося її повне зникнення. З іншого боку, немодифікована 27нт длРНК і модифікована ліпідом 27нт длРНК мали набагато більш високу нуклеазну стійкість, ніж 21 міРНК, і ці дволанцюжкові РНК зберігалися навіть через 48 годин. Ці результати привели до нового висновку про те, що модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК мала значно більш високу стабільність in vivo, ніж широко використовувана, як правило, 21 міРНК. 3. Опосередкований дайсером процесинг модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген люциферази Оцінювали процесинг синтезованих дволанцюжкових РНК і модифіковану ліпідом дволанцюжкових РНК рекомбінантним дайсером. Експерименти на розщеплення дайсером проводили таким чином. У пробірках для зразків в розчині з 20 мM Tris-HCl (pH 8,0), 15 мМ NaCl і 2,5 мМ Mg2Cl вміщували 10 мкл 0,5 МО рекомбінантного дайсера (Gene Therapy Systems) і немодифіковані дволанцюжкові РНК або модифіковані ліпідом дволанцюжкові РНК, розведені до кінцевої концентрації 2 мкМ, і потім зразки інкубували в інкубаторі при 37 °C протягом 12 11 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 годин. Для зупинки реакцій подальшого розщеплення ферментом перед додаванням 2 мкл завантажувального барвника в реакційні розчини додавали 2 мкл розчину, що блокує дайсер (Gene Therapy Systems). Отримані в результаті дослідні зразки піддавали електрофорезу в 20 % поліакриламідному гелі при 250 В протягом 70 хвилин. Потім продукти забарвлювали silver staining kit (GE Health Care Bioscience) (умови фарбування дивись в інструкції набору) і піддавали аналізу на ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). Як контроль немодифіковані 21 міРНК (мі21A2/21B) також аналізували за допомогою електрофорезу в гелі. Результати представлені на ФІГ. 4. Результати показали, що серед дволанцюжкових РНК, в яких смислові ланцюги ДЛ РНК (ДЛ 27A1/27B, ДЛ 25A1/25B, ДЛ 23A1/23B і ДЛ 21A1/21B) модифікували ліпідом, під дією рекомбінантного дайсера на ДЛ 27A1C16/27B і ДЛ 27A1C12/27B виявляли ланцюжки в однакових положеннях з немодифікованими 21 міРНК, і таким чином явно вказували на утворення в результаті розщеплення дайсером міРНК довжиною в 21 основу, що містять виступаючий кінець з 2 основ. Також у ДЛ 25A1C16/25B і ДЛ 23A1C16/23B в присутності дайсера виявляли нові ланцюжки в однакових положеннях з 21 міРНК, свідчачи про те, що вони утворювалися з участю дайсера. З іншого боку, в присутності дайсера не спостерігали значних змін в ДЛ 21A1C16/21B, виявляючи тим самим, що вона не процесувалась за допомогою дайсера. Крім того, схожим чином оцінювали процесинг за допомогою дайсера дволанцюжкових РНК, в яких кожний смисловий ланцюг ПВ РНК (ПВ 27A1/25B, ПВ 25A1/23B, ПВ 23A1/21B, і ПВ 21A1/19B), що має виступаючий кінець з 2 основ на 3'-кінцевому фрагменті смислового ланцюга, модифікували ліпідом. У результаті, в присутності дайсера у 3 типів, тобто ПВ 27A1C16/25B, ПВ 25A1C16/23B і RO23A1C16/21B, спостерігали ланцюжки в однакових положеннях з 21 міРНК, виявляючи тим самим, що вони процесувались за допомогою дайсера. ПВ 27A1C16/25B і ПВ 25A1C16/23B, особливо, зазнавали вираженого процесингу за допомогою дайсера. З іншого боку, навіть в присутності дайсера не виявляли ніяких змін у відносно короткій ПВ 21A1C16/19B, передбачаючи тим самим, що вона не процесується за допомогою дайсера. Крім того, оцінювали процесинг за допомогою дайсера дволанцюжкових РНК, в яких смислові ланцюги ПВ РНК (ПВ 27A1/23B і ПВ 25A1/21B), що мають виступаючий кінець з 4 основ на 3'-кінцевому фрагменті смислового ланцюга, модифікували ліпідом, а також дволанцюжкових РНК, в яких смислові ланцюги ПВ РНК (ПВ 27A1/21B), що містять виступаючий кінець з 6 основ на 3'-кінцевому фрагменті смислового ланцюга, модифікували ліпідом. У результаті, всі вказані вище ПВ РНК процесувались за допомогою дайсера, і нові ланцюжки виявляли в однакових з 21нт міРНК положеннях. Крім того, схожим чином оцінювали процесинг за допомогою дайсера дволанцюжкових РНК, в яких смислові ланцюги ПВ РНК (ПВ 25A1/27B, ПВ 23A1/25B і ПВ 23A1/27B), що містять виступаючий кінець на 5'-кінцевому фрагменті антисмислового ланцюга, модифікували ліпідом. У результаті, у деяких модифікованих ліпідом ПВ РНК, що мають виступаючий кінець на 5'кінцевому фрагменті антисмислового ланцюга, виявляли нові ланцюжки як результат процесингу за допомогою дайсера; однак ланцюжки виявлялися в тих же положеннях, що і за відсутності дайсера, вказуючи тим самим, що інтенсивність процесингу за допомогою дайсера була нижчою за інтенсивність процесингу ДЛ РНК і інших ПВ РНК. 4. Інгібування експресії гена люциферази за допомогою модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК Ефективність РНК-інтерференції синтезованих немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК оцінювали за допомогою люциферази Renilla як мішені. Клітини HeLa (клітини раку шийки матки людини; Інститут розвитку, старіння і раку, 5 Університет Тохоку), розведені до концентрації 1×10 клітин/мл заздалегідь розсіювали в 96ямковий планшет в 100 мкл на ямку і інкубували при 37 °C протягом ночі. На наступний день з ямки видаляли старе середовище і в кожну ямку, що містить клітини HeLa, додавали 80 мкл нового середовища без антибіотика і 10 мкл розчину комплексу вектора, експресуючого люциферази світляка і Renilla (psiCHECK™-2 Вектор; Promega) і Lipofectamine™ 2000 (комерційна назва; Invitrogen). Кількість експресійного вектора доводили до 0,02 мкг на ямку, Lipofectamine™ 2000 доводили до 0,2 мкл на ямку і OptiMem (Invitrogen) використовували для доведення об'єму ямки до необхідного рівня. Для утворення комплексу експресійний вектор і Lipofectamine™ 2000 змішували з використанням OptiMem, і потім суміш інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після додавання розчину комплексу, клітини інкубували при 37 °C протягом 4 годин в атмосфері 5 % CO2. Після інкубації отримували комплекси немодифікованих дволанцюжкових РНК, що містять антисмислові послідовності 12 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомологічні гену люциферази Renilla, і дволанцюжкових РНК, модифікованих на кінці ліпідом, з Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) в кінцевих концентраціях 0 нМ, 0,2 нМ, 0,5 нМ, 1 нМ, 2 нМ, 5 нМ і 10 нМ, і 10 мкл кожного з отриманих в результаті розчинів комплексу додавали клітинам HeLa, яким вводили експресійний вектор. Кінцевий об'єм становив 100 мкл на ямку. Розчин комплексу кожної РНК і Lipofectamine™ 2000 отримували шляхом змішування 5 мкл на ямку водного розчину РНК, розчину Lipofectamine™ 2000 (0,2 мкл) і 5 мкл на ямку OptiMem, і інкубації суміші при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після введення РНК клітини інкубували протягом 48 годин і досліджували рівні експресії люциферази світляка і Renilla за допомогою Dual-Glo™ Luciferase Assay System (Promega) і люмінометра (MicroLumat LB96p; Berthold), і інгібуючий вплив на експресію люциферази Renilla визначали виходячи з рівня експресії люциферази світляка як контрольного. ФІГ. 5 показує інгібуючий вплив немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК на експресію гена при концентраціях 0,2 нМ. У результаті виявили, що, якщо дволанцюжкові РНК, що мають тупий кінець на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, такі як ДЛ РНК і ПВ РНК, модифікували ліпідом, то такі дволанцюжкові РНК демонстрували істотно посилені ефекти РНК-інтерференції в порівнянні з ефектами, що отримуються за допомогою дволанцюжкових РНК, які мають таку ж структуру, але не модифікованих ліпідом. Також виявили, що такі ж сильні ефекти РНК-інтерференції в порівнянні з немодифікованими ПВ РНК такої ж структури виходили за допомогою модифікації 5'-кінця смислового ланцюга ліпідом незалежно від довжини ланцюжка або положення виступаючого кінця в ПВ РНК. Ці результати привели до нового висновку про те, що ефекти РНКінтерференції можна істотно поліпшити за допомогою модифікації ліпідом 5'-кінця смислового ланцюга молекули інтерферуючої РНК, що містить тупий кінець на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, такій як ДЛ РНК і ПВ РНК. Крім того, виявили, що мі 21A2C16/21B і мі 21A2C12/21B, в яких 5'-кінець смислового ланцюга 21нт міРНК модифікували ліпідом, також демонстрували більш сильні ефекти РНК-інтерференції, ніж ефекти, що отримуються за допомогою немодифікованих 21нт міРНК. 5. Ефекти РНК-інтерференції модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген люциферази (без використання засобу для трансфекції) Модифіковані ліпідом дволанцюжкові РНК трансфікували всередину клітин самостійно без використання засобів для генетичної трансфекції, таких як Lipofectamine™ 2000 або подібних, і оцінювали їх здатність виявляти ефекти РНК-інтерференції. Клітини HeLa (клітини раку шийки матки людини; Інститут розвитку, старіння і раку, 5 Університет Тохоку), розведені до 1×10 клітин/мл, заздалегідь розсіювали в 96-ямковий планшет в 100 мкл на ямку і інкубували при 37 °C протягом ночі. На наступний день з ямки видаляли старе середовище і в кожну ямку, що містить клітини HeLa, додавали 80 мкл нового середовища без антибіотика і 10 мкл розчину комплексу вектора, експресуючого люциферази світляка і Renilla (psiCHECK™-2 Вектор; Promega) і Lipofectamine™ 2000 (комерційна назва; Invitrogen). Кількість експресійного вектора доводили до 0,02 мкг на ямку, Lipofectamine™ 2000 доводили до 0,2 мкл на ямку і OptiMem (Invitrogen) використовували для доведення об'єму ямки до необхідного рівня. Для утворення комплексу експресійний вектор і Lipofectamine™ 2000 змішували з використанням OptiMem, і потім суміш інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після додавання розчину комплексу, клітини інкубували при 37 °C протягом 4 годин в атмосфері 5 % CO2. Кожну ямку потім тричі промивали 100 мкл середовища для видалення Lipofectamine™ 2000 з ямки. Після цього клітинам додавали середовище, що містить 90 мкл антибіотиків, і за допомогою OptiMem отримували зразки немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, що містять антисмислові послідовності гомологічні послідовності гена люциферази Renilla, в кінцевих концентраціях 0 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 600 нМ, 800 нМ і 1 мкМ, і 10 мкл кожного з отриманих в результаті зразків додавали клітинам, після чого їх інкубували при 37 °C протягом 48 годин. Рівні експресії люциферази світляка і Renilla досліджували за допомогою Dual-Glo™ Luciferase Assay System (Promega) і люмінометра (MicroLumat LB96p; Berthold). Для порівняння оцінювали ефекти РНК-інтерференції немодифікованих 21нт міРНК (мі 21A2/21B) і 27нт длРНК (ДЛ 27A1/27B) в тих же умовах, як описано вище. Ефекти РНК-інтерференції визначали шляхом оцінки рівня експресії люциферази Renilla, виходячи з рівня експресії люциферази світляка як контрольного. ФІГ. 6A показує результати для мі 21A2/21B, ДЛ 27A1/27B і ДЛ 27A1C16/27B в кінцевих концентраціях від 50 нМ до 1 мкМ, і ФІГ. 6B показує результати для ДЛ 23A1/23B і ДЛ 23A1C16/23B в кінцевих концентраціях від 25 нМ до 800 нМ. У результаті встановили, що модифіковані пальмітиновою кислотою на 5'кінцевому фрагменті смислового ланцюга ДЛ 27A1C16/27B і ДЛ 23A1C16/23B інгібували 13 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресію люциферази Renilla в залежності від концентрації дволанцюжкової РНК; таким чином, ці дволанцюжкові РНК, завдяки модифікації пальмітиновою кислотою, трансфікувались всередину клітин самостійно і тим самим здійснювали реакції РНК-інтерференції. З іншого боку, немодифіковані дволанцюжкові РНК (мі 21A2/21B, ДЛ 27A1/27B і ДЛ 23A1/23B) навіть у високих концентраціях не впливали значним інгібуючим чином на експресію гена. Це додатково підтвердилося тим, що модифіковані пальмітиновою кислотою дволанцюжкові РНК мали значно більш високу ефективність внутрішньоклітинного накопичення і демонстрували чудову здатність до інгібування експресії гена без використання засобу для генетичної трансфекції. 6. Оцінка ефективності внутрішньоклітинного накопичення модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК Клітини HeLa (клітини раку шийки матки людини; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку), клітини A549 (клітини раку легень людини; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку) і клітини SH10-TC (клітини раку шлунку людини; Інститут розвитку, 5 старіння і раку, Університет Тохоку), розведені перед експериментами до 1×10 клітин/мл, а також клітини Jurkat (клітини гострого лімфолейкозу; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку) і клітини K-562 (клітини хронічного мієлолейкозу), розведені перед 5 експериментами до 2×10 клітин/мл, розсіювали в 24-ямкові планшети по 1 мл на ямку, і клітини інкубували в середовищі, що містить 10 % ембріональної телячої сироватки (FBS; Sanko Junyaku, Inc.) і антибіотики, при 37 °C в атмосфері 5 % CO2. Що стосується використовуваних в даній роботі антибіотика і середовищ, то для всіх клітин використовували антибіотик стрептоміцин, для клітин HeLa використовували середовище MEM (Invitrogen) і для інших клітин використовували середовище RPMI-1640 (Invitrogen). Перед трансфекцією флуоресцентно мічених олігонуклеотидів ці середовища заміняли середовищем без антибіотика (450 мкл). Олігонуклеотиди, мічені 6-FAM на 5'-кінцевому фрагменті 27нт антисмислового ланцюга, використовували як флуоресцентно мічені олігонуклеотиди, і олігонуклеотиди об'єднували з немодифікованим 27нт смисловим ланцюгом або з 27нт смисловим ланцюгом, модифікованим ліпідом на 5'-кінцевому фрагменті, з утворенням подвійних ланцюжків. Експерименти на ефективність внутрішньоклітинного накопичення здійснювали таким чином: 50 мкл змішаного розчину, отриманого за допомогою об'єднання 25 мкл змішаного розчину, що складається з 10 мкл 10 мкM водного розчину флуоресцентно мічених олігонуклеотидів і 15 мкл розчину OptiMem, з 25 мкл змішаного розчину, що складається з 2 мкл розчину Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) і 23 мкл розчину OptiMem, інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин з утворенням комплексуфлуоресцентно мічених олігонуклеотидів і Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). Якщо не використовували Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) (розділ F на ФІГ. 7; LF2000), то замість 2 мкл розчину Lipofectamine™ 2000 використовували розчин OptiMem за умови формування описаного вище комплексу і отримували зразки згідно з описаним вище способом. 50 мкл отриманого в результаті комплексу флуоресцентно мічених олігонуклеотидів додавали до 450 мкл підготовлених раніше клітин (кінцева концентрація дволанцюжкових РНК: 200 нМ), і інкубували при 37 °C протягом 4 годин в атмосфері 5 % CO2. Після цього клітини тричі промивали PBS (-) або середовищем, і оцінювали ефективність внутрішньоклітинного накопичення дволанцюжкових РНК за допомогою конфокального флуоресцентного лазерного мікроскопа і проточної цитометрії. У дослідженні за допомогою конфокального флуоресцентного лазерного мікроскопа використовували систему Radiance 2000 (Bio Rad), і флуоресценцію визначали з використанням аргонового лазера. У ході проточної цитометрії вимірювали ефективність внутрішньоклітинного накопичення для 10,000 підрахованих клітин з допомогою цитометра coulter EPICS XL (Beckman coulter). Для аналізу проточної цитометрії використовували програмне забезпечення XL EXPO32™ (Beckman coulter). Результати представлені на ФІГ. 7-1-7-3. Розділ F (- LF2000) на ФІГ. 7-3 показує результати без використання Lipofectamine™ 2000, і розділи A-E (+LF2000) на ФІГ. 7-1-7-3 показує результати з використанням Lipofectamine™ 2000 як засобу для генетичної трансфекції. Розділ А на ФІГ. 7-1 показує результати ефективності внутрішньоклітинного накопичення різних дволанцюжкових РНК всередину HeLa клітин при використанні Lipofectamine™ 2000 як засобу для генетичної трансфекції; розділ В на ФІГ. 7-1 показує результати для клітин A549; розділ С на ФІГ. 7-2 показує результати для клітин SH10-TC; розділ D на ФІГ. 7-2 показує результати для клітин K-562; і розділ Е на ФІГ. 7-3 показує результати для клітин Jurkat. Розділ F на ФІГ. 7-3 показує результати ефективності внутрішньоклітинного накопичення різних дволанцюжкових РНК всередину клітин HeLa без використання комерційно доступного засобу для генетичної трансфекції. Таким чином, трансфекція немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК всередину всіх клітин (клітин HeLa, клітин A549, 14 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 клітин SH10-TC, клітин Jurkat і клітин K-562) підтверджувалася в присутності Lipofectamine™ 2000. Особливо дуже висока ефективність внутрішньоклітинного накопичення визначалася за допомогою конфокального флуоресцентного лазерного мікроскопа і проточної цитометрії для ДЛ 27A1C16/27B, модифікованих пальмітиновою кислотою на 5'-кінці смислового ланцюга, в порівнянні з немодифікованими дволанцюжковими РНК і дволанцюжковими РНК, модифікованими лауриновою кислотою. Крім того, спостереження за допомогою конфокального флуоресцентного лазерного мікроскопа дозволило передбачити, що дволанцюжкова РНК, модифікована пальмітиновою кислотою, активно розподілялася в цитоплазмі клітин. Ефективність накопичення була особливо помітна в адгезивних клітинах (клітини HeLa, клітини A549 і клітин SH10-TC). Крім того, проточний цитометричний аналіз підтвердив, що дволанцюжкова РНК, модифікована пальмітиновою кислотою демонструвала більш високу ефективність внутрішньоклітинного накопичення, ніж немодифікована дволанцюжкова РНК також в присутності Lipofectamine™ 2000. Ці результати привели до нового висновку про те, що, якщо дволанцюжкова РНК ковалентно пов'язана 5'-кінцевим фрагментом смислового ланцюга з ліпідом, таким як пальмітинова кислота або тому подібні, то дволанцюжкова РНК здатна демонструвати значно підвищену ефективність внутрішньоклітинного накопичення, і може розподілятися в цитоплазмі клітин. Приклад 2: Інгібуючий вплив 5'- модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК на експресію гена VEGF 1. Синтез модифікованої ліпідом дволанцюжкової РНК, направленої на ген VEGF 1-1. Послідовності смислових і антисмислових ланцюгів Розрахували дволанцюжкові РНК, що містять смисловий ланцюг довжиною в 27 або 21 основу і антисмисловий ланцюг довжиною в 27 або 21 основа і що мають послідовність гомологічну VEGF (фактор росту ендотелію судин) і здатні до інгібування експресії гена VEGF. За допомогою таких дволанцюжкових РНК проводили наступні експерименти. 27нт длРНК являє собою повністю дволанцюжкову РНК, що не має виступаючого кінця (одноланцюжкового фрагмента) (тобто, дволанцюжкова РНК, яка містить тупі кінці одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга), і 21 міРНК являє собою дволанцюжкову РНК, що має виступаючі кінці з 2 основ на 3'-кінцях одночасно смислового і антисмислового ланцюгів. Використовували 27нт длРНК і 21міРНК з наступними послідовностями: 27нт длРНК: смисловий ланцюг: v27A: 5'- CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3' (SEQ ID NO: 10) антисмисловий ланцюг: v27B: 3'- GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5' (SEQ ID NO: 11) 21 міРНК: смисловий ланцюг: v21A: 5'- UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3' (SEQ ID NO: 12) антисмисловий ланцюг: v21B: 3'- GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5' (SEQ ID NO: 13). 1-2. Синтез немодифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген VEGF Вказані вище смислові і антисмислові ланцюги ренатурували описаним в прикладі 1 способом з утворенням подвійних ланцюгів, і тим самим отриманням немодифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК. Утворення подвійних ланцюгів підтверджували електрофорезом в 20 % акриламідному гелі, згідно з описаним в прикладі 1 способу. 1-3. Синтез модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген VEGF Синтезували здатні до інгібування експресії гена VEGF модифіковані ліпідом дволанцюжкові РНК, в яких ліпід приєднували до 5'-кінця смислового ланцюга вказаних вище дволанцюжкових РНК. У модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК ліпід ковалентно зв'язували через аміноалкільну групу (Аміномодифікатор C6; Glen Research), приєднану до 5'-кінця вказаного вище смислового ланцюга. Модифіковані ліпідом одноланцюжкові РНК (смислові ланцюги) синтезували згідно зі способом, описаним в прикладі 1. Структурні моделі і виходи модифікованих ліпідом РНК, направлених на ген VEGF, представлені нижче: 15 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Отримані в результаті модифіковані ліпідом смислові ланцюги об'єднували з антисмисловими ланцюгами з отриманням модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК. Утворення подвійних ланцюгів підтверджували електрофорезом в 20 % акриламідному гелі згідно зі способом, описаним в прикладі 1. ФІГ. 8 показує структури модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК. Час елюювання модифікованих ліпідом РНК, направлених на ген VEGF, загалом відповідав описаному в прикладі 1. 2. Процесинг дайсером модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, направлених на ген VEGF Оцінювали процесинг синтезованих немодифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК рекомбінантним дайсером. Експерименти на розщеплення дайсером проводили згідно зі способом, описаним в прикладі 1. Результати показані на ФІГ. 9. В результаті дії рекомбінантного дайсера на ДЛ v27ACl6/v27B і ДЛ v27AC12/v27B виявляли ланцюжки в однакових положеннях з немодифікованими 21міРНК, що явно вказувало на утворення за допомогою розщеплення дайсером міРНК довжиною в 21 основу, що містять виступаючий кінець з двох основ. Ці результати довели, що приєднання ліпіду до 5'-кінця смислового ланцюга 27нт длРНК не перешкоджає процесингу дайсером. З іншого боку, навіть в присутності дайсера не спостерігали ніяких змін у мі V21AC16/V21B і мі v21AC12/v21B в порівнянні з відсутністю дайсера, показавши цим, що вони не процесувались за допомогою дайсера. 3. Інгібування експресії гена VEGF за допомогою модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК За допомогою клітин HeLa (клітини раку шийки матки людини; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку), клітин A549 (клітини раку легень людини; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку), клітин SH10-TC (клітини раку шлунку людини; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку), клітин Jurkat (клітини гострого лімфолейкозу; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку) і клітин K-562 (клітини хронічного мієлолейкозу; Інститут розвитку, старіння і раку, Університет Тохоку) оцінювали інгібуючий вплив 21нт міРНК з немодифікованими кінцями, 27нт длРНК з немодифікованими кінцями, 27нт длРНК, модифікованою ліпідом на 5'-кінці смислового ланцюга (27нт длРНК, модифікованою на кінці ліпідом), і 21нт міРНК, модифікованою ліпідом на 5'-кінці смислового ланцюга (21нт міРНК, модифікованою на кінці ліпідом) на експресію гена VEGF. Крім того, також оцінювали дволанцюжкові РНК, що не мають генетичної послідовності, гомологічної гену VEGF (27нт длРНК (випадкова) і 21нт міРНК (випадкова)), а також модифіковані ліпідом дволанцюжкові РНК, в яких ліпід приєднували до 5'-кінця смислових ланцюгів цих дволанцюжкових РНК. Експерименти здійснювали наступним способом: клітини HeLa, клітини A549 і клітин SH105 TC, розведені до 1×10 клітин/мл перед експериментами, а також клітини Jurkat і клітин K-562, 5 розведені до 2×10 клітин/мл перед експериментами, розсіювали в 500 мкл на ямку в 24-ямкові планшети і інкубували при 37 °C протягом ночі. На наступний день з ямки видаляли старе середовище, і в ямку додавали по 450 мкл нового середовища без антибіотика. Для клітин HeLa використовували середовище MEM, а для інших клітин використовували середовище PRMI1640. Отримували комплекс немодифікованих або модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК (25 мкл), що містять антисмислову послідовність гомологічну генетичній послідовності VEGF, з розчином Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) (25 мкл), і потім 50 мкл кожного з розчинів дволанцюжкової РНК додавали до 450 мкл вказаних вище клітин. Кінцевий об'єм становив 500 мкл на ямку. Комплекс розчину кожної РНК і розчину Lipofectamine™ 2000 отримували за 16 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою змішування 25 мкл на ямку водного розчину РНК і розчину Lipofectamine™ 2000 (2 мкл) і 25 мкл на ямку OptiMem, і інкубації суміші при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після введення РНК клітини інкубували при 37 °C протягом 48 годин в атмосфері 5 % CO2. Після інкубації клітини тричі промивали PBS (-), і за допомогою набору RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) з клітин виділяли загальну РНК. Потім для вимірювання кількості VEGF мРНК проводили реакції ПЛР в реальному часі. Для ПЛР в реальному часі використовували набір Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen), і як PCT праймери для VEGF використовували 5'-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3' (SEQ ID NO: 14) і 5'-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3' (SEQ ID NO: 15). Ген GAPDH вимірювали як контрольний згідно з описаним способом. 5'GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3' (SEQ ID NO: 16) і 5'-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3' (SEQ ID NO: 17) використовували як праймери для GAPDH. ПЛР в реальному часі здійснювали наступним способом: реакцію зворотної транскрипції проводили при 50 °C протягом 30 хвилин, і потім проводили ПЛР, яка включала від 25 до 28 повторних циклів (в залежності від використовуваних клітин), що складаються зі стадії денатурації подвійних ланцюгів при 92 °C протягом 30 секунд, стадії відпалу при 55 °C протягом 30 секунд і стадії елонгації при 68 °C протягом 45 секунд. Нарешті, проводили інкубацію при 68 °C протягом 10 хвилин, знижували температуру до 4 °C, і завершували реакцію. Реагенти, загальна РНК, праймери і т.п., використані для ПЛР в реальному часі готували згідно з рекомендованими умовами Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen). Після ПЛР в реальному часі додавали 2 мкл завантажувальних барвників, і продукти ПЛР, отримані з мРНК від VEGF і GAPDH, визначали за допомогою 2 % агарозного гелю. Інгібуючий вплив на експресію гена оцінювали за допомогою вимірювання рівня експресії VEGF в клітинах, всередину яких трансфікували дволанцюжкові РНК (як немодифіковані, так і модифіковані), передбачаючи, що рівень експресії гена VEGF генів в контрольних клітинах (всередину яких не трансфікували дволанцюжкові РНК) становив 100 %. Помилка в рівнях експресії серед клітин виправлялася на основі рівня експресії контрольного гена (GAPDH). ФІГ. 10-1-10-3 показують результати ефектів РНК-інтерференції немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК у випадках, коли VEGF був мішенню, і концентрація дволанцюжкових РНК становила 200 нМ. Графік А на ФІГ. 10-1 показує інгібуючий вплив немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК на експресію гена VEGF в клітинах HeLa; графік В на ФІГ. 10-2 показує результати для клітин A549; Графік С на ФІГ. 10-2 показує результати для клітин SH10-TC; Графік D на ФІГ. 10-3 показує результати для клітин Jurkat; і Графік Е на ФІГ. 10-3 показує результати для клітин K-562. Ці результати показали, що ДЛ v27AC16/v27B і ДЛ v27AC12/v27B, обидві отримані за допомогою модифікації ліпідом 5'-кінця смислового ланцюга дволанцюжкової РНК (ДЛ v27A/v27B) довжиною в 27 основ, а також мі v21AC16/v21B і мі v21AC12/v21B, обидві отримані за допомогою модифікації ліпідом 5'-кінця смислового ланцюга дволанцюжкової РНК (мі v21A/v21B) довжиною в 21 основу, впливали дуже сильно інгібуючим чином на експресію гена VEGF в порівнянні з немодифікованими дволанцюжковими РНК (мі v21A/21B і ДЛ v27A/v27B). Модифікована пальмітиновою кислотою ДЛ v27AC16/v27B, особливо, демонструвала помітно більш високий інгібуючий вплив на експресію гена для всіх клітин (клітин HeLa, клітин A549, клітин SH10-TC, клітин Jurkat і клітин K-562) в порівнянні з немодифікованими дволанцюжковими РНК (мі v21A/21B і ДЛ v27A/v27B). Це підтверджувало, що ефекти РНК-інтерференції можна значно поліпшувати за допомогою модифікації дволанцюжкових РНК ліпідами, такими як пальмітинова кислота і т. п. Також аналогічно оцінювали інгібуючий вплив на експресію гена немодифікованих дволанцюжкових РНК і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, що не має генетичної послідовності гомологічної гену VEGF, але жодна з дволанцюжкових РНК не демонструвала якого-небудь значного інгібуючого впливу на ген VEGF. Ці результати показали, що використані в даній роботі дволанцюжкові РНК, направлені проти VEGF, інгібували експресію гена-мішені з високою специфічністю до його послідовності, і також дозволили передбачити, що побічні ефекти для клітин можна зменшувати за допомогою приєднання ліпіду до дволанцюжкових РНК. КОРОТКИЙ ОПИС МАЛЮНКІВ ФІГ. 1 показує структури немодифікованих і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, синтезованих в прикладі 1. ФІГ. 2 показує результати ВЕРХ-аналізу, проведеного на модифікованих ліпідом одноланцюжкових РНК в прикладі 1. ФІГ. 3 показує виміряну в прикладі 1 нуклеазні стійкості дволанцюжкових РНК, модифікованих ліпідом на 5'-кінці. ФІГ. 4 показує аналіз результатів процесингу за допомогою дайсера кожної з модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК в прикладі 1. 17 UA 104131 C2 5 10 15 20 25 ФІГ. 5 показує аналіз результатів ефектів РНК-інтерференції для модифікованої ліпідом 27нт длРНК в концентрації 0,2 нМ в прикладі 1. ФІГ. 6 показує аналіз результатів ефектів РНК-інтерференції для дволанцюжкових РНК, модифікованих ліпідом на 5'-кінці (без використання засобу для перенесення генів) в прикладі 1. ФІГ. 7-1 показує аналіз результатів внутрішньоклітинного накопичення модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК всередині клітин HeLa і A549 в прикладі 1; де "FL" означає зображення, отримані на флуоресцентному мікроскопі; " Trans" означає зображення, отримані на фазово-контрастному мікроскопі в тому ж полі зору, що і зображення FL; і "Merge" означає зображення, в яких суміщали зображення FL і зображення Транс. ФІГ. 7-2 показує аналіз результатів внутрішньоклітинного накопичення модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК всередині клітин SH10-TC і K562 в прикладі 1; де "FL" означає зображення, отримані на флуоресцентному мікроскопі; "Trans" означає зображення, отримані на фазово-контрастному мікроскопі в тому ж полі зору, що і зображення FL; і "Merge" означає зображення, в яких суміщали зображення FL і зображення Trans. ФІГ. 7-3 показує аналіз результатів внутрішньоклітинного накопичення модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК всередині клітин Jurkat і HeLa в прикладі 1; де "FL" означає зображення, отримані на флуоресцентному мікроскопі; "Trans" означає зображення, отримані на фазово-контрастному мікроскопі в тому ж полі зору, що і зображення FL; і "Merge" означає зображення, в яких суміщали зображення FL і зображення Trans. ФІГ. 8 показує структури немодифікованих і модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК, синтезованих в прикладі 2. ФІГ. 9 показує аналіз результатів процесингу за допомогою дайсера кожної з модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК в прикладі 2. ФІГ. 10-1 показує аналіз результатів ефектів РНК-інтерференції модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК на ген VEGF в клітинах HeLa в прикладі 2. ФІГ. 10-2 показує аналіз результатів ефектів РНК-інтерференції модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК на ген VEGF в клітинах A549 і SH10-TC в прикладі 2. ФІГ. 10-3 показує аналіз результатів ефектів РНК-інтерференції модифікованих ліпідом дволанцюжкових РНК на ген VEGF в клітинах Jurkat і K567 в прикладі 2. 30 18 UA 104131 C2 19 UA 104131 C2 20 UA 104131 C2 21 UA 104131 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК, яка містить антисмисловий ланцюг, що має комплементарну послідовності-мішені в гені-мішені нуклеотидну послідовність, і смисловий ланцюг, що має комплементарну антисмисловому ланцюгу нуклеотидну послідовність, причому дволанцюжкова РНК здатна інгібувати експресію гена-мішені, і смисловий ланцюг має ліпід, приєднаний напряму або через лінкер щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів на 5'-кінці, а ліпід являє собою жирну кислоту, що має 6-50 атомів вуглецю. 2. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 1, тупокінцева на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, і тупокінцева, або така, що має виступаючий кінець на 3'-кінцевій стороні смислового ланцюга. 3. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 1, що має виступаючі кінці одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга. 4. Модифікована ліпідом дволапцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-3, в якій смисловий ланцюг складається з 21-27 нуклеотидів. 5. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 2, тупокінцева одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга, і в якій кожен зі смислового і антисмислового ланцюгів складається з 27 нуклеотидів. 6. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 2, тупокінцева одночасно на 5'- і 3'-кінцевих сторонах смислового ланцюга, і в якій кожен зі смислового і антисмислового ланцюгів складається з 23 нуклеотидів. 7. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 2, тупокінцева на 5'-кінцевій стороні смислового ланцюга, причому смисловий ланцюг складається з 25 нуклеотидів, а антисмисловий ланцюг складається з 23 нуклеотидів. 8. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за п. 3, в якій кожен зі смислового і антисмислового ланцюгів складається з 21 нуклеотиду. 9. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-8, в якій ліпід являє собою лауринову кислоту, стеаринову кислоту, міристинову кислоту або пальмітинову кислоту. 10. Модифікована ліпідом дволанцюжкова РНК за будь-яким з пп. 1-9, в якій ліпід приєднаний щонайменше до одного з перших шести нуклеотидів на 5'-кінці смислового ланцюга через лінкер, причому лінкер представлений структурною формулою -NH-(CH2)nl-(L-4), де nl являє собою ціле число від 1 до 40. 11. Фармацевтична композиція, що містить модифіковану ліпідом дволанцюжкову РНК за будьяким з пп. 1-10 і фармацевтично прийнятну основу. 22 UA 104131 C2 12. Фармацевтична композиція за п. 11 для застосування у способі інгібування експресії генамішені. 13. Фармацевтична композиція за п. 12 для застосування у інгібуванні експресії гена-мішені. 23 UA 104131 C2 24 UA 104131 C2 25 UA 104131 C2 26 UA 104131 C2 27 UA 104131 C2 28