Антитіло, що специфічно зв’язується з il-4 і іl-13 та спосіб лікування астми у ссавця за допомогою такого антитіла

Реферат: Винахід належить до біспецифічного антитіла, яке специфічно зв'язуються з IL-4 і IL-13. Винахід також належить до фармацевтичної композиції, яка містить дане антитіло, способів лікування за допомогою даного антитіла, молекули нуклеїнової кислоти, вектора та клітини-хазяїна. UA 104130 C2 (12) UA 104130 C2 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід належить до нових антитіл анти-IL-4, антитіл анти-IL-13 і біспецифічних антитіл анти-IL-4/анти-IL-13 і до їх застосування для поліпшення стану, лікування або профілактики захворювань або розладів у ссавців, включаючи людину, викликаних аномальною активністю або аномальним метаболізмом IL-4 і (або) IL-13. Розглянуте антитіло може блокувати зв'язування і (або) передачу сигналу ліганду, наприклад IL-4 або IL-13, з рецептором або комплексом рецептора, наприклад IL-4Rα, IL-4Rα1 і IL-4Rα2. Розкривається інформація про профілактичні, імунодіагностичні і діагностичні препарати, що містять розглянуті антитіла, і їх застосування в межах методів профілактики або лікування таких захворювань ссавців, включаючи людину, що викликані аномальним метаболізмом і (або) активністю лімфоїдних і нелімфоїдних клітин, включаючи моноцити, фібробласти і ендотеліальні клітини. До таких захворювань належать аутоімунні хвороби, а також хвороби, викликані або такі, що характеризуються запальними процесами, наприклад алергійна астма і дерматит. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Інтерлейкін-4 (IL-4) є плейотропним цитокіном, що має широкий спектр біологічних впливів на лімфоїдні В- і Т-клітини, а також багато нелімфоїдних клітин, у тому числі моноцити, ендотеліальні клітини і фібробласти. Наприклад, IL-4 стимулює проліферацію декількох ліній клітин, залежних від IL-2 і IL-3, індукує експресію молекул II класу головного комплексу гістосумісності в дрімаючих В-клітинах і підсилює секрецію IgG4 і IgE В-клітинами людини. IL-4 пов'язаний з імунною відповіддю Th2-типу і продукується Th2-клітинами, а також стимулює їхню диференціацію. Передбачається, що IL-4 проявляється в ряді таких захворювань, як алергія й астма. Нещодавно був ідентифікований цитокін IL-13 (Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250, і McKenzie, A. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739), що містить 112 амінокислот, що виділяється активованими Т-лімфоцитами, В-лімфоцитами, а також мастоцитами, після їх активації. На підставі своїх різноманітних біологічних властивостей, подібних з IL-4, IL-13 був віднесений до IL-4-подібних цитокінів. Його функції, дійсно, схожі на функції IL-4 у відношенні Вклітин (Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143, Punnonen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734, Fior, R. et al., Eur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600), моноцитів (Muzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743, De Waal Malefyt, R. et al., J. Immunol, 1993, 151, 6370-6381, Doyle, A. et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445, Montaner, L. J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747, Sozzani, P. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088) і інших негематопоетичних клітин (Herbert, J. M. et al., Febs Lett., 1993, 328, 268-270, і Derocq, J. M. et al., Febs Lett. 1994, 343, 32-36). З іншого боку, на відміну від IL-4 він не робить специфічного впливу на дрімаючі або активовані Т-клітини (Zurawuki, G. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 1926). Різні прояви біологічної активності IL-13 у відношенні моноцитів/макрофагів, В-лімфоцитів і визначених гематопоетичних попередників докладно описані в роботах A. J. Minty, а також в оглядах з IL-13. Крім того, ряд даних свідчить про те, що даний цитокін робить плейотропний ефект на клітини інших типів. До таких негематопоетичних клітин, на які IL-13 робить прямий вплив, належать ендотеліальні і мікрогліальні клітини, кератиноцити, а також клітини карциноми нирок і товстої кишки. Один з етапів аналізу сигналу, переданого біологічною молекулою всередині клітини, передбачає ідентифікацію її мембранного рецептора. Дослідження, проведені в цих цілях для рецептора IL-13, показали, що IL-13 і IL-4 мають загальний рецептор або принаймні деякі з компонентів загального рецепторного комплексу, а також загальні елементи ланцюга передачі сигналу (Zurawski S. M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670, Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218, Vita, N. et al., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517, Lefort, S. et al., Febs Lett., 1995, 366, 122-126). Даний рецептор присутній на поверхні різних видів клітин у різних кількостях залежно від розглянутого типу клітини. Порівняльний розподіл рецепторів IL-13 і IL-4 розглядалося в роботах A. J. Minty (Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease. Eds D. G. Remick and J. S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996). Рецептори клітинної поверхні і рецепторні комплекси зв'язують IL-4 і/або IL-13 з різною афінністю. До основних компонентів рецепторів і рецепторних комплексів, що зв'язують IL-4 і/або IL-13, належать IL-4Rα, IL-4Rα1 і IL-4Rα2. Ці ланцюги експресуються на поверхні клітин як мономери або гетеродимери IL-4Rα/IL-4Rα1 (II тип IL-4R) або IL-4Rα/γc (I тип IL-4R). Мономер IL-4Rα і гетеродимер IL-4Rα/γc зв'язують IL-4, але не зв'язують IL-13. Мономери IL-4Rα1 і IL4Rα2 зв'язують IL-13, але не зв'язують IL-4. Гетеродимер IL-4Rα/IL-4Rα1 зв'язує і IL-4, і IL-13 (Murata et al., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20). 1 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Імунні відповіді Th2-типу стимулюють продукцію антитіл і гуморальний імунітет і розвиваються для протидії позаклітинним патогенам. Клітини Th2 є медіаторами продукції Ig (гуморальний імунітет) і продукують IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 і IL-13 (Tanaka, et, al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251-272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)). Імунні відповіді Th2-типу характеризуються генерацією визначених цитокінів (наприклад IL-4, IL13) і специфічних типів антитіл (IgE, IgG4) і типові для алергійних реакцій, результатом яких можуть стати сльозаві очі й астматичні симптоми, наприклад запалення дихальних шляхів і скорочення м'язових клітин дихальних шляхів у легенях. І IL-4, і IL-13 є терапевтично важливими цитокінами, що визначається їх біологічними функціями, і відіграють важливу роль у багатьох захворюваннях, у тому числі при астмі (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo. 5, 161-166). Було показано, що IL-4 здатні інгібувати аутоімунні захворювання, і продемонстровано, що IL-4 і IL-13 мають потенціал підсилювати протипухлинну імунну відповідь. Оскільки обидва цитокіни задіяні в патогенезі алергійних захворювань, інгібітори таких цитокінів можуть мати позитивний терапевтичний ефект. Тому існує потреба в удосконалених агентах, що інгібують IL-4, інгібують IL-13, а також агентах, що інгібують і IL-4, і IL-13. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ У даному винаході пропонуються нові гуманізовані моноклональні і біспецифічні антитіла, а також їхні фрагменти і похідні, що специфічним чином зв'язуються з IL-4 і (або) IL-13. Деякі з моно- або біспецифічних антитіл анти-IL-4 і (або) IL-13 і їхні фрагменти можуть бути змінені, для того щоб перешкодити утворенню внутрішньоланцюжкового дисульфідного зв'язку, що призводить до утворення молекули, яка зберігає стабільність у процесі одержання і використання in vivo. Антитіла за даним винаходом нейтралізують активність IL-4 і (або) IL-13 у біологічних аналізах, що описані в даному документі. Винахід включає амінокислотні послідовності варіабельного важкого і легкого ланцюга антитіл і відповідні їм послідовності нуклеїнових кислот. Інший приклад здійснення даного винаходу включає клітинні лінії і вектори, що містять послідовності антитіл даного винаходу. Ще один приклад здійснення даного винаходу припускає використання антитіл для приготування фармацевтичного препарату для лікування захворювань і порушень, пов'язаних з функцією і метаболізмом IL-4 і (або) IL-13. Зокрема, даний винахід належить до лікування раку, аутоімунних захворювань і хвороб, викликаних або таких, що характеризуються запальними процесами, наприклад алергійної астми і дерматиту. Додаткові особливості і переваги описані в даному документі і будуть очевидні з наведеного нижче повного опису винаходу і фігур. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На фіг. 1 представлене схематичне зображення молекули біспецифічного антитіла анти-IL4/IL-13, що містить чотири поліпептидні ланцюги. Два більш легкі ланцюги містять N-VLhB-B13лінкер-VLh8D4-8-CL-C (CL, константна область легкого ланцюга), два більш важкі ланцюги містять N-VHhB-B13-лінкер-VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C. Лінкерна послідовність (G4S)2 представлена GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:6). На фіг. 2 наводяться амінокислотні послідовності гуманізованих варіабельних доменів антитіла B-B13 анти-IL-13 (SEQ ID NO:1 і 2) і гуманізованих варіабельних доменів антитіла 8D48 анти-IL-4 (SEQ ID NO:3, 4 і 5). Підкресленням виділені внесені зміни в амінокислотну послідовність. Напівжирним шрифтом виділена CDR. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід не обмежується конкретною методологією, протоколами, клітинними лініями, векторами або реагентами, описаними в даному документі, оскільки їх можна змінювати, не торкаючись при цьому основної ідеї й охоплення винаходу. Далі, використовувана в даному документі термінологія призначена винятково для опису конкретних здійснень і не має на увазі обмеження сфери охоплення даного винаходу. Якщо не вказане інше, усі технічні і наукові терміни і скорочення, використовувані в даному документі, мають таке саме значення, що загальновідоме рядовим фахівцям у даній галузі, до якої належить даний винахід. Будь-які методи і матеріали, аналогічні або ідентичні описаним у даному документі, можуть використовуватися в практичному застосуванні даного винаходу, і нижче наводиться опис тільки прикладів методів, пристроїв і матеріалів. Усі публікації і патенти, що згадуються в даному документі, включаються в даний документ у силу посилання на них для цілей опису і розкриття білків, що наводяться в ньому, ферментів, векторів, клітин-хазяїнів і методологій, що можуть використовуватися в поєднанні з даним винаходом і в ньому. Разом з тим, ніякі положення даного документа не слід тлумачити як 2 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визнання того, що даний винахід не має права на більш ранній пріоритет на підставі попереднього винаходу. Перед описом формулювань і додатків способів, пов'язаних з IL-4 і (або) IL-13, і розглянутих продуктів для відома фахівців нижче наводяться визначення деяких термінів і словосполучень. Термін "інтерлейкін-4" (IL-4) належить до існуючого в природі або ендогенних білків ссавців IL-4, а також до білків, що мають амінокислотну послідовність, яка співпадає з існуючим у природі або відповідним ендогенним білком ссавців IL-4 (наприклад рекомбінантні білки, синтетичні білки (тобто отримані з використанням методів синтетичної органічної хімії)). Відповідно, як вказано в даному документі, термін включає зрілий білок IL-4, поліморфні або алельні варіанти, а також інші ізоформи IL-4 і модифіковані або немодифіковані форми згаданого вище (наприклад ліпідні, глікозильовані). Існуючі в природі або ендогенні IL-4 включають зрілі білки, наприклад нативний IL-4, поліморфні або алельні варіанти, а також інші ізоформи і мутантні форми, що присутні в природних умовах в організмі ссавців (наприклад, людини, нелюдиноподібні примати). Такі білки можуть витягатися або виділятися з джерела, що у природних умовах продукує, наприклад, IL-4. Такі білки і білки, що мають амінокислотну послідовність, що співпадає з існуючим у природі або відповідним ендогенним IL-4, визначають за назвою відповідного ссавця. Наприклад, якщо відповідним ссавцем є людина, білок позначають як IL-4 людини. Фахівцям у даній галузі відомі кілька мутантних білків IL-4, наприклад, описаних у заявці WO 03/038041. Термін "інтерлейкін-13" (IL-13) належить до існуючого в природі або ендогенних білків ссавців IL-13, а також до білків, що мають амінокислотну послідовність, що співпадає з існуючим у природі або відповідним ендогенним білком ссавців IL13 (наприклад, рекомбінантні білки, синтетичні білки (тобто отримані з використанням методів синтетичної органічної хімії)). Відповідно, як визначено в даному документі, термін включає зрілий білок IL-13, поліморфні або алельні варіанти, а також інші ізоформи IL-13 (наприклад, отримані методом альтернативного сплайсинга або за допомогою інших клітинних процесів) і модифіковані або немодифіковані форми згаданого вище (наприклад, ліпідні, глікозильовані). Існуючі в природі або ендогенні IL-13 включають зрілі білки, наприклад зрілий IL-13, поліморфні або алельні варіанти, а також інші ізоформи і мутантні форми, що присутні в природних умовах в організмі ссавців (наприклад людина, нелюдиноподібні примати). Наприклад, використовуваний тут IL-13 включає варіант IL13 людини, в якому Arg у позиції 110 зрілого IL-13 людини заміщується на Gin (позиція 110 зрілого IL-13 відповідає позиції 130 білка попередника), що асоціюється з астмою (атопічною і неатопічною астмою) і іншими варіантами IL-13. (Heinzmann el al, Hum Mo Genet. 9:549-559 (2000).) Такі білки можуть виділятися або виділятися з джерела, що у природних умовах продукує, наприклад, IL-13. Такі білки і білки, які мають амінокислотну послідовність, що співпадає з існуючим у природі або відповідним ендогенним IL-13, визначають за назвою відповідного ссавця. Наприклад, якщо відповідним ссавцем є людина, білок позначають як IL-13 людини. Фахівцям у даній галузі відомі кілька мутантних білків IL-13, наприклад, описаних у заявці WO 03/035847. Термін "власне кажучи ідентичні" відносно послідовності поліпептидного ланцюга антитіла може інтерпретуватися як ідентичність принаймні на 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або більше послідовності ланцюга антитіла і поліпептидної послідовності, що зіставляється. Той самий термін відносно послідовності нуклеїнової кислоти може інтерпретуватися як послідовність нуклеотидів, що виявляє ідентичність принаймні на 85 %, 90 %, 95 %, 97 % або більше послідовності відносно послідовності, що зіставляється, нуклеїнової кислоти. Терміни "ідентичність" або "гомологія" можуть означати відсоток основ нуклеотидів або амінокислотних залишків у послідовності кандидата, що ідентичні залишку відповідної послідовності, з яким вона порівнюється, після зіставлення послідовностей і введення пропусків, якщо необхідно, для забезпечення максимального відсотка ідентичності по всій послідовності і без урахування будь-яких консервативних заміщень у межах ідентичності послідовності. Ні N-кінцеві або C-кінцеві подовжувальні сегменти, ні вставки не слід розглядати як такі, що зменшують ідентичність або гомологію. Методи і комп'ютерні програми для зіставлення доступні і відомі фахівцям у даній галузі. Ідентичність послідовності може оцінюватися за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовностей. Словосполучення і терміни "функціональний фрагмент, варіант, похідне або аналог" і їм подібні, а також їхні форми, застосовувані у відношенні антитіла або антигену, описують сполуку або молекулу, що має якісну біологічну активність, властиву розглянутому антитілу або повнорозмірному антигену. Наприклад, функціональний фрагмент або аналог антитіла анти-IL-4 може зв'язуватися з молекулою IL-4 або з молекулою, що може перешкоджати або суттєво знижувати здатність ліганду або агоніста чи антагоністичного антитіла, зв'язуватися з IL-4. 3 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Субституційними" варіантами називають такі, де принаймні один амінокислотний залишок у нативній послідовності вилучений і замінений іншою амінокислотою, введеною на його місце в тому ж положенні. Заміщення можуть бути одиночними, при яких замінюється тільки одна амінокислота в молекулі, або множинними, якщо в одній і тій самій молекулі заміщаються дві або більше амінокислоти. Множинні заміщення можуть проводитися в послідовних сайтах. Крім того, одна амінокислота може заміщуватися декількома залишками, такий варіант містить як заміщення, так і вставки. "Інсерційними" варіантами називають такі, де одна або декілька амінокислот були введені таким чином, що виявилися безпосередньо сусідніми з тією або іншою амінокислотою в конкретному положенні нативної послідовності. Під безпосередньо сусідньою з тією або іншою амінокислотою розуміється амінокислота, зв'язана з αкарбоксильною або α-амінною функціональною групою амінокислоти. "Делеційними" варіантами називають такі, де вилучена одна або декілька амінокислот з нативної амінокислотної послідовності. Зазвичай в делеційних варіантах видаляють одну або дві амінокислоти в конкретній області молекули. Термін "антитіло" використовується в найбільш широкому змісті і, зокрема, включає моноклональні антитіла (включаючи повнорозмірні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), фрагменти антитіл або синтетичні поліпептиди, що містять одну або більше послідовностей CDR або похідних від CDR, за умови, що поліпептиди виявляють бажану біологічну активність. Антитіла (Ab) і імуноглобуліни (Ig) належать до глікопротеїнів, що має однакові структурні особливості. Як правило, антитіла розглядають як Ig з визначеною або розпізнаваною специфічністю. Таким чином, антитіла виявляють специфічність зв'язування з конкретною мішенню, тоді як до імуноглобулінів належать і антитіла, і інші подібні до антитіл молекули, що не мають специфічності до мішені. Антитіла за даним винаходом можуть належати до будь-якого класу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA і т.п.) або підкласу (наприклад, IgG 1, IgG2, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 і т.п.) (терміни "тип" і "клас", а також "підтип" і "підклас" рівнозначно використовуються у даному документі). Нативні або немутантні, тобто отримані від представника популяції без штучних маніпуляцій антитіла й імуноглобуліни зазвичай являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною вагою приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох однакових легких ланцюгів (L) і двох однакових важких ланцюгів (H). Кожен важкий ланцюг має на кінці варіабельний домен (VH), за яким іде декілька константних доменів. Кожен легкий ланцюг має на кінці варіабельний домен (VL), а на іншому кінці - константний домен. Під виразом "без штучних маніпуляцій" розуміють відсутність обробки, після якого елементи містять або експресують чужорідну антиген-зв'язувальну молекулу. Визначення "нативний" може належати до найбільш переважної алелі або видів, що реєструються у популяції, або до антитіла, отриманого від тварини без маніпуляцій, у зіставленні з алеллю або поліморфізмом, або варіантом, або похідним, отриманим за рахунок тієї або іншої форми маніпуляцій, наприклад мутагенезу, застосування рекомбінантних методик і т.п. для зміни амінокислоти антиген-зв'язувальної молекули. Використовуваний у даному документі термін "антитіло анти-IL-4" означає антитіло або поліпептид, отриманий від нього (похідне), що специфічно зв'язуються з IL-4 відповідно до визначення даного документа, у тому числі, серед інших, молекули, що інгібують або суттєво знижують рівень зв'язування IL-4 з його рецептором або інгібують активність IL-4. Використовуваний у даному документі термін "антитіло анти-IL-13" означає антитіло або поліпептид, отриманий від нього (похідне), що специфічно зв'язуються з IL-13 відповідно до визначення даного документа, у тому числі, серед інших, молекули, що інгібують або суттєво знижують рівень зв'язування IL-13 з його рецептором або інгібують активність IL-13. Термін "варіабельний" у контексті варіабельного домену антитіл належить до визначених частин відповідної молекули, що значною мірою відрізняються своєю послідовністю від антитіл і використовуються для специфічного розпізнавання і зв'язування конкретного антитіла з його визначеною мішенню. При цьому варіабельність нерівномірно розподіляється за варіабельними доменами антитіл. Варіабельність зосереджується в трьох сегментах, що називаються визначаючими комплементарність областями (CDR; тобто CDR1, CDR2 і CDR3), також відомими як гіперваріабельні ділянки, що знаходяться у варіабельних доменах як легкого, так і важкого ланцюга. Області варіабельних доменів з більш високими рівнями збереження називають остовними областями (FR) або послідовностями. Варіабельні домени нативних важких і легких ланцюгів містять по чотирьох області FR, значною мірою мають конформацію βлиста і зв'язані трьома CDR, що утворюють петлі, які з'єднують, а в деяких випадках і утворюють, частину структури β-листа. CDR у кожному ланцюзі часто містяться поблизу один від одного областями FR, і разом з CDR іншого ланцюга сприяють формуванню шуканого 4 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (епітопа або детермінанта) сайту зв'язування антитіл (див., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Якщо не вказано інакше, використовувана в даному документі нумерація амінокислотних залишків імуноглобуліну виробляється відповідно до системи нумерації амінокислотних залишків імуноглобуліну з роботи Kabat et al. Одна CDR може мати здатність специфічно зв'язувати когнатний епітоп. Термін "шарнір", або "шарнірна область", використовуваний у даному винаході, належить до гнучкого поліпептиду, що містить амінокислоти між першим і другим константними доменами антитіла. Визначення "фрагмент антитіла" належить до частини інтактного або повного ланцюга або антитіла, як правило, області зв'язування мішені або варіабельної області. До прикладів фрагментів антитіла, серед інших, належать фрагменти Fab, Fab', F(ab')2 і Fv. "Функціональним фрагментом" або "аналогом антитіла анти-IL-4 і (або) IL-13" називають такий фрагмент, що може перешкоджати здатності рецептора, або суттєво знижувати таку здатність, зв'язуватися з лігандом або ініціювати сигнал. Використовуваний у даному документі термін "функціональний фрагмент" є синонімом терміна "фрагмент антитіла" і при вживанні у відношенні антитіл може належати до таких фрагментів, як Fv, Fab, F(ab')2 і т.п., що здатні перешкоджати здатності рецептора, або суттєво знижувати таку здатність, зв'язуватися з лігандом або ініціювати сигнал. Фрагмент "Fv" складається з димеру варіабельного домену з одним важким і одним легким ланцюгом, утвореного за допомогою нековалентної асоціації (димер VH-VL). У такій конфігурації три CDR кожного варіабельного домену взаємодіють, формуючи шуканий сайт зв'язування на поверхні димеру VH-VL, так само як в інтактному антитілі. У сукупності такі шість CDR забезпечують специфічність зв'язування мішені на інтактному антитілі. При цьому навіть одиничний варіабельний домен (або половина F v, що містить всього три CDR, специфічні до мішені) може мати здатність розпізнавати і зв'язувати мішень. "Одноланцюжкові Fv", фрагменти антитіл "sFv" або "scAb" включають домени антитіла VH і VL, причому ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюзі. Як правило, поліпептид F v додатково містить поліпептидний лінкер, часто гнучку молекулу, між доменами V H і VL, що дозволяє sFv утворити потрібну структуру для зв'язування мішені. Термін "діатіла" належить до фрагментів антитіл із двома антиген-зв'язувальними сайтами, якісь фрагменти можуть включати варіабельний домен важкого ланцюга (V H), зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) у тому ж поліпептидному ланцюзі. За рахунок використання лінкера, що занадто короткий, щоб забезпечувати об'єднання двох варіабельних доменів одного і того ж ланцюга, домени діатіл змушені поєднуватися з доменами зв'язування іншого ланцюга для формування двох антиген-зв'язуючих сайтів. Фрагмент Fab містить варіабельні і константні домени легкого ланцюга і варіабельний і перший константний домен (CH1) важкого ланцюга. Фрагменти Fab' відрізняються від фрагментів Fab додаванням декількох залишків у карбоксильному кінцевому закінченні домену CH1, так щоб він містив один або декілька цистеїнів із шарнірної області антитіла. Фрагменти F ab' можуть бути отримані розщепленням дисульфідного зв'язку в цистеїнах шарнірної області продукту руйнування пепсином F(ab')2. Додаткова ферментативна і хімічна обробка антитіл може призводити до утворення інших функціональних фрагментів, що представляють інтерес. Термін "лінійний Fab" належить до чотиривалентного антитіла, відповідно до опису в Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861. "Лінійний Fab" складається з тандема однакових доменів CH1-VH, з'єднаних однаковим легким ланцюгом у кожному положенні CH1-VH. Подібні молекули створювалися для того, щоб підвищити валентність антитіла з метою поліпшення його функціональної афінності за рахунок ефекту авідності, але вони є моноспецифічними. Термін "біспецифічні антитіла (BsAb)" належить до молекул, що поєднують антигенізв'язуючі сайти двох антитіл в одній молекулі. Так, біспецифічне антитіло здатне зв'язувати два різні антигени одночасно. Крім діагностичних додатків, BsAb відкривають дорогу новим терапевтичним застосуванням за рахунок переорієнтації потужної ефекторної системи на уражені хворобою області або за рахунок підвищення нейтралізуючої або стимулюючої функції антитіл. У ході перших спроб сполучення специфічності зв'язування двох повних антитіл проти різних антигенів-мішеней у лікувальних цілях використовувалися хімічно злиті гетерокон'юговані молекули (Staerz et al.(1985), Nature 314: 628-631). Біспецифічні антитіла продукувалися з вихідних гібридом за допомогою гетерогібридомних методик, і in vitro були продемонстровані властивості, подібні до тих, що спостерігаються для гетерокон'югатів (Milstein & Cuello (1983) Nature 305:537-540). Незважаючи на багатообіцяючі результати, отримані за допомогою гетерокон'югатів або біспецифічних антитіл, продукованих у результаті, як згадувалося вище, злиття клітин, ряд 5 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 факторів робить їх непридатними для широкомасштабних терапевтичних додатків. До таких факторів належать: швидке виведення гетерокон'югатів in vivo, трудомісткі методики, необхідні для одержання кожної з форм молекули, потреба в ретельному очищенні гетерокон'югатів від гомокон'югатів або моноспецифічних антитіл і характерні низькі виходи. Генна інженерія всі частіше використовувалася для конструювання, модифікації і продукції антитіл або похідних антитіл з бажаним набором властивостей зв'язування і ефекторних функцій. Була розроблена множина рекомбінантних методик для ефективної продукції BsAb, в обох випадках як фрагментів антитіла (Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4:463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3:83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:47-66) і повнорозмірні формати IgG (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15). Об'єднання двох різних scFv призводить до форматів BsAb з мінімальною молекулярною масою, що називають sc-BsAb або Ta-scFv (Mack et al. (1995), Proc. Acad. Sci. USA. 92:70217025; Mallender et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:199-206). BsAb конструювалися за допомогою генетичного злиття двох scFv за рахунок забезпечуючої димеризацію функціональності, наприклад лейцинової застібки (Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-53; de Kruif et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:7630-4). Як згадувалося вище, діатілами називають невеликі фрагменти бівалентних і біспецифічних антитіл. Фрагменти включають VH, зв'язаний з VL одного і того ж поліпептидного ланцюга за рахунок лінкера, що має занадто малу довжину (менше 12 амінокислот), щоб забезпечувати можливість зв'язування між двома доменами на одному і тому ж ланцюзі. Домени змушені міжмолекулярно поєднуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга для формування двох антиген-зв'язуючих сайтів. Такі димерні фрагменти антитіл, або "діатіла", є бівалентними і біспецифічними. (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448). Діатіла мають розмір, близький до фрагмента Fab. Поліпептидні ланцюги доменів VH і VL, зв'язані лінкером між 3 і 12 амінокислотами, утворюють в основному димери (діатіла), тоді як у випадку лінкера між 0 і 2 амінокислотними залишками переважними виявляються тримери (триатіла) і тетрамери (тетратіла). Крім довжини лінкера, точна модель олігомеризації очевидно залежить від сполуки, а також від орієнтації V-доменів (Hudson et al. (1999), J Immunol Methods 231: 177189). Передбачуваність кінцевої структури молекул діатіл винятково низька. Незважаючи на те, що sc-BsAb і конструкції на основі діатіл мають цікавий клінічний потенціал, було показано, що такі нековалентно асоційовані молекули недостатньо стабільні у фізіологічних умовах. Загальна стабільність фрагмента scFv залежить від внутрішньої стабільності доменів VL і VH, а також від стабільності доменного інтерфейсу. Недостатня стабільність інтерфейсу VH-VL фрагментів scFv часто вказувалася серед основних причин необоротної інактивації scFv, оскільки проміжне розкриття інтерфейсу, що допускає пептидний лінкер, відкриває доступ до гідрофобних ділянок, що сприяють агрегуванню, а тому визначає нестабільність і низький вихід продукції (Worn and Pluckthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010). Альтернативний метод приготування біспецифічних бівалентних антиген-зв'язуючих білків з доменів VH і VL наводиться в патенті US 5989830. Такі фрагменти антитіла з двома голівками одержують експресією двоцистронного вектора, що кодує два поліпептидні ланцюги, причому один поліпептидний ланцюг двічі містить VH у послідовності з пептидним лінкером (VH1-лінкерVH2), а інший поліпептидний ланцюг містить комплементарні домени VL, з'єднані в послідовність пептидним лінкером (VL1-лінкер-VL2). У патенті US 5989830 було показано, що лінкер повинен складатися принаймні з 10 амінокислотних залишків. Полівалентні білкові комплекси (PPC) зі зростаючою валентністю описані в патенті US 2005/0003403 A1. PPC містять два поліпептидні ланцюги, що зазвичай розташовуються латерально по відношенню один до одного. Кожен поліпептидний ланцюг зазвичай включає 3 або 4 "v-області", що містять амінокислотні послідовності, які здатні утворити сайт зв'язування антигену при зіставленні з відповідною v-областю на протилежному поліпептидному ланцюзі. На кожному поліпептидному ланцюзі може бути задіяно до приблизно 6 "v-областей". V-області кожного поліпептидного ланцюга зв'язані лінійно одна з одною і можуть з'єднуватися лінкерними областями, що перемежовуються. При організації у формі PPC v-області на кожному поліпептидному ланцюзі утворюють індивідуальні сайти зв'язування антигену. Комплекс може містити одну або декілька зв'язуючих специфічностей. Разом з тим при використанні таких молекул була продемонстрована схильність до агрегування, нестабільність і низький вихід експресії (Wu et al. (2001) Prot. Eng. 14: 1025-1033). Усі ці характерні проблеми стабільності, що можуть спостерігатися при експресії одноланцюжкових антитіл. (Wörn and Plückthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010). 6 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Тому метою даного винаходу є одержання біспецифічного полівалентного антитіла, за допомогою якого можна уникнути утворення агрегатів. Крім того, воно повинне мати стабільність, що визначає його придатність для використання в лікувальних цілях. Використовуваний у даному документі термін "моноклональне антитіло" належить до антитіла, отриманого з популяції значною мірою однорідних антитіл, тобто окремі антитіла, що утворюють популяцію, ідентичні, якщо не враховувати можливі природні мутації, що можуть бути присутніми у незначних кількостях. У даному випадку до моноклональних антитіл, зокрема, належать "химерні" антитіла, в яких частина важкого і (або) легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманим від конкретних видів або приналежних до визначеного класу або підкласу (типу або підтипу) антитіл, при цьому інший ланцюг (ланцюги) ідентичний або гомологічний відповідним послідовностям в антитілах, отриманих від інших видів або приналежних іншому класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови що вони виявляють бажану біологічну активність при зв'язуванні з IL-4 і (або) IL-13 або впливі на активність або метаболізм IL-4 і (або) IL-13 (патент США № 4816567; і Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)). Тому CDR одного класу антитіл можуть бути введені в FR антитіла іншого класу або підкласу. Моноклональні антитіла мають високу специфічність, вони орієнтовані на єдиний сайтмішень, епітоп або детермінант. Крім того, на відміну від звичайних (поліклональних) препаратів антитіл, що, як правило, містять різні антитіла, орієнтовані проти різних детермінантів (епітопів) антигену, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти єдиного детермінанта в мішені. На додаток до специфічності, перевага моноклональних антитіл полягає в тому, що вони продукуються клітиною-хазяїном без домішок інших імуноглобулінів, що забезпечує клонування відповідного гена і мРНК, що кодує антитіло його ланцюгів. Модифікатор "моноклональне" вказує на характеристику антитіла, що було отримане зі значною мірою однорідної популяції антитіл, і не повинний інтерпретуватися як потребуючий продукції антитіла будь-яким конкретним методом. Наприклад, моноклональні антитіла для використання в даному винаході можуть бути виділені з фаг-бібліотеки антитіл за допомогою добре відомих методик або ж можуть виділятися з поліклонального препарату. Вихідні моноклональні антитіла для використання відповідно до даного винаходу можуть бути приготовлені за допомогою гібридомного методу, описаного в Kohler et al., Nature 256:495 (1975), або можуть бути отримані рекомбінантними методами, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Термін "полівалентне антитіло", використовуваний у даному винаході, належить до антитіла, що містить два і більше сайтів зв'язування антигену, і тому здатне одночасно зв'язувати два або більше антигени, що мають однакову або різну структуру. Термін "бівалентне" означає, що антитіло містить два антиген-зв'язуючі сайти. Термін "тетравалентне" означає, що антитіло містить чотири антиген-зв'язуючі сайти. Термін "антиген-зв'язувальний сайт", що використовується в даному винаході, належить до частини антитіла, що містить область, яка специфічно зв'язує частину антигену або повний антиген і комплементарну частині антигену або повному антигену. У випадку великого за величиною антигену антитіло може зв'язуватися лише з визначеною його частиною, і таку частину називають епітопом. Антиген-зв'язувальний домен може забезпечуватися одним або декількома варіабельними доменами антитіла. Переважно, щоб антиген-зв'язувальний домен був утворений за рахунок зв'язування варіабельного домену легкого ланцюга антитіла (VL) і варіабельного домену важкого ланцюга антитіла (VH). Використовуваний у даному винаході термін "антиген" належить до молекули або частини молекули, що здатні зв'язуватися з антитілами даного винаходу. Антиген може містити один або декілька епітопів. До прикладів антигенів, розпізнаваних антитілами даного винаходу, серед інших, належать білки сироватки, наприклад цитокіни, такі як IL-4, IL5, IL9 і IL-13, біологічно активні пептиди, молекули клітинної поверхні, наприклад рецептори, переносники, іонні канали, вірусні і бактеріальні білки. Використовуваний у даному винаході термін "моноспецифічний" означає, що полівалентне антитіло даного винаходу розпізнає тільки один антиген, причому всі антиген-зв'язуючі сайти є ідентичними. Використовуваний у даному винаході термін "біспецифічний" означає, що полівалентне антитіло даного винаходу розпізнає два різні епітопи на тому самому антигені або двох різних антигенах. Використовуваний у даному винаході термін "мультиспецифічний" означає, що полівалентне антитіло даного винаходу розпізнає множину різних епітопів на тому самому антигені або множині різних антигенів. 7 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовуваний у даному винаході термін "лінкер" означає пептид, пристосований для сполуки варіабельних доменів конструкцій антитіл даного винаходу. Пептидний лінкер може містити будь-які амінокислоти, при цьому перевага віддається амінокислотам гліцину (G) і серину (S). Лінкери, що з'єднують поліпептид важкого ланцюга і поліпептид легкого ланцюга і всередині цих ланцюгів, можуть бути однаковими або відрізнятися один від одного. Крім того, лінкер може мати довжину 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот. Переважним пептидним лінкером для доменів важкого ланцюга, а також для доменів легкого ланцюга є GGGGS. Кількість лінкерних одиниць у важкому ланцюзі й у легкому ланцюзі може бути однаковою (симетричний порядок) або відрізнятися одна від одної (асиметричний порядок). Пептидний лінкер переважно є достатньо довгим, щоб забезпечувати належний ступінь гнучкості, що виключає вплив функціональних областей антитіла на активність один одного, наприклад, через стеричні ускладнення, щоб давати можливість для належного згортання білка, а також, за необхідності, дозволяти молекулам антитіла взаємодіяти з двома або більше, можливо, просторово вилученими один від одного рецепторами на поверхні однієї і тієї ж клітини; разом з тим, він повинен переважно бути достатньо коротким, щоб гарантувати стабільність функціональних областей антитіла всередині клітини. Тому довжина, сполука і/або конформація пептидних лінкерів може з легкістю варіюватися фахівцями в даній галузі, для того щоб оптимізувати бажані властивості полівалентного антитіла. У порівнянні з антитілом людини "гуманізовані" форми нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл являють собою химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їхні фрагменти (наприклад, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 або інших зв'язуючих мішень підпослідовностей антитіл), що містять послідовності, похідні від нелюдського імуноглобуліну. Як правило, гуманізоване антитіло буде включати власне кажучи всю послідовність одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, в яких всі або власне кажучи всі області CDR відповідають областям нелюдського імуноглобуліну, і всі або власне кажучи всі області FR являють собою матричну послідовність імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло може також включати принаймні частину константної області імуноглобуліну (Fc), як правило, вибраної матричної послідовності імуноглобуліну людини. Як правило, основною метою є одержання молекули антитіла, що мінімально імуногенна для людини. Тому існує можливість також замінити одну або декілька амінокислот в одній або декількох CDR на такі, які будуть менш імуногенні для організмухазяїна людини, суттєво не знижуючи специфічну функцію зв'язування однієї або декількох CDR з IL-4 і (або) IL-13. Як альтернативу можна використовувати нелюдську FR, але в ній найбільш імуногенні амінокислоти замінюються на менш імуногенні. Разом з тим вбудовування, що вище обговорювалося, у CDR не є єдиним методом одержання гуманізованого антитіла. Наприклад, модифікації одних тільки областей CDR може бути недостатньо, оскільки досить часто остовні залишки можуть відігравати важливу роль у визначенні тримірної структури петель CDR і загальної афінності антитіла до свого ліганду. Тому можуть застосовуватися будь-які способи модифікації молекули нелюдського вихідного антитіла, так щоб бути менш імуногенною для людини, і повна ідентичність з антитілом людини не завжди є обов'язковою. Отже, гуманізація може також досягатися, наприклад, простим заміщенням усього лише декількох залишків, зокрема, тих, які знаходяться на поверхні молекули антитіла і не сховані всередині її структури, а тому не є легко доступними для імунної системи хазяїна. Подібний спосіб запропонований у даному документі у відношенні заміщення "мобільних" або "гнучких" залишків молекули антитіла, при цьому мета полягає в тім, щоб зменшити або пригнітити імуногенність молекули, що виходить, не впливаючи на специфічність антитіла у відношенні епітопа або детермінанта. Див., наприклад, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 і патент США № 5869619. Пропонований спосіб гуманізації заснований на впливі гнучкості молекули антитіла в процесі і у момент імунного розпізнавання. Гнучкість білка пов'язана з молекулярним рухом його молекули. Під гнучкістю білка розуміють здатність усього білка, частини білка або окремо взятого амінокислотного залишку формувати ансамбль конформацій, що значною мірою відрізняються один від одного. Дані про гнучкість білка можна одержати за результатами експериментів рентгенівської кристалографії (див., наприклад, Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723–732.), ядерного магнітного резонансу (див., наприклад, Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923) або за результатами моделювання молекулярної динаміки (MD). Моделювання MD білка проводиться на комп'ютері і дозволяє виявити рухи всіх атомів білка за 8 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначений період часу за допомогою розрахунку фізичних взаємодій атомів один з одним. Результатом моделювання MD є траєкторія для досліджуваного білка за період часу моделювання. Траєкторія являє собою ансамбль конформацій білка, також називаний статичними конфігураціями, що періодично реєструються за час моделювання, наприклад кожну пікосекунду (псек). Саме за допомогою аналізу ансамблю статичних конфігурацій можна визначити гнучкість амінокислотних залишків білка. Тому гнучким залишком вважається такий, який може мати ансамбль різних конформацій у структурі поліпептиду, де такий залишок знаходиться. Методи MD відомі фахівцям у даній галузі, див., наприклад, Brooks et al. "Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988). Деякі програмні продукти дозволяють проводити моделювання MD, у тому числі Amber (див. Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688), Charmm (див. Brooks et al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; і MacKerell et al. (1998) у "The Encyclopedia of Computational Chemistry" vol. 1:271-177, Schleyer et al., eds. Chichester: John Wiley & Sons) або Impact (див. Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900.) Більшість комплексів білків має порівняно протяжні і планарні сховані поверхні, і було показано, що гнучкість партнерів, які зв'язуються, забезпечує основу для їх пластичності, що дозволяє їм конформаційно адаптуватися один до одного (Structure (2000) 8, R137-R142). Відповідно, було показано, що приклади "індукованої відповідності" відіграють домінуючу роль у взаємодії білок-білок. Крім того, існує постійно поповнювана сукупність даних, які показують, що білки насправді зв'язують ліганди різних форм, розмірів і структури (Protein Science (2002) 11:184-187) і що конформаціне різномаїття, мабуть, є суттєвою складовою здатності розпізнавати різних партнерів (Science (2003) 299, 1362-1367). Гнучкі залишки беруть участь у зв'язуванні партнерів у парі білок-білок (Structure (2006) 14, 683-693). Гнучкі залишки можуть приймати самі різні конформації, що формують ансамбль областей взаємодії, що, швидше за все, будуть розпізнаватися В-клітинами пам'яті і викликати імуногенну відповідь. Таким чином, антитіла можуть бути гуманізовані за допомогою модифікації ряду залишків остовної послідовності, так щоб ансамбль конформацій і доступних областей розпізнавання в модифікованому антитілі як можна більше походив на існуючі в антитілі людини. Це може досягатися модифікацією обмеженої кількості залишків за допомогою: (1) побудови моделі гомології вихідного моноклонального антитіла (mAb) і проведення молекулярнодинамічного моделювання (MD); (2) аналізу гнучких залишків і ідентифікації найбільш гнучких залишків у молекулі нелюдського антитіла, а також виявлення залишків або мотивів, що, швидше за все, будуть джерелом гетерогенності або реакції розпаду; (3) ідентифікації антитіла людини, що демонструє наявність найбільш схожого ансамблю зон розпізнавання, як вихідного антитіла; (4) виявлення гнучких залишків для мутації, залишків або мотивів, що, швидше за все, будуть джерелом гетерогенності і розпаду і також будуть піддаватися мутації; і (5) перевірки на наявність відомих епітопів Т- або В-клітин. Гнучкі залишки можуть виявлятися на основі розрахунків MD, що пропонуються в даному документі, з використанням моделі передбачуваного розчинника, що враховує взаємодію водного розчинника з атомами білка за період часу моделювання. Після виявлення набору гнучких залишків у варіабельних легких і важких ланцюгах визначають набір остовних послідовностей важких і легких ланцюгів варіабельних областей людини, що мають близьку подібність з існуючими в розглянутому антитілі. Для цього, наприклад, можна скористатися пошуком BLAST для набору гнучких залишків по базі даних для послідовностей антитіл зародкової лінії людини. Це також може досягатися за допомогою зіставлення динаміки вихідного mAb з динамікою бібліотеки канонічних структур зародкової лінії. Залишки і сусідні залишки CDR виключаються з пошуку, для того щоб забезпечити збереження високої афінності для антигену. Потім проводилася заміна гнучких залишків. Коли кілька залишків людини виявляли подібну гомологію, вибір визначався також природою залишків, що, швидше за все, робили би вплив на поводження гуманізованого антитіла в розчині. Наприклад, перевага віддавалася полярним залишкам у доступних гнучких петлях, на противагу гідрофобним залишкам. Залишки, що є потенційним джерелом нестабільності і гетерогенності, також піддавали мутації, навіть якщо вони виявлялися в CDR. Сюди включаються доступні метіоніни, оскільки утворення сульфоксиду може бути наслідком взаємодії з кисневими радикалами, протеолітичне розщеплення кислото-нестійких зв'язків, наприклад у дипептиді Asp-Pro (Drug Dev Res (2004) 61:137-154), сайти деамідування, що є присутніми у доступному залишку аспарагіну, за яким іде невелика за розмірами амінокислота, наприклад Gly, Ser, Ala, His, Asn або Cys (J Chromatog (2006) 837:35-43), а також сайти N-глікозилування, наприклад сайт Asn-X-Ser/Thr. Як правило, доступні метіоніни будуть заміщуватися лейцинами, доступні аспарагіни будуть заміщуватися 9 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глутаміном або аспартатом, або ж буде заміщуватися залишок, який іде за ними. У випадку сайту глікозилування (Asn-X-Ser/Thr) буде замінюватися або Asn, або залишок Ser/Thr. Результуюча композитна послідовність перевіряється на предмет присутності відомих епітопів В-клітин або лінійних епітопів Т-клітин. Пошук проводиться, наприклад, за загальнодоступною базою даних імунних епітопів (IEDB). Якщо всередині композитної послідовності виявляється відомий епітоп, шукається інший набір послідовностей людини, всередині яких виробляється заміщення. На відміну від запропонованого в патенті США № 5639641 методу зміни поверхні (resurfacing), у пропонованому способі враховуються також імуногенні відповіді, опосередковані В- і Т-клітинами. Спосіб також дозволяє обійти проблему втрати активності, що іноді спостерігається у випадку вставок у CDR (патент США № 5530101). Крім того, у процесі інженерії і селекції також враховуються аспекти стабільності і розчинності, що дозволяє створити антитіло, оптимізоване в плані низької імуногенності, високої афінності до антигену і більш прийнятних біофізичних характеристик. Стратегії і способи зміни поверхні антитіл, а також інші методи зниження імуногенності антитіл у різних організмах хазяїна викладені, наприклад, у патенті США № 5639641. У цілому в межах переважного способу: (1) проводиться зіставлення положень набору варіабельних областей важких і легких ланцюгів антитіла, для того щоб визначити доступні поверхневі положення важкого і легкого ланцюга варіабельної області остовної послідовності, при цьому зіставлені положення для усіх варіабельних областей повинні бути принаймні приблизно на 98 % ідентичні; (2) визначається набір нелюдських доступних поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області остовної послідовності, наприклад, для антитіла гризунів (або його фрагмента); (3) визначається набір доступних поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області остовної послідовності, що найбільш близький набору доступних поверхневих амінокислотних залишків гризунів; і (4) набір доступних поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області остовної послідовності, ідентифікований на етапі (2), замінюється набором доступних поверхневих амінокислотних залишків важких і легких ланцюгів варіабельної області остовної послідовності, ідентифікованим на етапі (3), за винятком тих амінокислотних залишків, що розміщуються в межах 5Å від будь-якого атома будь-якого залишку CDR антитіла гризунів, для того щоб одержати гуманізоване антитіло, наприклад антитіло гризунів, що зберігає специфічність зв'язування. Антитіла можуть гуманізуватися на основі множини інших методик, у тому числі вставки в CDR (EPO 0239400; WO 91/09967; а також патенти США №№ 5530101 і 5585089), зміни поверхні антитіл або відновлення поверхневого доступу (EPO 0592106; EPO 0519596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; і Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) і перестановки в ланцюзі (патент США № 5565332). Антитіла людини можуть готуватися з застосуванням різних методів, відомих фахівцям у даній галузі, у тому числі, серед інших, методів фаг-дисплею, див. патенти США №№ 4444887, 4716111, 5,545,806 і 5814318; і WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 і WO 91/10741, з використанням трансгенних тварин, наприклад гризунів, з використанням химерних клітин і т.п. Терміни "гомолог антитіла" або "гомолог" належать до будь-якої молекули, що специфічним чином зв'язує IL-4 і (або) IL-13 відповідно до змісту даного документа. Таким чином, до гомологів антитіла належать нативне або рекомбінантне антитіло, модифіковане або немодифіковане; частини антитіла, що зберігають біологічні властивості, які представляють інтерес; наприклад зв'язування IL-4 або IL-13; наприклад молекули Fab або Fv; одноланцюжкове антитіло; поліпептид, що містить одну або декілька областей CDR і т.п. Амінокислотна послідовність гомолога необов'язково повинна бути ідентична послідовності існуючого в природі антитіла, але може бути змінена або модифікована включенням заміщуючих амінокислот, введених амінокислот, вилучених амінокислот, амінокислот, що не входять у число двадцяти, які зустрічаються в білках, і т.п., для того щоб одержати поліпептид з поліпшеними або іншими корисними властивостями. Антитілами з гомологічними послідовностями називають антитіла з амінокислотними послідовностями, що мають гомологію послідовності з амінокислотними послідовностями антитіла IL-4, IL-13 або біспецифічного антитіла IL-4/IL-13 даного винаходу. Переважно, гомологія існує з амінокислотною послідовністю варіабельних областей антитіла даного винаходу. "Гомологія послідовності" належить до послідовності амінокислот даного документа, що визначається як послідовність з гомологією приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % або вище і, більш переважно, з гомологією принаймні близько 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % 10 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відносно іншої послідовності амінокислот, що визначається, наприклад, за методом пошуку FASTA відповідно до Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988). Химерним антитілом називають антитіло, що містить різні частини антитіла, отриманого з різних джерел, таких як різні антитіла, різні класи антитіл, різні види тварин, наприклад антитіла, що мають варіабельну область, отриману з мишачого моноклонального антитіла, з'єднані з константною областю імуноглобуліну людини і т.п. Таким чином, гуманізоване антитіло являє собою вид химерного антитіла. Методи приготування химерних антитіл відомі фахівцям у даній галузі, див., наприклад, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; і патенти США №№ 5807715, 4816567 і 4816397. До штучнихантитіл належать фрагменти scFv, химерні антитіла, діатіла, триатіла, тетратіла і mru (див. огляди Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; і Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557), кожне з них має здатність зв'язувати антиген або епітоп. В одноланцюжковому фрагменті Fv (scFv), домени VH і VL антитіла зв'язані гнучким пептидом. Зазвичай лінкер являє собою пептид довжиною близько 15 амінокислот. Якщо лінкер суттєво менше, наприклад довжиною в 5 амінокислот, утворюються діатіла. Найменшою зв'язувальною одиницею антитіла є CDR, як правило CDR2 важкого ланцюга, що має достатню здатність до розпізнавання і зв'язування. Такий фрагмент називають молекулярною областю розпізнавання, або mru. Трохи таких mru можуть бути зв'язані разом з короткими лінкерними пептидами, тим самим, утворюючи штучний зв'язувальний білок з більш високою авідністю в порівнянні з окремим mru. У сферу охоплення даного винаходу також включаються функціональні еквіваленти розглянутого антитіла. Термін "функціональні еквіваленти" включає, наприклад, антитіла з гомологічними послідовностями, гомологи антитіл, химерні антитіла, штучні антитіла і модифіковані антитіла, наприклад ті, в яких кожен функціональний еквівалент визначається здатністю зв'язуватися з IL-4 і (або) IL-13, інгібуючи здатність або функцію IL-4 і (або) IL-13 передавати сигнал, або інгібуючи зв'язування IL-4 і (або) IL-13 з його рецептором. Досвідченому фахівцю в даній галузі буде очевидно часткове накладення термінів, що позначають групи молекул, "фрагменти антитіл" і "функціональні еквіваленти". Методи приготування функціональних еквівалентів, що зберігають здатність до зв'язування IL-4 і (або) IL-13, відомі кваліфікованим фахівцям у даній галузі і викладені, наприклад, у WO 93/21319, EPO Ser. No. 239400, WO 89/09622, EPO Ser. No. 338745 і EPO Ser. No. 332424. До функціональних еквівалентів даної заявки також належать модифіковані антитіла, наприклад антитіла, модифіковані за рахунок ковалентного зв'язку молекули будь-якого типу з антитілом. Наприклад, до модифікованих антитіл належать антитіла, що були модифіковані, наприклад глікозилуванням, ацетилуванням, РЕGілюванням, деамідуванням, фосфорилуванням, амідуванням, введенням відомих захисних/блокувальних груп, протеолітичним розщепленням, зв'язком із клітинним лігандом, зв'язком з токсином або цитотоксичною групою або іншим білком і т.п. Ковалентне зв'язування необов'язково призводить до антитіла, що захищене від формування анти-ідіотипічного відгуку. Модифікація може проводитися з використанням відомих методик, у тому числі, серед інших, специфічного хімічного розщеплення, ацетилізування, формілування, метаболічного синтезу і т.п. Крім того, модифіковані антитіла можуть містити одну або декілька некласичних амінокислот. Рядовим фахівцям у даній галузі відома множина методик, що дозволяють проводити оптимізацію афінності зв'язування. Як правило, такі методики включають заміщення різних амінокислотних залишків у розглянутому сайті з наступним скринінговим аналізом афінності зв'язування мутантного поліпептиду з когнатним антигеном або епітопом. Після ідентифікації і виділення антитіла часто буває корисно одержати варіант або мутант антитіла, або мутеїн, де змінені один або декілька амінокислотних залишків, наприклад, в одній або декількох гіперваріабельних областях антитіла. В альтернативному варіанті або додатково в структуру антитіла може бути внесена одна або декілька змін (наприклад, заміщень) у залишках остовної послідовності, що призводить до поліпшення афінності зв'язування мутанта антитіла з IL-4 і (або) IL-13. Прикладами залишків остовної області, що можуть бути модифіковані, є ті, які прямо нековалентно зв'язують антиген (Amit et al., Science 233:747-753 (1986)); взаємодіють з конформацією CDR або впливають на неї (Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)); і (або) входять до складу інтерфейсу VL-VH (EP 239 400). У деяких прикладах здійснення модифікація одного або декількох таких залишків остовної області призводить до поліпшення афінності зв'язування антитіла з когнатним антигеном. Наприклад, у даному прикладі здійснення винаходу можуть змінюватися від одного до приблизно п'яти залишків остовної області. Іноді цього може бути достатньо, щоб одержати мутант антитіла, придатний для використання в доклінічних випробуваннях, навіть якщо не вносилися зміни в 11 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 жодний із залишків гіперваріабельної області. Однак, як правило, мутант антитіла може включати одну або декілька змін гіперваріабельної області. Константні області також можуть змінюватися, для того, щоб досягти бажаних або більш бажаних ефекторних властивостей. Залишки гіперваріабельної області, що піддаються заміщенню, можуть змінюватися випадковим чином, особливо, якщо вихідна афінність зв'язування вихідного антитіла така, що випадковим чином одержувані мутанти антитіл можуть легко аналізуватися в процесі скринінгу на зміну зв'язування за методикою аналізу, наведеною в даному документі. Одним з методів одержання мутантів антитіл, наприклад мутантів CDR, є "мутагенез сканування аланіну" (Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989); і Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)). Один або декілька залишків гіперваріабельної області замінюються аланіновими або поліаланіновими залишками. Такий залишок (залишки) гіперваріабельної області, що виявляє функціональну чутливість до заміщень, потім модифікують, вводячи подальші або інші мутації в сайтах заміни. Таким чином, незважаючи на те, що сайт для введення варіації послідовності амінокислоти визначений, сам по собі характер мутації необов'язково заздалегідь заданий. Можна спробувати ввести аналогічні заміщення з іншими амінокислотами, залежно від бажаних властивостей сканованих залишків. Більш систематичний метод ідентифікації амінокислотних залишків для модифікації включає вибір залишків гіперваріабельної області, задіяних у зв'язуванні IL-4 і (або) IL-13, а також тих залишків гіперваріабельної області, що слабко беруть участь або не задіяні в зв'язуванні IL-4 і (або) IL-13. Проводиться аланінове сканування залишків незв'язувальної гіперваріабельної області, причому кожен Ala мутант проходить тестування на поліпшення зв'язування з IL-4 і (або) IL-13. В іншому прикладі здійснення для модифікації вибирається той залишок (залишки), що суттєво задіяні в зв'язуванні IL-4 і (або) IL-13. Модифікація може передбачати делецію залишку або введення одного або декількох залишків у безпосередній близькості від розглянутого залишку. Однак, як правило, модифікація передбачає заміну залишку іншою амінокислотою. Перша заміна може бути консервативною. Якщо така заміна призводить до зміни біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування), тоді можна провести наступну консервативну заміну, щоб довідатися, чи вдалося домогтися більш суттєвих змін. Ще більш значуща зміна в лінії антитіл і прояві біологічних властивостей може бути досягнута при виборі амінокислоти, що більш помітно відрізняється за властивостями від тієї, яка зазвичай є присутньою на цьому сайті. Тому таке заміщення може проводитися при одночасному збереженні: (a) структури поліпептидного остова в зоні заміни, наприклад у вигляді листа або спіральної конформації; (б) заряду або гідрофобності молекули в мішеневому сайті, або (в) обсягу бічного ланцюга. Наприклад, амінокислоти, що зустрічаються в природі, можуть бути підрозділені на групи на основі загальних властивостей бічного ланцюга: (1) гідрофобні: метіонін (M або Met), аланін (A або Ala), валін (V або Val), лейцин (L або Leu) і ізолейцин (I або Ile); (2) нейтральні, гідрофільні: цистеїн (C або Суs), серин (S або Ser), треонін (T або Thr), аспарагін (N або Аsn) і глутамін (Q або Gln); (3) кислі: аспарагінова кислота (D або Аsр) і глутамінова кислота (E або Glu); (4) основні: гістидин (H або Ніs), лізин (K або Lys) і аргінін (R або Аrg); (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: гліцин (G або Gly) і пролін (P або Рrо); (6) ароматичні: триптофан (W або Тrр), тирозин (Y або Туr) і фенілаланін (F або Рhе). Під неконсервативними заміщеннями може розумітися заміна однієї з амінокислот на амінокислоту з іншої групи. Під консервативними заміщеннями може розумітися заміна однієї амінокислоти на іншу всередині однієї групи. До переважних заміщень амінокислот належать такі, які: (1) знижують схильність до протеолізу, (2) зменшують схильність до окиснення, (3) змінюють афінність зв'язування і (4) забезпечують або змінюють інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких аналогів. Серед аналогів можуть бути присутніми різні мутеїни з послідовністю, що відрізняється від існуючої в природі пептидної послідовності. Наприклад, одиничні або множинні заміни амінокислот (переважно консервативні заміни амінокислот) можуть проводитися в існуючій у природі послідовності (переважно в частині поліпептиду за межами домену (доменів), відповідального за міжмолекулярні контакти). Консервативна заміна амінокислот не повинна суттєво змінювати структурні характеристики вихідної послідовності (наприклад заміна амінокислоти зазвичай не повинна призводити до порушення спіральної конформації, що була присутня у вихідній послідовності, або ж порушувати інші елементи вторинної структури, що характеризують вихідну послідовність), виключенням є зміни загального обсягу або зміни конформації R-групи або бічного ланцюга, Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, 12 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); і Thornton et al. Nature 354:105 (1991). Зазвичай мутант антитіла з поліпшеними біологічними властивостями буде мати амінокислотну послідовність, що принаймні на 75 % ідентична або подібна амінокислотній послідовності важкого або легкого ланцюга варіабельного домену вихідного антилюдського антитіла IL-4 і (або) IL-13, або має принаймні 80 %-ну, принаймні 85 %-ну, принаймні 90 %-ну і часто принаймні 95 %-ну ідентичність. Ідентичність або подібність у відношенні послідовності вихідного антитіла визначається в даному документі як відсоток амінокислотних залишків у послідовності кандидата, що ідентичний (тобто той самий залишок) чи подібний (тобто амінокислотний залишок з тієї ж групи, виходячи з близьких властивостей бічного ланцюга, див. вище) залишкам вихідного антитіла після зіставлення послідовностей і введення пропусків, якщо необхідно, для забезпечення максимального відсотка ідентичності послідовності. В альтернативному варіанті мутанти антитіла можуть бути отримані систематичною мутацією областей FR і CDR важкого і легкого ланцюгів або ж області Fc антитіла анти-IL-4, анти-IL-13 або біспецифічного антитіла IL-4/IL-13. Інший метод одержання мутантів антитіла включає використання дозрівання афінності за допомогою фаг-дисплею (Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992) і Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)). Злиті білки оболонки бактеріофага (Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992); і патент США № 5223409) відомі як зручні об'єкти для зв'язування фенотипу білків або пептидів дисплею з генотипом частинок бактеріофага, що їх кодують. При використанні фаг-дисплею також відображаються домени Fab антитіл (McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991); і Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991)). Моновалентний фаг-дисплей передбачає відображення набору варіантів білка у формі злитих білків з білком оболонки бактеріофага на частинках фага (Bass et al., Proteins 8:309 (1990). Дозрівання афінності, або поліпшення рівноважної афінності зв'язування різних білків, раніше досягалося за допомогою послідовного застосування мутагенезу, моновалентного фагдисплею і функціонального аналізу (Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); і патент США № 5534617), наприклад, особлива увага приділялася областям CDR антитіл (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994); і Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)). 6 Бібліотеки множини (наприклад, 10 або більше) варіантів білків, що відрізняються у визначених положеннях послідовності, можна побудувати на частинках бактеріофагів, кожна з який містить ДНК, що кодує визначений варіант білка. Після циклів афінного очищення з використанням іммобілізованого антигену, ізолюють окремі клони бактеріофагів і на підставі ДНК визначають амінокислотну послідовність відображуваного білка. Після одержання мутанта антитіла можна визначити біологічну активність даної молекули в порівнянні з вихідним антитілом, згідно з даними, викладеними в даному документі. Як відзначалося вище, для цього може знадобитися визначити афінність зв'язування і (або) іншу біологічну активність або фізичні властивості антитіла. У переважному здійсненні даного винаходу готується набір мутантів антитіла з наступним скринінгом афінності зв'язування для антигену. Один або декілька мутантів антитіла, що вибираються за результатами скринінгу, можуть додатково перевірятися з використанням одного або декількох інших методів аналізу біологічної активності, для того, щоб підтвердити, що мутант (мутанти) антитіла має нові або поліпшені властивості. У переважних прикладах здійснення мутант антитіла зберігає здатність зв'язування IL-4 і (або) IL-13 з афінністю зв'язування, близькою або кращою/більш високою в порівнянні з характеристиками вихідного антитіла. Відібраний у такий спосіб мутант (мутанти) антитіла може піддаватися подальшим модифікаціям, що часто залежать від передбачуваного використання антитіла. Такі модифікації можуть включати подальшу зміну амінокислотної послідовності, злиття з гетерологічним поліпептидом (поліпептидами) і (або) ковалентні модифікації. Наприклад, залишок цистеїну, що не задіяний у збереження належної конформації мутанта антитіла, може заміщуватися, як правило, на серин, для того щоб поліпшити стійкість молекули до окиснення і попередити утворення абератних зшивок. Навпроти, цистеїн може вводитися в структуру антитіла, для того, щоб поліпшити його стабільність (особливо, якщо як антитіло вибирається фрагмент антитіла, наприклад, фрагмент Fv). Інший тип мутанта антитіла має змінену структуру глікозилування. З цією метою можуть віддалятися одна або декілька вуглеводних груп, що є присутніми в антитілі, і (або) додаватися один або декілька сайтів глікозилування, яких немає в молекулі антитіла. Глікозилування антитіл, як правило, або N-зв'язане з Asn, або O-зв'язане з Ser або Thr. Трипептидні 13 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності аспарагін-х-серин і аспарагін-х-треонін, де X - будь-яка амінокислота, крім проліну, є розповсюдженими послідовностями розпізнавання для ферментативного зв'язування вуглеводної групи з бічним ланцюгом аспарагіну. N-ацетилгалактозамін, галактоза, фукоза або ксилоза, наприклад, зв'язуються з гідроксіамінокислотою, як правило із серином або треоніном, хоча може використовуватися і 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додавання або заміщення одного або декількох залишків серину або треоніну до послідовності вихідного антитіла може підвищити імовірність O-зв'язаного глікозилування. Можливо, буде бажано модифікувати антитіло даного винаходу в плані ефекторної функції, для того щоб підвищити ефективність антитіла. Наприклад, в область F c може вводитися залишок (залишки) цистеїну, що забезпечує можливість утворення міжланцюжкового дисульфідного зв'язку в цій області. Отримане в такий спосіб гомодимерне антитіло може характеризуватися більш високою здатністю до інтерналізації і (або) комплемент-залежного лізису й антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC), див. Caron et al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992) і Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993). В альтернативному варіанті може бути сконструйоване антитіло, що має подвійні області F c і тому може забезпечувати підвищені комплемент-залежний лізис і здатність до ADCC, див. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989). Ковалентні модифікації антитіла включаються в охоплення даного винаходу. Вони можуть проводитися за допомогою хімічного синтезу або, якщо можливо, ферментативного або хімічного розщеплення антитіла. Інші форми ковалентних модифікацій антитіла вводяться в молекулу за допомогою взаємодії вибраних амінокислотних залишків антитіла з органічним агентом, використовуваним для одержання похідних, що здатні реагувати з вибраними бічними ланцюгами або з N-кінцевим або C-кінцевим залишком. Цистеїнілінові залишки можуть реагувати з α-галоацетатами (і відповідними амінами), наприклад хлороцтовою кислотою або хлорацетамідом, з утворенням карбоксиметильних або карбоксіамідометильних похідних. Похідні цистеїнілінових залишків також можна одержувати, наприклад, шляхом реакції з бромтрифторацетоном, α-бром-β-(5-імідозоїл)пропіоновою кислотою, хлорацетилфосфатом, N-алкілмалеімідами, 3-нітро-2-піридилдисульфідом, метил-2піридилдисульфідом, п-хлормеркурбензоатом, 2-хлормеркур-4-нітрофенолом або хлор-7нітробензо-2-окса-1,3-діазолом. Похідні гістидинілінових залишків можуть бути отримані за реакцією з діетилпірокарбонатом при pН 5,5-7,0. п-Бромфенацилбромід може також використовуватися, реакцію переважно проводити в 0,1 M розчині какодилату натрію при pН 6,0. Лізинілінові залишки і α-кінцеві залишки можуть реагувати з бурштиновим ангідридом або з ангідридами інших карбонових кислот, для того щоб змінити заряд залишків. До інших зручних реагентів для одержання похідних α-аміновмісних залишків належать імідоефіри, наприклад метилпіколінімідат, піридоксальфосфат, піридоксаль, хлорборогідрид, тринітробензолсульфонова кислота, O-метилізосечовина і 2,4-пентандіон, і амінокислота може каталізуватися трансаміназою у присутності гліоксилату. Залишки аргініну можуть модифікуватися за реакцією з одним або декількома стандартними реагентами, наприклад фенілгліоксалем, 2,3-бутандіоном, 1,2-циклогександіоном і нінгідрином. Для одержання похідних у випадку залишків аргініну часто потрібно проводити реакцію в лужному середовищі. Крім того, реагенти можуть взаємодіяти з лізином, а також з εаміногрупою аргініну. Специфічна модифікація залишків тирозину може проводитися за допомогою ароматичних діазонієвих сполук або тетранітрометану. Наприклад, N-ацетилімідазол і тетранітрометан використовуються для утворення O-ацетилтирозильних сполук і 3-нітропохідних, відповідно. 125 131 Залишки тирозину можуть йодуватися з використанням I або I, щоб одержати мічені білки для застосування в радіоімунологічному аналізі. Карбоксильні бічні групи (аспартил або глутаміл) можуть бути модифіковані за реакцією з карбодіімідами (R-N=C=C-R'), де R і R' можуть бути різними алкільними групами, наприклад 1циклогексил-3-(2-морфолініл-4-етил)карбодіімід або 1-етил-3-(4-азоній-4,4диметилпентил)карбодіімід. Крім того, залишки аспартилу і глутамілу можуть бути трансформовані в аспарагінілінові і глутамінілінові залишки за реакцією з іонами амонію. Глутамінілінові й аспарагінілінові залишки часто деамідують до відповідних глутамільних і аспартильних залишків, відповідно, у нейтральному або основному середовищі. Деамідована форма таких залишків входить у сферу охоплення даного винаходу. До інших модифікацій належить гідроксилювання проліну і лізину, фосфорилування гідроксильних груп залишків сериніл або треоніл, метилювання α-аміногруп бічних ланцюгів лізину, аргініну і гістидину (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & 14 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), ацетилування N-кінцевого аміну та амідування будь-якої Cкінцевої карбоксильної групи. Інша форма ковалентної модифікації являє собою хімічне або ферментативне зв'язування глікозидів з антитілом. Такі процедури не потребують продукції антитіл у клітині-хазяїні, що виявляє глікозилувальні властивості в N-зв'язаному або O-зв'язаному глікозилуванні. Залежно від використаного методу поєднання цукор (цукри) можуть зв'язуватися з: (a) аргініном і гістидином; (б) вільними карбоксильними групами; (в) вільними сульфгідрильними групами, наприклад цистеїну; (г) вільними гідроксильними групами, наприклад серину, треоніну або гідроксипроліну; (д) ароматичними залишками, наприклад фенілаланіну, тирозину або триптофану; або (е) амідною групою глутаміну. Подібні методи описані в WO 87/05330 і в Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981). Видалення будь-якої вуглеводної групи, що присутня у структурі антитіла, може здійснюватися хімічним або ферментативним способом. Наприклад, для хімічного деглікозилування може знадобитися подіяти на антитіло таким реагентом, як трифторметансульфонова кислота або рівноцінною сполукою, що призводить до розщеплення більшості або всіх цукрів, крім зв'язувального цукру (N-ацетилглюкозамін або Nацетилгалактозамін), при цьому антитіло залишається інтактним. Хімічне деглікозилування описане, наприклад, у Hakimuddin et al. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987) і в Edge et al., Anal Biochem 118:131 (1981). Ферментативне розщеплення вуглеводних груп на антитілах може здійснюватися за допомогою кожної з множини ендоглікозидаз і екзоглікозидаз, як це описано, наприклад, у Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350 (1987). Інша форма ковалентної модифікації антитіла включає зв'язування антитіла з одним з множини небілкових полімерів, наприклад поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами, на основі методу, наведеного в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 чи 4179337. Інша переважна методика одержання мутантів або мутеїнів являє собою дозрівання афінності за допомогою фаг-дисплею (Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992) і Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)). Коротко, проводиться мутація декількох сайтів гіперваріабельної області (наприклад, 6-7 сайтів), щоб одержати всі можливі амінокислотні заміщення на кожному сайті. Отримані в такий спосіб мутанти антитіла моновалентно виявляються на частинках фага як злиті з білком, що знаходиться на частинках. Фаг, що експресує різні мутанти, може проходити цикл процедур селекції зв'язування з наступним виділенням і секвенуванням тих мутантів, що демонструють високу афінність. Метод селекції нових зв'язуючих поліпептидів може спиратися на використання бібліотеки структурно зв'язаних поліпептидів. Бібліотека структурно зв'язаних поліпептидів, наприклад злитих з білком оболонки фага, виходить за допомогою мутагенезу і виявляється на поверхні частинки. Потім частинки вступають у контакт із молекулою-мішенню, і частинки з найвищою афінністю до мішені відокремлюються від таких, що мають більш низьку афінність. Частинки, які зв'язуються з високою афінністю, потім ампліфікуються за допомогою інфікування придатного бактеріального хазяїна, і стадію конкурентного зв'язування повторюють. Процес повторюють, доти поки не будуть отримані поліпептиди з бажаною афінністю. В альтернативному варіанті мультивалентний фаг (McCafferty et al. (1990) Nature 348:552554; і Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628) може також використовуватися для експресії випадкових точкових мутацій (наприклад отриманих у результаті використання допускаючої помилки ДНК-полімерази) для одержання фагової бібліотеки фрагментів антитіл, що потім можуть піддаватися скринінгу для перевірки афінності до IL-4 і (або) IL-13, Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 254:889-896. Переважно, щоб у процесі дозрівання афінності реплікований вектор експресії залишався під суворим контролем керуючого елемента транскрипції, а умови культивування коректувалися таким чином, щоб кількість частинок, що несуть більше однієї копії злитого білка, була менше приблизно 1 %. Крім того, переважно, щоб кількість частинок, що несуть більше однієї копії злитого білка, була менше 10 % від кількості частинок, що несуть єдину копію злитого білка. Переважно, щоб така кількість була менше 20 %. Функціональні еквіваленти можуть виходити заміною різних CDR у різних ланцюгах антитіл в остовній або композитній FR, отриманій від багатьох антитіл. Так, наприклад, можливо одержати різні класи антитіл для заданого набору CDR за допомогою заміщення різних важких ланцюгів, наприклад IgG1-4, IgM, IgA1-2 або IgD, для того щоб одержати типи та ізотипи антитіл IL-4 і (або) IL-13, що розрізняються. Аналогічним чином, штучні антитіла, що входять у сферу охоплення даного винаходу, можуть бути отримані за допомогою включення заданого набору CDR у цілком синтетичну остовну область. 15 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До фрагментів антитіл і функціональних еквівалентів даного винаходу належать такі молекули, що мають реєстрований рівень зв'язування з IL-4 і (або) IL-13. Реєстрований рівень зв'язування включає всі значення в діапазоні принаймні 10-100 %, переважно принаймні 50 %, 60 % або 70 %, більш переважно принаймні 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % здатності зв'язування антитіла, що представляє інтерес. У сферу охоплення даного винаходу також включаються еквіваленти з афінністю більше 100 % у порівнянні з розглянутим антитілом. CDR зазвичай мають велике значення для розпізнавання епітопів і зв'язування антитіла. При цьому, однак, можуть вноситися зміни в залишки, що входять до складу CDR, з одночасною відсутністю впливу на здатність антитіла розпізнавати когнатний епітоп і зв'язуватися з ним. Наприклад, можуть вноситися зміни, що не роблять впливу на розпізнавання епітопів, але проте підвищують афінність зв'язування антитіла з епітопом. У ряді досліджень наводиться огляд ефектів заміни однієї або декількох амінокислот у різних положеннях послідовності антитіла, виходячи зі знань про первинну послідовність антитіла, на їхні властивості, наприклад зв'язування і рівень експресії (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; і Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539). Таким чином, еквіваленти розглянутого антитіла можуть бути отримані зміною послідовностей генів важкого і легкого ланцюгів у CDR1, CDR2 або CDR3, або в остовних областях за допомогою таких методів, як олігонуклеотид-опосередкований сайт-напрямлений мутагенез, касетний мутагенез, ПЛР зниженої точності, перестановка в ДНК або штами мутатора E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; і Adey et al., 1996, Chap. 16, pp. 277-291, у Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Методи зміни послідовності нуклеїнової кислоти первинного антитіла можуть призводити до утворення антитіл з підвищеною афінністю (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:1636516370; і Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628). Повторювані цикли "поліпептидної селекції" можуть застосовуватися для відбору систем з все більш високою афінністю зв'язування, наприклад за допомогою селекції змін декількох амінокислот, що відбираються в ході множини циклів селекції. Після першого циклу селекції, що включає першу область селекції амінокислот у ліганді або поліпептиді антитіла, проводяться додаткові цикли селекції в інших областях або амінокислотах ліганду. Цикли селекції повторюються до досягнення бажаних характеристик афінності. До поліпшених антитіл також належать антитіла, що мають більш досконалі характеристики, приготовлені з використанням стандартних методик імунізації тварин, утворення гібридом і селекції антитіл з певними характеристиками. Термін "антагоніст" належить до молекули, здатної інгібувати один або декілька проявів біологічної активності молекули-мішені, наприклад передачу сигналу IL-4 і (або) IL-13. Антагоніст може перешкоджати зв'язуванню рецептора з лігандом і навпаки, виводячи з ладу або знищуючи клітини, активовані лігандом, і (або) блокуючи активацію рецептора або ліганду (наприклад активацію тирозинкінази), або передачу сигналу після зв'язування ліганду з рецептором. Антагоніст здатний цілком блокувати взаємодію рецептор-ліганд або може суттєво пригнічувати такі взаємодії. Термін "агоніст" належить до сполуки, що включає білок, поліпептид, пептид, антитіло, фрагмент антитіла, кон'югат, велику молекулу, малу молекулу, що активує один або декілька проявів біологічної активності IL-4 і (або) IL-13. Агоністи можуть попереджати зв'язуванню рецептора з лігандом і навпаки, діючи як мітоген клітин, активованих лігандом, і (або) перешкоджаючи інактивації клітин або інгібуванню сигналу після зв'язування ліганду з рецептором. Для цілей даного винаходу всі подібні аспекти впливу агоніста вважаються еквівалентними. Використовувані в даному документі терміни "клітина", "лінія клітин" і "клітинна культура" включають їх потомство. Також розуміється, що все потомство не може бути в точності ідентичним, наприклад за вмісту ДНК, внаслідок навмисних або випадкових мутацій. Сюди входить варіант потомства, що має такі ж функції або біологічну характеристику, що представляє інтерес, для яких проводиться скринінг у вихідних клітинах. Термін "вектор" означає конструкцію нуклеїнової кислоти, носій, що містить нуклеїнову кислоту, трансген, чужорідний ген або ген, що представляє інтерес, що може бути функціонально зв'язаний із придатними контрольними послідовностями для експресії трансгена в організмі придатного хазяїна. До таких контрольних послідовностей, наприклад, належать промотор для проведення транскрипції, додаткова операторна послідовність для контролю такої транскрипції, послідовність, що кодує придатні сайти зв'язування мРНК на рибосомі, а 16 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також послідовності, що контролюють зупинку транскрипції і трансляції. Вектором може бути плазміда, частинка фага або просто потенційна геномна вставка. Після трансформації в придатний хазяїн вектор може реплікуватися і функціонувати незалежно від геному хазяїна, або може в деяких випадках інтегруватися в геном клітини-хазяїна. У наведеному описі терміни "плазміда" і "вектор" використовуються рівнозначно, оскільки плазміда є широко застосовуваною формою вектора. Разом з тим передбачається, що винахід включає такі інші форми векторів, що виконують еквівалентні функції носіїв, що відомі або стають відомі фахівцям у даній галузі, наприклад віруси, синтетичні молекули, що містять нуклеїнові кислоти, ліпосоми і т.п. Під "ссавцем" для цілей лікування розуміється будь-яка тварина, що класифікується як ссавець, у тому числі людина, домашні і сільськогосподарські тварини, нелюдиноподібні примати, а також тварини з зоопарків, спортивні або домашні тварини, наприклад собаки, коні, кішки, корови і т.п. Представляючі інтерес антитіла можуть піддаватися скринінгу або можуть використовуватися в методах аналізу, що описані в даному документі або відомі фахівцям у даній галузі. Часто для таких аналізів потрібний реагент, що може виявлятися доступними методами, наприклад такий, що містить мітку. Використовуваний у даному документі термін "мітка" належить до детектованої сполуки або сполуки, що прямо або побічно може кон'югуватися з молекулою або білком, наприклад антитілом. Мітка може бути сама по собі детектованою (наприклад радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментативної мітки, може каталізувати хімічні зміни субстрату або сполуки, що піддаються детектуванню. Використовуваний у даному документі термін "тверда фаза" означає неводну матрицю, до якої може прикріплюватися структура або молекула, наприклад антитіло даного винаходу. Прикладами твердих фаз, що входять у сферу охоплення даного винаходу, є цілком або частково утворені зі скла (наприклад скла з контрольованою пористістю), полісахариди (наприклад агароза), поліакриламіди, полістирол, полівініловий спирт і силікони. У деяких прикладах здійснення, залежно від контексту, тверда фаза може являти собою ямку в аналітичному планшеті; в інших випадках вона може використовуватися в колонці для очищення (наприклад у колонці для афінної хроматографії). Таким чином, твердою фазою може бути папір, гранули, пластикова поверхня, чип і т.п., вона може бути виготовлена з усіляких матеріалів, наприклад нітроцелюлози, агарози, полістиролу, поліпропілену, силікону і т.п., а також може мати самі різні конфігурації. Як відомо фахівцям у даній галузі, ген або кДНК, що кодують IL-4 і IL-13, можуть клонуватися в плазміду або інший вектор експресії і експресуватися в межах кожної з декількох систем експресії відповідно до методів, добре відомих кваліфікованим фахівцям у даній галузі, див., наприклад, нижче. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують амінокислотну послідовність мутантів, можуть бути отримані за допомогою всіляких методів, відомих фахівцям у даній галузі. До таких методів, серед інших, належать олігонуклеотидний (або сайт-направлений) мутагенез, ПЛРмутагенез і касетний мутагенез раніше приготовленого мутованого або немутованого варіанта розглянутої молекули (див., наприклад, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)). Під рекомбінантною експресією антитіла даного винаходу або його фрагмента, похідного або аналога (наприклад важкого або легкого ланцюга антитіла даного винаходу, одноланцюжкового антитіла даного винаходу або антитіла мутеїну даного винаходу) розуміється конструювання вектора експресії, що містить полінуклеотид, що кодує антитіло або фрагмент антитіла, як описано в даному документі. Після одержання полінуклеотиду, що кодує молекулу антитіла, можна приготувати вектор для продукції антитіла, використовуючи технологію рекомбінантної ДНК, відому фахівцям у даній галузі. Конструюється вектор експресії, який містить послідовності, що кодують антитіло, а також відповідні маркери контролю транскрипції і трансляції. До таких методів належать, наприклад, методики рекомбінантної ДНК in vitro, синтетичні методики і генетична рекомбінація in vivo. Вектор експресії переноситься в клітину-хазяїн за допомогою стандартних методик, і трансфіковані клітини потім культивують за допомогою стандартних методик з метою одержати антитіло даного винаходу або його фрагмент. В одному з аспектів винаходу в клітині-хазяїні може проводитися спільна експресія векторів, що кодують важку і легку ланцюги, для того щоб забезпечити експресію всієї молекули імуноглобуліну, як це докладно описано в даному документі. При експресії молекул антитіла, представлених у даному винаході, можуть використовуватися найрізноманітніші системи хазяїна/вектори експресії. Такі системи експресії 17 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являють собою носії для одержання і наступного очищення кодуючих послудовностей, що представляють інтерес, але також являють собою клітини, що при трансформації або трансфекції відповідними кодуючими нуклеотидними послідовностями здатні експресувати молекулу антитіла даного винаходу in situ. Бактеріальні клітини, наприклад E. coli, а також еукаріотичні клітини широко використовуються для експресії молекули рекомбінантного антитіла, особливо для експресії всієї молекули рекомбінантного антитіла. Наприклад, клітини ссавців, такі як клітини CHO, у поєднанні з вектором, наприклад, що несе основний елемент проміжного раннього гена-промотору цитомегаловірусу людини, є ефективною системою експресії антитіл (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); і Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)). Як відомо фахівцям у даній галузі, для приготування білків, що представляють інтерес, можуть також використовуватися рослини і культури рослинних клітин, клітини комах і т.п. Крім того, може вибиратися клітина-хазяїн, що модулює експресію введених послідовностей або модифікує і забезпечує процесинг генного продукту конкретним заданим чином. Подібні модифікації (наприклад глікозилування) і процесинг (наприклад розщеплення) білкових продуктів можуть мати важливе значення для функціонування білка. Різні клітини-хазяїни мають характерні і специфічні механізми пост-трансляційного процесинга і модифікації білків і генних продуктів. Придатні лінії клітин або системи хазяїнів можуть вибиратися для забезпечення необхідної модифікації і процесинга експресованого представляючого інтерес антитіла. Отже, може використовуватися еукаріотична клітина-хазяїн, що має клітинний апарат для належного процесинга первинного транскрипта, глікозилування і фосфорилування генного продукту. До таких клітин-хазяїнів ссавців, серед інших, належать CHO, COS, 293, 3T3 клітини або мієломи. Стабільна експресія є переважною для довгострокової високопродуктивної продукції рекомбінантних білків. Наприклад, можуть бути сконструйовані лінії клітин, що стабільно експресують молекулу антитіла. Замість використання векторів експресії, що містять вірусні джерела реплікації, клітина-хазяїн може бути трансформована за допомогою ДНК в умовах регулювання, що забезпечується відповідними елементами контролю експресії (наприклад промотером, енхансером, послідовностями, термінаторами транскрипції, сайтами поліаденілування і т.п.) і селектованим маркером. Після інтродукції чужорідної ДНК сконструйованим клітин протягом одного або двох днів дають рости в збагаченому середовищі, потім їх переносять у селективне середовище. Селектований маркер у рекомбінантній плазміді додає стійкість відносно селекції і дозволяє клітинами стабільно інтегрувати плазміду в хромосому з наступним розвитком у лінію клітин. Такі сконструйовані лінії клітин зручні не тільки для продукції антитіл, але також придатні для скринінгу й оцінки сполук, що прямо або побічно взаємодіють з молекулою антитіла. Може використовуватися ряд систем селекції, у тому числі, серед інших, тимідинкіназа вірусу Herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансфераза (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)), селекція глутаматсинтази в присутності метіонінсульфоксіміду (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006, див. також веб-сайт або добірку літератури Lonza Group Ltd.), а також гени аденінфосфорибозилтрансферази (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) у клітинах tk, hgprt або aprt, відповідно. Також стійкість до антиметаболітів може використовуватися як основа для селекції наступних генів: dhfr, що забезпечує стійкість до метотрексату (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); О'Hаrе et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)); gpt, що забезпечує стійкість до мікофенолової кислоти (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)); neo, що забезпечує стійкість до аміноглікозиду, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)); hygro, що забезпечує стійкість до гігроміцину (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Методи, відомі фахівцям у даній галузі технології рекомбінантної ДНК, можуть стандартним чином застосовуватися для селекції бажаного рекомбінантного клону, і такі методи описані, наприклад, у Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); і Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981). Рівні експресії молекули антитіла можуть бути підвищені за допомогою векторної ампліфікації (наприклад, див. Bebbington et al., у DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)). У випадку можливості ампліфікації маркера у векторній системі, що експресує антитіло, збільшення рівня інгібітору, що присутній у культурі, буде призводити до росту кількості копій маркерного гена. Оскільки ампліфікована область асоційована з геном антитіла, продукція антитіла буде також зростати (Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)). Клітина-хазяїн може спільно трансфікуватися двома або більше векторами експресії даного винаходу, наприклад першим вектором, що кодує похідний від важкого ланцюга поліпептид, і другим вектором, що кодує похідний від легкого ланцюга поліпептид. Два вектори можуть 18 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містити ідентичні селектовані маркери, що забезпечують рівну експресію поліпептидів важкого і легкого ланцюгів. Як альтернатива може використовуватися одиничний вектор, що кодує і здатний експресувати поліпептиди як важкого, так і легкого ланцюгів. У подібних випадках легкий ланцюг повинен розташовуватися до важкого, щоб уникнути появи надлишку токсичного вільного важкого ланцюга (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); і Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)). Кодуючі послідовності для важкого і легкого ланцюгів можуть включати кДНК або геномну ДНК. Після того як молекула антитіла даного винаходу отримана в організмі тварини, синтезована хімічним шляхом або за допомогою рекомбінантної експресії, її можна очистити за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям у даній галузі, застосовуваного для очищення молекули імуноглобуліну, наприклад хроматографії (наприклад іонообмінної, афінної, зокрема, що спирається на афінність IL-4 і (або) IL-13 для білка A, а також гель-фільтрацією і т.п.), центрифугування, диференціальної розчинності або за допомогою будь-якої іншої стандартної методики для очищення білків. Крім того, для спрощення процесу очищення антитіла даного винаходу або їхні фрагменти можуть бути злиті в гетерологічні поліпептидні послідовності, описані в даному документі, або ж відомі фахівцям у даній галузі. Антитіла даного винаходу можуть бути отримані будь-яким зручним методом, відомим фахівцям у даній галузі. До антитіл даного винаходу можуть належати поліклональні антитіла, хоча через модифікацію антитіл для оптимізації застосування на людині, а також для оптимізації застосування антитіл самих по собі, моноклональні антитіла є переважними через простоту одержання й обробку конкретних білків. Методи приготування поліклональних антитіл відомі кваліфікованим фахівцям у даній галузі (Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)). Антитіла даного винаходу переважно включають моноклональні антитіла. Моноклональні антитіла можуть бути приготовлені за допомогою гібридомних методик, наприклад описаних у Kohler et al., Nature 256:495 (1975); патент США № 4,376,110; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) і Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981), методик рекомбінантної ДНК, наприклад приготування і використання трансфектом, або інших методів, відомих фахівцям у даній галузі. Інші приклади методів, що можуть використовуватися для продукції моноклональних антитіл, серед інших, включають, гібридомні методики В-клітин людини (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); і Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)), і EBVгібридомну методику (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)). Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, у тому числі IgG, IgM, IgE, IgA і IgD, а також до будь-якого їх підкласу. Гібридоми, що продукують mAb даного винаходу, можуть культивуватися in vitro або in vivo. У межах гібридомної моделі організм хазяїна, наприклад миші, гуманізованої миші, трансгенної миші з генами імунної системи людини, хом'ячка, кролика, щура, верблюда або будь-якої іншої придатної тварини-хазяїна, імунізується з метою активувати лімфоцити, що продукують або здатні продукувати антитіла, що специфічно зв'язуються з IL-4 або IL-13. В альтернативному варіанті лімфоцити можуть бути імунізовані in vitro. Потім лімфоцити зливають із клітинами мієломи за допомогою придатного реагенту для злиття, наприклад поліетиленгліколю, для того щоб утворити клітини гібридоми (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)). Як правило, при готуванні продукуючих антитіла гібридом використовуються лімфоцити периферичної крові (PBL), якщо бажано одержати клітини людського походження, або ж клітини селезінки або лімфатичних вузлів, якщо необхідні клітини, що походять від ссавців, крім людини. Імморталізовані лінії клітин зазвичай являють собою трансформовані клітини ссавців, зокрема, клітини мієломи, отримані від гризунів, бика або людини. Зазвичай використовують лінію клітин мієломи щурів або мишей. Клітини гібридоми можуть культивуватися в придатному культуральному середовищі, що переважно містить одну або декілька сполук, що інгібують ріст або виживання незлитих, імморталізованих клітин. Наприклад, якщо в батьківських клітинах був відсутній фермент гіпоксантин-гуанінфосфорибозилтрансферази (HGPRT або HPRT), культуральне середовище для гібридом, як правило, буде містити гіпоксантин, аміноптерин і тимідин ("середовище НАТ") - речовини, що перешкоджають росту HGPRT-дефіцитних клітин. До переважних ліній імморталізованих клітин належать такі, які ефективно беруть участь у злитті, підтримують стабільно високий рівень продукції антитіла відібраними антитілопродукуючими клітинами і чутливі до середовища, наприклад до середовища НАТ. До таких ліній клітин мієломи належать лінії мієломи миші, наприклад отримані з мишачих пухлин MOPC21 і MPC-11, що поставляються Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. а також 19 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини SP2/0, FO або X63-Ag8-653, що поставляються American Type Culture Collection, Manassas, VA. Описувалася також продукція моноклональних антитіл людини з ліній клітин мієломи людини і мишачо-людських клітин гетеромієломи (Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); і Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)). Може також використовуватися лінія клітин мієломи миші NSO (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK). В альтернативному варіанті для одержання гібридом пропонується використовувати електричне злиття замість хімічного. Разом злиття В-клітини можуть бути імморталізовані з використанням, наприклад вірусу Епштейна-Барр чи іншого трансформуючого гена, див., наприклад, Zurawaki et al., у Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp. 19-33. (1980). Можуть також використовуватися трансгенні миші і миші з важким комбінованим імунодефіцитом (SCID), яким трансплантовані В-лімфоцити людини. Культуральне середовище, в якому вирощують клітини гібридоми, аналізується на предмет продукції моноклональних антитіл, направлених проти IL-4 і (або) IL-13. Специфічність зв'язування моноклональних антитіл, продукованих клітинами гібридоми, може визначатися за імунопреципітацією або аналізом зв'язування in vitro, наприклад радіоімунологічним аналізом (RIA), флуороцитометричним аналізом (FACS) твердофазним або імуноферментним аналізом (ELISA). Перераховані методики відомі в даній галузі, і ними володіє будь-який фахівець у даній галузі. Афінність зв'язування моноклонального антитіла з IL-4 і (або) IL-13 може, наприклад, визначатися аналізом по Скетчарду (Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)). Після ідентифікації клітин гібридоми, що продукують антитіла з бажаною специфічністю, афінністю і (або) активністю, клони можуть бути субклоновані з використанням процедур серійних розведень і культивуватися за допомогою стандартних методів (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)). До придатних культуральних середовищ, наприклад, належить модифіковане Дульбекко середовище Ігла (DMEM) або середовище RPMI-1640. Крім того, клітини гібридоми можуть вирощуватися in vivo у формі асцитних пухлин в організмі тварини. Моноклональні антитіла, що продукуються субклонами, належним чином відокремлюються або виділяються з культурального середовища, асцитної рідини або сироватки з застосуванням стандартних процедур очищення імуноглобуліну, наприклад білка А-сефароза, білка Gсефароза, хроматографії на гідроксіапатіті, гель-фільтраційної хроматографії, гельелектрофорезу, діалізу або афінної хроматографії. У даній галузі існує широка розмаїтість методик продукції моноклональних антитіл, а тому винахід не обмежується тільки їх продукцією в гібридомах. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути приготовлені на основі методик рекомбінантної ДНК, наприклад, подібних описаній в патенті США № 4816567. У даному контексті термін "моноклональне антитіло" належить до антитіла, отриманого від єдиного еукаріотичного, фагового або прокаріотичного клону. ДНК, що кодує моноклональні антитіла даного винаходу, легко виділяється і секвенується з використанням стандартних процедур (наприклад із застосуванням олігонуклеотидних зондів, що здатні специфічно зв'язуватися з генами, які кодують важкий і легкий ланцюги мишачих антитіл або цього ж ланцюга людини, гуманізовані або з інших джерел) (Innis et al. у PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990), і Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)). Клітини гібридом служать як джерело такої ДНК. Після виділення ДНК може вводитися у вектори експресії, що потім трансфікуються в клітини-хазяїни, наприклад клітини E. coli, клітини NS0, клітини COS, клітини яєчників китайського хом'ячка (CHO) або клітини мієломи, що в інших ситуаціях не продукують імуноглобуліновий білок, для того щоб досягти синтезу моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах-хазяїнах. ДНК може також модифікуватися, наприклад за допомогою підстановки константних доменів кодуючої послідовності важких і легких ланцюгів людини замість гомологічних послідовностей миші (патент США № 4816567; і Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)) або ж ковалентного зв'язування кодуючої послідовності імуноглобуліну із усією або частиною кодуючої послідовності неімуноглобулінового поліпептиду. Такий неімуноглобуліновий поліпептид можна використовувати замість константних доменів антитіла даного винаходу або варіабельних доменів одного із сайтів комбінування IL-4 або IL-13 антитіла даного винаходу, так щоб утворити химерне бівалентне антитіло. Антитіла можуть бути моновалентними. Методи приготування моновалентних антитіл добре відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, один з методів передбачає рекомбінантну експресію легкого ланцюга імуноглобуліну і модифікованого важкого ланцюга. Важкий ланцюг зазвичай обрізається в будь-якій точці області Fc, для того щоб попередити утворення перехресних 20 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зшивок у важкому ланцюзі. В альтернативному варіанті відповідні цистеїнові залишки замінюються іншим амінокислотним залишком або видаляються, для того щоб перешкодити перехресним зшивкам. Фрагменти антитіла, що розпізнають специфічні епітопи, можуть бути отримані з використанням відомих методик. Такі фрагменти традиційно одержують методом протеолітичного руйнування інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); і Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Наприклад, фрагменти Fab і F(ab')2 даного винаходу можуть бути отримані протеолітичним розщепленням молекул імуноглобуліну під дією таких ферментів, як папаїн (для одержання фрагментів F ab) або пепсин (для одержання фрагментів F(ab')2). Фрагменти F(ab')2 містять варіабельну область, константний домен легкого ланцюга і домен CH1 важкого ланцюга. Разом з тим ці фрагменти можуть бути отримані прямо з рекомбінантних клітин-хазяїнів. Наприклад, фрагменти антитіла можуть бути виділені з фагової бібліотеки антитіла. В альтернативному варіанті фрагмени F (ab")2-SH можуть бути прямо виділені з E. coli і хімічно зв'язуватися з утворенням фрагментів F(ab") 2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992). Відповідно до іншого підходу фрагменти F (ab")2 можуть бути прямо виділені з культури рекомбінантних клітин-хазяїнів. Досвідченому експериментатору будуть очевидні й інші методики одержання фрагментів антитіл. В інших прикладах здійснення переважним антитілом є одноланцюжковий фрагмент Fv (Fv) (WO 93/16185). Для деяких додатків, у тому числі застосування антитіл в організмі людини in vivo і аналітичних методах детектування in vitro, може виявитися переважним використовувати химерні, гуманізовані або людські антитіла. Методи одержання химерних антитіл відомі фахівцям у даній галузі, див., наприклад, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); і патенти США №№ 5807715; 4816567 і 4816397. Гуманізовані антитіла одержують з молекул антитіл, що продукуються організмами, крім людини, і зв'язуються з IL-4 і (або) IL-13, причому одна або декілька їх CDR введена в області FR молекули імуноглобуліну людини. Антитіла можуть гуманізуватися на основі множини методик, відомих фахівцям у даній галузі, у тому числі, наприклад, вставки в CDR (EPO 239400; WO 91/09967; і патенти США №№ 5225539; 5530101 і 5585089), зміни поверхні антитіл (resurfacing) (EPO 592106; EPO 519596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); і Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)), і перестановки в ланцюзі (патент США № 5565332). Гуманізоване антитіло містить один або декілька амінокислотних залишків, джерелом яких є будь-який організм, крім людського. Не присутні в людини амінокислотні залишки часто називають "імпортованими" залишками, що зазвичай беруть з "імпортованого" варіабельного домену. Гуманізація може в основному проводитися з використанням методів Вінтера зі співробітниками (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); і Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), за допомогою заміщення нелюдських CDR ділянок або послідовностей CDR відповідними послідовностями антитіла людини. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними (патент США № 4816567), в яких значно менша ділянка в порівнянні з інтактним варіабельним доменом людини заміщена на відповідну послідовність організму, що не є людським. На практиці гуманізовані антитіла зазвичай являють собою антитіла людини, в яких деякі залишки CDR і, можливо, деякі залишки FR заміщені аналогічними сайтами антитіл гризунів. Константна область важкого ланцюга і шарнірна область можуть бути взяті від будь-якого класу або підкласу, для того щоб досягти бажаного ефекту, наприклад конкретної ефекторної функції. Часто остовні залишки остовних областей людини можуть бути замінені відповідним залишком CDR донорного антитіла, для того щоб змінити і, по можливості, поліпшити зв'язування антигену. Остовні заміщення визначають за методами, відомими фахівцям у даній галузі, наприклад за допомогою моделювання взаємодій CDR і остовних залишків, для того щоб визначити остовні залишки, що мають важливе значення для зв'язування антигену, а також шляхом зіставлення послідовності для ідентифікації незвичайних остовних залишків у конкретних положеннях, див., наприклад, патент США № 5585089; і Riechmann et al., Nature 332:323 (1988). Крім того, переважно, щоб гуманізовані антитіла зберігали високу афінність до IL-4 і (або) IL13, а також зберігали або набували інші сприятливі біологічні властивості. Таким чином, гуманізовані антитіла готуються в межах процесу аналізу вихідних послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів за допомогою тримірних моделей вихідних і гуманізованих послідовностей. Тримірні моделі імуноглобулінів широко доступні і відомі фахівцям у даній галузі. Існують комп'ютерні програми, що візуально представляють і 21 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відображають можливі тримірні конформаційні структури вибраних кандидатів імуноглобулінових послідовностей. Вивчення зображень дозволяє проводити аналіз ймовірної ролі різних залишків у функціонуванні імуноглобулінової послідовності-кандидата, тобто аналіз залишків, що впливають на здатність імуноглобуліну-кандидата зв'язувати IL-4 і (або) IL-13. Таким чином, можуть відбиратися і комбінуватися залишки FR з реципієнтної і імпортованої послідовностей, для того щоб максимізувати бажану характеристику антитіла, наприклад афінність до антигену-мішені, що зросла, хоча саме залишки CDR прямо і найбільш істотним чином впливають на зв'язування IL-4 або IL-13. Області CDR також можуть модифікуватися, так щоб містити одну або декілька амінокислот, що відрізняються від отриманих з вихідного антитіла, від якого була взята CDR, для того щоб забезпечити посилення або появу нових цікавих властивостей, наприклад зв'язування з більшою афінністю або більшою авідністю. Можна проводити маніпуляції і вносити зміни у певні частини константних областей антитіла, для того щоб надати гомологам, похідним, фрагментам і іншим елементам антитіла властивості, що відрізняються від спостережених у вихідному антитілі або переважні в порівнянні з ним. Так, наприклад, багато антитіл IgG4 утворюють внутрішньоланцюжкові дисульфідні зв'язки в околицях шарнірної області. Внутрішньоланцюжковий зв'язок здатний дестабілізувати вихідну бівалентну молекулу з утворенням моновалентних молекул, що містять важкий ланцюг з асоційованим легким ланцюгом. Такі молекули можуть знову асоціюватися, але вже випадковим чином. Відзначалося, що модифікація амінокислот у шарнірній області молекул IgG4 може знизити імовірність утворення внутрішньоланцюжкового зв'язку, тим самим стабілізуючи молекулу IgG4, що зведе до мінімуму імовірність утворення біспецифічних молекул. Подібна модифікація може виявитися корисною, якщо використовуваним для лікування антитілом є молекула IgG4, оскільки стабільність, що зросла, буде зводити до мінімуму імовірність дисоціації молекули в процесі одержання і виробництва, а також і in vivo. Моновалентне антитіло може не мати таку ж ефективність, що і бівалентна вихідна молекула. Наприклад, якщо пацієнту вводиться бівалентний IgG4, відсоток бівалентного IgG4 спадає до приблизно 30 % за двотижневий період. Заміщення амінокислоти в положенні 228 збільшує стабільність IgG4. Серин, що знаходиться в положенні 228, може бути заміщений на іншу амінокислоту, наприклад на одну з інших 19 амінокислот. Така зміна може бути зроблена, зокрема, у випадку рекомбінантних антитіл, де кодюча послідовність нуклеїнової кислоти може бути мутована, для того щоб одержати амінокислоту, що заміняє, у положенні 228. Наприклад, компонент S може бути замінений на пролін. Інший набір амінокислот, придатний для модифікації, включає амінокислоти в шарнірній області, що впливають на зв'язування молекули, яка містить важкий ланцюг з рецептором, що зв'язується з Fc, і інтерналізацію зв'язаного антитіла. У молекулах IgG1 до таких амінокислот належно залишки з приблизно 233 по приблизно 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly); (SEQ ID NO:49) із приблизно 252 по приблизно 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (SEQ ID NO:50) і з приблизно 318 (Glu) по приблизно 331 (Pro), включаючи, наприклад, Lys320, Lys 322 і Pro329. Використання повністю антитіл людини особливо бажано при терапевтичному впливі на людей-пацієнтів. Антитіла людини можуть готуватися з застосуванням різних методів, відомих фахівцям у даній галузі, у тому числі методів фаг-дисплею, описаних вище, з використанням бібліотеки антитіл людини, отриманих з імуноглобулінових послідовностей людини, див. патенти США №№ 4444887 і 4716111; і WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 і WO 91/10741. Методики з робіт Cole et al. і Boerder et al. також можуть застосовуватися для приготування моноклональних антитіл людини (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); і Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991)). Антитіла людини можуть бути також отримані з використанням трансгенних мишей, що нездатні до експресії функціональних ендогенних імуноглобулінів, але які також експресують певні гени імуноглобуліну людини. Наприклад, генні комплекси важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну людини можуть вводитися в ембріональні стовбурові клітини миші випадковим чином або за допомогою гомологічної рекомбінації. В альтернативному варіанті варіабельна область людини, константна область і D-область можуть вводитися в мишачі ембріональні стовбурові клітини на додаток до генів важкого і легкого ланцюга людини. Мишачі гени важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну можна перевести в нефункціональний стан окремо або одночасно з введенням локусів імуноглобуліну людини за допомогою гомологічної рекомбінації. Зокрема, гомозиготна делеція в області JH перешкоджає ендогенній продукції антитіла. Модифіковані ембріональні стовбурові клітини розмножують і проводять їх мікроін'єкцію в бластоцисти для одержання химерних мишей. Від химерних мишей потім виводять гомозиготне 22 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потомство, що експресує антитіла людини, див., наприклад, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); і Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)). Трансгенні миші звичайним чином піддаються імунізації цитокіном IL-4 або IL-13, наприклад повною послідовністю IL-4 або IL-13 або її частиною. Моноклональні антитіла, орієнтовані проти IL-4 і IL-13, можуть бути отримані від імунізованих трансгенних мишей за допомогою стандартної гібридомної технології. Трансгени імуноглобуліну людини, накопичені трансгенними мишами, реорганізуються під час диференціації В-клітин і потім піддаються класовому переключенню і соматичній мутації. Таким чином, за допомогою даної методики є можливість продукувати терапевтично застосовні антитіла IgG, IgA, IgM і IgE. Огляд див. у роботі Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995). Обговорення продукції антитіл людини і моноклональних антитіл людини і протоколів одержання таких антитіл: див., наприклад, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096 і WO 96/33735; EPO No. 0 598 877; і патенти США №№ 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 і 5939598. Крім того, такі компанії, як Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) і Medarex, Inc. (Princeton, NJ) можуть залучатися для постачання антитіл людини, націлених проти IL-4 і (або) IL-13, з використанням технології, що аналогічна наведеній вище. Крім того, mAb людини можуть бути приготовлені імунізацією мишей, яким трансплантовані лейкоцити периферичної крові людини, спленоцити або кістковий мозок (наприклад, методика тріом XTL Biopharmaceuticals, Israel). Повністю антитіла людини, що розпізнають вибраний епітоп, можуть бути отримані з використанням методики, що називається "направленою селекцією". У межах цього підходу відібране нелюдське моноклональне антитіло, наприклад мишаче антитіло, використовується для направленої селекції повністю антитіла людини, що розпізнає той самий епітоп (Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988)). При використанні рекомбінантних методик варіант антитіла може продукуватися внутрішньоклітинно, у периплазматичному просторі, або прямо секретуватися в середовище. Якщо варіант антитіла продукується внутрішньоклітинно, на першому етапі можна відокремити залишки частинок, хазяїни або фрагменти після лізису, наприклад за допомогою центрифугування або ультрафільтрації. У роботі Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992) описана процедура ізолювання антитіл, що секретируются в периплазматичний простір E. coli. Коротко, клітинну пасту обробляють ацетатом натрію (pН 3,5) і EDTA. Залишки клітин можна видалити центрифугуванням. Якщо варіант антитіла секретують у середовище, супернатант від такої системи експресії зазвичай спочатку концентрують за допомогою комерційно доступних фільтрів для концентрації білків, наприклад системи ультрафільтрації Amicon або Millipore Pellicon. Для інгібування протеолізу може додаватися інгібітор протеази, наприклад PMSF, а також можна включити антибіотики, щоб перешкодити росту випадкових забруднювачів. Препарат антитіл, приготовлений із клітин, може очищуватися з використанням, наприклад, хроматографії на гідроксіапатиті, гель-електрофорезу, діалізу й афінної хроматографії. Придатність білка А або білка G як афінного ліганду залежить від виду і ізотипу будь-якого домену Fc імуноглобуліну, що міститься у варіанті антитіла. Білок А може застосовуватися для очищення антитіл, в основі яких лежать важкі ланцюги IgG1, IgG2 або IgG4 людини (Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)). Білок G може використовуватися для ізотипів мишей і IgG3 людини (Guss et al., EMBO J 5:1567 (1986)). Як матриця, з яким зв'язується афінний ліганд, найчастіше використовується агароза, але існують і інші матриці. Механічно міцні матриці, наприклад скло з регульованою пористістю або полі(стирол-дивініл)бензол, допускають використання більш високих швидкостей потоку і дозволяють досягати більш коротких часів обробки в порівнянні з агарозою. Якщо у варіант антитіла включений домен CH3, для очищення зручно використовувати смолу Bakerbond ABXTM (JT Baker; Phillipsburg, NJ). Залежно від виділюваного антитіла і його варіанта можуть також застосовуватися інші методики очищення білка, наприклад фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, зворотнофазова ВЕРХ, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарин-агарозі, хроматографія на аніонообмінній або катіонообмінній смолі (наприклад на колонці з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, SDS-PAGE і осадження сульфатом амонію. Після будь-якої стадії (стадій) попереднього очищення можна провести хроматографію з гідрофобною взаємодією при низьких рН для суміші, що містить антитіло, яке представляє інтерес, або його варіант і домішки, в умовах елюювання буфером при pН в інтервалі приблизно 2,5-4,5, що переважно проводиться при низьких концентраціях солей (наприклад в інтервалі приблизно 0-0,25 M солі). Антитіла даного винаходу можуть бути біспецифічними. Біспецифічні антитіла можуть бути моноклональними, переважно антитілами людини або гуманізованими антитілами, що мають 23 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 специфічність зв'язування принаймні двох різних антигенів. У переважному здійсненні біспецифічне антитіло, його фрагмент і т.д. демонструє специфічності зв'язування, спрямовані на IL-4 і IL-13. Методи приготування біспецифічних антитіл добре відомі фахівцям у даній галузі. Зазвичай рекомбінантна продукція біспецифічних антитіл основана на спільній експресії пар важкий ланцюг/легкий ланцюг двох імуноглобулінів, причому два важкі ланцюги мають різні специфічності (Milstein et al., Nature 305:537 (1983)). Внаслідок випадкового розподілу важких і легких ланцюгів імуноглобуліну гібридоми (квадроми) продукують можливу суміш десяти різних молекул антитіл, з яких лише одна має правильну біспецифічну структуру. Очищення потрібної молекули зазвичай проводиться за допомогою декількох стадій афінної хроматографії. Аналогічні процедури описані в заявці WO 93/08829 і в роботі Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991). Інші методи приготування біспецифічних антитіл приводяться, наприклад, у Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004. Варіабельні домени антитіла з бажаними специфичностями зв'язування можуть зливатися з послідовностями константних доменів імуноглобулінів. Злиття переважно проводиться з константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить принаймні частину шарнірних областей CH2 і CH3. Принаймні в одному з продуктів злиття може міститися константна область першого важкого ланцюга (CH1), що включає сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга. ДНК, що кодують продукти злиття важкого ланцюга імуноглобуліну, і, якщо бажано, легкий ланцюг імуноглобуліну вводяться в різні вектори експресії і спільно трансформуються в придатному організмі хазяїна. Більш докладно про одержання біспецифічних антитіл можна довідатися, наприклад, у роботі Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986). Гетерокон'югати антитіл також складають частину даного винаходу. Гетерокон'югати антитіл складаються з двох ковалентно зв'язаних антитіл. Такі антитіла, наприклад, були запропоновані для орієнтування клітин імунної системи на небажані клітини (патент США № 4676980). Передбачається, що антитіла можуть бути приготовлені in vitro за допомогою відомих методів синтетичної хімії білків, у тому числі з застосуванням агентів для перехресних зшивок. Наприклад, імунотоксини можуть конструюватися за допомогою реакції дисульфідного обміну або за рахунок утворення тіоефірного зв'язку. Прикладами придатних для цього реагентів є імінотіолат і метил-4-меркаптобутирімідат, а також запропоновані, наприклад, у патенті США № 4676980. Крім того, можна одержати однодоменні антитіла до IL-4 і (або) IL-13. Приклади подібної технології були описані в заявці WO9425591 для випадку антитіл, отриманих з важкого ланцюга Ig верблюда, а також у US20030130496, де обговорюється виділення однодоменних повністю антитіл людини з фагових бібліотек. В альтернативному варіанті методики, описані при одержанні одноланцюжкових антитіл (патент США № 4946778; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988); і Ward, et al., Nature 334:544 (1989)), можуть бути адаптовані для одержання одноланцюжкових антитіл. Одноланцюжкові антитіла утворюються за допомогою зв'язування фрагментів важкого і легкого ланцюгів області Fv через амінокислотний місток з утворенням одноланцюжкового поліпептиду. Можна також використовувати методики зборки функціональних фрагментів Fv у E. coli (Skerra et al., Science 242:1038 (1988)). Даний винахід включає антитіла, рекомбінантно злиті або хімічно кон'юговані (у тому числі ковалентно і нековалентно кон'юговані) з поліпептидом. Злиті або кон'юговані антитіла даного винаходу можуть використовуватися для простоти очищення, див., наприклад, WO 93/21232; EP 439095; Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); патент США № 5474981; Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992); і Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991). Амінокислотна послідовність маркера може являти собою гексагістидиновий пептид, наприклад подібний до маркера у векторі pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), серед інших, багато з який комерційно доступні, Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989). До інших пептидних маркерів, зручних для очищення, серед інших, відносяться маркер "НА", що відповідає епітопа, отриманому з гемагглютинувального білка грипу (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) і маркер "flag". Можна також створити одноланцюжкові пептидні зв'язуючі молекули, в яких області важкого і легкого ланцюга Fv з'єднані одна з одною. Одноланцюжкові антитіла ("scFv") і метод їх конструювання описані, наприклад, у патенті США № 4946778. В альтернативному варіанті аналогічними способами можна сконструювати і експресувати Fab. Всі повністю або частково антитіла людини можуть бути менш імуногенними, ніж повністю мишачі моноклональні антитіла, фрагменти й одноланцюжкові антитіла також можуть бути менш імуногенними. 24 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла або фрагменти антитіл можуть виділятися з фагових бібліотек антитіл, отриманих за допомогою методик, описаних у McCafferty et al., Nature 348:552 (1990). Clarkson et al., Nature 352:624 (1991) і Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991) розглядають виділення антитіл миші й антитіл людини, відповідно, з використанням фагових бібліотек. У наступних публікаціях описана продукція високоафінних (в інтервалі нм) антитіл людини за допомогою перестановки в ланцюзі (Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)), а також метод комбінаторної інфекції і рекомбінація in vivo як стратегії побудови дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)). Таким чином, подібні методики є практичною альтернативою традиційним гібридомним методикам в одержанні моноклональних антитіл. Потенційні антитіла анти-IL-4 і (або) IL-13 аналізувалися методами твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), FACS, вестерн-блоттингом або іншими імунохімічними методами, відомими фахівцям у даній галузі. Щоб визначити, чи зв'язується той або інший конкретний гомолог антитіла з людським IL-4 і (або) IL-13, можна використовувати будь-який стандартний метод аналізу зв'язування. До зручних методів аналізу зв'язування IL-4 і IL-13 належать аналіз FACS, аналіз ELISA, поверхневий плазмонний резонанс (Biacore), радіоімунологічні методи аналізу і їм подібні, які детектують зв'язування антитіла з IL-4 і (або) IL-13 і виникаючі в результаті функції. Для таких аналізів зручні розглянуті тут такі, що мають повну довжину і розчинні форми IL-4 і IL-13 людини. Зв'язування антитіла або гомолога з IL-4 і (або) IL-13, або з його розчинними фрагментами, можна легко реєструвати за рахунок використання другого антитіла, специфічного до імуноглобулінів виду, від якого отримане антитіло або гомолог. Щоб встановити, чи блокує в помітному ступені те чи інше антитіло або гомолог зв'язування з IL-4 і (або) IL-13, можна скористатися будь-яким зручним методом конкурентного аналізу. До придатних методів аналізу, наприклад, належать методи ELISA, методи FACS, радіоімунологічні методи аналізу і їм подібні, які дозволяють кількісно визначити здатність антитіла або гомолога конкурувати з IL-4 і (або) IL-13. Переважно, оцінюється здатність ліганду блокувати зв'язування міченого IL-4 і (або) IL-13 людини з іммобілізованим антитілом або гомологом. Антитіла даного винаходу можуть описуватися або характеризуватися з точки зору епітопа (епітопів) або частини (частин) IL-4 і (або) IL-13, що антитіло розпізнає або з яким воно специфічно зв'язується. Епітоп (епітопи) або частина (частини) поліпептидів, як описано в даному документі, можуть характеризуватися, наприклад за N-кінцевими і C-кінцевими положеннями, за довжиною безперервного ланцюга амінокислотних залишків, конформаційними епітопами і т.п. Антитіла даного винаходу можуть також описуватися або характеризуватися за перехресною реакційною здатністю. У сферу охоплення даного винаходу також включаються антитіла, що зв'язують поліпептиди IL-4 і (або) IL-13, що характеризуються принаймні 95 %, принаймні 90 %, принаймні 85 %, принаймні 80 %, принаймні 75 %, принаймні 70 %, принаймні 65 %, принаймні 60 %, принаймні 55 % і принаймні 50 % ідентичністю (яка розраховується за допомогою методів, відомих фахівцям у даній галузі й описаних у даному документі) у порівнянні з IL-4 і (або) IL-13. Антитіла даного винаходу можуть також описуватися або характеризуватися за афінністю зв'язування з представляющим інтерес IL-4 і (або) IL-13. Антитіла анти-IL-4 і (або) анти-IL-13 -7 -6 можуть зв'язуватися з KD менше приблизно 10 M, менше приблизно 10 M або менше -5 приблизно 10 M. Більш висока афінність зв'язування розглянутого антитіла може бути більш -8 бажана, наприклад з рівноважною константою дисоціації KD від приблизно 10 до приблизно 10 15 -8 -12 -9 -11 M, від приблизно 10 до приблизно 10 M, від приблизно 10 до приблизно 10 M або від -8 -10 приблизно 10 до приблизно 10 M. У даному винаході також пропонуються антитіла, які конкурентно інгібують зв'язування антитіла з епітопом даного винаходу, що визначається будьяким методом, відомим фахівцям у даній галузі, для реєстрації конкурентного зв'язування, наприклад описаними в даному документі методами імунологічного аналізу. У переважних прикладах здійснення антитіло конкурентно інгібує зв'язування з епітопом принаймні на 95 %, принаймні на 90 %, принаймні на 85 %, принаймні на 80 %, принаймні на 75 %, принаймні на 70 %, принаймні на 60 % або принаймні на 50 %. У сферу охоплення даного винаходу також включаються кон'югати, що містять антитіло, яке представляє інтерес. Кон'югати складаються з двох основних компонентів: розглянутого антитіла і другого компонента, яким може бути зв'язувальний клітини агент, цитотоксичний агент і т.п. Використовуваний у даному документі термін "зв'язувальний клітини агент" належить до речовини, що специфічно розпізнає і зв'язує молекулу на поверхні клітини. Так, як зв'язувальна клітина агента може виступати антиген CD, патогенний антиген, наприклад вірусний антиген, 25 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 диференціювальний антиген, раковий антиген, клітинноспецифічний антиген, тканиноспецифічний антиген, Ig або подібна до Ig молекула і т.п. Зв'язуючі клітини агенти можуть бути будь-якого типу, що відомий у даний час або стає відомим у майбутньому, до них належать пептиди, небілкові сполуки, сахариди, нуклеїнові кислоти, ліганди, рецептори і т.п., або їх комбінації. Зв'язуючим клітини агентом може бути будьяка сполука, що зв'язує клітину як специфічним, так і неспецифічним чином. Як правило, як агент може виступати антитіло (особливо моноклональне антитіло), лімфокіни, гормони, фактори росту, вітаміни, молекули-переносники поживних речовин (наприклад трансферрин) чи будь-яка інша зв'язуюча клітину молекула або речовина. До інших прикладів зв'язуючих клітину агентів, що можуть використовуватися в даному винаході, належать: поліклональні антитіла, моноклональні антитіла і фрагменти антитіл, наприклад, Fab, Fab', F(ab')2 і Fv (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974); і Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)). Другим компонентом також може бути цитотоксичний агент. Використовуваний у даному документі термін "цитотоксичний агент" належить до речовини, що пригнічує або блокує функціонування або ріст клітин і (або) викликає деструкцію клітин. Так, як цитотоксичний агент може виступати таксол, майтансиноїд, наприклад DM1 або DM4, CC-1065 або CC-1065 аналог, рицин, мітоміцин C і т.п. У деяких прикладах здійснення цитотоксичний агент, подібно до будьякого зв'язуючого агента кон'югата даного винаходу, ковалентно зв'язаний з антитілом, що представляє інтерес, прямо або через розщеплюваний або нерозщеплюваний лінкер. Прикладами придатних майтансиноїдів є майтансинол і аналоги майтансинолу. Майтансиноїди пригнічують утворення мікроканальців і найвищою мірою токсичні для клітин ссавців. До прикладів придатних аналогів майтансинолу належать такі, що мають модифіковане ароматичне кільце, а також аналоги з модифікаціями в інших положеннях. Такі придатні для використання майтансиноїди пропонуються в патентах США №№ 4424219; 4256746; 4294757; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 6333410; 5475092; 5585499 і 5846545. Приклади придатних аналогів майтансинолу з модифікованим ароматичним кільцем включають: (1) C-19-дехлор (патент США № 4256746) (одержуваний, наприклад, LAHвідновленням ансамітоцину P2); (2) C-20-гідрокси (або C-20-деметил) +/- C-19-дехлор (патенти США № 4361650 і 4307016) (одержуваний, наприклад, деметилуванням з використанням стрептоміцетів або актиноміцетів чи дехлоруванням із застосуванням літійалюмінійгідриду (LAH)); і (3) C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США № 4294757) (одержуваний ацилуванням під дією ацилхлоридів). Приклади придатних аналогів майтансинолу з модифікаціями в інших положеннях включають: (1) C-9-SH (патент США № 4424219) (одержуваний за реакцією майтансинолу з H2S або P2S5); (2) C-14-алкоксиметил (деметокси/CH2OR) (патент США № 4331598); (3) C-14гідроксиметил або ацилоксиметил (CH2OH або CH2OAc) (патент США № 4450254) (одержуваний з нокардій); (4) C-15-гідрокси/ацилокси (патент США № 4364866) (одержуваний конверсією майтансинолу стрептоміцетами); (5) C-15-метокси (патенти США № 4313946 і 4315929) (що виділяється з Trewia nudiflora); (6) C-18-N-деметил (патенти США № 4362663 і 4322348) (одержуваний деметилуванням майтансинолу стрептоміцетами); і (7) 4,5-деокси (патент США № 4371533) (одержуваний відновленням майтансинолу під дією трихлористого титану/LAH). Цитотоксичні кон'югати можуть бути отримані методами in vitro. Для зв'язування цитотоксичного агента, ліків або проліків з антитілом, як правило, використовується лінкерна група. Придатні лінкерні групи відомі фахівцям у даній галузі, до них належать дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотонестійкі групи, фотолабільні групи, групи, нестійкі до впливу пептидази, а також групи, нестійкі до впливу естерази. Наприклад, кон'югати можуть конструюватися за допомогою реакції дисульфідного обміну або за рахунок утворення тіоефірного зв'язку між антитілом, що представляє інтерес, і ліками або проліками. Як обговорювалося вище, у даному винаході пропонуються послідовності виділених нуклеїнових кислот, що кодують описані в даному документі антитіло або його функціональний фрагмент або варіант, конструкції векторів, що включають нуклеотидну послідовність, що кодує зв'язувальну частину антитіла або функціонального фрагмента IL-4 і (або) IL-13 даного винаходу, клітини-хазяїни, що несуть такий вектор, а також рекомбінантні методики продукції такого поліпептиду. Вектор, як правило, складається з компонентів, відомих фахівцям у даній галузі, і зазвичай, серед інших, включає один або декілька перерахованих нижче елементів: сигнальна 26 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність, точка початку реплікації, один або декілька маркерів або генів селекції, послідовності, що сприяють і (або) стимулють трансляцію, енхансер і т.п. Таким чином, вектори експресії містять нуклеотидну послідовність, що функціонально зв'язана з такими придатними транскрипційними або трансляційними регуляторними нуклеотидними послідовностями, наприклад похідними генів ссавців, мікробів, вірусів або комах. До прикладів додаткових регуляторних послідовностей належать оператори, рибосомальні сайти зв'язування мРНК і (або) інші відповідні послідовності, що контролюють транскрипцію і трансляцію, наприклад їх ініціювання і припинення. Нуклеотидні послідовності є "функціонально зв'язаними", якщо регуляторна послідовність має функціональне відношення до нуклеотидної послідовності відповідного поліпептиду. Так, нуклеотидна послідовність промотору функціонально зв'язана, наприклад, з послідовністю важкого ланцюга антитіла, якщо нуклеотидна послідовність промотору контролює транскрипцію такої нуклеотидної послідовності. Крім того, у вектори експресії можуть вбудовуватися послідовності, що кодують відповідні сигнальні пептиди, які зазвичай не є природним чином зв'язаними з послідовностями важкого і (або) легкого ланцюгів антитіла. Наприклад, нуклеотидна послідовність сигнального пептиду (секреторний лідер) може бути злита всередині рамки з поліпептидною послідовністю, так щоб антитіло секретувалося у периплазматичний простір або в середовище. Сигнальний пептид, що діє в передбачуваних клітинах-хазяїнах, підсилює позаклітинну секрецію відповідного антитіла або його частини. Сигнальний пептид може відщеплюватися від поліпептиду при виділенні антитіла з клітини. Приклади таких секреторних сигналів добре відомі і включають, наприклад, описані в патентах США № 5698435; 5698417 і 6204023. Як вектор може виступати плазміда, одноланцюжковий або дволанцюжковий вірусний вектор, одноланцюжкова або двухланцюжкова РНК або ДНК фагового вектора, фагмід, або будь-який інший носій представляючого інтерес трансгена. Такі вектори можуть вводитися в клітини як полінуклеотиди, з використанням добре відомих методик введення ДНК і РНК у клітини. Вектори, у випадку фагових або вірусних векторів, також можуть вводитися в клітини у формі вірусу в оболонці або в капсулі з використанням добре відомих методик інфекції і трансдукції. Вірусні вектори можуть бути компетентними або дефективними відносно реплікації. В останньому випадку розмноження вірусу буде, як правило, проходити тільки в комплементарних клітинах-хазяїнах і з використанням множинних векторів, що несуть різні вірусні компоненти, необхідні для продукції частинок. Безклітинні системи трансляції можуть також застосовуватися для продукції білка з використанням РНК, отриманих з існуючих конструкцій ДНК (див., наприклад, WO 86/05807 і WO 89/01036; і патент США № 5122464). Експресія антитіл даного винаходу може здійснюватися в будь-якій клітині-хазяїні. До прикладів клітин-хазяїнів, придатних для використання в даному винаході, належать прокаріотичні, дріжджові або вищі еукаріотичні клітини, і сюди, серед інших, входять мікроорганізми, наприклад бактерії (зокрема E. coli, B. subtilis, ентеробактер, ервінії, клебсієли, протеус, сальмонели, сератії і шигели, а також паличкоподібні бактерії, псевдомонади і стрептоміцети), трансформовані за допомогою векторів експресії рекомбінантної ДНК бактеріофага, плазмідної ДНК або космідної ДНК, що містять кодуючі послідовності представляючого інтерес антитіла; дріжджі (наприклад сахароміцети, пічіа, актиноміцети, клювероміцети, шизосахароміцети, кандиди, триходерма, нейроспора і гіфоміцети, такі як нейроспора, пеніцил, толіпокладіум і аспергіли), трансформовані за допомогою рекомбінантних векторів експресії дріжджів, що містять кодуючі антитіла послідовності; клітинні системи комах, інфіковані рекомбінантними векторами експресії вірусу (наприклад, бакуловірусу), що містять кодуючі антитіла послідовності; рослинні клітинні системи, інфіковані рекомбінантними векторами експресії вірусу (наприклад, вірус мозаїки кольорової капусти, CaMV; або вірус тютюнової мозаїки, TMV) або трансформовані векторами експресії рекомбінантної плазміди (наприклад, плазміди Ti), що містять кодуючі послідовності антитіла; або ж клітинні системи ссавців (наприклад, клітини COS, CHO, BHK, 293 або 3T3), що несуть рекомбінантні конструкції експресії, які містять промотори, отримані з геному клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу або 7.5K промотор вірусу вісповакцини). Вектори експресії для використання в прокаріотичних клітинах-хазяїнах зазвичай включають один або декілька фенотипічних селектованих маркерних генів. Фенотипічний селектований маркерний ген, наприклад, являє собою ген, що кодує білок, який забезпечує стійкість відносно антибіотиків або задовольняє аутотрофні вимоги. До прикладів придатних для використання векторів експресії для прокаріотичних клітин-хазяїнів належать отримані на основі комерційно доступних плазмід, наприклад серії векторів pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) і pRSET (Invitrogen, 27 UA 104130 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Carlsbad, CA) (Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); і Schoepfer, Gene 124:83 (1993)). До промоторним послідовностей, що зазвичай використовуються для рекомбінантних векторів експресії прокаріотичних клітин-хазяїнів, належать T7, (Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)), βлактамаза (пеніциліназа), промоторна система лактози (Chang et al., Nature 275:615 (1978); і Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)), промоторна система триптофану (Тrр) (Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)), і tac-промотор (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)). У дріжджових векторах часто присутня послідовність точки початку реплікації, наприклад, від плазміди дріжджів 2μ, автономно реплікована послідовність (ARS), область промотору, послідовності поліаденілування, послідовності припинення транскрипції і ген селектованого маркера. До придатних промоторних послідовностей для векторів дріжджів, серед інших, належать промотори металотіонеїну, 3-фосфогліцераткінази (Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)) або інші гліколітичні ферменти (Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)), наприклад енолаза, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо-6-фосфатізомераза, 3фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюкозоізомераза і глюкокіназа. Інші придатні вектори і промотори для використання в експресії дріжджів докладно описані в роботі Fleer et al., Gene 107:285 (1991). Інші придатні промотори і вектори для дріжджів і протоколів трансформації дріжджів добре відомі фахівцям у даній галузі. Протоколи трансформації дріжджів також добре відомі. Один з таких протоколів описаний у Hinnen et al., + Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978), де проводиться відбір трансформантів Trp у селективному середовищі. Застосовна будь-яка клітинна культура еукаріотів, як з культури хребетних, так і безхребетних. До прикладів клітин безхребетних належать клітини рослин і комах (Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, pp. 277-9, Plenum Publishing (1986); і Maeda et al., Nature 315:592 (1985)). Наприклад, для продукції гетерологічних білків можуть використовуватися бакуловірусні системи. У системі комах вірус ядерного поліедрозу Autographa californica (AcNPV) може використовуватися як вектор для експресії чужорідних генів. Вірус росте в клітинах Spodoptera frugiperda. Послідовність кодую чого антитіла може клонуватися під контролем промотору AcNPV (наприклад промотору поліедрину). До інших встановленим хазяїнам належать комарі, Drosophila melanogaster і Bombyx mori. Широко доступні різноманітні вірусні штами для трансфекції, наприклад варіант L1 AcNPV і штам Bm-5 Bombyx mori NPV. Крім того, як відомо фахівцям у даній галузі, клітинні культури рослин, наприклад бавовни, кукурудзи, картоплі, соєвих бобів, петунії, томатів і тютюну, також можуть використовуватися як хазяїни. Використання клітин хребетних і розмноження клітин хребетних у клітинній культурі (культурі тканин) може являти собою стандартну процедуру, хоча в реальності й існують вибагливі лінії клітин, що вимагають, наприклад, спеціалізованого середовища з унікальними факторами, що харчують клітинами і т.п., див. Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973). Приклади придатних для використання ліній клітин-хазяїнів ссавців включають клітини нирок мавпи; клітини мезонефроса людини; клітини нирок новонародженого хом'ячка; клітини яєчників китайського хом'ячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)); мишачі клітини Сертоли; клітини карциноми шийки матки людини (наприклад HeLa); клітини нирок собаки; клітини легені людини; клітини печінки людини; клітини пухлини молочної залози мишей і клітини NS0. Клітини-хазяїни трансформують за допомогою векторів для продукції антитіл і культивують у стандартному пожвиному середовищі, що містить фактори росту, вітаміни, мінеральні речовини і т.п., а також індуктори, що підходять для використовуваних клітин і векторів. Широко застосовувані послідовності промотору і послідовності енхансера одержують з вірусу поліоми, аденовірусу 2, вірусу мавп 40 (SV40) і цитомегаловірусу людини (CMV). Послідовності ДНК, отримані з вірусного геному SV40, можуть використовуватися для підготовки інших генетичних елементів для експресії структурної генетичної послідовності в клітинах-хазяїнах ссавців, наприклад отриманих з SV40, ранніх і пізніх промоторів, енхансера, сайтів сплайсинга і поліаденілування. Вірусні ранні і пізні промотори особливо зручні, оскільки і той, і інший достатньо просто одержати з вірусного геному у вигляді фрагмента, що також може містити вірусну точку початку реплікації. У продажу є комерційно доступні стандартні вектори експресії для використання в клітинах-хазяїнах ссавців. Для культивування клітин-хазяїнів придатні комерційно доступні середовища, наприклад середовище Хема F10, мінімальне підтримуюче середовище (MEM), RPMI-1640 і модифіковане Дульбекко середовище Ігла (DMEM). Крім того, будь-яке середовище з описаних у Ham et al., 28