Спосіб збільшення біомаси рослини

Реферат: Винахід стосується застосування адреномедуліну для збільшення біомаси рослин і є корисним для його застосування в деревообробній промисловості, у виробництві енергії, одержуваної з відновлюваних джерел, і в сільському господарстві. UA 111823 C2 (12) UA 111823 C2 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 СПОСІБ ЗБІЛЬШЕННЯ БІОМАСИ РОСЛИНИ Сфера техніки, якої стосується винахід Даний винахід стосується сфери біотехнології, зокрема, виробництва рослинної біомаси. Даний винахід, таким чином, стосується застосування пептиду, що включає шестичленне кільце, утворене дисульфідним зв'язком між двома цистеїнами, у збільшенні біомаси рослини, що знаходить застосування в деревообробній промисловості, при отриманні енергії з відновлюваних джерел і в сільському господарстві. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Ріст клітин як у рослин, так і у тварин, керується рядом позаклітинних сигналів, відомих як гормони або фактори росту (Galinha et al. 2009, Semin Cell Dev Biol. 20:1149-1156), які діють через специфічні мембранні рецептори (Santner and Estelle 2009, Nature 459:1071-1078; De, I et al. 2009, Nat Cell Biol 11:1166-1173). Гормони можуть синтезуватися в рослинах або можуть надходити з інших організмів, як у випадку факторів, продукованих ризобактеріями, які сприяють росту своєї рослини-симбіонта (Lugtenberg and Kamilova 2009, Annu Rev Microbiol 63:541-556). Існує п'ять груп факторів росту рослин: ауксини, гібереліни, цитокініни, абсцизова кислота й її похідні, й етилен. Вказані речовини широко поширені й можуть, фактично, бути виявлені у всіх вищих рослин. Вони є специфічними відносно своєї дії, активними при дуже низьких концентраціях і регулюють ріст клітин, поділ клітин і диференціювання, а також органогенез, старіння і латентний стан. Менш поширено, хоча не є зовсім невідомим, явище, при якому збереження структури фактора росту відбувається таким чином, що вказаний фактор росту є функціональним як у рослин, так і в тварин. Типовим прикладом є глікопротеїн, відомий як гранулін, що має представників від грибів до ссавців і виконує такі різні функції, як модуляцію вегетативного росту в овочів або регуляцію раку в тварин (Bateman and Bennett 2009, Bioessays 31:1245-1254). Із метою регулювання розвитку рослин і збільшення рослинної біомаси було зроблено множину спроб керувати їхнім ростом за допомогою застосування хімічних сполук, таких як, наприклад, описані в заявці на патент EP0934951A1, або добрива. У заявці на патент US2010/0016166A1 описаний спосіб збільшення кількості насіння і квіток рослини, який включає культивування рослини в присутності глутамату. У заявці на міжнародний патент WO2010/001184A1 описана композиція, яка включає (І) мікронізований природний мінерал кальцит; (ІІ) мікронізований цеоліт; і (ІІІ) одну або більше добавок для стимуляції росту рослини й підвищення врожайності. Утім, застосування мінеральних добрив має негативний вплив на сільськогосподарське виробництво, оскільки високі концентрації добрива можуть ушкоджувати ґрунт, і не завжди досягається необхідна врожайність. В останні роки, і завдяки успіхам у генній інженерії, була створена нова стратегія збільшення біомаси рослин, що складається з регуляції експресії певних генів, які керують метаболізмом рослинної клітини. У цьомвідносно в заявці на патент США US2009/0094716A1 описаний спосіб збільшення біомаси рослини, що включає маніпуляцію експресією гена fve, який кодує білок (FVE), що містить 6 копій домену WD40. Інгібування експресії FVE призводить до рослини з поліпшеними сільськогосподарськими властивостями, зокрема, збільшеним виходом біомаси, виробленої рослиною, у порівнянні з контрольною рослиною. Крім того, у заявці на міжнародний патент WO2007/027866 описано застосування рекомбінантної ДНК для експресії білків, застосовних у контролі морфології, фізіології й росту рослини. Вказана рекомбінантна ДНК включає функціональний у рослинах промотор, ковалентно зв'язаний із нуклеотидною послідовністю, що кодує білок, який містить щонайменше один домен білків сімейства Pfam. У заявці на патент WO2009/003429A2 описаний спосіб регуляції продукції біомаси в рослинах, що включає модифікацію експресії гена ckil або його ортологів або гомологів. У заявці на патент США US2010/0037351A1 описане збільшення біомаси рослини й разом із тим урожайності рослини в умовах гіперосмотичного стресу за допомогою надекспресії в рослинах гена, що кодує фосфоліпазу Dє (РLDє). Утім, способи, що включають генетичну модифікацію рослини, зазвичай дорогі й не приймаються суспільством. У заявці на міжнародний патент WO2004/035798 розкрита ідентифікація генів, експресія яких підвищується або знижується в трансгенних рослинах, що надекспресують E2Fa/DPa, та їхнє застосування для зміни характеристик рослини; зокрема, розкритий білок SEQ ID NO: 1848, хоча його можливе застосування як фактор росту рослин не показано. Крім того, у заявці на міжнародний патент WO2004/035798 розкритий, загалом, спосіб одержання рослини зі збільшеною врожайністю в порівнянні з відповідною рослиною дикого типу, який включає, щонайменше, підвищення активностей групи білків, яка включає білки SEQ ID NO: 4659 і 4660, хоча здатність вказаних білків збільшувати біомасу рослин не розкрита. 1 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Таким чином, на рівні техніки існує потреба у створенні способів збільшення біомаси рослини, альтернативних уже існуючим, і, разом з цим, урожайності, що не мають вищевказаних недоліків. Нещодавно було встановлено, що введення адреномедуліну в рослини й водорості збільшує їхню біомасу. Адреномедулін (AM) і пептид довжиною 20 амінокислот N-кінцевої ділянки проадреномедуліну (PAMP) утворюються в результаті посттрансляційного процесингу одного й того ж білка, препроадреномедуліну, який кодується геном adm. Незважаючи на відсутність деякої структурної подібності, обидва пептиди викликають подібні й численні фізіологічні відповіді. Серед них - судинорозширювальна дія, бронхорозширювальна дія, ефект регуляції рухливості й росту клітин, ефект модуляції для секреції інших гормонів і ефект регуляції кишкової абсорбції (Lopez, J and Martinez, A. 2002. Int Rev Cytol 221:1-92). Відносно ракових клітин AM діє подібно до фактору росту, підвищує рухливість клітин, зменшує апоптоз і викликає ангіогенез (Martinez et al. 2002, J Natl Cancer Inst 94:1226-1237). СУТЬ ВИНАХОДУ Автори даного винаходу виявили, що, несподівано, введення адреномедуліну в рослини й водорості (включаючи мікроводорості), загалом, "фотосинтезуючі організми", викликає в вказаних організмах ріст їхньої біомаси, виявляючи, таким чином, нове застосування вказаного білка як фактора росту в рослинах і водоростях. Як показано в Прикладі 1, калуси моркви й тютюну вміщували в умови з концентраціями адреномедуліна, що збільшуються, і спостерігали, що в порівнянні з контрольним зразком відбувалося збільшення росту калусів відповідно до дозозалежної відповіді (Фігура 1). Крім того, Приклад 2 показує, що мікроводорості (Chlorella), оброблені адреномедуліном, ростуть швидше, ніж необроблені мікроводорості. Таким чином, на підставі вказаних відкриттів, даний винахід дозволяє збільшувати рослинну біомасу рослини або водорості без необхідності в застосуванні гормонів (гіберелінів, ауксинів, цитокінінів тощо) або агрохімічних продуктів. Крім того, за умови, що це - фактор, не властивий фотосинтезуючому організму (тобто він не виробляється рослинами або водоростями в природі), він не буде викликати побічних ефектів відносно фізіології рослини (рух соку, відкриття устячок, пружність, відносини з грибами-симбіонтами тощо) або фізіології водорості й впливати тільки на ріст рослини або водорості, що є ефектом, який спостерігали. Додатково, той факт, що він не виробляється в рослинах або водоростях у природних умовах, полегшує екологічний контроль і контроль за поширенням генетично модифікованого матеріалу. З іншого боку, відомо, що адреномедулін містить характерний мотив (або ідентифікуючу ознаку) у своїй амінокислотній послідовності, який бере участь у пізнаванні рецептора й складається з кільця із 6 амінокислот, сформованого дисульфідним зв'язком між двома цистеїнами [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]. Таким чином, не бажаючи бути зв'язаними з якоюнебудь теорією, передбачається, що будь-який білок, який містить вказаний мотив у своїй амінокислотній послідовності, буде пізнавати рецептор і викликати процеси, які призводять до збільшення біомаси вказаних фотосинтезуючих організмів (наприклад, рослин або водоростей), виконуючи свою роль як фактор росту. Таким чином, на підставі вказаного нового ефекту адреномедуліну відносно фотосинтезуючих організмів (наприклад, рослин і водоростей) і приймаючи до уваги мотив, присутній у його амінокислотній послідовності, були визначені наступні аспекти винаходу: - Спосіб збільшення біомаси фотосинтезуючого організму, наприклад, рослини або водорості, який включає культивування вказаного фотосинтезуючого організму в присутності пептиду, що включає: (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1] де Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту, і (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), які формують дисульфідний місток між ними. - Генна конструкція, що включає: (a) нуклеїнову кислоту, що кодує пептид, який включає: (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1] де Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту і (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), які формують дисульфідний місток між ними, і (b) регуляторні елементи для регуляції її експресії в фотосинтезуючому організмі. 2 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - Вектор, клітина-хазяїн, клітина трансгенного фотосинтезуючого організму і трансгенний фотосинтезуючий організм, наприклад, рослина або водорості, що включають генну конструкцію, таку як конструкція, визначена вище, або нуклеїнову кислоту, що кодує пептид, який включає: (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1], в якій Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту, і (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), які формують дисульфідний місток між ними. Вказані аспекти винаходу, а також інші конкретні варіанти його здійснення будуть докладно обговорюватися нижче в докладному описі винаходу. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1 являє собою гістограму, на якій показаний відносний ріст біомаси рослини залежно від молярної концентрації адреномедуліну, присутнього в середовищі. Кожен стовпчик являє собою статистичне середнє й стандартне відхилення для 8 незалежних повторів. Фігура 2 являє собою графік, на якому показана дія адреномедуліну на мікроводорості (Chlorella); мікроводорості, оброблені адреномедуліном, ростуть швидше, ніж необроблені мікроводорості. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Спосіб винаходу В одному аспекті винахід стосується способу збільшення біомаси фотосинтезуючого організму (що надалі називається способом винаходу), який включає культивування вказаного фотосинтезуючого організму в присутності пептиду (що надалі називається фактором росту винаходу), який включає: (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1] де Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту, і (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), які формують дисульфідний місток між ними. Амінокислоти Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 можуть бути однаковими або відмінними один від одного. У конкретному варіанті здійснення Xaa1, Xaa2, Xaa3 і/або Xaa4 є амінокислотою, відмінною від Cys. Використовуваний у даній заявці термін "фотосинтезуючий організм" включає будь-який організм, здатний здійснювати фотосинтез, тобто процес, який перетворює вуглекислий газ у органічні сполуки, особливо цукри, із використанням енергії сонячного світла. Фотосинтез відбувається в рослинах, водоростях і багатьох видах бактерій, наприклад, ціанобактеріях тощо, але не в археях. Фотосинтезуючі організми також називають фотоавтотрофами, оскільки вони можуть створювати свою власну їжу. Термін "рослина", використовуваний у даній заявці, включає живі організми, що відносяться до царства Рослини, наприклад, дерева, квіти, трав'янисті рослини, кущі, трави, виткі рослини, папороті, мохи, зелені водорості тощо. Зараз рослини можуть бути розділені на три групи, а саме: (І) Наземні рослини або ембріофіти, більш формально Embryophyta або Metaphyta, які складають саму відому групу рослин і включають безсудинні наземні рослини або бріофіти (мохоподібні), судинні рослини або трахеофіти, які включають насінні рослини або сперматофіти; (ІІ). Зелені рослини, також відомі як Viridiplantae, Viridiphyta або Chlorobiont; і (ІІІ) Archaeplastida, Plastida або Primoplantae. Використовуваний у даній заявці термін "водорость" включає велику й різноманітну групу простих, як правило, автотрофних, організмів, від одноклітинних до багатоклітинних форм. У конкретному варіанті здійснення водорость є мікроводоростю, тобто мікроскопічною водоростю, як правило, що зустрічається у прісноводних і морських системах. Використовуваний у даній заявці термін "ціанобактерії", який зазвичай називають синьозеленими водоростями, хоча й відносили традиційно до водоростей у більш ранніх підручниках, багато сучасних джерел вважають це застарілим, оскільки вони, як тепер вважають, є бактеріями. У рамках даного винаходу "біомаса фотосинтезуючого організму" розуміється і як кількість біологічного матеріалу або органічної речовини, яка складає фотосинтезуючий організм, і як біологічний матеріал або органічна речовина, що утворюються в біологічному процесі, спонтанному або не спонтанному (тобто викликаному). В одному варіанті здійснення біомаса може застосовуватися як джерело енергії, наприклад, деревина, відходи, (водневмісний) газ, спиртові палива тощо. В одному варіанті здійснення, в якому фотосинтезуючий організм є судинною рослиною, біомаса вказаної рослини включає кількість біологічного матеріалу або органічної речовини, присутньої в рослині, тобто біологічний матеріал або органічна речовина, що складає надземну 3 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частину рослини, тобто стебло, стовбур, листя, гілки, плоди, суцвіття тощо (надземна біомаса), так і його підземну частину, тобто корені, калуси, бульби тощо (підземна біомаса). "Біомаса рослини" часто вимірюється як суха маса або вага (або "сира вага" у відповідних випадках) рослини. У даному винаході вислів "збільшення біомаси фотосинтезуючого організму" варто розуміти як вплив на фотосинтезуючий організм із отриманням швидкості росту, що перевищує 1, де швидкість росту (GR) визначається формулою: GR = Кінцева вага/початкова вага Інший спосіб виміру збільшення біомаси фотосинтезуючого організму заснований на обчисленні відносної швидкості росту (RGR) або приросту біомаси в розрахунку на одиницю біомаси й час і визначається формулою: RGR=(Ln2-Ln1)/(t1-t2), в якій W 1 і W 2 являють собою вагу рослини в моменти часу 2 і 1 (t 2-t1, відповідно) [Valladares, F. 2004, Ecologia del bosque mediterráneo en un mundo cambiante, pp. 191-227. Ministerio de Medio Ambiente (Ministry of the Environment), EGRAF, S.A., Madrid]. Як зуміє оцінити фахівець, кваліфікований у даній сфері техніки, у випадку судинних рослин у рівні техніки існують інші параметри, які прямо або непрямо зв'язані з GR і можуть застосовуватися для визначення росту рослинної біомаси вказаної рослини. Ілюстративні, необмежувальні приклади вказаних параметрів включають: - відношення площі листка (LAR) або відношення площі листка до повної ваги рослини. Її 2 -1 виражають у м (лист) кг (рослина). Площа листка може бути виміряна декількома способами. Існують автоматичні пристрої для виміру площі листка, які забезпечені відеокамерою, цифровою картою і комп'ютерною програмою для аналізу зображення, які забезпечують досить швидке виконання вимірів площі (на додаток до інших вимірів: ширина, довжина тощо) деякої кількості листя. Інша система дозволяє фотокопіювати або сканувати листя й за допомогою програми для аналізу зображення оцінює поверхню. Інша проста альтернатива є у вирізанні силуетів фотокопійованого листя й їхньому зважуванні з використанням вирізуваного за їх контуром паперу з відомою площею поверхні для калібрування співвідношення ваги/площі. Після виміру площі поверхні листків листя зберігають у паперових конвертах із їх описом, сушать у термостаті й зважують, одержуючи, таким чином, "суху вага"; 2 - питому площу листка (SLA) або відношення площі листка до ваги листка. Її виражають у м -1 (листок) кг (рослина); - середню фракцію листя (LMF) або відношення біомаси листя до повної біомаси рослини. Її -1 виражають у кг (листок) кг (рослина); або - швидкість істинної асиміляції (NAR) або швидкість збільшення ваги рослини на одиницю -2 -1 площі листка. Її виражають у кг (рослина) м (листок) день . Відносна швидкість росту дорівнює добутку LAR і NAR. Інші параметри аналізу росту включають: - фракцію маси стебла (SMF) або відношення біомаси стебла до повної біомаси рослини. Її -1 виражають у кг (стебло) кг (рослина); - фракцію маси кореня (RMF) або відношення біомаси кореня до повної біомаси рослини. Її -1 виражають у кг (корінь) кг (рослина); і - суха речовина (DM) або відношення сухої ваги рослини до сирої ваги рослини. Її -1 виражають у кг (суха вага) кг (сира вага). Спосіб відповідно до винаходу може бути застосований до будь-якого типу фотосинтезуючого організму, наприклад, рослини, водорості тощо. Таким чином, згідно з даним винаходом, при контакті фактично будь-якого фотосинтезуючого організму з фактором росту винаходу одержують збільшення біомаси вказаного фотосинтезуючого організму. Як вказано на початку даного опису, фактор росту винаходу являє собою пептид, що включає мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]. Утім, у конкретному варіанті здійснення, фактор росту винаходу є пептидом, що включає мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], за умови, що вказаний пептид не є пептидом SEQ ID NO: 4 або пептидом SEQ ID NO: 6. Як зуміє оцінити фахівець, кваліфікований у даній сфері техніки, вказаний мотив, необов'язково, буде фланкований іншими амінокислотними послідовностями, що складають частину пептиду, ідентифікованого як фактор росту винаходу. Таким чином, у конкретному варіанті здійснення вказаний пептид (фактор росту винаходу) включає амінокислотну послідовність: X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2 В якій: - X1 позначає амінокислотну послідовність N-кінця пептиду, і 4 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - X2 позначає амінокислотну послідовність C-кінця пептиду. Використовуваний у даному описі термін "пептид" стосується молекули, сформованої при зв'язуванні амінокислот шляхом пептидних зв'язків, і він включає, із метою спрощення, пептиди, поліпептиди й білки, хоча зазвичай прийнято, що термін "білок" застосовують до повних біологічних молекул зі стабільною конформацією, тоді як термін "пептид" зазвичай стосується амінокислотних олігомерів із коротким ланцюгом, які часто не мають стабільної тривимірної структури; аналогічним чином, термін "поліпептид" зазвичай стосується будь-якого бічного ланцюга амінокислот, незалежно від їхньої довжини (у більшості випадків), яка часто не має визначеної конформації. Хоча довжина амінокислотної послідовності N-кінцевого пептиду (X1) може змінюватися в межах широкого діапазону, у конкретному варіанті здійснення X 1 має довжину в межах від 1 до 250 амінокислот, або ще більш типово в межах від 1 до 175 амінокислот, зазвичай у межах від 1 до 100 амінокислот, частіше в межах від 1 до 50 амінокислот, ще частіше в межах від 2 до 40 амінокислот, і навіть ще частіше в межах від 5 до 35 амінокислот. Аналогічним чином, хоча довжина амінокислотної послідовності C-кінця (або карбоксильного кінця) пептиду (X2) може змінюватися в межах широкого діапазону, у конкретному варіанті здійснення X2 має довжину в межах від 1 до 250 амінокислот або ще більш типово в межах від 1 до 175 амінокислот, зазвичай у межах від 1 до 100 амінокислот, частіше в межах від 1 до 50 амінокислот, ще частіше в межах від 2 до 40 амінокислот. У конкретному варіанті здійснення амінокислотна послідовність C-кінця пептиду (X2) включає амінокислотну послідовність GRRRR (SEQ ID NO: 7), яка, в іншому конкретному варіанті здійснення, розташована на відстані 10-50 амінокислот від останнього Cys послідовності Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, тобто між останньою амінокислотою (Cys) вказаної послідовності й першою амінокислотою (G) послідовності GRRRR (SEQ ID NO: 7) є присутніми від 10 до 50 амінокислот. У конкретному варіанті здійснення C-кінець X2 амідований. Ілюстративні приклади пептидів, що включають указаний мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4Cys], включають, крім іншого, адреномедулін, білки Arabidopsis, амінокислотні послідовності яких показані в послідовностях SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 6, білки Oryza sativa (рис), амінокислотні послідовності яких показані в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10, і білок Thalassiosira pseudonana (діатомова водорость), амінокислотна послідовність якого показана в послідовності SEQ ID NO: 11. Таким чином, у конкретному варіанті здійснення способу винаходу фактор росту винаходу вибраний із групи, що складається з адреномедуліну, пептидів, амінокислотні послідовності яких показані в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 11, та їхніх комбінацій, які будуть докладно описані нижче. Адреномедулін Адреномедулін (AM) являє собою гіпотензивний пептид, спочатку виявлений у феохромоцитомі людини, який складається з 52 амінокислот, має внутрішньомолекулярний дисульфідний місток [Cys-Cys] і має високу гомологію з пептидом, зв'язаним із геном кальцитоніну. Білок-попередник, препроадреномедулін (SEQ ID NO: 2) має довжину 185 амінокислот (номер GenBank AAC60642.1), який в результаті внутрішньоклітинного процесингу приводить до утворення зрілого білка, що містить 52 амінокислоти, який і є адреномедуліном. У конкретному варіанті здійснення способу винаходу AM є адреномедуліном людини, визначеним у SEQ ID NO: 3. Не бажаючи бути зв'язаними з якою-небудь теорією, передбачається, що факт наявності активності AM людини в тканинах рослин обумовлений існуванням подібного фактору в рослинах або в мікроорганізмах, зв'язаних із ними. SEQ ID NO: 2 (препроадреномедулін) MKLVSVALMY LGSLAFLGAD TARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL [Амінокислотна послідовність адреномедуліну підкреслена, а амінокислотна послідовність мотиву GRRRR підкреслена подвійною лінією й виділена жирним шрифтом] SEQ ID NO: 3 (людський адреномедулін) YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2 [Характеристичний мотив адреномедуліну (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys) виділений жирним шрифтом, при цьому два цистеїну, що формують дисульфідний місток, підкреслені] 5 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як буде очевидно фахівцю, кваліфікованому в даній сфері техніки, будь-який варіант SEQ ID NO: 3, що має здатність збільшувати біомасу фотосинтезуючого організму, також включений у даний винахід. Використовуваний у даному описі термін "варіант SEQ ID NO: 3" стосується будь-якого пептиду, амінокислотна послідовність якого може бути отримана з SEQ ID NO: 3 за допомогою консервативних амінокислотних замін з перевіркою того, що отриманий у результаті варіант має здатність збільшувати біомасу фотосинтезуючого організму за допомогою виміру кожного із вказаних вище параметрів. Консервативні амінокислотні заміни відносяться до взаємозамінності залишків, що мають подібні бічні ланцюги. Наприклад, група амінокислот, що мають аліфатичні бічні ланцюги, складається із гліцину, аланіну, валіну, лейцину й ізолейцину; група амінокислот, що мають аліфатичні, гідроксильні бічні ланцюги, складається із серину й треоніну; група амінокислот, що мають бічні ланцюги, що містять амідну групу, складається з аспарагіну й глутаміну; група амінокислот, що мають ароматичні бічні ланцюги, складається з фенілаланіну, тирозину й триптофану; група амінокислот, що мають основні бічні ланцюги, складається з лізину, аргініну й гістидину, і група амінокислот, що мають сірковмісні бічні ланцюги, складається із цистеїну й метіоніну. Переважні групи консервативних амінокислотних замін є наступними: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін і аспарагін-глутамін. Функціонально еквівалентні варіанти адреномедуліну включають поліпептиди, які є по суті гомологічними нативному адреномедуліну [SEQ ID NO: 3]. Використовуваний у даному описі вислів "по суті гомологічний" стосується будь-якої амінокислотної послідовності, що володіє ступенем ідентичності відносно амінокислотної послідовності, показаної в SEQ ID NO: 3, щонайменше 50 %, переважно щонайменше 60 %, переважно щонайменше 70 %, більш переважно щонайменше 85 % і ще більш переважно щонайменше 95 %. Ступінь ідентичності між двома пептидами може бути визначена при використанні комп'ютерних алгоритмів і методів, які широко відомі фахівцям, кваліфікованим у даній сфері. Ідентичність між двома амінокислотними послідовностями двох пептидів переважно визначають при використанні алгоритму BLASTP (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J., 1990, Mol. Biol. 215:403-410). З іншого боку, адреномедулін містить у своїй амінокислотній послідовності характеристичний мотив (або ідентифікуючу ознаку), який бере участь у пізнаванні рецептора адреномедуліну й складається з кільця з 6 амінокислот, сформованого дисульфідним зв'язком між двома цистеїнами [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]. Адреномедулін додатково має амідований C-кінець (CONH2), відділений від мотиву приблизно 20-40 амінокислотами. Будьякий варіант адреномедуліну, що містить мотив Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys у своїй амінокислотній послідовності, буде пізнавати рецептор адреномедуліну й викликати процеси, яку призводять до збільшення біомаси фотосинтезуючого організму. Таким чином, даний винахід також розглядає такі варіанти адреномедуліну, які мають здатність збільшувати біомасу фотосинтезуючого організму й включають вказане кільце з 6 амінокислот, сформоване дисульфідним зв'язком між двома цистеїнами. Варіанти SEQ ID NO: 3 можуть додатково мати амідований C-кінець. На закінчення, фрагменти адреномедуліну або його варіанти, як визначено вище, також включені в даний винахід за умови, що вони зберігають здатність збільшувати біомасу фотосинтезуючого організму. Вказана здатність може бути визначена за допомогою параметрів, вказаних у попередніх параграфах. Білки Arabidopsis Інші конкретні варіанти здійснення фактора росту винаходу включають білки Arabidopsis, описані в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 6. Білок, ідентифікований відповідно до послідовності SEQ ID NO:4 [MLDTLIGGIVGGIAGAIGTVDGFARGIGICPDSYQSCTRTDCEEHKKKLPTNLSRNGG AAAVKAKENGRRRRQKPRE-NH2], є білком із невідомою назвою під номером GenBank NP_564910. Білок, ідентифікований відповідно до послідовності SEQ ID NO: 5 [MDPKSCENSSDVKGQTSDSVSKKVLIEEEEDVKKPQQGKENDSRMAKDWSCSSNISAHVVHEEVA DNVTAVSCNEAESDIKAKAKEFHTIDLSGVGERICRICHFGSDQSPEASGDDKSVSPELIEIGCKCKNE LGLAHFHCAEAWFKLRGNSVCEICGCTAKNVTVRLMEDWSGERDNTLDGRRRRGRGQSCCIFMVFL LTILLLHWFFKKISGYYQNT-NH2], є білком сімейства білків із цинковими пальцями (RING палець C3HC4-типи) під номером GenBank NP_180967. Білок, ідентифікований відповідно до послідовності SEQ ID NO: 6 [MGDVILFIDDTKSKVRITRCRICHEEEEESFFEVPCACSGTVKFAHRNCIQRWCNEKGNTTCEICLQV 6 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 YKDGYTAVLKOSKLIEQEVTIRVNGRRRRRSRRLVSIAESDISOCNSVADRGASFCRSLTFTLSVFLLM KHTFDVIYGTEEYPFSVFTVLTLKAIGILLPMFIIIRTISTIQKTLRRRHQYPESEEEDRLSSDDDDDLEEE DEEQQQHLA-NH2], є білком, званим pitchoun 1 (PIT1), із номером GenBank NP_567222. [У всіх випадках характеристичний мотив фактора росту винаходу (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3Xaa4-Cys) виділений жирним шрифтом, два цистеїну, що формують дисульфідний місток, підкреслені, й амінокислотна послідовність мотиву GRRRR підкреслена подвійною лінією й виділена жирним шрифтом] Як зуміє оцінити фахівець, кваліфікований у даній сфері, варіанти й фрагменти указаних білків також включені в рамки даного винаходу за умови, що вони зберігають характеристичний мотив фактору росту винаходу й при введенні у фотосинтезуючий організм збільшують його біомасу. Збільшення біомаси фотосинтезуючого організму може бути встановлене за допомогою кожного з вказаних вищепараметрів, наприклад, за допомогою аналізу збільшення біомаси рослини, такого як аналіз, описаний у Прикладі 1, або за допомогою аналізу збільшення біомаси водорості, такого як аналіз, описаний у Прикладі 2. Термін варіант і його значення в рамках даного винаходу були визначені в попередніх параграфах. Білки Oryza sativa Пептиди, що включають мотив [Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], включають, без обмеження, білки Oryza sativa (рис), амінокислотні послідовності яких показані в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10. SEQ ID NO: 8: MEAAPRDDKPARMNSEDDDGHRRWGSDGGEAMPRTTSPVRRCDAGGGGGVADSAWEEEGP TGEIPARRMERPARHGGVPAKYGRRLDGEDDGVLVPGEWATSASAQETRQRRPEAEQWRQRHCC RRGCTSGGVRGKRRAGRGRGGDYDAGGGDGTAGRRADAAAGVAGFGRRRRRERRSATVWLGRS GRGKTEGEVD* SEQ ID NO: 9 (білок-попередник рецепторної протеїнкінази 2, передбачуваний, експресований): MHAACLCSTCCSCRPRCAARRPRRARRRRCSRGRTPCRARRRRRPASSGRGRRRRRSSRTRT PRRGARGAAWRRRVGRRGGRRRGGAGVAGTLDALDLSSLPGLAALNLSLNSLTGSFPSNVSSPLLS LRSIDLSSNNLSGPIPAALPALMPNLEHLNLSSNQFSGEIPASLAKLTKLQSVVLGSNLLHGGVPPVIGN ISGLRTLELSGNPLGGAIPTTLGKLRSLEHINVSLAGLESTIPDELSLCANLTVIGLAGNKLTGKLPVALA RLTRVREFNVSKNMLSGEVLPDYFTAWTNLEVFQADGNRFTGEIPTAITMASRLEFLSLATNNLSGAIP PVIGTLANLKLLDLAENKLAGAIPRTIGNLTSLETLRLYTNKLTGRLPDELGDMAALQRLSVSSNMLEGE LPAGLARLPRLVGLVAFDNLLSGAIPPEFGRNGQLSIVSMANNRFSGELPRGVCASAPRLRWLGLDD NQFSGTVPACYRNLTNLVRLRMARNKLAGDVSEILASHPDLYYLDLSGNSFDGELPEHWAQFKSLSF LHLSGNKIAGAIPASYGAMSLQDLDLSSNRLAGEIPPELGSLPLTKLNLRRNALSGRVPATLGNAARM EMLDLSGNALDGGVPVELTKLAEMWYLNLSSNNLSGEVPPLLGKMRSLTTLDLSGNPGLCGHDIAGL NSCSSNTTTGDGHSGKTRLVLAVTLSVAAALLVSMVAVVCAVSRKARRAAWVEKAETSASGGGGSS TAAAVQASIWSKDTTFSFGDILAATEHFNDAYCIGKGSFGTVYRADLGGGRAVAVKRLDASETGDAC WGVSERSFENEVRALTRVRHRNIVKLHGFCAMGGYMYLVYELAERGSLGAVLYGGGGGGGCRFDW PARMRAIRGVAHALAYLHHDCSPPMIHRDVSVNNVLLDPDYEPRVSDFGTARFLVPGRSTCDSIAGS YGYMAPELAYMRVTTKCDVYSFGWAMEMLMGKYPGGLISSLQHSPQSLSAEGHDGSGGGGGEEA SASASRRLLLKDVVDQRLDAPAGKLAGQWFAFVVALSCVRTSPDARPTMRAVAQELAARRRPILDRP FEMIKIGDLTNSHR* SEQ ID NO: 10: MSRRGTRRQRDGNGDRGAASSSSPSTSPSHGPAGGWASQIRCCGAWCGGRTSVAVMLGDGA PVLLGRRRRRPPSSLLLMLFFFFFFHVQNACMPCSLAC* [У всіх випадках характеристичний мотив фактора росту винаходу (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3Xaa4-Cys) виділений жирним шрифтом, два цистеїни, формуючі дисульфідний місток, підкреслені, і амінокислотна послідовність мотиву GRRRR підкреслена подвійною лінією й виділена жирним шрифтом] Білок Thalassiosira pseudonana (діатомова водорость) SEQ ID NO: 11: MAPALCGDLISTRRSFLALAWTLTTLLSFFSFWAVFLAGRINQQYISMTSGDYAEWYTHEYGNDF YDRLLEEGSGECCRYLEGGEEGGGGEQQREGEDHDRQEGGSNDRNQLDAEFFQSLANANSRSLE FAGVYTTVLGIALSLYGSTVWGFMSLKGEYIPPCFSFRSMSMIEEEGEVGVEDADTGPRNLWGEKIH RGVFLGCLVIFANLLLLCAVIFGELEVHDNYNNYDQQNNDNIFSYRIEKISSVFAITCIVLACVYVLFAVIY LSCGGMLDDDNDTVQHNTGNWMDHSHSOFELSPRGNGRRRRGRRDMPDKAEPLVSAVGGGITEI GCATRSDERAYVLDEGCIDETT* 7 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [Характеристичний мотив фактора росту винаходу (Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys) виділений жирним шрифтом, два цистеїни, формуючі дисульфідний місток, підкреслені, і амінокислотна послідовність мотиву GRRRR підкреслена подвійною лінією й виділена жирним шрифтом] Для того, щоб фактор росту винаходу справляв необхідний ефект, тобто збільшував біомасу фотосинтезуючого організму, необхідний контакт вказаного фактора росту із вказаним фотосинтезуючим організмом. У рівні техніки існує безліч процесів, які дозволяють вводити активні компоненти (у даному винаході фактор росту винаходу) у фотосинтезуючий організм, особливо рослини. Аналогічним чином, активний компонент включають у композицію в такий спосіб, який підходить для застосовуваного способу введення. Зазвичай для його введення в фотосинтезуючий організм фактор росту винаходу буде частиною композиції, яку можна застосовувати в твердій формі або в рідкій формі, наприклад, у формі змочуваного порошку або емульгованого концентрату, що включає стандартні розріджувачі. Вказані композиції можуть бути отримані стандартним способом, наприклад, при змішуванні фактора росту винаходу з розріджувачем і, необов'язково, з іншими компонентами або елементами. У конкретному варіанті здійснення фотосинтезуючий організм є рослиною, і при цьому композиція, яка включає фактор росту винаходу, може бути отримана, стандартними способами, шляхом змішування фактора росту винаходу з розріджувачем і, необов'язково, з іншими компонентами або елементами, які зазвичай застосовуються в сільськогосподарських композиціях і які відомі фахівцю, кваліфікованому в даній сфері техніки, такими як, крім іншого, розчинники, активні речовини або регулятори pН, добрива тощо. У конкретному варіанті здійснення фактор росту винаходу вводять як добавку, доповнюючу поживний розчин, що надходить рослині в гідропонній системі, або, в іншому конкретному варіанті здійснення, його вводять у поливну воду вказаної рослини. Концентрація фактора росту винаходу в композиції може змінюватися в межах широкого -2 -16 -4 -12 діапазону, як правило, від щонайменше 10 до 10 М, зазвичай від щонайменше 10 до 10 -6 -11 -8 -10 М, частіше від щонайменше 10 до 10 М, ще частіше від щонайменше 10 до 10 М. Додатковими технічними особливостями вказаної композиції є, наприклад, сільськогосподарські прийнятні носії, які можуть використовуватися, додаткові компоненти, які можуть бути включені, форма її подання, спосіб її одержання тощо. У змісті, використовуваному в даному описі, термін "сільськогосподарсько прийнятний носій" включає будь-яку речовину або комбінацію речовин, які можуть застосовуватися в сільськогосподарському секторі, при цьому він включає будь-який сільськогосподарсько прийнятний рідкий або твердий матеріал, який може бути доданий до і/або змішаний з фактором росту винаходу для отримання більш простої або поліпшеної в застосуванні форми, або із застосовною або потрібною інтенсивністю активації. Композиція, описана в даній заявці, також може містити, при необхідності, інші компоненти або елементи, зазвичай використовувані в сільськогосподарських композиціях, такі як, без обмеження, розчинники, активні речовини або регулятори pН, добрива тощо, якщо усі вони дозволяють або не піддають ризику, чи не порушують здатність фактора росту винаходу збільшувати рослинну біомасу рослини. Указані компоненти або елементи, зазвичай використовувані в сільськогосподарських композиціях, загальновідомі фахівцям, кваліфікованим в даній сфері техніки. Композиція, запропонована в даному винаході, може бути отримана стандартними способами, зазвичай заснованими на суміші різних компонентів композиції у відповідних кількостях. Як вказано вище, спосіб винаходу може застосовуватися на будь-якому фотосинтезуючому організмі. У конкретному варіанті здійснення спосіб винаходу застосовують до таких фотосинтезуючих організмів, у яких збільшення біомаси є особливо бажаним, таких як, наприклад, рослини й водорості, які можуть у промисловому масштабі застосовуватися в будьякій галузі промисловості. Таким чином, у конкретному варіанті здійснення фотосинтезуючий організм є рослиною, наприклад, рослиною для застосування у виробництві енергії, наприклад, відновлюваних джерел енергії, для харчування людини або тварин, порід деревини, декоративних рослин тощо. Приклади рослин, біомаса яких використовується у виробництві палив або відновлюваних джерел енергії, включають, без обмеження: (І) рослини для застосування у виробництві електроенергії, одержуваної головним чином із швидкорослих порід дерев для одержання енергії, таких як тополя, верба, евкаліпт, білої акації, хвойних дерев, акації, бананового дерева тощо, а також трав'янистих рослин, таких як будяк, міскантус, гігантський очерет, молочай, опунція тощо; і 8 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ІІ) рослини для застосування у виробництві біопалива: виробництво біоспиртів одержуваних із буряка, кукурудзи, солодкого сорго, цукрової буряка, картоплі, топінамбура тощо, і біомасел, одержуваних із насіння ріпаку, соняшника, сої тощо. Як буде очевидно фахівцю, кваліфікованому в даній сфері техніки, також рослинну біомасу можна застосовувати для одержання теплової енергії й у виробництві паливних газів. Утім, через особливості вказаних процесів (теплова енергія складається із застосування систем прямого згоряння для одержання тепла, а виробництво паливних газів складається з руйнування біомаси в метантанку з одержанням газу), біомаса, застосовувана у виробництві вказаної енергії, може бути отримана з будь-якої рослини. Приклади деревних рослин включають, крім іншого, сосну, евкаліпт, корковий дуб, кедр, дуб, дуб падуболистий тощо. Ілюстративні необмежувальні приклади представляючих інтерес декоративних рослин включають рослини, що відносяться до роду Aeschynanthus; Carina; Columnea; Anemone; Azalea; Begonia; Calceolaria; Camelia; Dianthus; Freesia; Gerbera; Hibiscus; Hypoestes; Kalanchoe; Nicotiana; Pelargonium; Primula; Primula; Ranunculus; Rhipsalidopsis; Rosa; Saintpaulia; Sinningiagloxinia; Streptocarpus; Tigridia; Verbena або Zinnia. Інші декоративні рослини включають орхідеї (сімейство Orchidaceae) і декоративні кущі, які включають лавр благородний (Laurus nobilis), жимолость (Lonicera fragrantissima), магнолію зірчасту (Magnolia stellata), гортензію крупнолисту (Hydrangea macrophylla), бобівник (Laburnum x watereri), японську троянду або керрію (Kerria japonica) тощо. Ілюстративні необмежувальні приклади рослин, застосовуваних для харчування людини або тварин, включають плодові дерева, які включають, крім інших, вишню, сливу, персик, абрикос, маслинове дерево, манго, грушу, яблуню, мушмулу японську, айву, апельсин, лимон, інжир, папайю, каштан, дуб, дуб падуболисний, дуб кермесовий, лісовий горіх, мигдаль, волоський горіх тощо; кормові рослини, які включають, крім інших, бобові (наприклад, конюшину, люцерну, кліторії арахіс, леуцену, дзвіночки тощо), трави (наприклад, жито, вівсяницю, грястицю збірну, бутелуа витончену, родсову траву, траву буйвола, бородані, вітв'янки, бермудську траву, яка вважається газонною травою, і слонову траву або мишій, цукровий буряк, арундо тайванську й метлюг польовий, які є фуражними, тощо), зернові (наприклад, сорго, пшеницю, жито, ячмінь тощо); рослини для вживання людиною (салат, капуста, шпинат, швейцарський мангольд, зелені боби, томати тощо) тощо. В іншому конкретному варіанті здійснення фотосинтезуючий організм є водоростю, наприклад, мікроводоростю, такою як мікроводорості роду Chlorella, Botryococcus, Nannochloropsis, Haematococcus, Neochloris або Tetraselmis; інші ілюстративні, необмежувальні приклади водоростей у рамках даного винаходу включають аонорі (Enteromorpha intestinalis) (кілька видів зеленої водорості Моностроми) (Японія), араме (Eisenia bicyclis), алярію їстівну (Alaria esculenta), каролу (Callophyllis variegata) (Південна Америка), ірландський мох (Mastocarpus stellatus), хлорелу, ламінарію цукристу, дурвилею антарктичну, Palmaria palmata, Euchema cottonii, Caulerpa lentillifera, грацилярію, грацилярію конферовидну (Agardhiella tenera), хіджикі або хізикі (Sargassum fusiforme), хондавара (Sargassum enerve), Chondrus crispus, Porphyra laciniata/Porphyra umbilicalis, Ulva lactuca, Sargassum echinocarpum, Saccharina japonica, міру (Codium sp.), мозуки (Cladosiphon okamuranus), норі (кілька видів червоної водорості Porphyra), ламінарію пальчаторозітнуту (Laminaria digitata), огонорі (кілька видів червоної водорості Gracilaria), Fucus vesiculosus, нереоцистис Лютке (Nereocystis luetkeana), порфіру лопатеву (Porphyra purpurea, syn. Porphyra laciniata), Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, морський ремінець (Himanthalia elongata), цуномато (кілька видів червоної водорості Chondrus), вакаме (Undaria pinnatifida) тощо. Генна конструкція винаходу Інша, розглянута відповідно до даного винаходу можливість досягнення того, що фактор росту винаходу збільшує біомасу фотосинтезуючого організму, перебуває у вставці в геном вказаного фотосинтезуючого організму нуклеотидної послідовності, кодуючої вказаний фактор росту, при цьому, коли вказана нуклеотидна послідовність експресується, це здійснює необхідний ефект у фотосинтезуючому організмі. Таким чином, в іншому аспекті винахід стосується генної конструкції, надалі генній конструкції винаходу, що включає: (a) нуклеїнову кислоту, що кодує пептид, що включає (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1] у якій - Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту, і 9 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), формують дисульфідний місток між ними, і (b) регуляторні елементи для регуляції її експресії в фотосинтезуючому організмі. У конкретному варіанті здійснення вказані регуляторні елементи підходять для регуляції експресії послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої вказаний пептид у водорості; вказані елементи відомі кваліфікованим фахівцям. В іншому конкретному варіанті здійснення вказані регуляторні елементи підходять для регуляції експресії послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої вказаний пептид у рослині; вказані елементи також відомі кваліфікованим фахівцям. У конкретному варіанті здійснення регуляторні елементи для регуляції експресії послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючої вказаний пептид, є гетерологічними відносно вказаної послідовності нуклеїнової кислоти, тобто, коли вказана послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок Arabidopsis (наприклад, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 6), вказана послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем регуляторних елементів для регуляції її експресії в рослині, відмінних від регуляторних елементів, які регулюють експресію вказаних білків Arabidopsis у вказаній рослині в природі, або коли вказана послідовність нуклеїнової кислоти кодує білок Oryza sativa (наприклад, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 або SEQ ID NO: 10), вказана послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем регуляторних елементів для регуляції її експресії в рослині, відмінних від регуляторних елементів, які регулюють експресію вказаних білків Oryza sativa в вказаній рослині в природі; або коли вказана послідовність нуклеїнової кислоти кодує Thalassiosira pseudonana (наприклад, SEQ ID NO: 11), вказана послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться під контролем регуляторних елементів для регуляції її експресії у водорості, відмінних від регуляторних елементів, які регулюють експресію вказаного білка Thalassiosira в вказаній водорості в природі. Амінокислоти Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 можуть бути однаковими або відмінними один від одного. У конкретному варіанті здійснення Xaa1, Xaa2, Xaa3 і/або Xaa4 є амінокислотою, відмінною від Cys. Таким чином, у конкретному варіанті здійснення вказана генна конструкція винаходу включає: (a) нуклеїнову кислоту, кодуючу пептид, який включає (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1] у якій - Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту, і (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), формують дисульфідний місток між ними, і (b) регуляторні елементи для регуляції її експресії в фотосинтезуючому організмі, за умови, що, коли вказана послідовність нуклеїнової кислоти (a) кодує білок, вибраний із групи, що складається з білків, амінокислотні послідовності яких показані в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 6, вказана послідовність нуклеїнової кислоти (a) знаходиться під контролем регуляторних елементів для регуляції її експресії в рослині, відмінних від регуляторних елементів, які регулюють експресію вказаних білків у Arabidopsis sp. у природі; за умови, що, коли вказана послідовність нуклеїнової кислоти (a) кодує білок, вибраний із групи, що складається з білків, амінокислотні послідовності яких показані в SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10, вказана послідовність нуклеїнової кислоти (a) знаходиться під контролем регуляторних елементів для регуляції її експресії в рослині, відмінних від регуляторних елементів, які регулюють експресію вказаних білків у Oryza sativa sp. у природі; і за умови, що, коли вказана послідовність нуклеїнової кислоти (a) кодує білок, амінокислотна послідовність якого показана в SEQ ID NO: 11, вказана послідовність нуклеїнової кислоти (a) знаходиться під контролем регуляторних елементів для регуляції її експресії у водорості, відмінних від регуляторних елементів, які регулюють експресію вказаних білків у Thalassiosira pseudonana (діатомової водорості) у природі. У конкретному варіанті здійснення генної конструкції винаходу вказаний пептид включає амінокислотну послідовність X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2 у якій: - X1 позначає амінокислотну послідовність N-кінця пептиду, і - X2 позначає амінокислотну послідовність C-кінця пептиду. 10 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хоча довжина амінокислотної послідовності N-кінця пептиду (X1) може змінюватися в межах широкого діапазону, у конкретному варіанті здійснення X1 має довжину в межах від 1 до 250 амінокислот, або ще більш типово в межах від 1 до 175 амінокислот, зазвичай у межах від 1 до 100 амінокислот, частіше в межах від 1 до 50 амінокислот, ще частіше в межах від 2 до 40 амінокислот і ще частіше в межах від 5 до 35 амінокислот. Аналогічним чином, хоча довжина амінокислотної послідовності C-кінця пептиду (X2) може змінюватися в межах широкого діапазону, у конкретному варіанті здійснення X 2 має довжину в межах від 1 до 250 амінокислот або ще більш типово в межах від 1 до 175 амінокислот, зазвичай у межах від 1 до 100 амінокислот, частіше в межах від 1 до 50 амінокислот, ще частіше в межах від 2 до 40 амінокислот. У конкретному варіанті здійснення амінокислотна послідовність C-кінця пептиду (X2) включає амінокислотну послідовність GRRRR (SEQ ID NO: 7), яка, в іншому конкретному варіанті здійснення, розташована на відстані 10-50 амінокислот від останнього Cys послідовності Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys. У конкретному варіанті здійснення C-кінець X2 амідований. В іншому конкретному варіанті здійснення вказаний пептид вибраний із групи, що складається з адреномедуліну й білків, амінокислотні послідовності яких показані в послідовностях SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 11, а також їх функціонально еквівалентних варіантах і фрагментах. Генна конструкція винаходу може бути отримана при використанні методів, відомих із рівня техніки [Sambrock et aI., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol.1-3]. Вказана генна конструкція винаходу містить у собі функціонально зв'язані з нею регуляторні елементи для регуляції її експресії в фотосинтезуючому організмі. Використовуваний в даному описі вислів "функціонально зв'язані" означає, що нуклеїнова кислота, яка кодує фактор росту винаходу [тобто пептид, що включає амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys], експресується в правильній рамці зчитування під контролем регуляторних контрольних елементів або регулюючих експресію послідовностей. Контрольні регуляторні елементи являють собою послідовності, яку контролюють і регулюють транскрипцію і, у відповідних випадках, трансляцію білка, і включають промоторні послідовності, послідовності, що кодують регулятори транскрипції, послідовності зв'язування рибосоми (RBS) і/або послідовності термінації транскрипції. Генна конструкція винаходу може бути вбудована в геном клітини фотосинтезуючого організму, наприклад, клітину рослини або тканини, або клітину водорості, будь-яким придатним способом із отриманням трансформованих фотосинтезуючих організмів. Вказані способи можуть включати, наприклад, застосування ліпосом, електропорації, дифузії, бомбардування частинками, мікроін'єкції, генних гармат, хімічних сполук, які збільшують поглинання вільної ДНК, наприклад, преципітацію з фосфатом кальцію, вірусні вектори тощо. Таким чином, в іншому аспекті винахід стосується вектора, що включає генну конструкцію винаходу. У конкретному варіанті здійснення вказаний вектор є вектором, що підходить для трансформації водоростей; вказані вектори відомі фахівцю, кваліфікованому в даній сфері (наприклад, у WO 2009149470 розкриті способи й композиції для трансформованих вектором клітин водоростей, де вектор містить у собі Vcp промотор, керуючий експресією гена стійкості до антибіотика в клітині водорості. В іншому конкретному варіанті здійснення вказаний вектор є вектором, що підходить для трансформації рослин; вказані вектори також відомі фахівцю, кваліфікованому в даній сфері. У більш конкретному варіанті здійснення вектори, що підходять для трансформації рослин, включають вектори на основі Ti-плазміди Agrobacterium tumefaciens, такі як описані в EP 120516. На додаток до трансформуючих векторів, отриманим на основі Ti або Ri плазмід Agrobacterium, для введення генної конструкції в клітини й тканини рослини можуть використовуватися альтернативні методи, такі як, наприклад, крім інших, методика вакуумної інфільтрації. Із іншого боку, як нуклеїнова кислота, що кодує пептид, який включає (І) амінокислотну послідовність Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys [SEQ ID NO: 1], у якій Xaa1, Xaa2, Xaa3 і Xaa4 незалежно позначають амінокислоту, і (ІІ) залишки цистеїну амінокислотної послідовності, показаної в (І), які формують дисульфідний місток між ними [надалі нуклеїнова кислота (a)], так і генна конструкція винаходу також можуть бути включені у вектор, який включає прокаріотичний реплікон, тобто послідовність ДНК, здатну направляти автономну реплікацію й підтримку позахромосомної рекомбінантної молекули ДНК, коли вона введена в прокаріотичну клітину 11 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хазяїна, таку як бактерію. Вказані реплікони відомі в рівні техніки. Вектори, що включають прокаріотичний реплікон також зазвичай включають сайти рестрикції для вставки генної конструкції. Такі вектори відомі в рівні техніки й описані, наприклад, у патенті США 6268552. Аналогічним чином, вектори також можуть включати маркери для перевірки присутності гетерологічної ДНК у фотосинтезуючих організмах, наприклад, клітинах і/або тканинах рослини, або клітинах водорості, які були трансформовані. Генетичні маркери, які дозволяють відбирати гетерологічну ДНК у вказаних фотосинтезуючих організмах, наприклад, клітинах рослини, включають гени, які надають стійкість до антибіотиків, наприклад, ампіциліну, тетрацикліну, канаміцину, гігроміцину, гентаміцину тощо. Ген неоміцинфосфотрансферази має перевагу можливості експресії як у еукаріотичних, так і прокаріотичних клітинах. Маркер дозволяє відбирати задовільно трансформовані фотосинтезуючі організми, наприклад, рослини, вирощені в середовищі, що містить відповідний антибіотик, оскільки вони містять придатний ген стійкості. Уведення вказаної нуклеїнової кислоти (a), як і введення вказаної генної конструкції для трансформації фотосинтезуючого організму, наприклад, клітини або тканини рослини, або клітини водорості, й одержання трансгенного фотосинтезуючого організму, наприклад, трансгенної рослини або трансгенної водорості, може бути виконано, як було вказано вище, будь-яким способом, відомим у рівні техніки, включаючи, крім іншого, перенос ДНК, опосередкований A. tumefaciens, переважно з використанням неонкогенного T-ДНК вектора, електропорацію, прямий перенос ДНК, бомбардування часточками тощо (для перегляду інформації з вказаних тем див., наприклад, Marta Izquierdo Rojo in "Ingenieria Genetica y Transferencia Genica", 1999, Ediciones Piramide, S.A, Madrid). В іншому аспекті винахід стосується клітини-хазяїна, що включає вказану нуклеїнову кислоту (a), генну конструкцію відповідно до винаходу або вектор, як було описано вище. Придатні клітини-хазяї для вмісту генної конструкції відповідно до винаходу або вектора, як було описано вище, включають, без обмеження, прокаріотичні клітини, дріжджі або еукаріотичні клітини, такі як, наприклад, клітини комах. Як буде очевидно фахівцю, кваліфікованому в даній сфері, у залежності від трансформованої клітини-хазяїна, генна конструкція винаходу або вектор, що її містить, можуть містити послідовності контролю експресії, які можуть бути функціональними в прокаріотичних клітинах і організмах, наприклад, бактеріях тощо, або функціональними в еукаріотичних клітинах і організмах, наприклад, клітинах комах, клітинах ссавців тощо. В іншому аспекті винахід стосується трансгенної клітини рослини або водорості, що включає інтегровану в її геномі вказану нуклеїнову кислоту (a) або вказану генну конструкцію винаходу. Способи культивування трансформованих клітин і тканин рослини або водорості, і регенерації трансгенних рослин або водоростей відомі в рівні техніки, як і умови культивування і росту вказаних рослин або водоростей (див., наприклад, Marta Izquierdo (1999), процитовану вище). Таким чином, трансгенна рослина, отримана з клітини рослини, трансформованою генною конструкцією винаходу, або водорості, трансформованою генною конструкцією винаходу, складає додатковий винахідницький аспект даного винаходу. Застосування фактора росту винаходу Здатність фактора росту винаходу збільшувати біомасу фотосинтезуючого організму знаходить застосування в різних галузях промисловості залежно від фотосинтезуючого організму. Таким чином, як вказано в попередніх аспектах винаходу, фактор росту винаходу може застосовуватися для збільшення біомаси морських водоростей або рослин, які передбачається застосовувати у виробництві енергії, при отриманні деревини, для харчування людини або тварин, або в квітництві як спосіб поліпшення зовнішнього вигляду декоративних рослин. Наступні приклади ілюструють даний винахід і не повинні розглядатися як обмежуючі його можливості. ПРИКЛАД 1 Збільшення рослинної біомаси в рослинах моркви й тютюну Матеріал і Методи Калуси моркви (Daucus carota) і тютюну (Nicotiana tabacum) отримували від компанії Carolina Biological Supply Company (Burlington, NC, USA) і підтримували в стерильних умовах у твердому середовищі для ініціації росту калусу для моркви або для тютюну, відповідно (також наданої Carolina Biological). Її визначений склад доступний в каталозі компанії. Поодинокий калус розділяли на невеликі фрагменти, отримані фрагменти зважували в стерильних умовах і висівали на свіже середовище (тверде середовище для ініціації росту калусу, отримане від Carolina Biologicals), яке містило різні концентрації синтетичного людського пептиду адреномедуліну (AM) (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA). Через 30 днів 12 UA 111823 C2 5 10 15 20 25 30 35 росту в темряві калуси знову зважували й обчислювали швидкість росту як співвідношення кінцевої ваги, діленої на початкову вагу. Суху вагу кожного зразка обчислювали, піддаючи калуси процесу сушіння в термостаті при 250°C протягом 24 годин. Результати Збільшення росту калусів відповідно до дозо-залежної відповіді спостерігали й у моркві, і в тютюні (Фігура 1). Найбільш ефективна концентрація AM для стимуляції росту клітин складала -10 10 М. Більш помірне збільшення росту відбувалося при більш низьких або більш високих концентраціях. 60 %-е збільшення біомаси в порівнянні з контролем отримували при оптимальній дозі AM. Для перевірки того, що таке збільшення маси не відбувалося внаслідок збільшення гідратації тканини, вимірювали суху вагу тканини, і при цьому виявили, що відмінності зберігалися, що вказує на те, що збільшення біомаси відповідало чистому росту включених тканин. Ефект, спостережений в клітинах калусу, що полягає в збільшенні росту (клітинної проліферації) клітин калусу, ідеально передавався на цілі рослини. Іноді збільшення проліферації клітин впливає на органолептичні або фізичні властивості рослин. Однак збільшення біомаси буде відбуватися в рослинах так само, як це відбувається в клітинах калусу. ПРИКЛАД 2 Збільшення водоростевої біомаси в водоростях роду Chlorella Матеріал і Методи Дві ідентичні культури хлорели готували в середовищі Гілларда F/2 (по 250 мл кожна) у двох окремих скляних колбах [Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, pp. 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA.; Guillard, R.R.L. and Ryther, J.H. 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239]. Потім 100 мкл вказаного середовища Гілларда F/2 додавали в колбу й 100 мкл вказаного середовища Гілларда F/2, що містить синтетичний людський пептид-адреномедулін (AM) (Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA) у достатній кількості, щоб одержати кінцеву -8 концентрацію 10 М, в іншу колбу. Повітря, що містить 5 % CO2, безупинно пропускали через культуру. Колби освітлювали з фотоперіодом 12 годин світла/12 годин темряви. Аліквоти періодично відбирали із середовища для оцінки росту мікроводоростей. Спектральне поглинання вимірювали при 680 нм за допомогою спектрофотометра Perkin Elmer Lambda 35 UV/Visible. Результати Оброблені AM мікроводорості ростуть швидше й досягають стаціонарної фази скоріше, ніж необроблені мікроводорості. 13 UA 111823 C2 14 UA 111823 C2 15 UA 111823 C2 16 UA 111823 C2 17 UA 111823 C2 18 UA 111823 C2 19 UA 111823 C2 20 UA 111823 C2 21 UA 111823 C2 22 UA 111823 C2 23 UA 111823 C2 24 UA 111823 C2 25 UA 111823 C2 26 UA 111823 C2 27 UA 111823 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 1. Спосіб збільшення біомаси рослини, який включає культивування вказаної рослини в присутності адреномедуліну. 2. Спосіб за п. 1, де вказаний адреномедулін є людським адреномедуліном. 3. Спосіб за будь-яким із пп. 1-2, де адреномедулін уводять як добавку для доповнення живильного розчину, який подають вказаній рослині в гідропонній системі, або його вводять до поливної води вказаної рослини. 4. Спосіб за п. 3, де вказана рослина вибрана з рослини, застосовуваної для виробництва відновлюваних джерел енергії; рослини для харчування людини або тварин, породи деревини й декоративної рослини. -2 -16 5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, де адреномедулін присутній у концентрації від 10 М до 10 -6 -11 -8 -10 М, переважно від 10 М до 10 М, найбільш переважно від 10 М до 10 М. 6. Генна конструкція для підвищення біомаси рослини, яка включає: (a) нуклеїнову кислоту, що кодує адреномедулін, і (b) регуляторні елементи для регуляції її експресії в рослині. 7. Генна конструкція за п. 6, де вказаний адреномедулін є людським адреномедуліном. 8. Вектор, що включає генну конструкцію за будь-яким із пп. 6 або 7. 9. Клітина-хазяїн для підвищення біомаси рослини, яка включає нуклеїнову кислоту, що кодує адреномедулін, або генну конструкцію за будь-яким з пп. 6 або 7, або вектор за п. 8. 10. Трансгенна рослинна клітина, яка включає інтегровану в її геномі нуклеїнову кислоту, що кодує адреномедулін, або генну конструкцію за будь-яким із пп. 6 або 7. 11. Трансгенна рослина, яка включає щонайменше одну трансгенну рослинну клітину за п. 10. 28