Спосіб збільшення виходу насіння рослини шляхом руйнування гена ahp6

Реферат: Винахід стосується засобів і способів для поліпшення врожайності рослин. Запропоновано спосіб збільшення виходу насіння рослини, що включає руйнування ендогенного гена АНР6 у клітинах рослини, при цьому дане руйнування пригнічує експресію та (або) активність продукту вищезгаданого ендогенного гена АНР6 у порівнянні з відповідною контрольною рослиною, у якій немає зазначеного руйнування. Запропонований спосіб використовується для збільшення виходу насіння рослини й отриманого від нього потомства та (або) створення рослини, що не зустрічається в природі, з підвищеним виходом насіння. Рослина, згідно з винаходом, включає руйнування ендогенного гена АНР6 і руйнування хоча б одного ендогенного гена СКХ. UA 109040 C2 (12) UA 109040 C2 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У зв'язку з необхідністю постачання постійно зростаючої популяції їжею й іншими продуктами рослинного походження, людей завжди цікавило підвищення врожайності в сільському господарстві. На врожайність рослини можна впливати різними способами, наприклад, шляхом поліпшення характеристик росту рослини або затримування старіння листів. Відомо багато механізмів і шляхів, що відносяться до росту й розвитку рослин. Цитокінін - рослинний гормон, що грає позитивні й негативні регуляторні ролі в багатьох аспектах росту й розвитку рослин. Він стимулює утворення й активність меристем пагонів, здатний утворювати акцептуючі тканини, сповільнювати старіння листів, стримувати ріст і розгалуження кореня, а також впливає на проростання насіння і реакцію на стрес (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 52, 89-1 18). Аналіз рослин з недостатністю цитокініна показав, що цитокінін виконує протилежні функції в меристемах пагонів і кореня, що наводить на думку про незамінну функцію цього гормону в кількісному контролі росту органів (Werner T, Motyka V, Laucou V, Smets R, Van Onckelen H, Schmulling T, Plant Cell 2003, 15(1 1):2532-50; Werner T, Motyka V, Strnad M, Schmulling T, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(18): 10487-92). Було показано, що цитокінін-оксидази/цитокінін-дегідрогенузи (CKX) є важливим чинником у регуляції гомеостазу рослинного гормону цитокініна. Геном арабідопсису кодує сім генів CKX, що мають різні домени експресії (Werner et al., 2001; Werner et al., 2003). Білки CKX розрізняються по своїй субклітиновій локалізації й біохімічних властивостях (Werner et al., 2003). За допомогою надекспресії індивідуальних генів CKX вдалося встановити рослини з дефіцитом цитокініна, а також виявити, що цитокінін є позитивним регулятором активності меристеми пагонів і негативним регулятором активності меристеми кореня. Недавні дослідження показали, що в рослині рису придушення функції певного гену CKX, ортологу рису стосовно гену CKX3 арабідопсису, приводить до збільшення числа несучих часток вищевказаної рослини рису (див. US 2006/0123507 A1). Хоча ці результати досить багатообіцяючі, як і раніше існує потреба надалі підвищувати врожайність рослин. Метою цього винаходу є створення засобів і способів, що підходять для поліпшення врожайності рослин. Для досягнення вищевказаної мети в даному винаході використовується рішення, докладно описане нижче. У цьому винаході пропонується спосіб збільшення виходу насіння рослини, що включає руйнування ендогенного гену AHP6 у клітинах рослини, при цьому дане руйнування придушує експресію й (або) активність продукту вищезгаданого ендогенного гену AHP6 у порівнянні з відповідною контрольною рослиною, у якому немає зазначеного руйнування. Було виявлено дивне явище: руйнування гену AHP6 у рослині приводить до появи рослин з підвищеним виходом насіння у порівнянні з рослиною, у якій відсутнє зазначене руйнування гену. Тоді як навіть одиночне руйнування AHP6 приводить до істотного збільшення виходу насіння, одночасне руйнування AHP6 разом з хоча б одним геном CKX приводить до надзвичайно великого додаткового збільшення виходу насіння у порівнянні з генами дикого типу й одиночних руйнувань генів CKX. Найбільш помітний ріст виходу насіння був відзначений при одночасному руйнуванні генів AHP6, CKX3 й CKX5. Ще більш дивним стало виявлення того, що одночасне стабільне руйнування гену AHP6 і хоча б одного з генів CKX приводить до утворення рослин із ще більшою врожайністю. Зважаючи на все це, руйнування ендогенного гену AHP6 у рослині з підвищеним статусом цитокінінів є особливо ефективним. Підвищення статусу цитокінінів спостерігається при прояві в рослині фенотипу, що звичайно зв'язують із присутністю підвищеної кількості цитокінінів. Підвищення статусу цитокінінів може виникати в результаті одночасного руйнування гену AHP6 разом з хоча б одним ендогенним геном CKX рослини, наприклад, одночасного руйнування гену AHP6 разом з руйнуванням мінімум двох різних ендогенних генів CKX. Однак підвищений статус цитокінінів також може бути викликаний іншими змінами або маніпуляціями, наприклад, мутаціями в генах, що беруть участь у синтезі цитокінінів, або мутаціями в рецепторах цитокінінів. Ще одним варіантом є вплив на цитокініновий статус рослини шляхом введення хімічних сполук. Відомі сполуки, які приводять до підвищення статусу цитокінінів. У цьому винаході передбачається спосіб збільшення виходу насіння рослини, що включає руйнування ендогенного гену AHP6 у клітинах рослини, при цьому дане руйнування придушує експресію й (або) активність продукту вищезгаданого ендогенного гену AHP6 у порівнянні з відповідною контрольною рослиною, у якому немає зазначеного руйнування. 1 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також у винаході передбачається використання пропонованого способу для збільшення виходу насіння рослини й отриманого від нього потомства й (або) створення рослини, що не зустрічається в природі, з підвищеним виходом насіння. Крім того, у цьому винаході передбачається рослина, що не зустрічається в природі, що включає руйнування ендогенного гену AHP6 і руйнування хоча б одного ендогенного гену CKX. У цьому винаході також передбачається ізольована рослинна клітина або рослина, що не зустрічається в природі, які можна отримати або які були отримані за допомогою одного із пропонованих у винаході способів. Якщо не зазначене інше, всі технічні й наукові терміни, що використані в тексті, мають таке ж значення, у якому їх звичайно розуміють звичайні фахівці в області, до якої відноситься винахід. В описі й формулі цього винаходу використовується наступна термінологія відповідно до наведених далі визначень. В описі й прикладеній формулі винаходу форми однини включають індивідуальні й множинні об'єкти, якщо контекст явно не вказує на зворотне. Таким чином, приміром, при згадуванні "клітини" цей термін охоплює як одну клітину, так і комбінацію двох і більше клітин, і так далі. У способі з цього винаходу збільшується вихід насіння рослини. Термін "рослина" у загальному значенні стосується кожного з наступного: цільні рослини, частини або органи рослин (наприклад, листи, стебла, коріння і т.д.), вегетативні органи або структури пагонів (наприклад, листи, стебла й бульби), коріння, квітки й квіткові органи або структури (наприклад, приквітники, чашолистки, пелюстки, тичинки, плодолистики, пильовики й насіннязачатки), насіння (включаючи ембріон, ендосперм і насінну оболонку), плоди (дозріла зав'язь), рослинна тканина (наприклад, судинна тканина, покривна тканина й так далі), тканинна культура калюс і рослинні клітини (наприклад ті, що замикають клітини, яйцеклітини, трихоми й так далі), а також їхнє потомство. Термін "рослина" у загальному значенні позначає всі організми з функцією фотосинтезу. Поняття рослини в межах обсягу винаходу містить у собі всі роди й види вищих і нижчих рослин царства рослин. Під зрілими рослинами маються на увазі рослини на будь-якій стадії розвитку після стадії сіянцю. Сіянець - молода незріла рослина на ранній стадії розвитку. Рослини у винаході можуть бути однолітніми, багаторічними, однодольними й (або) дводольними рослинами. Зокрема, рослини у винаході можуть являти собою рослини з наступного сімейства квітів: Капустяні (Brassicaceae), зокрема рослини роду Капуста (Brassica) і Резуховидка (Arabidopsis). Рослинна клітина в даному контексті також включає, серед іншого, клітини, отримані з або виявлені в рослині або його частині: насінні, культурах, суспензійних культурах, ембріонах, меристемних областях, тканинах калюса, листах, коріннях, пагонах, гаметофітах, спорофітах, пилку й мікроспорах. Рослинні клітини також можуть припускати включення видозмінених клітин, наприклад, протопластів, отриманих з вищезгаданих тканин. При використанні в даному описі стосовно рослини, термін "не зустрічається в природі" позначає рослину з геномом, що був модифікований людиною. Трансгенна рослина являє приклад рослини, що не зустрічається в природі. Трансгенна рослина може містити, наприклад, екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, у тому числі химерний ген, що включає ділянку, що транскрибується, яка при транскрибуванні дає біологічно активну молекулу РНК, здатну знижувати експресію ендогенного гену, наприклад, гену AHP6 відповідно до винаходу, таким чином, подібна рослина генетично модифікована людиною. Крім того, рослину, що містить мутацію в ендогенному гені, наприклад, мутацію в ендогенному гені AHP6 (зокрема, у регуляторному елементі або в послідовності, що кодує) у результаті впливу мутагенного агента, також вважається рослиною, що не зустрічається в природі, тому що вона була генетично модифікована людиною. Також рослиною, що не зустрічається в природі, вважається рослина певного виду, наприклад, рапс (Brassica napus) або інші члени сімейства Капустяних, що містить мутацію в ендогенному гені, наприклад, в ендогенному гені AHP6, що у природі не зустрічається серед рослин конкретно цього виду і яка утворилася в результаті, наприклад, спрямованих процесів схрещування, зокрема схрещування з використанням маркера й селекції або інтрогресії, з рослиною цього ж або іншого виду. Навпроти, рослина, що містить тільки спонтанні або природні мутації, тобто рослина, що не була генетично модифікована людиною, не є такою, що "не зустрічається в природі" рослиною в даному контексті і, отже, не охоплюється цим винаходом. Фахівцям у даній області очевидно, що хоча рослини, що не зустрічаються в природі, як правило мають змінену нуклеотидну послідовність у порівнянні з рослинами, що зустрічаються в природі, проте рослина, що не зустрічається в природі, може бути генетично модифікована людиною без зміни її нуклеотидної послідовності, наприклад, шляхом зміни її патерна метилірування. 2 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "трансгенний" стосується рослини з вбудованими нуклеотидними послідовностями, включаючи серед іншого гени, полінуклеотиди, ДНК, РНК і т.д., і (або) їх зміни (наприклад, мутації, крапкові мутації й т.п.), які були введені в рослину в порівнянні з незміненою рослиною за допомогою процесів, які не є переважно біологічними процесами у виробництві рослин. Таким чином, термін "трансгенна рослина" охоплює не тільки рослини з неендогенними нуклеїновими кислотами, але і явно включає також рослини з мутаціями в ендогенному гені, наприклад, крапковими мутаціями, які були введені у вищевказану трансгенну рослину в порівнянні з незміненою рослиною за допомогою процесів, які не є переважно біологічними процесами у виробництві рослин. У пропонованому способі вихід насіння рослини збільшується за допомогою руйнування ендогенного гену AHP6. Термін "ген" або "генна послідовність" використовується в широкому змісті для позначення будь-якої нуклеїнової кислоти, пов'язаної з біологічною функцією. Гени, як правило, включають послідовності, що кодують, і (або) регуляторні послідовності, необхідні для експресії цих послідовностей, що кодують. Термін "ген" стосується конкретної геномної послідовності, а також до кДНК або іРНК, що кодуються даною геномною послідовністю. Гени також включають неекспресовані сегменти нуклеїнових кислот, які, наприклад, утворюють розпізнавальні послідовності для інших білків. Неекспресовані регуляторні послідовності включають промотори й підсилювачі, з якими зв'язуються регуляторні білки, наприклад фактори транскрипції, які приводять до транскрипції суміжних або близьких послідовностей. Термін "ендогенний" стосується будь-якого гену або нуклеотидної послідовності, що вже є присутнім у заданій клітині або організмі дикого типу, наприклад, рослини. Термін "екзогенний" стосується будь-якого гену або нуклеотидної послідовності, які не є ендогенними. Ген AHP6 кодує білок AHP6, що був уперше описаний для арабідопсису (гистидінфосфотрансферний білок арабідопсису 6). Білок AHP6 належить структурному сімейству гистидін-фосфотрансферних протеінкіназ і протеіинтранфераз. Однак у білку AHP6 немає залишку гистидіну, який необхідний для фосфотрансмісії і є присутнім в інших білках AHP, і який зберігається в сімействі гистидін-фосфотрансферних кіназ і транфераз. Замість залишку гистидіну AHP6 має залишок аспарагіну в позиції Asn83 AHP6a з номером послідовності SEQ ID 1. У контексті цього винаходу термін "білок AHP6" може ставитися до білка, що, наприклад: належить структурному сімейству гистидін-фосфотрансферних протеинкиназ і протеінтранфераз; і (або) не має гистидіну в позиції, що відповідає позиції Asn83 у послідовності SEQ ID 1; і (або) проявляє в основному таку ж саму функцію, що й білок AHP6 з SEQ ID 1 або 12; і (або) містить амінокислотну послідовність із ідентичністю послідовності не менш 70 %, не менш 80 %, не менш 90 % або не менш 95 % у порівнянні з повною амінокислотною послідовністю SEQ ID 1 або 12. Вважається, що білок AHP6 проявляє в основному таку ж саму функцію, що й білок AHP6 з SEQ ID 1 або 12, якщо він проявляє не менш 50 %, не менш 70 % або не менш 90 % активності білка AHP6 арабідопсису з SEQ ID 1 або 12 при вимірі в рамках біохімічної in vitro перевірки функції білка AHP6. Підходящий біохімічний in vitro тест на функцію білка AHP6 описаний у джерелі Mahonen et al. "Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development", Science 2006, 311, 94-98. Відповідно до опису в джерелі Mahonen et al. (2006), білок AHP6 не проявляє фосфотрансферної активності й виступає як інгібітор сигналінгу цитокінінів шляхом взаємодії з механізмом фосфоперенесення. Білок AHP6 арабідопсису існує у двох альтернативно сплайсированих формах, а саме AHP6a й AHP6b, які розрізняються по довжині перших экзонів. У даному контексті, якщо не зазначене інше, термін "білок AHP6" стосується обох сплайсированих форм AHP6a й AHP6b. Білок AHP6 арабідопсису включає амінокислотну послідовність SEQ ID 1 у випадку AHP6a або SEQ ID 12 у випадку AHP6b, геномна послідовність гену AHP6 арабідопсису включає нуклеотидну послідовність SEQ ID 2, що кодує послідовність гену AHP6 арабідопсису включає нуклеотидну послідовність SEQ ID 3 у випадку білка AHP6a й SEQ ID 13 у випадку білка AHP6b, а кДНК гену AHP6 арабідопсису включає нуклеотидну послідовність SEQ ID 4 у випадку AHP6a і SEQ ID 14 у випадку AHP6b. Ендогенний ген AHP6 може включати або складатися з: (а) нуклеїнової кислоти, що кодує білок AHP6 і включає амінокислотну послідовність SEQ ID 1, 12 або її ортолог; (б) нуклеїнової кислоти, що кодує білок AHP6 і включає амінокислотну послідовність із ідентичністю послідовності не менш 70 %, не менш 80 %, не менш 90 % або не менш 95 % у порівнянні з повною амінокислотною послідовністю SEQ ID 1 або 12; 3 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (в) нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID 2, 3, 4, 13 або 14; (г) нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність із ідентичністю послідовності не менш 90 % щодо всієї повної нуклеотидної послідовності SEQ ID 2, 3, 4, 13 або 14; або (д) нуклеїнової кислоти, що гібридизується при жорстких умовах в одну з нуклеотидних послідовностей, зазначених у підпунктах (а), (б), (в) і (або) (г). Термін "нуклеїнова кислота" або "полінуклеотид" в основному використовується відповідно до загальноприйнятого в даній області значенням для позначення полімеру рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК), або його аналога, наприклад, нуклеотидного полімеру, що включає модифікації нуклеотидів, пептид-нуклеїнової кислоти й т.п. У деяких випадках нуклеїнова кислота може являти собою полімер, що включає кілька типів мономерів, наприклад, субодиниці і РНК, і ДНК. Нуклеїнова кислота може являти собою, наприклад, хромосому або хромосомний сегмент, вектор (наприклад, экспресійний вектор), экспрессійну касету, полімер оголеної ДНК або РНК, продукт полимерізної ланцюгової реакції (ПЦР), олигонуклеотид, зонд і т.д. Нуклеїнова кислота може бути, приміром, одноланцюговою і (або) дволанцюговою. Якщо не зазначене інше, у контексті цього винаходу певна нуклеотидна послідовність може включати або кодувати комплементарну послідовність на додаток до будьякої іншої явно зазначеної послідовності. Термін "полінуклідна послідовність", "нуклеотидна послідовність" або "нуклеїнова кислота" стосується суміжної послідовності нуклеотидів в одній нуклеїновій кислоті або її подання, наприклад, у вигляді рядка символів. Таким чином, залежно від контексту, "полінуклідна послідовність" являє собою полімер нуклеотидів (олигонуклеотиду, ДНК, нуклеїнової кислоти й т.п.) або рядок символів, що позначає полімер нуклеотиду. З будь-якої зазначеної полінуклеотидної послідовності може бути визначена відповідна нуклеїнова кислота або комплементарна полінуклідна послідовність (наприклад, комплементарна нуклеїнова кислота). Термін "підпослідовність" або "фрагмент" позначає будь-яку частину повної послідовності. Термін "ортолог" у контексті даного винаходу означає ген будь-якого виду, наприклад, відмінного від арабідопсису, що демонструє найбільшу подібність, тобто найвищу ідентичність послідовності, із зазначеним геном арабідопсису, і (або) який кодує білок, що виконує в основному ту ж функцію, що й зазначений ген арабідопсису, тому що обидва гени мають походження від того самого предка. Термін "ортолог" може позначати ендогенний ген, що кодує білок з фактично такою же функцією, і що включає послідовність (поліпептиду або нуклеїнової кислоти) з ідентичністю послідовності не менш 70 %, не менш 80 %, не менш 85 %, не менш 90 %, не менш 95 % або не менш 99 % у порівнянні із заданою послідовністю, до якої відноситься зазначений ортолог, наприклад, по всій довжині послідовності. Зокрема, термін "ортолог" може позначати ендогенний ген, що походить від виду, відмінного від арабідопсису, кодує білок з фактично такою ж функцією й включає послідовність із ідентичністю послідовності не менш 70 %, не менш 80 %, не менш 85 %, не менш 90 %, не менш 95 % або не менш 99 % у порівнянні із заданою послідовністю арабідопсису, до якої відноситься відповідний ортолог, наприклад, по всій довжині послідовності. У контексті даного винаходу під ортологом може розумітися ендогенний ген, що походить від виду, відмінного від арабідопсису, кодує білок з фактично такою ж функцією й включає амінокислотну послідовність із ідентичністю послідовності не менш 70 %, не менш 80 %, не менш 85 %, не менш 90 %, не менш 95 % або не менш 99 % по всій довжині послідовності в порівнянні з: білком AHP6 арабідопсису з номером послідовності SEQ ID 1 або 12; білком CKX1 арабідопсису з SEQ ID 5; білком CKX2 арабідопсису з SEQ ID 6; білком CKX3 арабідопсису з SEQ ID 7; білком CKX4 арабідопсису з SEQ ID 8; білком CKX5 арабідопсису з SEQ ID 9; білком CKX6 арабідопсису з SEQ ID 10; і (або) білком CKX7 арабідопсису з SEQ ID 11, відповідно. Ортолог білка AHP6 виконує в основному ту ж функцію, що й білок AHP6 арабідопсису, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID 1 або 12. Біохімічний in vitro тест для функції білка AHP6 описаний у джерелі Mahonen et al. "Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development", Science 2006, 1, 94-98. Ортолог білка AHP6 може проявляти не менш 50 % активності білка AHP6 арабідопсису з SEQ ID 1 або 12 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. 4 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ортолог певного білка CKX арабідопсису виконує в основному ту ж саму функцію, що й відповідний білок CKX арабідопсису. Фахівцеві добре відомі засоби й способи визначення того, чи проявляє певний білок цитокінін-оксидазну або цитокінін-дегідрогенузну активність, чи ні, а також визначення рівня цитокінін-оксидазної або цитокінін-дегидрогенузної активності певного білка або зонда в абсолютних величинах й (або) щодо іншого білка або зонда. У спеціальній літературі наводяться докладні вказівки відносно перевірки білків на зазначену активність, див. наприклад EC 1.5.99.12. Ортолог білка CKX1 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX1 арабідопсису з SEQ ID 5 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. Ортолог білка CKX2 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX2 арабідопсису з SEQ ID 6 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. Ортолог білка CKX3 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX3 арабідопсису з SEQ ID 7 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. Ортолог білка CKX4 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX4 арабідопсису з SEQ ID 8 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. Ортолог білка CKX5 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX5 арабідопсису з SEQ ID 9 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. Ортолог білка CKX6 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX6 арабідопсису з SEQ ID 10 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. Ортолог білка CKX7 може проявляти не менш 50 % активності білка CKX7 арабідопсису з SEQ ID 11 при вимірі в рамках вищезгаданого біохімічного in vitro тесту, переважно не менш 70 %, ще більш переважно - не менш 90 %. У контексті цього винаходу "ідентичність" послідовності об'єктивно визначається будь-яким з безлічі способів. Фахівцям добре відомі ці способи і ясно, як вибрати підходящий спосіб без особливих утруднень. У даній області існує й добре відомі безліч способів для визначення взаємин (наприклад, ідентичності, схожості й (або) гомології) між двома й більше послідовностями. Зокрема, ці способи включають ручне вирівнювання, комп'ютеризоване вирівнювання послідовності і їхньої комбінації. Є безліч доступних алгоритмів (які, як правило, реалізуються на комп'ютері) для виконання вирівнювання послідовності, також подібні алгоритми можуть бути реалізовані фахівцями. Ступінь ідентичності однієї амінокислотної або нуклеотидної послідовності іншій може бути визначена по алгоритму BLAST за авторством Karlin й Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Також можуть бути використані програми, наприклад, BLASTN й BLASTX, розроблені на основі цього алгоритму (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). Для аналізу нуклеотидної послідовності в програмі BLASTN на базі BLAST, задають, наприклад, наступні параметри: score (шкала) = 100, word length (довжина слова) = 12. При аналізі амінокислотних послідовностей у програмі BLASTX на базі BLAST задають, наприклад, такі параметри: score (шкала) = 50, word length (довжина слова) = 3. При використанні програм BLAST й Gapped BLAST використовують параметри за замовчуванням. Конкретні техніки подібного аналізу відомі фахівцям (див. http://www.ncbi.nim.nih.gov.). Жорсткі умови гібридизації згідно із цим винаходом включають такі умови, як: 6 М сечовини, 0,4 % SDS (додецилсульфат натрію) і 0,5 x SSC (розчин цитрату й хлориду натрію); а також аналогічні жорсткі умови. При виконанні гібридизації в умовах підвищеної жорсткості, наприклад, при 6 М сечовини, 0,4 % SDS й 0,1 x SSC, очікується одержання нуклеотидних послідовностей з підвищеною гомологією. Очікується, що ізольовані в подібних умовах нуклеотидні послідовності будуть кодувати білок з високою гомологією рівня амінокислот відносно білка AHP6 (SEQ ID 1). У цьому випадку під високою гомологією мається на увазі ідентичність не менш 50 % і більше, 70 % і більше, 90 % і більше (наприклад, 95 % і більше), щодо всієї повної амінокислотної послідовності. Уже відомі три алельні рецесивні мутації, які є прикладами руйнування ендогенного гену AHP6 за аналогією з цим винаходом. Так, автори Mahonen et al. в "Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development", Science 2006, 311, 94-98, описують мутації aph6-1, aph6-2 й aph6-3. Мутація aph6-1 виражається в передчасній появі стоп-кодона в першому екзоні, тоді як в aph6-2 мутація розташовується в першому інтроні, в 5 парах основ від 5'-границі сплайс-варіанту AHP6b, а aph6-3 являє собою инсерційний алель Т-ДНК. І aph6-1, і 5 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 aph6-3, виходячи з усього, є нульовими алелями, а в алелі aph6-2 є присутнім тільки сплайсваріант APH6a. У даному контексті термін "руйнування" або "зруйнований" означає, що ген може бути структурно зруйнований так, щоб включати не менш однієї мутації або структурної зміни, при яких зруйнований ген губить здатність здійснювати ефективну експресію повнорозмірного повнофункціонального генного продукту. Руйнування ендогенного гену в змісті цього винаходу може відбуватися тоді, коли ендогенний ген включає одну або кілька мутацій, наприклад: (а) "міссенс-мутацію", що являє собою зміну в нуклеотидній послідовності, що приводить до заміни однієї амінокислоти на іншу амінокислоту; (б) "нонсенс-мутацію" або "мутацію стоп-кодону", що являє собою зміну в нуклеотидній послідовності, що приводить до передчасного введення стоп-кодону й, отже, припиненню трансляції (що приводить до утворення вкороченого білка); гени рослини містять трансляційні стоп-кодони TGA (UGA у РНК), TAA (UAA у РНК) і TAG (UAG у РНК); таким чином, будь-яка заміна, вставка або видалення нуклеотидів, у результаті яких один із цих кодонів виявиться в зрілій трансльованій іРНК (у рамці зчитування), приведе до переривання трансляції. (в) "інсерційну мутацію" однієї або декількох амінокислот, зумовлену додаванням у послідовність, що кодує, нуклеїнової кислоти одного або декількох кодонів; (г) "делеціонну мутацію" однієї або декількох амінокислот, зумовлену видаленням з послідовності, що кодує, нуклеїнової кислоти одного або декількох кодонів; (д) "мутацію зі здвигом рамки", у результаті якої трансляція нуклеотидної послідовності відбувається в іншій рамці далі по ходу транскрипції щодо мутації. Мутація зі здвигом рамки може бути викликана різними причинами, наприклад, вставкою, видаленням або дуплікацією одного або декількох нуклеотидів. Як уже говорилося, бажано, щоб мутація (мутації) в ендогенному гені переважно приводили б до утворення мутантного білка з істотно зниженою або відсутньою біологічною активністю in vivo або до неутворення білка. Як правило, будь-яка мутація, що приводить до утворення білка з хоча б однією вставкою, видаленням й (або) заміною амінокислоти в порівнянні з білком дикого типу, може викликати істотне скорочення або повну відсутність біологічної активності. Однак відомо, що мутації в певних частинах білка з більшою ймовірністю приводять до зниження функції мутантного білка APH6, наприклад, мутації, що приводять до утворення вкорочених білків, у яких відсутня значна частина функціональних доменів. Термін "руйнування" або "зруйнований" також містить у собі функціональне придушення або інактивацію зруйнованого гену або одного з його продуктів, при яких такий ген або не експресується, або нездатний ефективно экспресувати повнорозмірний і (або) повнофункціональний генний продукт. Функціональне придушення або інактивація можуть бути викликані структурним руйнуванням і (або) перериванням експресії на рівні транскрипції або трансляції. Функціональне придушення або інактивація також можуть бути досягнуті, наприклад, такими способами, як антизначеннєве придушення гену полінуклеотиду, сайленсинг генів, що індуцюється двохланковою РНК, техніки з використанням рибозимів і т. д., відповідно до докладного опису нижче. Придушення експресії і (або) активності може бути викликане, наприклад, антизначеннєвими конструкціями, значеннєвими конструкціями, конструкціями сайленсингу РНК, РНК-інтерференцією, геномними руйнуваннями (наприклад, транспозонами, TILLING-методом, гомологичною рекомбінацією і т.п.) і т.д. Придушення експресії й (або) активності може бути виміряне шляхом визначення наявності й (або) кількості транскриптів (наприклад, за допомогою технік нозерн-блоттингу або ПЦР зі зворотною транскрипцією) і (або) шляхом визначення наявності й (або) кількості повнорозмірного або вкороченого поліпептиду, що кодується даним геном (наприклад, за допомогою імуносорбентного ферментного аналізу або вестерн-блоттингу) і (або) шляхом визначення наявності й (або) кількості білкової активності продукту зруйнованого гену. У контексті даного винаходу термін "руйнування" або "зруйнований" також містить у собі руйнування, що має місце тільки в частині рослини, зокрема, у певному типі клітин або тканин, наприклад, у репродуктивній меристемі або у верхівці пагонів. Руйнування може бути досягнуте шляхом взаємодії й (або) впливу в області, що кодує, в області, що не кодує, і (або) у регуляторній області, наприклад, у промоторній області певного гену. Руйнування в змісті цього винаходу переважно приводить до повної або часткової втрати функцій зруйнованого гену й (або) його продукту. Мінімум одне з руйнувань відповідно до запропонованого у винаході способу або в рослині, що не зустрічається в природі, пропонованому у винаході, може бути отримане шляхом введення в геном рослинної клітини не менш однієї полінуклеотидної послідовності, що включає нуклеотидну послідовність із не менш 90 %, не менш 95 %, не менш 99 %, не менш 99,5 % і 6 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 більше ідентичності з послідовністю SEQ ID 2, 3, 4, 13, 14 або її підпослідовністю, або її комплементом, у результаті чого хоча б одна полінуклідна послідовність зчіплюється із промотором відповідно до смислової або антисмислової орієнтації. В іншому варіанті здійснення руйнування вводиться в геном рослинної клітини за допомогою мінімум однієї полінуклеотидної послідовності, сконфігурованої для сайленсингу або інтерференції РНК. Одне, більше одного або всі руйнування в мінімум одному з ендогенних генів може включати вставку одного або декількох транспозонів. "Мобільний елемент" (TE) або "транспозуємий генетичний елемент" являє собою послідовність ДНК, що може переміщатися з однієї локалізації в клітині в іншу. Переміщення мобільного елемента може походити від епісоми до епісоми, від епісоми до хромосоми, від хромосоми до хромосоми або від хромосоми до епісоми. Мобільні елементи характеризуються присутністю послідовностей інвертованих повторів у точках закінчення. Мобілізація здійснюється ферментативно за допомогою "транспозази". Структурно мобільний елемент категоризується як транспозон (TN) або "елемент інсерційної послідовності" (IS-елемент) залежно від присутності або відсутності, відповідно, генетичних послідовностей крім тих, які необхідні для мобілізації елемента. Міні-транспозон або міні-IS-елемент, як правило, не має послідовностей, що кодують транспозазу. У ще одному варіанті здійснення винаходу одне, більше одного або всі руйнування можуть включати одну або кілька крапкових мутацій у хоча б одному з ендогенних генів. Одне, більше одного або всі руйнування в хоча б одному з ендогенних генів можуть являти собою гомозиготні руйнування. В іншому варіанті одне, більше одного або всі руйнування в хоча б одному з ендогенних генів можуть являти собою гетерозиготні руйнування. У деяких варіантах здійснення руйнування в хоча б одному з ендогенних генів можуть включати гомозиготні руйнування, гетерозиготні руйнування або комбінацію гомозиготних руйнувань і гетерозиготних руйнувань. Руйнування можуть викликатися шляхом введення в геном рослини експресійної касети. "Експресійна касета" - конструкція нуклеїнової кислоти, наприклад, вектор, зокрема, плазмида, вірусний вектор і т.д., здатний утворювати транскрипти й, можливо, поліпептиди, що кодуються полинуклеотидною послідовністю. Експресивний вектор здатний утворювати транскрипти в екзогенній клітині, наприклад, бактеріальній клітині, або в рослинній клітині, in vivo або in vitro, наприклад, у протопласті культивованої рослини. Експресія продукту може бути конститутивною або індуційованою, залежно від обраного промотору. Антисмислові, значеннєві, РНКінтерференційні або РНК-сайленсингові конфігурації, які не підлягають трансляції, явно входять у це визначення. У контексті експресуйного вектора промотор називають "функціонально зв'язаним" з полинуклеотидною послідовністю, якщо він здатний регулювати експресію зв'язаної полинуклеотидної послідовності. Цей термін також стосується альтернативних конструкцій екзогенного гену, наприклад, експресіонованим або інтегрованим трансгенам. Аналогічно, термін "функціонально зв'язаний" також застосовується до альтернативних або додаткових транскрипційних регуляторних послідовностей, наприклад, підсилювачам, пов'язаним з полинуклеотидною послідовністю. Термін "вектор" позначає засіб поширення й (або) переносу нуклеїнової кислоти між організмами, клітинами або клітинними компонентами. Вектори включають плазміди, віруси, бактеріофаги, провіруси, фагміди, транспозони, штучні хромосоми і т. д., які реплициюються автономно або можуть вбудовуватися в хромосому клітини-хазяїна. Вектор може також являти собою полінуклеотид оголеної РНК, полінуклеотид оголеної ДНК, полінуклеотид, що складається з і ДНК, і РНК в одній і тій же нитці, полі-лізин-кон'югировану ДНК або РНК, пептидкон'югировану ДНК або РНК, липосом- кон'югировану ДНК і т.п., які не реплициюються автономно. Полінуклідна послідовність, нуклеотидна послідовність або ген "кодує" значеннєву або антизначеннєву РНК молекулу, РНК-інтерференційну або РНК-сайленсингову молекулу або поліпептид, якщо полінуклідна послідовність може бути розшифрована (у сплайсированій або несплайсированій формі) і (або) трансльована в РНК або поліпептид, або у відповідну підпослідовність. Фахівцям добре відома дегенерація генетичного коду, що допускає кодування однієї й тієї ж амінокислотної послідовності або поліпептиду декількома різними нуклеотидними послідовностями, і для фахівців не представляє складності визначення того, чи кодує задана нуклеотидна послідовність задану амінокислотну послідовність або поліпептид. "Експресія гену" або "експресія нуклеїнової кислоти" означає транскрипцію ДНК у РНК (може включати модифікацію РНК, наприклад, сплайсинг), трансляцію РНК у поліпептид (може включати наступну модифікацію поліпептиду, наприклад, посттрансляційну модифікацію), або й транскрипцію, і трансляцію, залежно від контексту. 7 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонований у винаході спосіб може додатково містити кроки введення в геном рослини руйнування ендогенного гену AHP6 і регенерацію рослини з подібним чином зміненим геномом. Це руйнування може стабільно вводитися в геном рослини для генерації рослини, що не зустрічається в природі. Вважається, що руйнування вноситься в геном рослини стабільно, якщо це руйнування копіюється й сегрегується під час розподілу клітин і передається потомству вищевказаної рослини або рослинної клітини. Пропонований у винаході спосіб може додатково містити крок введення в геном рослини руйнування хоча б одного ендогенного гену CKX, наприклад, не менш двох різних ендогенних генів CKX. У контексті даного винаходу термін "ген CKX" або "ген цитокінін-оксидази або дегідрогенузи" стосується гену, що кодує білок CKX із цитокінін-оксидазною або дегідрогенузною активністю. Білок CKX, також називаний цитокінін-оксидазою або дегідрогенузой, представляє собою фермент, що каталізує наступну хімічну реакцію: N6-диметилаллиладенін + акцептор + H2O аденін + 3-метилбут-2-енал + відновлений акцептор. Три субстрати даного ферменту - це N6-диметилаллиладенін, акцептор і H2O, а три продукти - аденін, 3-метилбут-2-енал і відновлений акцептор. Термін "цитокінін-оксидазна або дегідрогенузна активність" охоплює активність заданого поліпептиду при каталізації реакції оксидоредуктази з хоча б одним цитокініном як субстратом. Фахівцям добре відомі засоби й способи визначення того, чи має заданий поліпептид цитокінін-оксидазну або дегідрогенузну активність чи ні, і визначення рівня цитокінін-оксидазної або дегідрогенузної активності певного поліпептиду або зонда в абсолютних величинах й (або) щодо іншого поліпептиду або зонда. У спеціальній літературі приводяться докладні вказівки відносно перевірки поліпептидів на зазначену активність, див. наприклад EC 1.5.99.12. Термін "цитокінін-оксидазна або дегідрогенузна активність" може охоплювати активність заданого поліпептиду при каталізації реакції оксидоредуктази з хоча б одним цитокініном як субстратом з рівнем активності не менш 30 % від активності AtCKX3 (CKX3 з SEQ ID 7) або не менш 50 % від активності AtCKX3. Хоча б один CKX ген може являти собою: ендогенний ген CKX1, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 5, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX2, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 6, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX3, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 7, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX4, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 8, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX5, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 9, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX6, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 10, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX7, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 11, або відповідний ортолог. У запропонованому в цьому винаході способі може бути присутнім руйнування не менше ніж двох ендогенних генів CKX на додаток до руйнування ендогенного гену AHP6. Зокрема, два руйнованих ендогенних гени CKX являють собою ендогенний ген CKX3, що кодує білок CKX, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 7 або відповідний ортолог, і ендогенний ген CKX5, що кодує білок CKX, що включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 9 або відповідний ортолог. Було показано, що комбінація руйнування гену AHP6 з руйнуванням генів CKX приводить до ще більш вираженого впливу на вихід насіння. Пропонований у цьому винаході спосіб може використовуватися для збільшення числа стручків на одну рослину, що дозволяє домогтися збільшення виходу насіння рослини й отриманого від нього потомства. Пропонований у цьому винаході спосіб також може використовуватися для одержання рослини, що не зустрічається в природі, зі збільшеним числом стручків на одну рослину, що дозволяє домогтися збільшення виходу насіння у рослині й отриманому від неї потомстві. Дійсний винахід також стосується рослини, що не зустрічається в природі, що включає руйнування ендогенного гену AHP6 і руйнування хоча б одного ендогенного гену CKX. Наприклад, ендогенний ген AHP6 може включати або складатися з: 8 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (а) нуклеїнової кислоти, що кодує білок AHP6 і включає амінокислотну послідовність SEQ ID 1, 12 або її ортолог; (б) нуклеїнової кислоти, що кодує білок AHP6 і включає амінокислотну послідовність із ідентичністю послідовності не менш 70 %, не менш 80 %, не менш 90 % або не менш 95 % у порівнянні з повною амінокислотною послідовністю SEQ ID 1 або 12; (в) нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID 2, 3, 4, 13 або 14; (г) нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність із ідентичністю послідовності не менш 90 % по усій повній нуклеотидній послідовності SEQ ID 2, 3, 4, 13 або 14; або (д) нуклеїнової кислоти, що гибридизується при жорстких умовах в одну з нуклеотидних послідовностей, визначених у підпунктах (а), (б), (в) і (або) (г). У рослині, що не зустрічається в природі, відповідно до винаходу, хоча б один зруйнований ендогенний ген CKX може являти собою: ендогенний ген CKX1, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 5, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX2, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 6, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX3, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 7, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX4, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 8, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX5, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 9, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX6, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 10, або відповідний ортолог; ендогенний ген CKX7, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 11, або відповідний ортолог. Ендогенні гени CKX, що руйнують у не рослині, що зустрічається в природі, відповідно до винаходу можуть являти собою: ендогенний ген CKX3, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 7, або відповідний ортолог; а також ендогенний ген CKX5, що кодує білок CKX і включає амінокислотну послідовність, ідентичну або таку, що має не менш 90 % ідентичності з SEQ ID 9, або відповідний ортолог. Пропонована в цьому винаході рослина, що не зустрічається в природі, може бути отримана традиційними засобами, наприклад, за допомогою трансформації. Трансформація рослинних клітин і протопластів може виконуватися по суті будь-якими з різних шляхів, відомих фахівцям у молекулярній біології рослин, включаючи, серед іншого, описані тут способи. Див. "Methods in Enzymology", тім 153 (Recombinant DNA Part D) Wu and Grossman (редактори) 1987, Academic Press. У даному контексті термін "трансформація" позначає зміну генотипу рослини-хазяїна або рослинної клітини шляхом введення нуклеотидної послідовності, наприклад, "гетерологічної", "екзогенної" або "чужорідної" нуклеотидної послідовності. Гетерологічна нуклеотидна послідовність необов'язково походить із іншого джерела, однак у якийсь момент часу вона повинна була бути зовнішньою стосовно клітини, у яку вводиться. У пропонованому в цьому винаході способі й пропонованій в цьому винаході рослині, що не зустрічається в природі, руйнування ендогенного гену може виконуватися за допомогою декількох різних відомих методик. Але, декілька або всі руйнування хоча б одного ендогенного гену можуть бути виконані шляхом введення в геном й экспресуванні в рослинній клітині або рослині трансгенної полінуклеотидної послідовності, наприклад, в антисмислових або смислових конфігураціях, РНК-інтерференційних або РНК-сайленсингових конфігураціях і т.д., при цьому трансгенна полінуклідна послідовність включає нуклеотидну послідовність, що представляє собою або є комплементарною стосовно одного з ендогенних генів, який руйнують. Крім того, вищезгадана полінуклідна послідовність може включати промотор, у результаті чого вона придушує експресію й (або) активність хоча б зруйнованого ендогенного гену в порівнянні з відповідною контрольною рослинною клітиною або рослиною без зазначених руйнувань (наприклад, нетрансгенним батьком або нетрансгенною рослиною того ж виду). Введення трансгенної полінуклеотидної послідовності може виконуватися за допомогою різних технік, включаючи, серед іншого, електропорацію, балістичну трансфекцію, перенос за допомогою агробактерій та інші доступні способи. У деяких варіантах здійснення винаходу полінуклеотид зв'язується із промотором відповідно до смислової або антисмислової орієнтації або сконфігурирований для саленсингу або інтерференції РНК. 9 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Руйнування одного або декількох ендогенних генів може виконуватися за допомогою залежного від гомології сайленсингу генів - техніки, що докладно описана в спеціальній літературі. Іншим підходом до сайленсингу генів може бути використання антисмислової технології. Застосування антисмислових нуклеїнових кислот добре відоме фахівцям у даній області. Антисмислова нуклеїнова кислота має ділянку комплементарності стосовно цільової нуклеїнової кислоти, наприклад, певну послідовність геномного гену, іРНК або кДНК. Антисмислова нуклеїнова кислота може являти собою РНК, ДНК або будь-яку іншу підходящу молекулу. Між антисмисловою послідовністю і її комплементарною смисловою послідовністю може утворюватися дуплекс, що приводить до інактивації гену. Антисмислова нуклеїнова кислота може придушувати експресію гену шляхом утворення дуплекса із РНК, транскрибованої з гену, шляхом утворення триплекса з дуплексної ДНК і т.д. Антисмислова нуклеїнова кислота може бути отримана й перевірена за допомогою декількох загальновизнаних технік. Каталітичні молекули РНК або рибозими також можуть використовуватися для придушення експресії певних обраних генів. Можна спроектувати рибозими, які утворюють специфічні пари з практично будь-якою цільовою РНК і розщеплюють фосфодиефірний остов у певному місці, що приводить до функціональної інактивації цільової РНК. При виконанні розщеплення сам рибозим не міняється й тому здатен рециклювати і розщеплювати інші молекули. Включення рибозимних послідовностей в антисмислові РНК привносить у них активність розщеплення РНК, у результаті чого збільшується активність конструкцій. Було виявлено кілька класів рибозимів. Наприклад, один клас рибозимів походить із декількох малих кільцевих РНК, які мають здатність до саморозщеплення й ауторепродукції в рослинах. РНК можуть реплицируватися самостійно (РНК віроїди) або з вірусом-помічником (сателитні РНК). Приклади РНК включають РНК від віроїду сонячної плямистості авокадо й сателитні РНК від вірусу кільцевої плямистості тютюну (velvet), вірусу тимчасової смугастості люцерни, вірусу стеблевої плямистості тютюну, вірусу плямистості паслену (nodiflorum) і вірусу плямистості конюшини підземної. Проектування й застосування цільових РНК-специфічних рибозимів описане в спеціальній літературі. Див, наприклад, Haseloff et al. (1988) Nature, 334: 585-591. Ще одним із способів інактивації певного обраного гену шляхом придушення експресії є смислова супресія. Було показано, що введення експрасійних касет, у яких нуклеїнова кислота сконфігурована відповідно до смислової орієнтації стосовно промотору, є ефективним засобом блокування транскрипції цільового гену, що цікавить. Див., наприклад, патенти США з номерами 5,034,323, 5,231,020 і 5,283,184. Руйнування відповідно до винаходу також може виконуватися за допомогою сайленсингу або інтерференції РНК (РНК-інтерференції), що також може називатися посттранскрипційним сайленсингом гену (PTGS) або косупрессией. У контексті цього винаходу "сайленсинг РНК" (також називаний RNAi або РНК-інтерференцією) позначає будь-який механізм, за допомогою якого присутність одноланкової або, як правило, дволанкової РНК у клітині приводить до придушення експресії цільового гену, що містить послідовність, ідентичну або майже ідентичну послідовності РНК, включаючи, серед іншого, інтерференцію РНК, репресію трансляції цільової іРНК, транскрибованої із цільового гену без зміни стабільності іРНК, а також транскрипційний сайленсинг (наприклад, ацетилування гистону і утворення гетерохроматину, що приводить до придушення транскрипції цільової іРНК). В "РНК-інтерференції" присутність одноланкової або дволанкової РНК у клітині приводить до ендонуклеолитичного розщеплення й наступної деградації цільової іРНК. В одному з варіантів здійснення винаходу в рослинну клітину вводиться трансген (наприклад, послідовність, що цікавить, і (або) підпослідовність гену або послідовність, що кодує) для руйнування одного або декількох генів за допомогою РНК-сайленсингу або інтерференції (RNAi). Наприклад, послідовність або підпослідовність (трансген) включає невелику підпослідовність, наприклад довжиною в 21-25 основ, більш довгу підпослідовність, наприклад довжиною в 25-100 або 100-2000 (або 200-1500, 250-1000 і т.д.) основ, і (або) повну послідовність, що кодує, або ген, обраний з або комплементарний до ендогенного гену, який потрібно зруйнувати. Такий трансген може включати ділянку послідовності або підпослідовності з довжиною в 21-25 основ і не менш 80 %, не менш 90 %, не менш 99 % ідентичності в порівнянні з підпослідовністю однієї з нуклеотидних послідовностей з номером послідовності SEQ ID 2, 3.4, 13 або 14. Використання RNAi для придушення експресії генів у різних видах клітин (включаючи рослинні клітини) і організмах, наприклад, шляхом експресії РНК-«шпильки" (стебло-петля) або двох ланцюжків інтерферуючої РНК, докладно описане в спеціальній літературі, як і способи визначення підходящої інтерферуючої РНК (або їхнього набору) для впливу на цільовий ген, а 10 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також способи одержання подібних інтерферуючих РНК. Так, інтерференція РНК описана в публікаціях патентних заявок США 20020173478, 20020162126 й 20020182223. Полінуклідна послідовність (послідовності) або підпослідовність (підпослідовності), що підлягає експресії для індукування RNAi, може бути экспресована, наприклад, під контролем конститутивного промотору, промотору, що індуцюється, або тканеспецифічного промотору. Експресія за рахунок тканеспецифічного промотору може бути кращою в певних варіантах здійснення винаходу. Термін "промотор" у даному контексті включає ділянку ДНК, розташовану проти ходу транскрипції стосовно початку транскрипції, що бере участь у розпізнаванні й зв'язуванні РНК-полімерази й інших білків для початку транскрипції. "Рослинний промотор" - це промотор, здатний викликати транскрипцію в рослинних клітинах. Приклади рослинних промоторів включають, серед іншого, промотори, які отримуються із рослин, вірусів рослин і бактерій, що міститять гени, виражені в рослинних клітинах, таких як агробактерій або мікоризів. Приклади промоторів, що залежать від стадії розвитку, включають промотори, які переважно викликають транскрипцію в певних тканинах, наприклад, листах, коріннях або насінні, або територіально в таких ділянках як ендосперм, ембріон або меристемні області. Такі промотори називаються "тканеспецифічними". Промотор з тимчасовим регулюванням викликає експресію в певні моменти, наприклад, через 0-25 днів після запилення. "Специфічний для типу клітин" промотор в основному викликає експресію в певних типах клітин одного або декількох органів, наприклад, судинних клітинах у коріннях або листах. "Індукований" промотор - це промотор під контролем середовища, що може бути індукованим або дерепрессованим. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть викликати транскрипцію завдяки індукованим промоторам, включають анаеробні умови або наявність світла. Тканеспецифічні, специфічні для типу клітин й індуковані промотори утворюють клас неконститутивних промоторів. "Конститутивний" промотор - це промотор, що залишається активним у більшості умов навколишнього середовища й у всіх або майже всіх тканинах, а також на всіх або майже всіх стадіях розвитку. Одне, декілька або всі руйнування хоча б в одному з вищевказаних ендогенних генів можуть вводитися за допомогою, наприклад, інактивації гену на базі транспозону. Одна або декілька мутацій послідовності гену може включати одну або кілька вставок транспозонів, при цьому руйнування придушують експресію й (або) активність як мінімум зруйнованого ендогенного гену в порівнянні з відповідною контрольною рослинною клітиною або рослиною без подібних руйнувань. Наприклад, одна або кілька мутацій включають гомозиготне руйнування в одному або декількох з вищезгаданих генів, або включають гетерозиготне руйнування в одному або декількох з вищезгаданих генів, або включають комбінацію і гомозиготних, і гетерозиготних руйнувань. Транспозони були вперше виявлені в кукурудзі Барбарою Мак-Клинток наприкінці 1940-х років. Сімейство мутаторів мобільних елементів, наприклад, мобільні елементи Мутатору Робертсона (Mu), як правило, використовуються в мутагенезі генів рослин, тому що вони присутні з великим числом копій (10-100) і переважно вставляються всередині й навколо генів. Мобільні елементи можна розділити на два широких класи залежно від їхнього режиму транспозиції. Вони позначаються як Клас I і Клас II; обидва класи застосовуються як мутагени й вектори доставки. Мобільні елементи класу I транспозуються за допомогою РНК посередника й використовують зворотні транскриптази, тобто є ретроелементами. Існує як мінімум три типи мобільних елементів класу I: ретротранспозони, ретропозони й SINE-подібні елементи. Ретротранспозони звичайно містять довгі кінцеві повтори, гени, що кодують білки вірусної оболонки (gag) і зворотню транскриптазу, РНК-азу H, гени інтегрази й поліимерази (pol). У видах рослин описана безліч ретротранспозонів. Подібні ретротранспозони мобілізуються й переміщаються за допомогою РНК-посередника в реакції, що каталізується зворотньою транскриптазою і РНК-азою H, що кодується транспозоном. Приклади попадають у групи Tylcopia й Ty3-gypsy, а також у класифікації SINE-подібні й LINE-подібні. Більш докладний опис див. у статті авторів Kumar й Bennetzen (1999) "Plant Retrotransposons" у журналі Annual Review of Genetics 33: 479. Крім того, мобільні елементи ДНК, такі як Ac, Taml й En/Spm, також зустрічаються в багатьох різних видах рослин і можуть використовуватися в цьому винаході. Транспозони (і IS-елементи) є загальноприйнятими засобами введення мутацій у рослинні клітини. Ці мобільні генетичні елементи доставляються в клітини, наприклад, шляхом статтевого схрещування, вибирається транспозиція й підсумкові інерційні мутанти відсіваються, наприклад, відповідно до фенотипу, що цікавить. Зруйновані гени потім можуть вводитися в інші рослини шляхом схрещування ізольованих рослин, що не зустрічаються в природі або трансгенних рослин з незруйнованою рослиною, наприклад, за допомогою статевого 11 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 схрещування. Можуть використовуватися будь-які з безлічі стандартних технік схрещування, залежно від видів, які схрещують. Місцезнаходження транспозону в геномі ізольованого, що не зустрічається в природі або трансгенного рослини може визначатися за допомогою відомих способів, наприклад, шляхом секвенування фланкуючих областей. Наприклад, Пцр-реакція рослини може застосовуватися для ампліфіцирування послідовності, що потім може бути секвенована за допомогою діагностики для підтвердження її походження. При необхідності інсерційні мутанти відсіваються відповідно до бажаного фенотипу, наприклад, придушенням експресії або активності гену, що цікавить, у порівнянні з контрольною рослиною. Також для введення й визначення руйнування в цьому винаході може використовуватися методика "TILLING". "TILLING" - таргетування індукованих місцевих ушкоджень у геномах. Див. McCallum et al., (2000), "Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) for Plant Functional Genomics" Plant Physiologv 123: 439-442; McCallum et al., (2000), "Targeted screening for induced mutations" Nature Biotechnologv 18: 455-457; а також Colbert et al., (2001), "High-Throughput Screening for Induced Point Mutations" Plant Physiology 126: 480-484. TILLING сполучає крапкові мутації високої щільності зі швидким чутливим виявленням мутацій. Як правило, для мутагенації насіння рослин використовується этил метансульфонат (EMS). EMS алкілує гуанін, що звичайно приводить до помилкового спарювання. Наприклад, насіння вимочують в 10-20 мМ розчині EMS протягом 10-20 годин; насіння промивають, а потім висівають. Позначимо рослини цього покоління як М1. Рослини М1 потім самозапилюють. Присутні в клітинах, які утворюють репродуктивні тканини, мутації успадковуються наступним поколінням (М2). Як правило, рослини М2 просівають на наявність мутації в потрібному гені й (або) на конкретні фенотипи. Наприклад, ДНК від рослин М2 поєднують і визначають наявність мутацій у гені, що цікавить, шляхом детектування гетеродуплексного утворення. Як правило, підготовляють ДНК від кожної М2-рослини й поєднують у пул. Бажаний ген ампліфікують за допомогою ПЦР. Об'єднаний зразок потім денатурують і ренатурують, щоб могли утворитися гетеродуплекси. Якщо в одній з рослин присутня мутація, продукти ПЦР будуть двох видів: дикі й мутантні. Пули, які містять гетеродуплекси, визначають шляхом поділу ПЦР реакції, наприклад, за допомогою денатуруючої високоефективної рідинної хроматографії (DPHPLC). DPHPLC виявляє помилкове спарювання в гетеродуплексах після плавлення й ренатурації гетероалельної ДНК. Хромотографію проводять при нагріванні ДНК. Гетеродуплекси мають знижену термостійкість й утворюють пухирці, що плавляться, що прискорює рух у хроматографічній колоні. Якщо на додаток до очікуваних гомодуплексів присутні гетеродуплекси, буде видний подвійний пік. У результаті визначаються пули, що несуть мутацію в гені, що цікавить. Після цього можуть бути ідентифіковані й секвеновані окремі ДНК від рослин, що утворять обрану об'єднану популяцію. При необхідності рослина, що має потрібну мутацію в гені, що цікавить, може схрещуватися з іншими рослинами для усунення фонових мутацій. Для введення руйнування відповідно до винаходу також можуть застосовуватися інші мутагенні способи. Способи введення в гени рослини генетичних мутацій і відбору рослин з бажаними характеристиками добре відомі фахівцям. Наприклад, насіння або інший рослинний матеріал можна обробляти мутагенною хімічною речовиною у відповідності зі стандартними методиками. Подібні хімічні речовини включають, серед іншого, наступні: диетилсульфат, етиленимін й N-нітрозо-N-етилуреа. Також може використовуватися іонізуюче випромінювання з таких джерел, як рентгенівські або гама промені. Рослина, що містить потрібне руйнування відповідно до винаходу, може схрещуватися з іншими рослинами для введення руйнувань у ці рослини. Для цього можуть використовуватися стандартні техніки схрещування. Гомологічна рекомбінація також може використовуватися для введення руйнування відповідно до винаходу. Гомологічна рекомбінація була продемонстрована на рослинах. Гомологічна рекомбінація може застосовуватися для індукування модифікацій цільового гену шляхом таргетування гену, що цікавить, in vivo. Мутації в певних ділянках обраної генної послідовності (у тому числі 5' проти ходу транскрипції, 3' по ходу транскрипції, а також у внутрішньогенних областях) виконуються in vitro і вводяться в рослину, що цікавить, за допомогою стандартних методик. Видозмінений ген буде взаємодіяти із цільовим геном дикого типу, викликаючи гомологічну рекомбінацію й цільове заміщення гену дикого типу в трансгенних рослинах. Рослини, що не зустрічаються в природі, відповідно до винаходу, які можуть вживатися в їжу людиною й тваринами, також можуть використовуватися як продукти харчування або кормів, безпосередньо або після підготовки відомими способами. 12 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід також стосується використання вищевказаних рослин, що не зустрічаються в природі, відповідно до винаходу, а також клітин, культур клітин, частин, наприклад, корінь, листів, а також матеріалу для розмноження, що не зустрічається в природі, наприклад, насіння, бульб, коренеплодів або наростів стрижневих корінь або плодів, отриманих з вищезгаданих рослин, для виготовлення харчових або кормових продуктів, фармацевтичних препаратів або хімічних продуктів тонкого органічного синтезу. Далі описані приклади здійснення цього винаходу. Креслення: ФІГ. 1: розташування вставок Т-ДНК і транспозонів у мутантах ckx. Інсерційні мутанти виявлялися шляхом ПЦР просівання, а місце вставки визначалося шляхом секвенування ДНК прикордонного фрагмента. Чорними прямокутниками позначені екзони, білими - інтрони, а трикутниками показані вставки Т-ДНК. G-GABI-KAT колекція Т-ДНК; S-Salk колекція Т-ДНК; TTorrey Mesa колекція Т-ДНК; Z-ZIGIA колекція транспозонів. ФІГ. 2: репродуктивний розвиток ahp6-1 й ahp6-3 у порівнянні з арабідопсисом дикого типу (Col-0): (A.) Число стручків на головному стрижні суцвіття однієї окремої рослини. (B.) Щільність стручків на головному стрижні суцвіття. (C.) Сумарний вихід насіння дикого типу й ahp6мутантних рослин. Рослини вирощували в парнику в умовах довгого світлового дня. Дані відповідають середнім значенням ± середньоквадратичне відхилення (n=20). Для порівняння значень зі значеннями дикого типу використовувався критерій Стьюдента. *, P < 0,01; **, P < 0,0001. ФІГ. 3: репродуктивний розвиток ckx3 і подвійного мутанта ckx3 ahp6-3 у порівнянні з арабідопсисом дикого типу. На графіку показане число стручків на головному стрижні суцвіття. Дані відповідають середнім значенням ± середньоквадратичне відхилення (n=20). Для статистичного порівняння використовувався критерій Стьюдента. * й°, P < 0,01; * = у порівнянні з диким типом,° = у порівнянні з ckx3. ФІГ. 4: репродуктивний розвиток подвійного мутанта ckx3 ckx5 і потрійного мутанта ckx3 ckx5 ahp6 у порівнянні з арабідопсисом дикого типу. На графіку (А) показане число стручків на головному стрижні суцвіття для потрійного мутанта ckx3 ckx5 ahp6-1 і контрольних рослин. Дані відповідають середнім значенням ± середньоквадратичне відхилення (n=20). Для статистичного порівняння використовувався критерій Стьюдента.°, P < 0,05; **, P < 0,0001; * = у порівнянні з диким типом,° = у порівнянні з ckx3 ckx5; На графіку (B) показане число стручків на головному стрижні суцвіття для потрійного мутанта ckx3 ckx5 ahp6-3 і контрольних рослин. Дані відповідають середнім значенням ± середньоквадратичне відхилення (n=20). 00 Для статистичного порівняння використовувався критерій Стьюдента. * й°, P < 0,01; ** й , P < 0,0001; * = у порівнянні з диким типом,° = у порівнянні з ckx3 ckx5. СПОСОБИ Рослинний матеріал й умови росту Як дикий тип використали екотип Колумбія (Col-0) резуховидки Таля (арабідопсису). Мутанти із вставками Т-ДНК ckx2-S1 (SALK_068485), ckx3-S1 (SALK_050938), ckx4-S1 (SALK_055204), ckx5-S1 (SALK_064309) і ckx6-S1 (SALK_070071) були взяті з лабораторії геномного аналізу інституту Salk (Alonso et al., (2003) Science 301, 653-657), мутант із вставкою транспозону ckx4-Z був узятий з колекції транспозонів ZIGIA (Baumann E, Lewald J, Saedler H, Schulz B, Wisman E (1998) Successful PCR-based reverse genetic screens using an En-7mutagenised Arabidopsis thaliana population generated via single-seed descent. Theoretical and Applied Genetics 97: 729-734), ckx5-G2 (лінія 332B10) і ckx7-G1 (лінія 363C02) були взяті з колекції GABI-KAT (Rosso, M.G., Li, Y., Strizhov, N., Reiss, B., Dekker, K., and Weisshaar, B. (2003) Plant Mol. Biol. 53, 247-259), а ckx7-T1 (SAIL_515_A07) був узятий з дослідницького інституту Torrey Mesa (у цей час Syngenta). Алель ahp6-1 був ідентифікований й ізольований у супрессорному скринінгу для детермінантного росту кореня, пов'язаного з мутацією wol рецептора цитокінінів CRE1/AHK4 (Mahonen, A. P., Bonke, M., Kauppinen, L, Riikonen, M., Benfey, P.N., and Helariutta, Y. (2000). A novel two-component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 14, 2938-2943; and Mahonen, A. P., Bishopp, A., Higuchi, M., Nieminen, K.M., Kinoshita, K., Tormakangas, K., Ikeda, Y., Oka, A., Kakimoto, T., and Helariutta, Y. (2006). Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development. Science 31 1, 94-98). Алель ahp6-3 - вставка Т-ДНК, що представляє очевидно нульовий алель і придушує фенотип wol за аналогією з ahp6-1 (Mahonen et al., 2006,). Множинні мутанти одержували шляхом генетичного схрещування. Рослини вирощували в парнику в ґрунті при 22 °C в умовах довгого світлового дня (16 ч день / 8 ч ніч). Для виміру виходу насіння вирощували рослини в кліматичних камерах (Percival AR-66L) у ґрунті при 24 °C, 100 мкЕ й 65 % вологості в умовах довгого світлового дня. 13 UA 109040 C2 5 10 15 20 25 30 35 Визначення параметрів урожайності Число стручків на головному стрижні визначали після припинення цвітіння. Число стручків на головному стрижні є загальноприйнятим індикатором виходу насіння. Збільшення числа стручків на головному стрижні, як правило, указує на збільшення сумарного виходу насіння у рослині (як видно з фігур 2 A й 2 C). Для безпосереднього аналізу виходу насіння рослини поміщали в паперові пакети після припинення цвітіння й зберігали в сухому місці протягом ще трьох тижнів, післячого визначали сумарний вихід насіння. ПРИКЛАДИ: Порівнювався репродуктивний розвиток ahp6-мутантних рослин з контрольними рослинами дикого типу. Квітки в арабідопсисі утворяться безупинно меристемою невизначених суцвіть. Обидва ahp6-мутанта утворили збільшені суцвіття, які складалися з істотно більшої кількості квіток у порівнянні з диким типом. Збільшення числа квіток, утворених меристемою суцвіть ahp6, привело до збільшення числа стручків у порівнянні з диким типом (фіг. 2A). Порівнювалося число стручків на головному стрижні після утворення останньої квітки. Мутанти ahp6-1 й ahp6-3 утворили, відповідно, на 11 й 21 % більше стручків, ніж рослини дикого типу (фіг. 2A). Крім того, збільшилася щільність стручків на стрижнях суцвіть ahp. Число стручків на одиницю довжини стрижня суцвіття зросло на 22 й 20 % у мутантах ahp6-1 й ahp6-3, відповідно, у порівнянні з рослинами дикого типу (фіг. 2B). Для перевірки того, чи буде збільшення утворення квіток і стручків впливати на вихід насіння мутантних рослин, було зібрано все насіння від окремих рослин після припинення цвітіння й визначена вага насіння. Сумарний вихід насіння у випадку мутантів ahp6-1 й ahp6-3 збільшився на 19,5 й 16,7 %, відповідно, у порівнянні з диким типом (фіг. 2C). Для аналізу ефекту мутації ahp6 на репродуктивний розвиток у рослинах із уже підвищеним статусом цитокінінів, одержуваним за допомогою мутації одного або декількох генів CKX, в оточення мутантів ckx3 й ckx3 ckx5 уводилася мутація ahp6 методом генетичного схрещування й аналізувалися отримані гібридні рослини. Число квіток і стручків, що сформувалися, на головному стрижні ckx3-мутантної рослини було аналогічно контрольній рослині дикого типу (фіг. 3). Однак комбінація мутацій ckx3 й ahp6 приводила до збільшення розміру суцвіть й 14 %му збільшенню утворення стручків у порівнянні з рослинами дикого типу й ckx3-мутантами (фіг. 3). Також ahp6-мутація підвищувала репродуктивну активність рослин, що містять мутації в декількох генах CKX. Наприклад, у рослинах з подвійними мутаціями ckx3 ckx5 формується більше стручків на головному стрижні в порівнянні з контрольною рослиною дикого типу (фіг. 4A й 4B). Однак у рослинах з потрійними мутаціями ckx3 ckx5 ahp6 число стручків додатково істотно збільшується в порівнянні з рослинами з подвійними мутаціями ckx3 ckx5, що в підсумку дає ще більш виражений ріст числа стручків на головному стрижні в рослинах з потрійною мутацією ckx3 ckx5 ahp6 у порівнянні з рослинам дикого типу (ahp6-1 на фіг. 4A й ahp6-3 на фіг. 4B). 14 UA 109040 C2 15 UA 109040 C2 16 UA 109040 C2 17 UA 109040 C2 18 UA 109040 C2 19 UA 109040 C2 20 UA 109040 C2 21 UA 109040 C2 22 UA 109040 C2 23 UA 109040 C2 24 UA 109040 C2 25 UA 109040 C2 26 UA 109040 C2 27 UA 109040 C2 28