Лікарський засіб для лікування лімфатичних пухлин

Даний винахід стосується засобів, застосовуваних при лікуванні пухлин лімфатичних тканин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіла, які специфічно зв'язуються з білками, що експресуються у зазначених пухлинах лімфатичної тканини. Даний винахід стосується також засобів, застосовуваних при лікуванні пухлин Т-клітин або пухлин В-клітин (за винятком мієломи). Крім того, даний винахід стосується антитіл, що специфічно зв'язуються з білками, що експресуються у пухлинах лімфатичних тканин і які мають цитотоксичну активність. Передумови створення винаходу За імунітет живих істот відповідають насамперед лімфатичні клітини. До лімфатичних клітин відносяться всі клітини, що походять з тих самих гемопоетичних стовбурних клітин, які вивільняються в периферичний кровотік після повторних стадій диференціації під дією різних факторів, що індуціюють диференціацію, включаючи фактори, називані інакше ростовими фактором, які є наявними в кістковому мозку або інших органах. На підставі різниць у ди ференціації, лімфоцити класифікуються на дві великі групи В-клітин і Т-клітин. Вважається, що В-клітини мають здатність продуціювати антитіла, тоді як Т-клітин мають відношення до прояву антигенності, цитотоксичності й ін. властивостей. При цьому, стан, коли такі клітини за тих або інших причин піддаються змінам, зв'язаним з утворенням пухлин, на ти х або інших стадіях ди ференціації і починають безконтрольно проліферувати у кістковому мозку, лімфатичній тканині, крові або т.п., відносять до пухлин лімфатичної тканини. Завдяки використанню нової технологи, зокрема тих переваг, що дає метод застосування моноклональних антитіл проти поверхневих антигенів диференціації, стало можливим ідентифікувати початок і/або стадію диференціювання лімфатичних клітин. У цьому випадку стало можливо не тільки визначити, із яких: Т-клітин або В-клітин, походять такі пухлинні клітини, але також ідентифікувати ступінь зрілості пухлинних клітин. Пухлини лімфатичної тканини на основі походження і ступеня зрілості пухлинних клітин підрозділяють на два великих класи: пухлини В-клітин і пухлини Т-клітин. В залежності від ступеня зрілості пухлинних клітин пухлини В-клітин далі класифікують на гострий В-лімфолейкоз (В-ГЛЛ), хронічний В-лімфолейкоз (В-ХЛЛ), лреВ-лімфому, лімфому Буркітта, фолікулярну лімфому, фолікулярну лімфому кори головного мозку, дифузійну лімфому й ін. З іншого боку, пухлини Т-клітин, у залежності від ступеня зрілості пухлинних клітин, класифікують на гострий В-лімфолейкоз (В-ГЛЛ), хронічний В-лімфолейкоз (В-ХЛЛ), захворювання, пов'язане з людським вірусом Т-клітин (АТЛ), лімфому периферичних Т-клітин не АТЛ-типу (ПНТЛ) і ін. (Zukai Rinso [Gan] (Illustrated Clinical: Cancer), series No. 17 Leukemia and lymphoma, Takashi Sugimura et al., Medical View Co., Ltd., 1987, В cell tumors, Kiyoshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991). Однак, незважаючи на останні досягнення медичної технології, лікування пухлин лімфатичних тканин не досягло задовільних результатів. Ступінь вилікування гострого лімфолейкозу (ГЛЛ), наприклад, усе ще складає 20% або нижче, а лімфоми на стадії розвитого захворювання - біля 50%, при цьому відносно високий ступінь вилікування В-лімфоми пов'язаний із прогресом множинної терапії. Крім того, Т-лімфома більш схильна до проникнення в інші тканини і характеризується ступенем вилікування біля 30%, тоді як ступінь вилікування захворювання, пов'язаного з людським вірусом Т-клітин (АТЛ), у даний час складає 10%. Крім того, Гото із співав. (Goto, A. et al.) повідомили про одержання моноклонального антитіла (антитіла до НМ1.24) при імунізації мишей мієломними клітинами людини (Blood, 1994, 84, 1922-1930). При введенні миші із трансплантованими клітинами мієломи людини антитіла до НМ1.24, антитіло специфічно накопичується в пухлинних тканинах (Masaakai Kosaka et al., Nippon Rinsho (Japan Clinical) 1995, 53, 627-635), що дає підставу припустити можливість застосування антитіла до НМ1.24 для діагностики локалізації пухлини при радіоізотопному міченні, при терапії частками, такої як радіоімунотерапія й ін. Однак, не були відомі дані про те, що антитіло до НМ1.24 використовується для лікування пухлин лімфатичних тканин. Сутність винаходу Застосовуваний у даний час метод лікування пухлин лімфатичних тканин включає різні види хіміотерапії, рентгенотерапію, трансплантацію кісткового мозку й ін. Однак, як відзначалося вище, жодний із цих методів не дає задовільних результатів при лікуванні зазначених захворювань і, у цьому зв'язку, усе ще є потреба в прориві по створенню лікарських засобів і розробці методів, що могли б полегшити хід пухлин лімфатичних тканин і подовжити тривалість життя пацієнтів. У зв'язку з вищесказаним, метою даного винаходу є розробка лікарського засобу для застосування у випадку пухлин лімфатичних тканин, за винятком мієломи. Для створення такого лікарського засобу автори винаходу провели великі дослідження in vitro, що включали аналіз методом проточної цитометрії, визначення цитотоксичної активності, такої як антитіло обумовленої клітиннозалежної цитотоксичності (ADCC/АОКЦ активності), комплементзалежної цитотоксичності (CDC/КЗЦ цитотоксичності) і ін., дослідження in vivo по визначенню протипухлинного ефекту з використанням антитіла до НМ1.24 (Goto et al. Blood, 1994, 84, 1922-1930), а також роботи з виділення білкового антигену, із яким специфічно зв'язується антитіло до НМ1.24. У результаті проведених досліджень автори показали, що на лімфатичних пухлина х експресується білковий антиген, специфічно розпізнаваний антитілом до НМ1.24, при цьому зазначене антитіло до НМ1.24 має протипухлинну дію у відношенні пухлин лімфатичних тканин, що і склало предмет даного винаходу. У зв'язку з цим, даний винахід стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах лімфатичних тканин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності SEQ ID N0:1, і що має цитотоксичну активність. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клїтин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного' інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності SEQ ID N0:1, і що має цитотоксичну активність. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта моноклональне антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності SEQ ID N0:1, і що має цитотоксичну активність. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності SEQ ID N0:1, і що має АОКЦ або КЗЦ активність в якості цитотоксичної активності. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності SEQ ID N0:1, і що в якості константної області містить Сg людського антитіла. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта химерне антитіло або гуманізоване антитіло, що специфічно зв'язується з білком, що має амінокислотну послідовність, зазначену в послідовності SEQ ID N0:1, і що має цитотоксичну активність. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом, розпізнаваним антитілом до НМ1.24. Даний винахід також стосується лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах Т-клітин, або лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах В-клітин (за винятком мієломи), що включає в якості активного інгредієнта антитіло до HM1.24. Крім того, даний винахід стосується антитіла, що специфічно зв'язується з білком, експресує у пухлинах лімфатичних тканин, і що має цитотоксичну активність. Короткий опис малюнків На фіг.1 показана гістограма, одержана в результаті аналізу методом проточної цитометрії зазначеної Вклітинної лінії непрямим методом із використанням антитіла до HM1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.2 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.3 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.4 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.5 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, що була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.6 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.7 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.8 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.9 показана гістограма зазначеної В-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.10 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.11 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.12 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.13 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 \ контрольного мишачого igG2a. На фіг.14 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.15 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.16 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.17 показана гістограма зазначеної Т-клітинної ліни, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.18 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.19 показана гістограма зазначеної Т-клітинної лінії, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого !gG2a. На фіг.20 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.21 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.22 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.23 показана гістограма зазначеної клітинної лінії, яка не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, яка була досліджувана непрямим методом за способом проточної цитометрії з використанням антитіла до НМ1.24 і контрольного мишачого lgG2a. На фіг.24 приведений графік, який показує, що антитіло до НМ1.24 надає цитотоксичний ефект на клітинні лінії пухлин Т-клітин CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 і HPB-MLT залежним від дози способом. На фіг.25 приведений графік, що показує, що антитіло до НМ1.24 надає цитотоксичний ефект на клітинні лінії пухлин В-клітин ЕВ-3, МС116 і CCRF-SB залежним від дози способом. На фіг.26 приведений графік, що показує, що при введенні антитіла до НМ1.24 дослідній групі мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини, спостерігається приглушення збільшення об'єму пухлини в порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводили lgG2a. На фіг.27 приведений графік, що показує, що при введенні антитіла до НМ1.24 дослідній групі мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини, відбувається подовження періоду виживання в порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводили IgG2a. Варіанти реалізації винаходу 1. Одержання антитіл 1-1. Одержання гібридоми Гібридоми, що продукують антитіла, використовувані згідно з даним винаходом, можуть бути сконструйовані, в основному, із використанням відомих процедур, приведених нижче. Так, білковий антиген НМ1.24 або клітини, що експресують антиген НМ1.24, можуть використовуватися в якості антигену, що сенсибілізує, і далі застосовуватися для імунізації в рамках традиційного методу імунізації. Одержані імунні клітини зливають із відомими батьківськими клітинами в ході звичайного процесу злиття клітин і потім проводять скринінг за допомогою традиційного методу скринінгу для відбору клітин, які продукують моноклонапьні антитіла. Конкретно, моноклональні антитіла можуть бути одержані в такий спосіб. Так, наприклад, в якості клітин, що експресують антиген НМ1.24, який представляє собою антиген для одержання антитіла, що сенсибілізує, може використовуватися множинна мієломна клітинна лінія людини КРММ2 (заявка на патент Японії, що не розглядається, (Kokai) No. 7-236475) або КРС-32 (Goto Т. et. al., Jpn.J.CIin.Hematol., 1991, 32, 1400). Альтернативно, в якості антигену, що сенсибілізує, може бути використаний білок, що має амінокислотну послідовність, зазначену нижче в SEQ ID N0:1, або пентид або поліпептед, що містять епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМ1.24. В рамках даного опису кДНК, яка кодує білок, що має амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 1, була вставлена в сайт розщеплення Xbal вектори pUC19 з одержанням плазміди pRS38-pUC19. Ecoli, що несе цю плазміду, депонована в Міжнародній Колекції згідно з положенням Будапештського Договору як Escherichia coil DH5a (pRS38-pUC19) 5 жовтня 1993 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як FERM BP-4434) (див. заявку на патент Японії, що не розглядається,(Kokai) No. 7-196694). Фрагмент кДНК, що міститься в плазміді pRS38-pUC19, може бути використаний для одержання пептиду або поліпептиду, що містять епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМ1.24, із використанням методів генної інженерії. Переважно, ссавці, які імунізують антигеном, що сенсибілізує, відбирають з урахуванням сумісності їх із батьківською клітиною в процедурі клітинного злиття. В основному вони включають, не обмежуючись ними, гризунів, таких як миші, пацюки, хом'ячки й ін. Імунізація тварин антигеном, що сенсибілізує, проводиться з використанням відомого методу. Загальний метод включає, наприклад, внутрішньочеревне або підшкірне введення антигену, що сенсибілізує, ссавцю. Специфічно, антиген, що сенсибілізує, який був розведений і суспендований у відповідній кількості фосфатнобуферного розчину (ФБР) або фізіологічного розчину й ін., змішують, за бажанням, із відповідною кількістю ад'юванта Фрейнда. Після емульгування його переважно вводять ссавцю декілька разів, кожні 4-21 день. Альтернативно може використовуватися відповідний носій для введення його в момент імунізації антигеном, що сенсибілізує. Після проведення імунізації і підтвердження підвищення рівня потрібного антитіла в сироватці імунної клітини відбирають з організму ссавця і проводять клітинне злиття, в якому переважні імунні клітини включають, зокрема, клітини селезінки. Мієломні клітини ссавців, як приклад інших батьківських клітин, що піддають процедурі клітинного злиття з зазначеними імунними клітинами, включають переважно інші різні клітинні лінії, такі як P3X63Ag8.653 (J.Immunol. 1979, 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, 81:1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C, Eur.J.Immunol., 1976, 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et. al., Cell, 1976, 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et. al., Nature, 1978, 276: 269-270), FO (de St.Groth, S.F. et. al., J. Immunol .Methods, 1980, 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J.Exp.Med., 1978, 148: 313-323), R210 (Galfre, G. et. al.. Nature, 1979, 277: 131-133) і ін. Процедура клітинного злиття між зазначеними імунними клітинами і мієломними клітинами може бути проведена, власне кажучи, згідно з відомим методом, таким як описано Мільштейном із співавт. (Kohler, G. and Milstein, С, Methods Enzymol., 1981, 73: 3-46) і ін. Більш конкретно зазначена процедура злиття клітин проводиться в звичайному живильному бульйоні в присутності, наприклад, прискорювача злиття клітин. В якості прискорювача злиття клітин використовують, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), Сендаі вірус (HVJ) і, крім того, може бути, за бажанням, доданий ад'ювант, такий як диметилсульфоксид і ін., для підвищення активності процесу злиття. Переважно, співвідношення використаних імунних клітин і мієломних клітин відповідає, наприклад, 1-10кратній кількості імунних клітин у порівнянні з мієломними. Прикладом культуральних середовищ, які можуть використовуватися для здійснення вищевказаного процесу злиття клітин є середовище RPMI1640 і культуральне середовище MEM, придатні для росту зазначених мієломних клітинних ліній, і традиційне культуральне середовище, які використовуються для культивування зазначеного типу клітин, крім того, у них можуть бути внесені сироваткові добавки, такі як навколоплідна сироватка теляти (НСТ, FSC). В процесі злиття клітин задана кількість зазначених імунних клітин і мієломних клітин ретельно перемішують у культуральному середовищі, в яке добавляють розчин ПЕГ, попередньо нагрітий приблизно до 37°С, наприклад розчин ПЕГ із середньою молекулярною вагою від приблизно 1000 до 6000, у концентрації від 30 до 60% (вага/об'єм) і перемішують з одержанням потрібних клітин злиття (гібридом). Потім, за допомогою повторного послідовного додавання відповідного культурального середовища і центрифугування з видаленням супернатанта, агенти, необхідні для злиття клітин і ін., які небажані для росту гібридом, можуть бути віддалені. Селекцію зазначених гібридом проводять при культивуванні в традиційному селекційному середовищі, наприклад у культуральному середовищі HAT (рідка культура, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин). Культивування в зазначеному культурапьному середовищі продовжують, в основному, протягом часу, достатнього для загибелі клітин, відмінних від бажаних гібридом (які не є клітинами злиття), і, як правило, це складає від декількох днів до декількох тижнів. Звичайно застосовують традиційний метод серійних розведень, у рамках якого гібридоми, які продукують бажане антитіло, відбирають і піддають моноклональному клонуванню. Крім одержання зазначеної гібридоми за допомогою імунізації антигеном тварину відмінного від людини, можна також сенсибілізувати людські лімфоцити in vitro антигеном НМ1.24 або клітинами, що експресують антиген НМ1.24, а потім одержані сенсибілізовані лімфоцити зливають із мієломними клітинами людини, наприклад U266, з одержанням бажаного людського антитіла, що має активність по зв'язуванню з антигеном НМ1.24 або клітинами, що експресують антиген НМ1.24 (див. публікацію за заявкою на патент Японії (Kokoku) No. 1-59878). Крім того, трансгенну тварину, що несе спектр усіх генів антитіл людини, имунізують антигеном, наприклад антигеном НМ1.24, або клітинами, що еспресують антиген НМ1.24, з одержанням бажаного гуманізованого антитіла за описаним вище методом (див. заявки на Міжнародний патент WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 і WO 96/33735). Сконструйовані в такий спосіб гібридоми, що продукують моноклональне антитіло, можуть бути піддані субкультивуванню в традиційному культуральному середовищі або можуть зберігатися протягом тривалого періоду часу в рідкому азоті. Для одержання моноклонального антитіла від зазначеної гібридоми використовують метод, у рамках якого зазначену гібридому культивують традиційним способом і одержують антитіла в супернатанті, або метод, згідно з яким гібридому вводять для подальшого росту в організм ссавця, сумісного з зазначеною гібридомою, і потім антитіла одержують з асцитів. Перший спосіб підходить для одержання антитіл високого ступеня чистоти, тоді як останній придатний для великомасштабного процесу одержання антитіл. Зокрема, гібридома, що продукує антитіло проти НМ1.24, може бути одержана з використанням методу Гото (Goto, Т., et.al., Blood, 1994, 84: 1922-1930). Вона також може бути одержана за допомогою методу, у рамках якого гібридому, що продукує антитіло проти НМ1.24, яка була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як FERM ВР-5233 14 вересня 1995 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) ін'єкціюють внутрішньочеревно мишам лінії BALB/C (виробництво CLEA, Японія) з одержанням асцитів, із яких виділяють і очищують антитіла, проти НМ1.24, або використовується метод, згідно з яким зазначену гібридому культивують у відповідному культуральному середовищі, такому як RPMI1640, що містить 10% навколоплідної сироватки і 5% BM-Condimed HI (виробництво Boehringer Mannheim), середовищі SFM для вирощування гібридом (виробництво GIBCO-BRL), середовищі PFHM-H (виробництво GIBCO-BRL) і ін., і в цьому випадку антитіло проти НМ1.24 може бути виділене й очищене із супернатанту. 1-2. Рекомбінантне антитіло Рекомбінантне антитіло, одержуване згідно з технологією маніпулювання рекомбінантними генами, у рамках якої ген для антитіла клонують із гібридоми й інтегрують у відповідний вектор, який потім вводять в організм хазяїна, може використовуватися згідно з даним винаходом як моноклональне антитіло (див., наприклад, Carl, Α.Κ., ВоггеЬаеск, James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, опублікована у Великобританії, Macmillan Publishers LTD. 1990). Зокрема, мРНК, що кодує варіабельну область (V-область) бажаного антитіла, виділяють із гібридоми, що продукує антитіло. Для виділення мРНК одержують загальну РНК із використанням, наприклад, відомого методу, такого як метод ультрацентрифугування в гуанідині (Chirgwin, J., Analytical Biochemistry, 1987, 162: 156-159) і потім виділяють мРНК із загальної маси РНК із використанням набору для обчищення мРНК (виробництво Pharmacia) і ін. Альтернативно, мРНК можна безпосередньо одержати з використанням набору Quick Prep для обчищення мРНК виробництва Pharmacia. кДНК до V-області антитіла може бути синтезована з одержаної зазначеним способом мРНК із використанням зворотної траскриптази. кДНК може бути синтезована з використанням набору, що включає зворотну транскриптазу, для синтезу кДНК AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit і ін. Альтернативно, для синтезу й ампліфікації кДНК може бути використаний набір 5'-АгпрІІ Finder Race Kit (виробництво Clontech) і метод 5'-Race (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:8998-9002; Belyavsky, A. Et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17:2919-2932), у рамках якої використовується полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Бажаний фрагмент ДНК очищують з одержаного продукту ПЛР і далі він може бути лігований із векторної ДНК. Крім того, на його основі конструюють рекомбінантний вектор і вводять його в Е.соіі і далі до відбору колоній для одержання бажаного рекомбінантного вектора. Нуклеотидна послідовність заданої ДНК може бути підтверджена за допомогою відомого методу, такого як дидезоксиметод. При одержанні ДНК, що кодує V-область бажаного антитіла, її можна лігувати із ДНК, що кодує константну область (С-область) бажаного антитіла, і потім одержаний продукт інтегрують у вектор експресії. Альтернативно, ДНК, що кодує V-область антитіла, може бути інтегрована у вектор експресії, який вже містить ДНК, що кодує С-область антитіла. Для продукування антитіла, застосовуваного згідно з даним винаходом, ген антитіла інтегрують, як буде описано нижче, у вектор експресії так, щоб експресія проходила під контролем регуляторної області експресії, наприклад енхансера і/або промотора. Згодом вектор експресії може бути принесений трансформацією в клітину хазяїна, де антитіло може експресуватися. 1-3. Змінене антитіло Згідно з даним винаходом, штучно змінене рекомбінантне антитіло, таке як химерне антитіло і гуманізоване антитіло, може використовуватися для цілі зниження гетерологічної антигенності щодо людини. Такі змінені антитіла можуть бути одержані з використанням відомих методів. Химерне антитіло може бути одержане при лігуванні одержаної описаним вище способом ДНК, що кодує V-область антитіла, із ДНК, що кодує С-область антитіла людини, і потім одержаний продукт вбудовують у вектор експресії і вводять в організм хазяїна для продукування в ньому антитіла (див. заявку на Європейський патент ЕР 125023 і заявку на Міжнародний патент WO 96/02576). Химерне антитіло, застосовуване згідно з даним винаходом, може бути одержане з використанням відомого методу. Наприклад, Е..соlі, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує L-ланцюг V-області або Н-ланцюг Vобласті химерного антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як Escherichia coil DH5a (pUC19-1.24L-gk) i Escherichia coli DH5a (pUC19-1.2 4H-ggl) , відповідно, 29 серпня 1996 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi lchome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як FERM BP-5646 і FERM BP-5644, відповідно (див. заявку на патент Японії No.9-271536). Гуманізоване антитіло, яке також називають відновленим людським антитілом, одержують при трансплантації гіперваріабельної ділянки (ҐВД) антитіла ссавця, відмінної від людини, наприклад антитіла миші, у ГВД людського антитіла. У цілому, те хнологія, заснована на одержанні рекомбінантної ДНК, для продукування таких антитіл також відома (див. заявку на Європейський патент ЕР 125023 і заявку на Міжнародний патент WO 96/02576). Конкретно, методом ПЛР синтезують послідовність ДНК, яка повинна підходити для лігування ГВД мишачого антитіла з каркасною областю (КО) людського антитіла з використанням декількох роздільних олігонуклеотидів, що несуть на кінцях розрізи, що перекриваються один з іншим. Одержану в такий спосіб ДНК лігують із ДНК, що кодує С-область людського антитіла, і потім вбудовують одержаний продукт у вектор експресії, який потім вводять в організм хазяїна для продукування антитіл (див. заявку на Європейський патент ЕР 239400 і заявку на Міжнародний патент WO 96/02576). Відбирають КО людських антитіл, що зшиті через ГВД так, щоб ділянки, що визначають комплементарність, утворювали сайт, сприятливий для зв'язування з антигеном. При бажанні, амінокислоти в каркасних областях варіабельної області антитіла можуть бути заміщені так, щоб гіперваріабельна ділянка відновленого людського антитіла могла утворювати відповідний сайт для зв'язування з антигеном (Sato, К. et al., Cancer Res., 1993, 53:851-856). Наприклад, E.coli, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант a (SEQ ID N0:2) L-ланцюга Vобласті і варіант г (SEQ ID N0:3) Η-ланцюга V-області гуманізованого антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLaAH M-gk) і Escherichia coli DHSa. (pUC19-RVHr-AH M-ggf) відповідно, 29 серпня 1996 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як FERM BP-5645 і FERM BP-5643, відповідно (див. заявку на патент Японії No.9-271536). Крім того, Есоli, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант s (SEQ ID N0:4) Η-ланцюга V-області гуманізованого антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як Escherichia coli DH5a (pl)C19-RVHs-AHM-ggl) 29 вересня 1997 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi I-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як FERM BP-6127 (заявка на патент Японії No.9-271536). У випадку химерного або гуманізованого антитіла використовують С-область людського антитіла і найбільш переважно в якості константної ділянки людського антитіла може бути використана Сg, така як Сg1, Сg2, Сg3 і Сg4. Серед них антитіла, що містять Сg1 і Сg3, мають потужну цитотоксичну активність, тобто АОКЦ і КЗЦ активність, і в цьому зв'язку вони переважно використовуються згідно з даним винаходом . Химерне антитіло включає варіабельну ділянку антитіла, що походить із ссавця, відмінного від людини, і С-область, що походить з людського антитіла, при цьому гуманізоване антитіло включає гіперваріабельні ділянки антитіла, що походить із ссавця, відмінного від людини, каркасні ділянки (КД) і С-область антитіла, що походить з людського антитіла. Згідно з цим, їх антигенність в організмі людини знижується, так що вони можуть бути використані в якості активного інгредієнта лікарських засобів згідно з даним винаходом. Переважний варіант гуманізованого антитіла для використання згідно з даним винаходом включає гуманізоване антитіло проти НМ1.24 (див. заявку на патент Японії No.9-271536). Переважний варіант Lланцюга V-області гуманізованого антитіла проти НМ1.24 включає той, у якому є амінокислотна послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, зазначеною в SEQ'ID NO: 2. Переважний варіант Н-ланцюга Vобласті гуманізованого антитіла проти НМ1.24 включає той із них, що має амінокислотну послідовність, що кодується послідовністю основ, зазначеною в SEQ ID N0:3 або 4. 1-4. Експресія і продукування Гени для антитіл, сконструйованих як зазначено вище, можуть експресуватися, у результаті чого з використанням відомого методу може бути отримане антитіло. У випадку використання клітин ссавців експресія може проводитися з використанням вектора експресії, що містить звичайно застосовуваний промотор, ген антитіла, який повинний експресуватися, і ДНК, в якій полі А сигнал був оперативно зшитий на 3і кінці в напрямку реплікації, або вектор, що містить зазначену ДНК. Приклади промотору/енхансера включають ранній промотор/енхансер цитомегаловірусу людини. Крім того, в якості промотору/енхансера, які можуть використовуватися для експресії антитіла згідно з даним винаходом, можуть знайти застосування вірусні промотори/енхансери, такі як промотори/енхансери ретровірусу, вірусу поліоми, аденовірусу і вакуолізуючого мавпячого вірусу 40 (SV40), а також промотори/енхансери, одержані з клітин ссавців, такі як людський фактор елонгації la (HEFIa). Так наприклад, експресія може бути легко здійснена за методом Міллігана із співавт. (Milligan et al., Nature, 1979, 277,108) у рамках якого використовується промотор/енхансер SV40, або за методом Міцушима із співавт. (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5322), в якому використовується промотор/енхансер HEFIa. У випадку Е.соlі експресія може бути здійснена при оперативному зв'язуванні звичайно використовуваного промотору, сигнальної послідовності для секреції антитіла і гена антитіла, який підлягає експресії, із подальшою його експресією. В якості промотору можна, наприклад, згадати промотор lacz і промотор аrаВ. У випадку використання, промотору lacz можна використовувати метод Варда із співавт., (Ward et aL Nature, 1996, 341, 544-546; Faseb J. 1992, 6, 2422-2427), а у випадку використання промотору araВ може знайти застосування метод Беттера із співавт., (Better et aL Science, 1988, 240, 1041-1043). В якості сигнальної послідовності для секреції антитіла при продукуванні його в периплазмі Е.соїі може використовува тися сигнальна послідовність реІВ (Lei, S.P. et al., J.Bacteriol., 1987, 169, 4379). Після відділення продукованого в периплазмі антитіла структура антитіла піддається складанню перед використанням (див., наприклад, WO 96/30394). В якості сайта початку реплікації можуть бути використані такі ділянки, які одержують Із SV40, вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу бичачої папіломи (BPV) і ін. Крім того, для ампліфікації генних копій у хазяйській клітинній системі вектор експресії може включати в якості маркера ген, що селектується, аміноглікозидтрансферази (ΑΡΗ), ген тимідинкінази (ТК) і ген ксантингуанінфосфорибозилтрансферази Е.соlі (Ecogpt), ген дигідрофолатредуктази (dhfr) і ін. Для продукування антитіла, використовуваного згідно з даним винаходом, можна застосовувати будь-яку систему продукування. Система продукування антитіла може ґрунтуватися на системі продукування in vitro і in vi vo. В якості системи продукування in vitro може бути згадана система продукування, в якій використовуються еукаріотичні клітини, і система продукування, в якій використовуються прокаріотичні клітини. Системи продукування на основі еукаріотичних клітин включають клітини тварин, рослинні клітини і грибні клітини. Відомі клітини тварин включають (1) клітини ссавців, такі як клітини СНО, клітини COS, мієломної клітини, ниркові клітини дитинчат хом'ячків (ВНК), HeLa клітини і Vero клітини, (2) клітини земноводних, такі, як социти Xenopus або (3) клітини комах, такі як sf9, sf21 і Тn5. Відомі рослинні клітини включають, наприклад, ті з них, які походять з роду Nicotiana і, більш конкретно, клітини, що походять з Nicotiana tabacum, що утворюють капусні культури. Відомі грибні культури включають дріжджі, такі як представники роду Saccharomyces, більш конкретно Saccharomyces, cereviceae або ниткоподібні гриби, такі як представники роду Aspergillus і, більш конкретно, Aspergillus niger. Системи продукування на основі прокаріотичних клітин включають бактеріальні клітини. Відомі бактеріальні клітини включають Escherichia coil (Е.соІІ) і Bacillus subtills. Антитіло може бути одержане при введенні через процес трансформації гена бажаного антитіла в ці клітини і подальшого культивування трансформованих клітин in vitro. Культивування здійснюють відомими методами. Так наприклад, можуть використовуватися культуральні середовища, такі як DMEM, MEM, RPMI1640, в які можуть вноситися сироваткові добавки, такі як навколоплідна сироватка теляти (НСТ). Крім того, антитіла можуть продукуватися in vi vo при імплантуванні клітин, в які був уведений ген антитіла, у черевній порожнині тварин й ін. В якості інших систем продукування можна відзначити ті з них, в яких використовуються тварини, і ті з них, в яких використовуються рослини. Системи продукування на основі тваринних організмів включають клітини ссавців і комах. В якості ссавців можуть використовува тися кози, свині, вівці, миші і велика рогата худоба (Vicki Glaser, Spectrum Biotechnology Application, 1993). В якості комах може використовуватися тутовий шовкопряд. У випадку використання рослин може знайти застосування рослина тютюну. Ген антитіла вводять в організм зазначених тварин і рослин, і в таких тваринах і рослинах продукуються антитіла. Так наприклад, ген антитіла вводять у середину гена, що кодує білок, який продукується в молоці, такий як козячий β-казеїн, для одержання злитих генів. Фрагменти ДНК, що містять злитий ген, в який був вставлений ген антитіла, ін'єктують у козячий ембріон і потім ембріон вводять в організм кози. Бажане антитіло одержують із молока, продукованого трансгенною козою, якою стала та коза, якій ввели зазначений ембріон, або її потомство. Для того, щоб підвищити кількість молока, що містить бажане антитіло, що продукується трансгенною козою, такій трансгенній козі, у випадку прийнятності, можуть уводитися гормони (Ebert K.M. et al., Bio/Technology, 1994, 12,699-702). У випадку використання тутового шовкопряда для інфікування його використовують бакуловірус, в який вбудований ген бажаного антитіла, при цьому бажане антитіло може бути одержане з рідин тіла тутового шовкопряда (Susumu, M.et al., Nature, 1985, 315, 592-594). А у випадку використання рослин тютюну ген бажаного антитіла вставляють у відповідний для рослин вектор експресії, наприклад pMON 530, і потім вектор вводять у бактерію, таку як Agrobacterum tumefaciens. Зазначену бактерію потім використовують для інфікування рослин тютюну, таких як Nicotiana tabacum, з одержанням бажаного антитіла з листів тютюну (Julian, К.-С. Ma et al., Eur.J.lmmunol., 1994, 24, 131-138).При продукуванні антитіла в системах продукції in vitro і in vivo, як зазначено вище, ДНК, що кодує важкий ланцюг (Η-ланцюг) або легкий ланцюг (L-ланцюг) антитіла, може бути роздільно введена у вектор експресії, якими потім одночасно трансформують хазяйські клітини, в іншому випадку ДНК, що кодують Н-ланцюг і L-ланцюг, можуть бути інтегровані в єдиному векторі експресії і використані для трансформації хазяйського організму (див. заявку на Міжнародний патент WO 94/11523). Антитіло, що продукується за описаним вище методом, може бути зв'язане з різними молекулами, такими як полі етиленгліколь (ПЕГ), для одержання з метою подальшого використання модифікованого антитіла. «Антитіло» у контексті даного опису включає такі модифіковані антитіла. Для того, щоб одержати таке модифіковане антитіло, антитіло піддають хімічній модифікації. Такі методи вже є на досягнутому рівні те хніки. 2. Поділ і очищення антитіл 2-1. Поділ і очищення антитіла Антитіла, що продук уються і експресуються, як було описано вище, можуть бути відділені від внутрішнього або зовнішнього середовища клітини або виділені з організму хазяїна і далі вони можуть бути очищені до гомогенності. Виділення й очищення антитіла з метою подальшого використання згідно з даним винаходом можуть бути здійснені з використанням афінної хроматографії. В якості колонки, використовуваної в такій афінній хроматографії, може застосовуватися колонка з білком А і колонка з білком G. Прикладами носіїв, застосовуваних у колонці А, є Hyper D, Poros,.Sepharose F.F. і ін. Альтернативно, без всяких обмежень можуть використовуватися традиційні методи виділення й очищення білків. Виділення й очищення антитіла для використання його далі згідно з даним винаходом можуть бути проведені при зв'язуванні належним способом у процесі хроматографування, відмінного від зазначеної вище афінної хроматографії, при фільтруванні, ультрафільтруванні, висолюванні, діалізі й. ін. Хроматографія включає, наприклад, іонообміну хроматографію, гідрофобну хроматографію, гель-фільтрацію й ін. Такі види хроматофафії можуть бути введені в систему ВЕЖХ. Альтернативно, може бути використана хроматографія з обертанням фаз. 2-2. Визначення концентрації антитіла Концентрація антитіла, одержаного в зазначеному вище поділі 2-1, може бути визначена вимірюванням поглинання або за допомогою імуноферментного твердофазного аналізу (ІФТФА) і ін. Так, при використанні для вимірювання рівня поглинання, антитіло згідно з даним винаходом або зразок, що містить антитіло, розбавляють відповідним чином ФБР(-) і потім вимірюють поглинання при 280нм, після чого проводять розрахунок із використанням коефіцієнта поглинання (оптичної густини), рівного 1,35, при концентрації 1мг/мол. При використанні методу ІФТФА вимірювання проводять таким способом. 100мкл козячого проти людського IgG (виробництво Віо Source) розбавляють до концентрації 1мкг/мл у 0,1Μ бікарбонатному буфері, рН 9, 6, вносять на 96-лунковий мікротитрувальний планшет (виробництво Nunc) і інкубують протягом ночі при температурі 4°С для імобілізації антитіла. Після блокування 100мкл кожного, розведеного відповідним чином антитіла згідно з даним винаходом або зразок, що містить антитіло, або 100мкл людського IgG відомої концентрації, узятого в якості стандарту, добавляють в лунку і проводять інкубування при кімнатній температурі протягом 1 години. Після промивання добавляють 100мкл, розведеного в 5000 разів антитіла проти IgG людини, мічене лужною фосфатазою (виробництво Bio Source) і проводять інкубацію при кімнатній температурі протягом 1 години. Після промивання добавляють субстратний розчин і інкубують і потім, після вимірювання поглинання при 405нм, із використанням Microplate reader, модель 3550 (виробництво Bio-Rad) проводять підрахунок концентрації бажаного антитіла. 3. Аналіз методом проточної цитометрії Реакційна здатність антитіл, використовуваних згідно з даним винаходом у відношенні пухлинних клітин лімфатичної тканини може бути досліджувана методом проточної цитометрії. Використовувані клітини можуть являти собою встановлені клітинні лінії або свіжовиділені клітини. В якості встановлених клітинних ліній може використовуватися, наприклад, лінія Т-клітин RPMI 8402 (АТСС CRL-1994), CCRF-CEM (АТСС CCL-119), одержана з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, HPB-ALL (FCCH1018), одержана з клітин при гострому лімфолейкозі, HPB-MLT (FCCH1019), одержана з клітин при Тлімфомі, JM (FCCH1023), одержана з клітин при гострому лімфолейкозі, MOLT-4 (АТСС CRL-1582), одержаний із клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, Jurkat (FCCH1024), одержана з клітин при гострому лімфолейкозі, CCRF-HSB-2 (АТСС CCL-120.1), одержана з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, МТ-1 (FCCH1043), одержана з клітин при захворюванні, зв'язаному з людським вірусом Т-клітин, КТ-3, одержана з клітин при лімфомі Леннерта (Shimizu, S. et al., Blood, 1988, 71,196-203) і ін.; а в якості лінії Вклітин лінія (АТСС ТІВ-190), трансформована вірусом ЕВ, позитивна на вірус ЕВ лінія В-клітин SKW 6.4 (АТСС ТІВ-215), МС116 (АТСС CRL-1649), одержана з клітин із В-лімфомою, CCRF-SB (АТСС CCL-120), одержана з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, лінія В-клітин RPMI 6410 (FCCH6047), одержана від пацієнта з гострою мієлоцитарною лейкемією, Daudi (АТСС CCL-213), одержана з клітин при лімф омі Буркітта, ЕВ-3 (АТСС CCL-85), одержана з клітин при лімфомі Буркітта, Jijoye (ATCC CCL-87), одержана з клітин при лімфомі Буркітта, Raji (ATCC CCL-86), одержана з клітин при лімфомі Буркітта, і в якості клітинної лінії, що не відноситься ні до Т-, ні до В-типу, лінія HL-60 (ATCC CCL-240), одержана з клітин при гострій мієлоцитарній лейкемії, ТНР-1 (ATCC TIB-202), одержана з клітин при гострій моноцитарній лейкемії, U-937 (ATCC CRL1593), одержана з клітин при гістіоцитарній лімфомі, К-562 (ATCC CCL-243), одержана з клітин при хронічній мієлоцитарній лейкемії й ін. Після промивання вищевказаних клітин у ФБР(-) до них добавляють 100мкл антитіла або контрольного антитіла, розведеного до концентрації 25мкг/мл у FACS буфері (ФБР(-), що містить 2% навколоплідної сироватки теляти і 0,1% азиду натрію) і потім інкубують одержану суміш на льоду протягом 30 хвилин. Після промивання в FACS буфері добавляють 100мкл протимишачого козячого антитіла, міченого ФІТЦ (GAM, виробництво Becton Dickinson), у концентрації 25мкг/мл і потім інкубують суміш на льоду протягом 30 хвилин. Після промивання у FACS буфері клітини суспендують у 600мкл або 1мл FACS буфера і вимірюють інтенсивність флуоресценції всіх клітин за допомогою приладу FACScan (виробництво Becton Dickinson). На основі одержаного для кожного типу клітин значення інтенсивності флуоресценції, обчислюється реакційна здатність антитіла, із погляду використання згідно з даним винаходом, із кожним видом клітин. Так, на основі значення інтенсивності флуоресценції для кожного типу клітин" можна визначити, чи експресується антиген НМ1.24 на клітинах кожного виду (позитивних або негативних) або може бути визначений ступінь експресії. Дані по наявності й інтенсивності експресії антигену НМ1.24 у п ухлинних клітинах лімфатичної тканини приведені нижче в прикладі 2.2., присвяченому аналізу методу проточної цитометрії. Пухлинні клітини при пухлинах лімфатичної тканини, які можуть стати мішенню для лікування згідно з даним винаходом, експресують антиген НМ1.24. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлині лімфатичної тканини переважно відносяться до тих клітин, що є позитивними по відношенню до антигену НМ1.24 і в яких відсоток прояву зазначеного антигену не нижче 5%. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлинах лімфатичної тканини переважно являють собою ті з них, в яких позитивний відсоток прояву антигену НМ1.24 складає 20% або вище. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлинах лімфатичної тканини являють собою переважно ті з них, в яких позитивний відсоток прояву антигену НМ1.24 складає 50% або вище. Більш конкретно, пухлинні клітини в пухлинах лімфатичної тканини переважно являють собою ті з них, в яких позитивний відсоток прояву антигену НМ1.24 складає 80% або вище. 4. Цитотоксична активність 4-1. Вимірювання КЗЦ активності Антитіло, застосовуване згідно з даним винаходом, являє собою таке антитіло, яке має, наприклад, КЗЦ активність в якості цитотоксичної активності. КЗЦ активність лікарського засобу, застосовуваного при пухлинах лімфатични х тканин згідно з даним винаходом, може бути вимірювана в такий спосіб. Спочатку готують клітини-мішені в концентрації 4x105 клітин/мл у відповідному середовищі, наприклад у середовищі RPMI1640, що містить 10% навколоплідної сироватки теляти (виробництво Gibco-BRL). В якості клітин-мішеней можуть бути використані CCRF-CEM (АТСС CCL-119), CCRF-HSB-2 (АТСС CCL-120.1), HPB-MLT (FCCH1019), ЕВ-3 (АТСС CCL-85), MC116 (АТСС CRL-1649), CCRF-SB (АТСС CCL-120), К-562 (АТСС CCL-243) і ін. П'ятдесят мкл зазначених клітин вносять на 96-лунковий мікротитрувальний планшет з плоским дном (виробництво Falcon) і планшет інкубують в інкубаторі з подачею СО2 при температурі 37°С протягом ночі. Потім добавляють антитіло, КЗЦ активність якого має бути вимірювана, інкубують все протягом 60 хвилин і потім добавляють відповідним чином розведений комплемент, наприклад комплемент дитинчати кролика (Baby Rabbit Complement, виробництво Cedarlane) і проводять інкубацію протягом 2 годин. Потім до кожної лунки добавляють 10мкл Alamar Bule (виробництво Bio Source) і проводять інкубацію протягом 4-х годин і потім вимірюють інтенсивність флуоресценції (довжина хвилі збудження 530нм, довжина хвилі емісії 590нм) із використанням системи вимірювання флуоресценції CytoFluor 2350 (виробництво МіІІірог). Цитотоксична активність (%) може бути обчислена згідно з формулою (А-С)/(В-С)х100, де А позначає інтенсивність флуоресценції при інкубації в присутності антитіла, В позначає інтенсивність флуоресценції при інкубації в середовищі,, що не містить антитіло, і С являє собою інтенсивність флуоресценції лунки, що не містить клітин. 4-2. Вимірювання АОКЦ активності Антитіло, використовуване згідно з даному винаходом, являє собою таке антитіло, що має, наприклад, АОКЦ активність в якості цитотоксичної активності. АОКЦ активність лікарського засобу, використовуваного при лікуванні пухлин лімфатичних тканин згідно з даним винаходом, може бути виміряна в такий спосіб. Спочатку, моноядерні клітини виділяють в якості ефекторних клітин із периферичної крові людини або з кісткового мозку при гравітаційному центрифугуванні. В якості клітин-мішеней беруть CCRF-CEM (АТСС CCL-119).1), HPB-MLT (FCCH1019), ЕВ-3 (АТСС CCL-85), МС116 (АТСС CRL-1649), CCRF-SB (АТСС CCL-120), К-562 (АТСС CCL-243) або ін., що мітять 51Сr з одержанням препаратів В-клітин-мішеней. Потім до мічених кпітин-мішеней добавляють антитіло, активність якого має бути виміряна, і проводять інкубацію. Ефекторні клітини у відповідному співвідношенні добавляють потім до клітин-мішеней і проводять інкубацію. Після інкубації збирають супернатант і вимірюють радіоактивність за допомогою гамма-лічильника, при цьому для вимірювання максимуму вивільненої радіоактивності може бути використаний 1% NP-40. Цитотоксичну активність (%) обчислюють згідно з формулою (А-С)/(В-С)х100, де А позначає радіоактивність (імп/хв), що вивільняється в присутності антитіла, В позначає радіоактивність (імп/хв), що вивільняється при наявності NP-40, і С позначає радіоактивність (імп/хв}, що вивільняється в середовищі, що не містить антитіло. 4-3. Підвищення цитотоксичної активності Для досягнення цитотоксичної активності, такої як АОКЦ активність і КЗЦ активність, краще використовува ти Сg, зокрема Сg1 і Сg3, в якості константної області (С-області) антитіла людини. Крім того, посилена АОКЦ активність або КЗЦ активність може бути, індукована при додаванні, зміні або модифікації частини амінокислот у С-області антитіла. Як приклад можна зазначити на конструювання IgM-подібного полімеру IgG при заміщенні амінокислот (Smith, R.I.F. and Morrison, S.L, Bio/Technology, 1994,12, 683-688), конструювання IgM-подібного полімеру IgG при додаванні амінокислот (Smith, R.I.F. et. al., J.Inununology, 1995, 154, 2226-2236), експресію тандемнолігованого гена, що кодує L-ланцюг (Shuford, W, et al.. Science, 1991, 252, 724-727), димеризацію IgG при заміщенні амінокислот (Caron, P.C. et al., J.Exp.Med., 1992, 176, 1191-1195; Shopes. В., J. Immunology, 1992,148, 2918-2922), димеризацію IgG при хімічній модифікації (Wolff, E.A. et al., Cancer Res., 1993, 53, 25602565) і введення ефекторної функції при зміні амінокислот(и) у шарнірній області антитіла (Norderhaug, L, et al., Eur. J. Immunol., 1991, 21, 2379-2384) і ін. Усі ці процедури можуть бути здійснені з застосуванням сайтспецифічного мутагенезу з використанням праймера, при додаванні нуклеотидної послідовності в сайті розщеплення рестрикційних ферментів при використанні хімічних модифікуючих речовин, які створюють ковалентний зв'язок. 5. Підтвердження терапевтичного ефекту Терапевтичний ефект лікарського засобу використовуваного згідно з даним винаходом, при пухлинах лімфатичних тканин, може бути підтверджений при введенні антитіла, використовуваного згідно з даним винаходом, тваринам, яким трансплантували клітини пухлини лімфатичних тканин із подальшою оцінкою протипухлинного ефекту засобу на тваринах. В якості лімфатичних пухлинних клітин, що вводяться тварині, можуть використовуватися встановлені клітинні лінії або свіжовиділені клітини. В якості встановленої клітинної лінії може бути використана CCRFCEM (АТСС CCL-119), НРВ-MLT (FCCH1019), MOLT-4 (АТСС CRL-1582), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) і ін. в якості Т-клітинної лінп і CESS (АТСС ТІВ-190), SKW 6.4 (АТСС ТІВ-215), CCRF-SB (АТСС CCL-120), RPMI 6410 (FCCH6047), ЕВ-3 (АТСС CCL-85) і ін. в якості В-клітинної лінії. Тварини, яким провели трансплантацію, переважно відносяться до тих, у яких імунологічні функції знижені або відсутні. Наприклад, можуть використовуватися миші, позбавлені волосяного покриву, миші SCID, бежеві миші, пацюки, позбавлені волосяного покриву, і ін. Визначений протипухлинний ефект може бути підтверджений вимірюванням об'єму і ваги пухлин або на підставі тривалості виживання тварин і ін. Як показано в приведених нижче прикладах, введення антитіла проти НМ1.24 приводить до придушення росту об'єм у пухлини і, крім того, до збільшення періоду виживаності мишей із трансплантованою пухлиною. Ці факти вказують на те, що антитіло проти НМ1.24 має протипухлнний вплив на пухлини лімфатичної тканини. 6. Спосіб введення і фармацевтичні препарати Лікарські засоби для лікування пухлин лімфатичних тканин згідно з даним винаходом можуть бути введені або системно, або місцево, парентеральним способом, наприклад шляхом внутрішньовенної ін'єкції, такої як краплинна інфузія, внутрішньом'язової ін'єкції, внутрішньочеревної ін'єкції і підшкірної ін'єкції. Метод уведення може бути обраний за показанням в залежності від віку і стану пацієнта. Ефективне, дозування вибирають у діапазоні від 0,01мг до 100мг на кілограм ваги тіла на введення. Альтернативно, може бути обране дозування, у діапазоні від 1 до 1000мг, переважно від 5 до 50мг на пацієнта. Лікарські засоби для лікування пухлин лімфатичної тканини згідно з даним винаходом можуть містити фармацевтично прийнятні носії або добавки, в залежності від застосовуваного способу введення. Приклади таких носіїв або добавок включають воду, фармацевтично прийнятний органічний розчинник, колаген, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, карбоксивініловий полімер, натрій-карбоксиметил-целюлозу, натрієву сіль поліакрилової кислоти, альгінат натрію, водорозчинний декстран, натрій-карбоксиметиловий крохмаль, пектин, метилцелюлозу, етилцелюлозу, ксантанову камідь, аравійску камідь, казеїн, желатин, агар, дигліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, вазелін, парафін, стеариловий спирт, стеаринову кислоту, людський сироватковий альбумін (ПСА), маніт, сорбіт, лактозу, фармацевтично прийнятна поверхневоактивна речовина й ін. Використовувані добавки вибирають із зазначених засобів або їх сполучень, не обмежуючись ними, в залежності від форми застосовуваного дозування. Захворювання, що підлягають лікуванню згідно із способом даного винаходу, являють собою пухлини лімфатичної тканини (за винятком мієломи), які несуть антиген на пухлинних клітинах і з яким зв'язується антитіло, застосовуване згідно з даним винаходом. В якості конкретних захворювань такого роду можна відзначити гострий В-лімфолейкоз (В-ГЛЛ). хронічний В-лімфолейкоз (В-ХЛЛ), пре-В-лімфому, лімфому Буркітта, фолікулярну лімфому, фолікулярну лімфому кори головного мозку, дифузійну лімфому, гострий Тлімфолейкоз (Т-ГЛЛ), хронічний Т-лімфолейкоз (Т-ХЛЛ), захворювання, зв'язане з людським вірусом Т-клітин (АТЛ), периферичну Т-лімфому, не зв'язану з людським вірусом Т-клітин (ПНТЛ) і ін. Лікарські засоби згідно з даним винаходом використовуються в якості лікарських засобів при лікуванні пухлин лімфатичних тканин. Приклади Приведені нижче приклади служать для більш детального опису даного винаходу. Слід зазначити, що даний винахід не обмежується зазначеними прикладами ніяким чином. Приклад 1. Конструювання антитіла проти Η Μ 1.24 1. Одержання мишачих асцитів, що містять антитіло проти НМ1.24 Одержують гібридоми, що продукують антитіла проти НМ1. 24 згідно з методом Гото із співавт. (Goto, Т. et al., Blood, 1994, 84, 1922-1930). Мишам лінії BALB/c (одержувані від фірми CLEA, Японія), яким попередньо увели внутрішньочеревно 500мкл 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (виробництво Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), за 11 і за 3 дні до експерименту ін'єкціюють внутрішньочеревно 5x106 гібридомних клітин. Починаючи з 10 дня після ін'єкції гібридомних клітин, збирають асцити, які накопичилися в черевній порожнині миші, за допомогою постійної голки 19 розміру Happycas (виробництво Medikit). Зібрані асцити центрифугують двічі зі швидкістю 1000 і 3000об/хв із використанням низькошвидкісної центрифуги RLX-131 (виробництво Тату Seiko) для видалення гібридом і контамінантів, таких як клітини крові й ін. 2. Очи щення антитіла проти НМ1.24 Із мишачих асцитів Очищення антитіла проти НМ1.24 із зазначених вище мишачих асцитів проводять таким способом. Після додавання рівної кількості ФБР(-) до мишачих асцитів суміш фільтрують із використанням волокнистого фільтра Mediaprep (виробництво МіІІіроrе) і потім піддають афінному очищенню з використанням високошвидкісного приладу для очищення антитіл ConSep LC100 (виробництво МіІІіроrге) і колонки Hyper D Protein A (колонка об'ємом 20мл виробництва Ninon Gaisi), ФБР(-) в якості адсорбційного буфера і 0,1Μ натрійцитратного буфера (рН 4) в якості буфера, що елюює, у відповідності з інструкціями, що додаються. Фракції, що елююються, відразу ж доводять до значення рН 7,4 при додаванні 1М Трис-НСІ (рН 8,0), і потім піддають концентруванню і заміщають буфер на ФБР(-) із використанням ультрафільтраційного концетратора Centriprep 10, із подальшим стерильним фільтруванням через мембранний фільтр МіІІіроrе (виробництво Міlliроrе) із розміром пор 0,22мкм з одержанням очищеного антитіла проти НМ1.24. 3. Визначення концентрації антитіла Концентрацію очищеного антитіла визначають при вимірюванні поглинання. Так, очищене антитіло розбавляють у ФБР(-), вимірюють поглинання при 280нм і обчислюють концентрацію з використанням коефіцієнта перерахування, що складає: 1,35 одиниць оптичної густини = 1мг/мол. Приклад 2. Вивчення реакційної здатності антитіла проти НМ1.24 із лімфатичними пухлинними клітинами 1. Очи щення контрольного мишачого lgG2a. Контрольний мишачий lgG2a очищають у такий спосіб. Комерційно доступний lgG2a (KAPPA) (UpC 10) з асцитів (виробництво СарреІ) розчиняють в очищеній воді і ФБР(-). Розчин фільтрують із використанням мембранного фільтра Aero-disc (виробництво Gelman Sciences) із розміром пор 0,2мкм, і потім очищують афінним способом за допомогою високошвидкісного приладу для очищення антитіл ConSep LC 100 (виробництво МШІроге), колонки Hyper D Protein А (колонка об'ємом 20мл, виробництво Nihon Gaisi), ФБР(-) в якості адсорбційного буфера і 0,1Μ натрій-цитратного буфера (рН 4) в якості буфера, що елюює, у відповідності з інструкціями, що додаються. Фракції, що елюються, відразу ж доводять до значення рН 7,4 при додаванні 1М Трис-НСІ (рН 8,0) і потім піддають концентруванню і заміщають буфером ФБР(-) із використанням центрифужного ультрафільтраційного концентратора Centriprep 10 із подальшим стерильним фільтруванням через мембранний фільтр МіІІе х GV (виробництво МіІІіроrе) із розміром пор. 0,22мкм з одержанням очищеного контрольного мишачого lgG2a. Визначення концентрації контрольного мишачого lgG2a проводять згідно з процедурою, приведеною раніше в розділі "З. Визначення концентрації антитіла. 2. Аналіз згідно з методом проточної цитометрії Реакційну здатність антитіла проти НМ1.24 із лімфатичними пухлинними клітинами досліджують методом проточної цитометрії. Після промивання у ФБР(-) Т-клітинної лінії RPMI 8402 (АТСС CRL-1995), CCRF-CEM (АТСС CRL-119), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі HPB-ALL (FCCH1018), одержаної з клітин при гострому лімфолейкозі, HPB-MLT (FCCH1019), одержаної з клітин при Т-лімфомі, JM (FCCH1023), одержаної з клітин при гострому лімфолейкозі, MOLT-4 (АТСС CRL-1582), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, Jurkat (FCCH1024), одержаної з клітин при гострому лімфолейкозі, CCRF-HSB-2 (АТСС CCL-120.1), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, МТ-1 (FCCH1043), одержаної з клітин при захворюванні, зв'язаному з людським вірусом Т-клітин, і КТ-3, одержаної з клітин при лімфомі Леннерта (Shimizu, S.et al.. Blood, 1988, 71, 196-203), а в якості В-клітинної лінії клітин CESS (АТСС ТІВ-190), трансформованих вірусом ЕВ, позитивних на ЕВ вірус В-клітин SKW 6.4 (АТСС ТІВ-215), МС116 (АТСС CRL1649), одержаних при В-лімфомі, CCRF-SB (АТСС CCL-120), одержаної з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, В-клітин RPMI 6410 (FCCH6047), одержаних від пацієнта з гострою мієлоцитарною лейкемією, Daudi (АТСС CCL-213), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта, ЕВ-3 (АТСС CCL-85), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта, Jijoye (АТСС CCL-87), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта, Raji (АТСС CCL86), одержаної з клітин при лімфомі Буркітта й в якості клітинної лінії, що не відноситься ні до Т-, ні до В-типів, HL-60 (АТСС CCL-240), одержаної з клітин при гострій мієлоцитарній лейкемії, ТНР-1 (АТСС ТІВ-202), одержаної з клітин при гострій моноцитарній лейкемії, U-937 (АТСС CRL-1593), одержаної з клітин при гістіоцитарній лімфомі і К-562 (АТСС CCL-243), одержаної з клітин при хронічній мієлоцитарній лейкемії, добавляють 100мкл антитіла проти НМ1.24 або очищене контрольне мишаче антитіло lgG2, розведене до концентрації 25мкг/мл у FACS буфері (ФБР(-), що містить 2% навколоплідної сироватки теляти і 0,1% азиду натрію), після чого усе інкубують на льоду протягом 30хвилин. Після промивання в FACS буфері добавляють 100мкл козячого протимишачого антитіла (GAM), міченого ФІТЦ у концентрації 25мкг/мл і потім інкубують суміш на льоду протягом 30 хвилин. Після промивання в FACS буфері клітини суспендують у 600мкл або 1мл FACS буфера й у кожній клітинній суспензії вимірюють інтенсивність флуоресценції за допомогою приладу FACScan (виробництво Becton Dickinson). Результати, подані на фігурах 1-23, підтверджують, що усі Т-клітинні лінії і усі В-клітинні лінії (за винятком Daudi і Raji, які не реагують), реагують з антитілом проти НМ1.24 і у високому ступені експресують антиген НМ1. 24. З іншого боку, жодна з клітинних ліній, що не відносяться до Т- або В-типу, не реагує з антитілом проти НМ1.24 і не експресує антиген. На гістограмах, приведених на фігурах 1-23, маркери показують, що при фарбуванні контрольним мишачим lgG2a негативні клітини складають 98% і позитивні клітини складають 2%. На підставі картини, одержаної з зазначеними гістограмними маркерами, був обчислений відсоток позитивних по антигену НМ1.24 клітин при використанні антитіла проти НМ1.24, і результат поданий у Таблиці 1. По відсотку позитивних по антигену НМ1.24 клітин рівень експреси антигену НМ1.24 підрозділили на 5 рівнів: -, +/-, +, ++ і +++. У результаті було підтверджено, що усі Т-клітинні лінії і В-клітинні лінії (за винятком Daudi і Raji) у високому ступені експресують антиген НМ1.24, що аналогічно результатам, показаним на фігура х 1-23. При цьому, в усі х випадках використання клітинних ліній, що не відносяться до Т- і В-типів, відсоток позитивних по антигену НМ1.24 клітин, був негативним або складав менше 5%, що вказує на те , що експресія антигену відсутня або знаходиться на дуже низькому рівні. Таблиця 1 В-клітинна лінія Т-клітинна лінія Назва клітин Рівень експресії CESS +++ SKW6.4 +++ МС116. ++ CCRF-SB +++ RPMI6410 +++ EB-3 +++ Jijoye +++ Daudi Raji RPMI 8402 +++ CCRF-CEM +++ HPE-ALL ++ 94.5 92.9 65.0 98.4 94.5 88.3 92.3 2.8 2.0 94.0 97.8 63.8 HPB-MLT JM MOLT-4 Jurkat CCRF-HSB-2 MT-1 KT-3 Клітинна лінія, що не HL-60 відноситься до Β-і ΤTHP-1 типів U-937 К-562 +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ 94.6 99.6 84.1 70.9 100.0 95.9 96.0 2.9 1.5 1.1 3.9 -, 80% Приклад 3. Визначення КЗЦ активності КЗЦ активність антитіла проти НМ1.24 стосовно лімфатичних пухлинних клітин визначається в такий спосіб: 1. Одержання кліток-мішеней У якості кліток-мішеней готують завись CCRF-CEM (АТСС CCL-119), одержану з клітин при гострому лімфолейкозі, CCRF-HSB-2 (АТСС CCL-120.1), одержану з клітин при гострому лімфобластичному лейкозі, HPB-MLT (FCCH1019), одержану з клітин при Т-лімфомі, ЕВ-3 (АТСС CCL-85), одержану з клітин при лімфомі Буркітта, МС 116 (АТСС CRL-1649), одержану з клітин при лімфомі Буркітта, CCRF-SB (АТСС CCL-12Q), одержану з клітин при гострому лімфолейкозі, і К-562 (АТСС CCL-243), одержану з клітин при хронічній мієлоцитарній лейкемії, у концентрації 4x105 клітин/мл у середовищ RPMI1640 (виробництво Gibco BRL), що містить 10% навколоплідної сироватки теляти (Gibco BRL). П'ятдесят мкл кожної з цих клітинних суспензій вносять на 96-лунковий мікротитрувальний планшет з плоским дном (виробництво Falcon) і проводять інкубацію в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 5% СО2 (виробництво Tabai) протягом ночі при 37°С. 2. Одержання антитіла проти НМ1.24 Очищене антитіло проти НМ1.24, одержане в зазначеному вище Прикладі 1, готують у концентраціях 0, 0,2, 2 і 20мкг/мл у середовищі RPMI1640, що містить 10% навколоплідної сироватки теляти (виробництво Gibco BRL) і 50мкл суміші добавляють до 96-лункового мікротитрувального планшету, підготовленому, як зазначено вище в Розділі 1. Після інкубування планшети в інкубаторі з високою вологістю в а тмосфері 5% СО2 (виробництво Tabai) при температурі 37°С протягом 60 хвилин, проводять центрифугування на низькошвидкісній центрифузі 05PR-22 (виробництво Hitachi) при 1000об/хв протягом 5 хвилин і відбирають 50мкл супернатанту. 3. Приготування комплементу Комплемент дитинчат кролика (Baby Rabbit) (виробництво Cedariane) розчиняють в очищеній воді з розрахунку 1 мл на ампулу, і далі розбавляють у 5мл середовища RPMI1640 (виробництво Gibco-BRL), що не містить навколоплідної сироватки теляти. П'ятдесят мкл зазначеної суміші розподіляють по 96-лунковому мікро титрувальному планшету з плоским дном, підготовленому, як зазначено вище в Розділі 2, і проводять інкубацію в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 5% СО2 (виробництво Tabai) протягом 2-х годин при 37°С. 4. Визначення КЗЦ активності Після завершення інкубації добавляють 10мкл Alamar Bute (виробництво Βiο Source) до кожної лунки 96лункового мікротитрувального планшету з плоским дном, описаного в Розділі 3, і проводять інкубацію в інкубаторі з високою вологістю в атмосфері 5% СО2 (виробництво Tabai) протягом 4-х годин при 37°С. Потім кожну лунку проміряють на інтенсивність флуоресценції (довжина хвилі збудження 530нм, довжина хвилі емісії 590нм) із використанням системи вимірювання флуоресценції CytoFluor 2350 (виробництво МіІІіроrе). Цитотоксичну активність (у відсотках) обчислюють за формулою (А-С)/(В-С)х100, де А позначає інтенсивність флуоресценції при інкубуванні в присутності антитіла, В позначає інтенсивність флуоресценції при інкубуванні тільки в середовищі без додавання антитіла, С позначає інтенсивність флуоресценції лунки, що не містить клітин. Результати показали, як видно з фігур 24 і 25, що К-562, яка не реагує з антитілом проти НМ1.24 за результатами аналізу методом проточної цитометрії, не продемонструвала цитотоксичність навіть при додаванні антитіла проти НМ1.24, тоді як CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, ЕВ-3, МС-116 і CCRF-SB, які взаємодіють з антитілом проти НМ1.24, демонструють цитотоксичність способом, залежним від концентрації антитіла проти НМ1. 24. Цей результат указує, що антитіло проти НМ1.24 виявляє КЗЦ активність у відношенні лімфатичної пухлини, що несе на клітинній поверхні білковий антиген, із яким антитіло проти НМ1.24 специфічно зв'язується. Приклад 4. Протипухлинна дія антитіла проти НМ1.24 у відношенні мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини 1. Одержання антитіла для введення 1-1. Одержання антитіла проти НМ1.24 Очищене антитіло проти НМ1.24, одержане в приведеному вище Прикладі 1, готують у концентрації 1мг/мл і 200мкг/мл у стерильно відфільтрованому ФБР(-) і використовують у наступних експериментах. 1-2.Одержання контрольного мишачого lqG2a Очищене антитіло, одержане в зазначеному вище Прикладі 2, готують у концентрації 1 мг/мл у стерильно відфільтрованому ФБР(-) і використовують у наступних експериментах. 2. Протипухлинний ефект антитіла проти НМ1.24 на мишах із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини 2-1. Одержання мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини Мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини одержують таким способом . Клітини CCRFHSB-2 (АТСС CCL-120.1), одержані при гострому лімфобластичному лейкозі і які субкультивували in vi vo із використанням мишей SCID (СІеа, Японія), готують у вигляді зависі в концентрації 1x108клітин/мл у середовищі RPM11640, що містить 10% навколоплідної сироватки теляти (виробництво Gibco-BRL). Клітинні суспензії, одержані як зазначено вище, ін'єктують підшкірно в черевну порожнину мишей SCID (6-тижневі самці), наступного дня після введення їм внутрішньочеревно 100мкл антиасіального препарату GM1 (Waco Pure Chemical Industries). 2-2. Введення антитіла На 7 день після трансплантації пухлини вимірюють циркулем діаметр пухлини, що утворилася в тому місці, куди зазначеним мишам трансплантували CCRF-HSB-2 із лімфатичною пухлиною людини. Після визначення об'єму пухлини тварин груп ують так, щоб у кожній групі середнє значення об'єму пухлини було приблизно однаковим (по 8 тварин на групу, усього 3 групи). Починаючи з того самого дня, тваринам у кожній групі уводять внутрішньочеревно 100 мкл антитіла проти НМ1.24 у концентрації 1мг/мл або 200мкг/мл, або 1мкг/мл контрольного мишачого lgG2a, підготовленого як зазначено вище в Розділі 1. Уведення проводять двічі на тиждень, усього 19 разів аналогічним способом. Протягом цього періоду вимірюють циркулем діаметр пухлини двічі на тиждень і підраховують об'єм пухлини. 2-3. Оцінка протипухлинного ефекту антитіла проти НМ1.24 на мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини Протипухлинний ефект антитіла проти НМ1.24 оцінюють по зміні об'єму пухлини і періоду виживаності мишей. У результаті, як показано на фігурі 26, було встановлено, що збільшення об'єму пухлини придушується при уведенні тваринам антитіла проти НМ1.24 у порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводили мишачий lgG2a. При цьому, що також видно з фігури 27, при введенні групі тварин антитіла проти НМ1.24 спостерігається збільшення періоду виживаності тварин у порівнянні з контрольною групою тварин, яким уводять мишачий lgG2a. Ці факти вказують на те, що антитіло проти НМ1.24 приховують протипухлинну дію на мишей із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини. Посилальний Приклад 1. Одержання гібридом, які продукують мишаче моноклональне антитіло проти НМ1.24 За методом Гото із співавт. (Go to, Т. et al., Blood, 1994, 84, 1922-1930) одержують гібридоми, що продукують мишаче моноклональне антитіло проти НМ1.24. Плазмову клітинну лінію КРС-32 (1х107), одержану з кісткового мозку пацієнта з множинною мієломою людини (Goto, Т. et al., Jpn. J. Clin. Hematol., 1991, 32, 1400) ін'єктують двічі в черевну порожнину мишей лініїBALB/c (виробництво Charles River) кожні шість тижнів. За 3 дні до умертвіння тварини в селезінку миші ін'єктують 1,5x106 клітин КРС-32 для посилення антитілоутворювальної здатності миші (Goto, Т. et al., Tokushima J.Exp. Med., 1990, 37, 89). Після умертвіння тварини екстрагують селезінку, і в екстрагованому органі проводять процедуру клітинного злиття з мієломною клітиною SP2/0 (за методом Groth, de St. and Schreidegger, Cancer Research, 1981, 41, 3465). За методом ІФТФА на клітинах (Posner, M.R. et al., J. Immunol. Methods, 1982,48, 23) із використанням КРС-32 проводять скринінг культурального супернатанту гібридом на наявність антитіла. 5x104 клітин КРС-32 суспендують у 50мл ФБР, аліквоту переносять на 96-лунковий мікротитрувальний планшет (U-образне фанульоване дно, виробництво Iwaki) і потім висушують на повітрі при температурі 37°С протягом ночі. Після блокування реакції додаванням ФБР, що містить 1% бичачого сироваткового альбуміну (БСА), вносять культуральний супернатант гібридом і проводять інкубацію при 4°С протягом 2-х годин. Потім проводять реакцію при 4°С протягом 1 години козячого антитіла проти мишачого IgG, міченого пероксидазою (виробництво Zymed). Після промивання проводять реакцію з розчином о-фенілендіаміну (виробництво Sumitomo Bakelite) при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Реакцію зупиняють додаванням 2н сірчаної кислоти і вимірюють поглинання при 492мм із використанням лічильника ІФТФА (виробництво Bio-Rad). Для добору гібридом, які продукують антитіла проти людського імуноглобуліну, культуральний супернатант позитивних гібридом спочатку адсорбують на людську сироватку, після чого проводять скринінг реакційної здатності по відношенню до інших клітинних ліній за допомогою методу ІФТФА. Відбирають позитивні гібридоми і їх реакційну здатність до різних клітин визначають за допомогою методу проточної цитометрії. Останній відібраний гібридомний клон клонують двічі і ін'єктують у черевну порожнину мишей лінії BALB/c, оброблених пристаном, і далі збирають із них асцити. З асцитів миші одержують моноклональні антитіла й очищають їх осадженням сульфатом амонію і з використанням набору для афінної хроматофафії білка A (Ampure PA, виробництво Amersham). Очищені антитіла мітять ФІТЦ із використанням набору Quick Tag FITC biding kit (виробництво Boehringer Mannheim). В результаті досліджень показано, що моноклональні антитіла, що продукуються 30 гібридомними клонами, реагують із КРС-3 і RPMI 8226. Після клонування досліджують реакційну здатність клітинного супернатанту від зазначених гібридом з іншими клітинними лініями або моноядерними клітинами периферичної крові. З них 3 клону продукують моноклональні антитіла, які специфічно реагують із плазмовою клітиною. Із зазначених 3-х клонів був відібраний і позначений як НМ1.24 гібридомний клон, який найбільш придатний для аналізу методом проточної цитометрії і який має КЗЦ активність до RPMI 8226. Підклас моноклональних антитіл, що продукуються зазначеними гібридомами, ідентифікують методом ІФТФА з використанням протимишачого антитіла кролика, специфічного до даного підкласу (виробництво Zymed). Анти тіло проти НМ1.24 відноситься до підкласу lgG2a. Гібридома НМ1.24, яка продукує антитіло проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як FERM ВР-5233 14 вересня 1995 року Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi I-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія). Посилальний приклад 2. Одержання гуманізованого антитіла проти НМ1.24 Гуманізоване антитіло проти НМ1.24 одержують у відповідності з наступним методом. З гібридоми НМ1.24, одержаної в посилальному Прикладі 1, одержують загальну РНК із використанням традиційного методу. На її основі синтезують кДНК, що кодує V-область мишачого антитіла, і ампліфікують за методом з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і за методом 5'-RACE. Одержують фрагмент ДНК, що містить ген, що кодує мишачу V-область, який лігують із вектором клонування на основі плазміни pUC і потім вводять у компетентні клітини Е.соlі із повчанням трансформанта E.coli. Зазначену плазміду одержують із трансформанта. Визначають традиційним методом нуклеотидну послідовність кодуйочої ділянки кДНК у плазміді й ідентифікують гіперваріабельну ділянку (ГВД) у кожній V-області. Для конструювання вектора, що експресує химерне антитіло проти НМ1.24, у HEF вектор уставляють кДНК, що кодує V-область кожного з L-ланцюга і Η-ланцюга мишачого антитіла проти НМ1. 24. Далі для конструювання гуманізованого антитіла проти НМ1.24 ГВД V-області мишачого антитіла проти НМ1.24 пересаджують на людське антитіло за методом пересадки ГВД. L-ланцюг людського антитіла REI використовують в якості L-ланцюга антитіла людини, для каркасних областей (КО) 1-3 Η-ланцюга людського антитіла використовують КО 1-3 людського антитіла HG3 і КО4 із людського антитіла JH6 використовують для КО4. Деякі амінокислоти в КО із V-області Η-ланцюга заміщають так, щоб ГВД-трансплантоване антитіло могло сформувати відповідний сайт для зв'язування антигену. Для експресії гена L-ланцюга і Η-ланцюга сконструйованого таким способом гуманізованого антитіла проти НМ1.24 у клітини ссавця кожний ген окремо вводять у вектор HEF для конструювання вектора, який буде експресувати L-ланцюг або Н-ланцюг гуманізованого антитіла проти НМ1.24, відповідно. При одночасному введенні зазначених 2-х векторів експреси в СНО клітини встановлюється клітинна лінія, що продукує гуманізоване антитіло проти НМ1.24. Активність, що зв'язує антиген, і інгібування активності, що зв'язує, щодо клітинної лінії WISH клітин амніону людини гуманізованого антитіла проти НМ1.24, одержаного при культивуванні зазначеної клітинної лінії, були досліджувані клітинним методом ІФТФА. Одержаний результат показує, що гуманізоване антитіло проти НМ1.24 має антиген-зв'язуючу активність, що дорівнює такій у химерного антитіла, і в тому, що стосується активності по інгібуванню зв'язування з використанням біотинвмісного мишачого антитіла проти НМ1.24, воно також виявляє активність, яка дорівнює активності химерного антитіла або мишачого антитіла. E.coli, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує V-область L-ланцюга, і ДНК, що кодує V-область Ηланцюга химерного антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як Escherichia coil DH5a (pUC19-l,24L-gk) i Escherichia coil DH5a (pUC19-l.24H-ggl) 29 серпня 1996p. Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних те хнологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як FERM BP-5646 і FERM BP-5644, відповідно. Крім того, E.coli, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант a (SEQ ID N0:2) V-області L-ланцюга або варіант r (SEQ ID N0:3) V-області Ηланцюга гуманізованого антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як Escherichia coil DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gk) і Escherichia coil DH5a (pUC19-RVHr-ggl), відповідно, 29 серпня 1996p. Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як PERM BP-5645 і FERM BP-5643, відповідно. Далі, E.coli, що несе плазміду, яка містить ДНК, що кодує варіант s (SEQ ID N0:4) V-області Н-ланцюга гуманізованого антитіла проти НМ1.24, була депонована в Міжнародній Колекції згідно з положеннями Будапештського Договору як Escherichia coil DH5a (pUC19-RVHs-AHM-ggl) 29 вересня 1997p. Національним Інститутом біологічних наук і гуманітарних технологій (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія) як FERM BP-6127. Посилальний приклад 3. Клонування кДНК, що кодує білковий антиген НМ1.24. Клонують кДНК, що кодує білковий антиген НМ1.24, специфічно розпізнаваний антитілом проти НМ1.24. 1. Конструювання бібліотеки кДНК 1) Одержання загальної РНК З клітинної лінії множинної мієломи людини КРММ2 одержують загальну методом Чиргвіна із співавт. (Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979). Згідно із зазначеним методом, 2,2x108 клітин КРММ2 цілком гомогенізують у 20мл 4М гуанідінотіоцианату (виробництво Nacalai Tesque Inc.). Гомогенат нашаровують на 5, 3М розчин хлориду цезію в центрифужній пробірці, яку потім центрифугують із використанням ротора Beckman SW40 із швидкістю 31000об/хв при 20°С протягом 24 годин для осадження РНК. Осад РНК промивають 70% етанолом і потім розчиняють у 300мкл 10мм Трис-НСІ (рН 7,4), що містить 1М ЕДТА і 0,5% ДСН. Добавляють проназу (виробництво Boehringer) до концентрації 0,5мг/мл і потім проводять інкубацію при температурі 37°С протягом 30 хвилин. Суміш екстрагують фенолом і хлороформом і РНК осаджують етанолом. Осад РНК розчиняють у 200мкл 10мм Трис-НСІ (рН 7,4), що містить 1мм ЕДТА. 2) Одержання полі(А)+РНК Полі(А)+РНК очищають із використанням в якості вихідного матеріалу 500мкг загальної РНК, одержаної згідно з описаним вище методом за допомогою набору для виділення мРНК Fast Track 2,0 mRNA Isolation Kit (виробництво Invitrogen) згідно з інструкцією, що додається до набору. 3. Конструювання бібліотеки ДНК Синтезують дволанцюгову кДНК із використанням в якості вихідного матеріалу 10мкг зазначеної вище полі-(A)+FHK за допомогою набору для синтезу кДНК TimeSaver cDNA Synthesis Kit (виробництво Pharmacia), згідно з інструкцією, що додається до набору, і потім проводять лігування з EcoRI адаптером, що поставляється в наборі, із використанням Directional Cloning Toolbox (виробництво Pharmacia), згідно з інструкцією, що додається до набору. Кінування й обробку рестрикційним ферментом Not адаптеру EcoRI проводять згідно з інструкцією, що додається до набору. Далі дволанцюгову кДНК, що додається до адаптеру, що має розмір 500нп або більше, відокремлюють і очищають із використанням 1,5% низькоплавкого агарозного гелю (виробництво Sigma) з одержанням 40мкл доданої до адаптеру ланцюгової кДНК. Одержану в такий спосіб додану до адаптеру дволанцюгову кДНК лігують із використанням вектора pCOS1 (заявка на патент Японії 8-255196) і ДНК-лігази Т4 (виробництво Gibco-BRL), яка була попередньо оброблена рестриктазами EcoRt і Notl і лужною фосфатазою (виробництво Takara Shuzo) для створення бібліотеки кДНК. Сконструйовану бібліотеку кДНК за допомогою трансдукції вводять у штам Е coli DH5a. (виробництво Gibco-BRL), при цьому згодом було встановлено, що це незалежний клон, що має загальний розмір біля 2,5x106. 2. Клонування методом прямої експресії 1) Трансфекція COS-7 клітин Приблизно 5x105 клонів зазначеного вище штаму трансдукованої Е.coli культивують у середовищі 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), що містить 50мкг/мл ампіциліну, для ампліфікації кДНК, яку піддають обробці за лужним методом (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), із відновленням плазмідної ДНК з Е.соlі. Одержану в такий спосіб плазмідну ДНК переносять методом трансфекції в COS-7 клітини методом електропорації з використанням приладу Gene Pulser (виробництво Bio-Rad). Згідно з зазначеним методом, 10мкг очищеною плазмідною ДНК добавляють до 0,8мл розчину COS-7 клітин, в якому клітини були суспендовані у ФБР у концентрації 1x107клітин/мл, і одержану суміш піддають впливу імпульсів у 1500 V при ємності 25мкф. По закінченні 10-хвилинного відновлювального періоду при кімнатній температурі клітини після електропорації культивують у культуральному середовищі DMEM (виробництво Gibco-BRL), що містить 10% навколоплідної сироватки теляти (виробництво Gibco-BRL) при температурі 37°С в атмосфері 5% СО2 протягом 3-х днів. 2) Підготовка кювети Кювету, на якій наносять мишаче антитіло проти НМ1.24, готують за методом Сіда із співавт. (B.Seed et al. Proc.Nail.Acad.Sci. USA; 84, 3365-3369, 1987). Згідно із зазначеним методом, мишаче антитіло проти НМ1.24 добавляють до 50мм Трис-НСІ (рН 9,5) до концентрації 10мкг/мол. Три мілілітри приготовленого в такий спосіб розчину антитіла добавляють до чашки з клітинною культурою діаметром 60мм і інкубують при кімнатній температурі протягом 2-х годин. Після промивання 3 рази 0,15М розчином NaCI до чашки добавляють ФБР, що містить 5% навколоплідної сироватки теляти, 1мм ЕДТА і 0,02% NaN3. Суміш після блокування використовують для подальшого клонування. 3) Клонування бібліотеки кДНК COS-7 клітини, що піддавалися трансфекції за описаним вище методом, обробляють ФБР, що містить 5мм ЕДТА. Після однократного промивання клітин ФБР, що містять 5% навколоплідної сироватки теляти, їх суспендують у ФБР, що містить 5% навколоплідної сироватки теляти і 0,02% NaN3 до концентрації приблизно 1x106клітин/мол. Суспензію вносять у кювету, підготовлену як зазначено вище, і проводять інкубацію при кімнатній температурі протягом приблизно 2-х годин. Після обережного триразового промивання ФБР, що містить 5% навколоплідної сироватки теляти і 0,02% NaN3, виділяють плазмідну ДНК із клітин, зв'язаних із кюветою, із використанням розчину, що містить 0,6% ДСН і 10мм ЕДТА. Відновлену плазмідну ДНК переносять методом трансдукції в E.coli DH5a. Після ампліфікації за описаним вище методом плазмідну ДНК відновлюють лужним методом. Відновлену плазмідну ДНК переносять шляхом трансфекції в COS-7 клітини за допомогою електропорації і відновлену з клітин плазмідну ДНК зв'язують, як описано вище. Повторюють один раз аналогічну процедуру і відновлену плазмідну ДНК розщеплюють рестриктазами EcoRI і Not, що підтверджує факт наявності вставки, що має розмір приблизно 0,9 тис.нм. Клітини Е.соlі, в яких частина відновленої плазмідної ДНК була перенесена шляхом трансдукції, інокулюють на чашку з 2-YT агаром, що містить 50мкг/мл ампіциліну. Після культивування протягом ночі виділяють з однієї колонії плазмідну ДНК. її розщеплюють рестриктазами EcoRI і Not з одержанням клону р3.19, в якому розмір вставки складає приблизно 0,9тис.нп. Проводять реакцію зазначеного клону з використанням набору для секвенування PRISM, Dye Terminator Cycle Sequencing kit (виробництво Perkin Elmer), згідно з інструкцією, що додається до набору, і визначають нуклеотидну послідовність із використанням секвенатора ДНК АВІ 37 ЗА DNA Sequencer (виробництво Perkin Elmer). Зазначена нуклеотидна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність подані в SEOIDNO:1. Промислова застосовність Результати аналізу методом проточної цитометрії показали, що антитіло проти НМ1.24 активно взаємодіє з більшістю клітин, одержаних із пухлин лімфатичних тканин, указуючи на те, що у випадку багатьох пухлин лімфатичних тканин поліпептид, що має епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМ1.24, експресується значною мірою. Крім того, уведення мишам із трансплантованою лімфатичною пухлиною людини, що реагує з антитілом НМ1.24, антитіла проти НМ1.24 приводить до придушення росту об'єму пухлини, а також до збільшення періоду виживання. Зазначені факти показують, що антитіло проти НМ1.24 або антитіла, розпізнавані поліпептидом, що має епітоп, розпізнаваний антитілом проти НМ1.24, мають цитотоксичну активність проти багатьох пухлин лімфатичних тканин і це дає підставу припускати, що зазначене антитіло може використовуватися для лікування хворих із пухлинами лімфатичних тканин. Посилання на мікроорганізми, депоновані згідно з договором по Патентному співробітництву (Patent Cooperation Treaty), Положення 13-2 і найменування Інституту, що депонує. Інститут, що депонує Найменування: Національний Інститут біологічних наук і гуманітарних технологій. Агентство промислової науки і технології (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology) Адреса: 1-3, Higashi l-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Японія Мікроорганізм (1) Найменування: Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) Номер збереження: FERM BP-4434 Дата депонування: 5 жовтня 1993 року Мікроорганізм (2) Найменування: Гібридома НМ1.24 Номер збереження: FERM BP-5233 Дата депонування: 14 вересня 1995р. Мікроорганізм (3) Найменування: Escherichia coli DH5a(pUC19-RVHr-AH M-ggl) Номер збереження: FERM BP-5643 Дата депонування: 29 серпня 1996р. Мікроорганізм (4) Найменування: Escherichia coil DH5a (pUC19-l.24H-ggI) Номер збереження: FERM BP-5644 Дата депонування: 29 серпня 1996р. Мікроорганізм (5) Найменування: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gk) Номер збереження: FERM BP-5645 Дата депонування: 29 серпня 1996p. Мікроорганізм (6) Найменування: Escherichia coil DH5a (pUC19-l,24L-gk) Номер збереження: FERM BP-5646 Дата депонування: 29 серпня 1996р. Мікроорганізм (7) Найменування: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-ggl) Номер збереження: FERM BP-6127 Дата депонування: 29 вересня 1997р. Перелік послідовностей CHUGAl SEIYAKU KABUSHIKl KAISH A Лікарський засіб, застосовуваний при лікуванні пухлин лімфатичних тканин Е908 PCT/JP98/00568 1998-02-12 JP 9-41410 1997-02-12 8 1 1013 ДНК Homosapiens Нуклеотидна послідовність ДНК, що кодує антиген НМ1.24 1