Похідні гідроксиламіну як лікарський засіб для лікування або профілактики захворювань, спричинених пошкодженням васкулярних ендотеліальних клітин та спосіб лікування

Винахід стосується продуктів для лікування чи профілактики захворювань, пов'язаних з порушенням функції васкулярних ендотеліальних клітин, які містять як активний агент похідне гідроксиламіну загальної формули (І) або (II). Нормальне функціонування васкулярних ендотеліальних клітин має дуже велике значення для організму. Ці клітини утворюють поверхневий шар між циркулюючою кров'ю та елементами стінки вени, які виконують тромбогенну діяльність. Роль васкулярних ендотеліальних клітин у гомеостазі дуже різноманітна: - вони беруть участь у двобічному транспорті речовин, які утворюються у крові та тканинах, - вони утворюють бар'єр для макромолекул, - ці клітини є місцем синтезу та розкладу медіаторів, які беруть участь у регулюванні взаємодії між клітинними елементами стінок вени та кров'ю (наприклад, фібриноген, колаген, протеоглікани, PGI2, EDRF (NO), EDHF, ендотелін-І, ангіотензин-ІІ), - вони ініціюють міграційні, проліферативні та тромболітичні процеси, які потрібні для відновлення тканин, - вони підтримують тромборезистентність стінки вени [Rubanyi, G., J. Carcliovasc. Pharmacol., 1993, 22 (42 Suppl.), p.S1-14]. Пошкодження ендотелію призводить до атеросклерозу. Пошкодження, яке спричинює деградацію ендотелію, може відбутись при механічному втручанні, наприклад, катетеризації, а також внаслідок біохімічних та імунологічних процесів. На першій стадії утворення атеросклеротичної бляшки в інтимі артерій накоплюються клітини, наповнені ліпідами [Steinberg D.Ta ін., JAMA, 264-304, 1990]. Ці клітини - особливо моноцити та макрофаги, які беруть походження із крові - спочатку прилипають до ендотелію, а потім проникають до інтими. Пошкодження ендотеліальних клітин може також зробити свій внесок до адгезії, хоч на ранній стадії ніяких морфологічних змін не спостерігається. Окислення частинок ліпопротеїдів низької щільності (LDL) може призвести до їх включення до моноцитів, які знаходяться в інтимі, внаслідок чого ці моноцити становляться пінистими клітинами. Ці пінисти клітини утворюють ліпідні смужки - найпершу форму артеріосклеротичних змін. На пізніших стадіях відбуваються кровотеча, некроз, реваскуляризація та склероз, і одночасно утворюється внутрішня бляшка, яка потім спричинює звуження артерій (Ір. JH, Fuster та ін., J. Am. Coll. Cardiol., 15:1667,1990). Тромбоз може відбутись на різних стадіях атеросклерозу. Повторний тромбоз призводить до обструкції судин та тромбоемболічних захворювань, таких як тромбоз коронарних судин, тромбоз судин мозку, або захворювання периферичних судин. У клінічному розумінні “синдром порушення ендотеліальної функції” стосується генералізованого чи локалізованого судинного спазму, тромбозу, артеріосклерозу та рестенозу. Спроби лікування цих захворювань включають методи клінічного втручання, хірургічне шунтування та медикаментозне лікування. Придатними для "лікування" порушення ендотеліальної функції є лише кілька з існуючих лікарських препаратів. Вони діляться на чотири велики категорії: - препарати для заміщення природних "захисних" ендотеліальних речовин (наприклад, стабільні аналоги PGI2, нітро-вазодилататори, активатор плазміногена рекомбінантної тканини (rt-PA)); - інгібітори чи антагоністи ендотелій-продукованих скорочувальних факторів (наприклад, інгібітори АСЕ, антагоністи рецепторів ангіотензину-ІІ, антагоністи рецепторів ТХА2); - цитозахисні агенти (наприклад, супероксиддисмутаза та пробукол, які знищують вільні радикали, та лазароїди, які є інгібіторами продукування вільних радикалів); - лікарські засоби, які знижують рівень ліпідів. Хоч жоден з цих препаратів не був спочатку призначений для цієї мети, їх вже доведена клінічно сприятлива дія у випадку певних захворювань може включати захист чи відновлення нормальної ендотеліальної функції. Нові методи лікування у цій категорії засновані на відновленні нормальної ендотеліальної клітинної оболонки, так щоб її клітини самі "зробили все, як треба". Потенційні підходи можуть включати стимулювання відновлення росту нормального ендотелію, або використання нових щойно виникаючих способів лікарського впливу, основаних на технологіях рекомбінації ДНК (Science, 1990; 249; 12858). Згідно з наявними даними, жоден з признаних препаратів не задовольняє цим критеріям. На сьогодні невідомо ніяких визнаних чи запропонованих лікарських препаратів, які б діяли безпосередньо на ендотелій, а тому всі вони є непридатними для лікування порушення ендотеліальної функції. Таким чином, існує велика потреба у лікарському препараті, який був би здатний попереджувати, обертати чи принаймні уповільнювати утворення симптомів ускладнення, або зменшити поширеність захворювання. Під час наших досліджень ми знайшли, що похідні гідроксиламіну загальної формули (І) та (II) виявляють сильну захисну та регенеративну дію на васкулярні ендотеліальні клітини, та є здатними попереджувати їх ушкодження від різних факторів. У загальних формулах (І) та (II) R1 та R2 незалежно один від одного означають атом водню або лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 1 до 6 атомів вуглецю, або R1 та R2 разом з розміщеним між ними атомом азоту утворюють насичену 5-7-членну гетероциклічну групу, яка необов'язково містить додаткові гетероатоми азоту та/або кисню, А означає лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 4 до 12 атомів вуглецю, фенільну групу, заміщену чи незаміщену, яка бажано містить як замісник алкільну, галоїдалкільну чи нітрогрупу, або 5-6членне гетероароматичне кільце, яке містить азот, кисень чи сірку, у сполуках загальної формули (І) Ζ означає ковалентний зв'язок, а у сполуках загальної формули (II) ковалентний зв'язок чи групу =ΝΗ, у сполуках загальної формули (І) X означає атом галогену чи групу -NR3R4, у якій R3 та R4 незалежно один від одного означають атом водню або лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 1 до 6 атомів вуглецю, тоді як у сполуках формули (II) X означає атом кисню, у сполуках формули (II) R' означає атом водню або лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 1 до 6 атомів вуглецю, і у сполуках загальних формул (І) та (II) Υ означає атом водню, гідроксильну групу чи ацилоксигрупу, яка бажано містить як ацильний компонент ацильну частину довголанцюгової жирної кислоти, яка містить від 8 до 22 атомів вуглецю, або циклічної ароматичної карбонової кислоти, причому у сполуках загальної формули (І), у яких X означає групу -NR3R4, a Y означає гідроксильну групу, група X є сконденсованою з замісником Υ і утворює внутрішньомолекулярне кільце. Ефективними сполуками є також солі та оптично активні форми цих сполук. Сполуки загальної формули (І), у яких X означає групу -ΝΗ2, а А означає незаміщену фенільну чи піридильну групу, та у яких Υ означає гідроксильну групу, є вже відомими з опублікованої заявки на патент Франції № 2362845 А1. Ці сполуки, згідно з вищевказаною заявкою, є селективними бета-блокаторами, і тому придатні для лікування діабетичної ангіопатії. Сполуки загальної формули (І), у яких X означає атом галогену, Υ означає гідроксильну групу, і А означає незаміщену чи заміщену фенільну чи піридильну групу, є вже відомими з опублікованої заявки на патент РСТ № WO 90/04584 А1. Ці сполуки мають селективну бета-блокуючу дію, і тому є придатними до застосування як ефективні агенти у лікуванні діабетичної ангіопатії. Сполуки загальної формули (II), у яких А означає фенільну (незаміщену чи заміщену галоїдалкільною групою), піридильну чи тієнільну групу, Ζ означає ковалентний зв'язок, R' означає атом водню, і Υ означає гідроксильну групу, є вже відомими із заявки на патент Угорщини № 2385/92, опублікованої за № Т/66350. Ці сполуки мають протиішемічну та антиангінальну дію і тому можуть бути ефективно застосовані у лікуванні ускладнень на венах, пов'язаних з цукровим діабетом. Сполуки загальної формули (І), у яких А означає ароматичне чи гетероароматичне кільце, X означає атом галогену, a Y означає атом водню, є вже відомими з опублікованої заявки РСТ № WO 95/30649 А1. Ці сполуки мають протиішемічну та антиангінальну дію і можуть бути найбільш ефективно застосовані при лікуванні випадків ішемії, для яких характерні гіпертонічні вени та тромбоцитна агрегація. У жодному з вищеназваних описів не зазначено, що описані сполуки можуть чинити будь-який ефект на васкулярні ендотеліальні клітини. Як ми зазначали вище, наші дослідження довели, що сполуки загальних формул (І) та (II) чинять вплив на ендотеліальні клітини серцево-судинної та цереброваскулярної систем. У експериментах, які детально будуть описані далі, спостерігалось, що ці сполуки здатні блокувати пошкодження цих клітин або відновлювати їх. Таким чином, ці сполуки можуть бути використані як активна речовина у лікарських продуктах, які використовуються у лікуванні хвороб, спричинених аномальним функціонуванням чи пошкодженням ендотеліальних клітин, особливо серцево-судинними і цереброваскулярними захворюваннями, гіпертензією, гіпергомоцистинемією та захворюваннями периферичних судин. Винахід оснований на цих спостереженнях і полягає у застосуванні похідних гідроксиламіну загальних формул (І) та (II), у яких R1 та R2 незалежно один від одного означають атом водню або лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 1 до 6 атомів вуглецю, або R1 та R2 разом з розташованим між ними атомом азоту утворюють насичену 5-7-членну гетероциклічну групу, яка необов'язково містить додаткові гетероатоми азоту та/або кисню, А означає лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 4 до 12 атомів вуглецю, фенільну групу, заміщену чи незаміщену, яка бажано містить як замісник алкільну, галоїдалкільну чи нітрогрупу, або 5-6членне гетероароматичне кільце, яке містить азот, кисень чи сірку, у сполуках загальної формули (І) Ζ означає ковалентний зв'язок, а у сполуках загальної формули (II) ковалентний зв'язок чи групу =ΝΗ, у сполуках загальної формули (І) X означає атом галогену чи групу -NR3R4, у якій R3 та R4 незалежно один від одного означають атом водню або лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 1 до б атомів вуглецю, тоді як у сполуках загальної формули (II) X означає атом кисню, у сполуках формули (II) R’ означає атом водню або лінійну чи розгалужену алькільну групу, яка містить від 1 до 6 атомів вуглецю, і у сполуках загальних формул (І) та (II) Υ означає атом водню, гідроксильну групу чи ацилоксигрупу, яка бажано містить як ацильний компонент ацильну частину довголанцюгової жирної кислоти, яка містить від 8 до 22 атомів вуглецю, або циклічної ароматичної карбонової кислоти, однак у певних типів сполук загальної формули (І), у яких X означає групу -NR3R4, a Υ означає гідроксильну групу, група X є сконденсованою із замісником Υ і утворює внутрішньомолекулярне кільце, зображене загальною формулою (III): у якій A, Z, R1 та R2 мають значення, які було визначено вище, а крім того, солей та оптично активних форм цих сполук, для виробництва лікарського засобу, який використовується у лікуванні чи профілактиці захворювань, пов'язаних з порушенням функції ендотеліальних клітин. Винахід також стосується фармацевтичних продуктів, які використовуються для лікування та профілактиці захворювань, пов'язаних з аномаліями функціонування васкулярних клітин, що містять як активну речовину (крім звичайних речовин носіїв та допоміжних засобів, які використовуються у фармацевтичних композиціях) сполуку загальної формули (І) чи (II) у кількості 0,5-95,5% мас, або, у певних випадках, солі чи оптично активні форми цих сполук, причому у цих формулах означення R1, R2, Α, Ζ, Χ, Υ та R’ мають наведені вище значення. При застосуванні згідно з винаходом перевага надається таким сполукам загальних формул (І) та (II), у яких А означає піридильну, тієнільну, фенільну, нітрофенільну чи трифторметилфенільну групу. Перевага надається також тим сполукам загальної формули (І), у яких X означає атом хлору чи групу ΝΗ2. Із цих останніх сполук особлива перевага надається таким, що містять внутрішньомолекулярне кільце, утворене конденсацією груп X та Υ. Перевага надається також таким сполукам загальної формули (II), у яких R’ означає атом водню, а також таким сполукам загальних формул (І) та (II), у яких Υ означає атом водню чи гідроксильну групу. Із усіх вищеназваних категорій перевага надається тим сполукам, у яких група NR1R2 означає піперидинову чи діалкіламіногрупу. Особлива перевага надається таким сполукам загальних формул (І) та (II) за винаходом: N-[2-бензоїлокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-3-піридинкарбоксімідамін (Z)-2-бутендіоат (1:1) (сполука №1); N-[2-пальмітоїлокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-3-піридинкарбоксімідамід моногідрохлорид (сполука №2); Ν-{3-[(1,1-диметилетил)аміно]-2-гідроксипропокси}-3-трифторметилбензол-карбоксімідоїлхлорид моногідрохлорид (сполука №3); N-[2-гідрокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-2-тіофенкарбоксімідоїлхлорид моногідрохлорид (сполука №4); N-[2-гідрокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-бензолкарбоксімідоїлхлорид моногідрохлорид (сполука №5); N-[2-гідрокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-4-піридинкарбоксімідоїлхлорид (Z)-2-бутендіоат (1:1) (сполука №6); N-[2-гідрокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-2-нітробензолкарбоксімідоїлхлорид моногідрохлорид (сполука №7); N-[3-(1-піперидиніл)пропокси]-3-піридинкарбоксімідоїлхлорид дигідрохлорид (сполука №8); N-[3-(1-піперидиніл)пропокси]-3-нітробензолкарбоксімідоїлхлорид моногідрохлорид (сполука №9); N-{3-[(1,1-диметилетил)аміно]-2-гідроксипропокси}-3-трифторметилбензамід (сполука №10); N-гексил-N'-[2-гідрокси-3-(1-піперидиніл)пропокси]-сечовина (сполука №11); N-гексил-N’-[3-(1 -піперидиніл)пропокси]-сечовина (сполука №12); 5,6-дигідро-5-(1-піперидиніл)метил-3-(3-піридил)-4Н-1,2,4-оксадіазин (сполука №13). Ці сполуки загальної формули (І), у яких X означає атом галогену, можуть бути одержані шляхом проведення реакції амідоксиму загальної формули (V): у якому А має значення, які було визначено вище, з амінохлорпропановим похідним, у якому R1, R2 та Υ мають значення, які було визначено вище, з наступним перетворенням групи -ΝΗ2 одержаної проміжної сполуки загальної формули (IV): у якій Ζ означає ковалентний зв'язок, а інші замісники мають значення, які було визначено вище, на атом галогену шляхом проведення реакції діазотування. У випадках, коли одержують сполуку загальної формули (І), у якій замісник Υ означає гідроксильну групу, потрібне амінохлорпропанове похідне загальної формули (XII): що містить як Y-замісник гідроксильну групу, може бути одержане із епіхлоргідрину формули (VI): та аміну загальної формули (IX): у якому R1 та R2 мають значення, які було визначено вище. За альтернативною методикою проводять спочатку реакцію епіхлоргідрину з амідоксимом загальної формули (V) а потім діазотують одержану проміжну сполуку загальної формули (VII): у якій А має значення, які було визначено вище, і проводять реакцію епоксісполуки загальної формули (VIII): 11 у якій А має значення, які було визначено вище, з аміном загальної формули (IX). Сполуки загальної формули (І), у яких Υ означає ацилоксигрупу, можуть бути одержані шляхом проведення реакції придатної сполуки загальної формули (І), яка замість Υ містить гідроксильну групу, з хлорангідридами кислот загальної формули (XI): у якій R5 означає довголанцюгову алкільну чи арильну групу. Сполуки загальної формули (II), які замість Ζ містять ковалентний зв'язок, можуть бути одержані одним з таких способів: (і) проведення реакції приєднання гідроксамату лужного металу загальної формули (XIII): у якій А та R' мають значення, які було визначено раніше, а К означає катіон лужного металу, з галогензаміщеною сполукою загальної формули (XII), у якій R1, R2 та Υ мають значення, які було визначено вище, або (іі) проведення реакції аміносполуки загальної формули (XIV), у якій R1, R2, Υ та R’ мають значення, які було визначено вище, з галогенідом кислоти, у якому А має значення, які було визначено вище, тоді як сполуки загальної формули (II), у яких Ζ означає ковалентний зв'язок, a R' означає атом водню, можуть бути також одержані, крім способів (і) та (іі), такими способами: (ііі) діазотуванням придатної сполуки загальної формули (І), у якій X означає групу -NH2, a Z означає ковалентний зв'язок, у середовищі, яке не містить галогенів, або (iv) гідролізом придатної сполуки загальної формули (І), у якій X означає атом галогену. Сполуки загальної формули (II), у якій А означає алкільну групу, a Z означає групу =ΝΗ, можуть бути одержані шляхом проведення реакції сполуки загальної формули (II), у якій R1, R2, Υ та R' мають значення, які було визначено вище, в органічному розчиннику, бажано у хлороформі, з еквімолярною кількістю алкілізоціанату, у якому А означає алкільну групу. Сполуки загальної формули (III): є особливим випадком сполук загальної формули (І), у якій азотовмісна група X сконденсована с замісником Υ з утворенням внутрішньомолекулярного кільця. Такі сполуки можуть бути одержані шляхом проведення реакції сполуки загальної формули (І) (у якій Υ означає гідроксильну групу) з надлишковою кількістю тіонілхлориду з наступним замиканням кільця одержаної проміжної сполуки загальної формули (IV) (у якій Υ означає атом хлору, а інші замісники мають значення, які було визначено вище) у присутності надлишкової кількості трет-бутоксиду калію при кип'ятінні в органічному розчиннику (бажано у трет-бутанолі). Похідні гідроксиламіну за винаходом виявляють несподівані фармакологічні властивості. Слід особливо зазначити, що вони регенерують ендотеліальні клітини не лише морфологічно, але й функціонально, тобто завдяки їх дії ендотеліальні клітини серцево-судинної та цереброваскулярної систем організму, який підлягає лікуванню, поновлюють своє функціонування. Також слід відзначити хорошу переносимість цих сполук. Ці характеристики створюють основу фармацевтичного використання похідних гідроксиламіну загальних формул (І) та (II). Такі лікарські засоби можуть бути використані для лікування серцево-судинних та цереброваскулярних захворювань людини та тварин, таких як гіпертензія, гіпергомоцистеїнемія та захворювання периферичних судин. Ці сполуки можуть бути найбільш ефективно використані при таких серцево-судинних захворюваннях, як захворювання коронарної артерії, атеросклероз, рестеноз внаслідок катетеризації та хірургічне шунтування коронарної артерії, і при таких цереброваскулярних захворюваннях, як оклюзія мозкової артерії; похідні гідроксиламіну загальних формул (І) та (II) можуть бути використані також при лікуванні випадків гіпертензії, спричинених есенційними, нирковими, легеневими та ендокринними захворюваннями, тоді як у терапії захворювань периферичних судин вони будуть найбільш ефективними у випадках аортального стенозу ніг. Сполуки за винаходом можуть бути також використані для протидії сприйнятливості до захворювання, спричиненої генетично детермінованим чи тимчасовим послабленням захисного механізму. Звичайна доза залежить від пацієнта, який одержує курс лікування, та від захворювання, і може змінюватись у межах 0,1200мг/кг, бажано 1-50мг/кг щоденно. Це може означати, наприклад, що щоденна доза для курсу лікування людини становитиме від 10 до 200мг перорально, від 1 до 15мг ректально, або від 2 до 20мг парентерально, для дорослих пацієнтів. Придатні фармацевтичні композиції можуть бути, наприклад, твердими речовинами чи рідинами, і мати вигляд будь-яких композицій лікарських засобів, що використовуються у лікуванні людини чи у ветеринарії, таких як простих таблеток чи таблеток з покриттям, желатинових капсул, гранулятів, розчину, сиропу, супозиторію, ліофілізованого чи неліофілізованого продукту для ін'єкцій; вони можуть бути одержані звичайними способами. Активна речовина може переноситись носіями, які звичайно використовуються у цих типах фармацевтичних продуктів, такими як тальк, гуміарабік, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, какаова олія, водні чи неводні носії, тваринні чи рослинні жири, похідні парафіну, гліколі, різними зволожуючими, диспергуючими чи емульгуючими речовинами та консервантами. Біологічні ефекти сполук за винаходом, представлених загальними формулами (І) та (II), проілюстровані наведеними нижче результатами досліджень ефекту релаксації вен, проведених in vitro на щурах, та морфологічних досліджень грудної аорти. Генетично гіпертонічні (SH) щури Wistar Okamoto у віці трьох місяців одержували протягом одного місяця курс лікування різними сполуками, що досліджувались, з наступним проведенням функціональних та морфологічних аналізів. Ефект релаксації вен дослідженими похідними гідроксиламіну на грудній аорті щурів SH (тест in vitro) Дослідження проводились за методикою, відомою з літератури [Japan J. Pharmacol., 59, 339-347 (1992)]. Щурів SH усипляли нембуталом (40мг/кг, інтраперитонеально), і їх грудну аорту виймали та поміщали до оксигенованого (95% О2 + 5% СО2) розчину Кребса-Хенселайта. Склад розчину: NaCI 118; КСІ 4,7; СаСІ2 2,52; MgSO4 1,64; NaHCO3 24,88; КН2РО4 1,18; глюкоза 5,5. Кільця вени довжиною 3мм суспендували у 20мл термостатованій бані для органів при 37°С. Натяг у стані покою становив 1г, і це значення підтримувалось протягом експерименту. Протягом періоду зрівноважування тривалістю 1 годину середовище термостатованої бані для органів змінювали кожні 20 хвилин. Скорочення вени викликали 10-6 Μ метоксаміном (біля 80% від максимального скорочення). Після досягнення максимального ступеню скорочення визначали величину вазодилатації, спричиненої ацетилхоліном (Ach) (10-6-10-4 М), яка свідчила про стан ендотелію стінки вени. Силу скорочення вимірювали ізометричним тензометром (SG-01D, Experimetria Ltd.) і реєстрували множинним самописом ОН-850 (Radelkis). Результати аналізів приведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Ефект релаксації вен дослідженими похідними гідроксиламіну на грудній аорті щурів SH (тест in vitro) Речовини / Дози Контрольна група SH-щурів, n=10 Сполука №13, n=12; 20мг/кг Сполука №5, n=11; 5мг/кг Сполука №4, n=11; 20мг/кг Сполука №6, n=10; 5мг/кг Сполука №10, n=12; 10мг/кг Сполука №1, n=12; 20мг/кг Сполука №2, n=10 Сполука №11, n=12; 20мг/кг Сполука №8, n=10; 5мг/кг Сполука №3, n=8; 10мг/кг Сполука №12, n=12; 10мг/кг Сполука №7, n=11; 5мг/кг Каптопріл, n=8; 20мг/кг -6 10 53,8 79,6 82,3 75,6 87,5 64,8 74,7 80,4 88,1 74,1 76,4 66,3 81,7 88,7 Дози Ach (M) 10-5 10-4 55,6 86,0 84,5 79,8 87,9 63,7 58,7 75,6 91,3 75,3 77,2 67,2 86,0 88,2 71,0 95,9 87,2 80,5 84,4 78,0 82,7 88,0 91,9 80,9 84,8 84,1 95,9 94,2 Як видно з таблиці, у випадку гіпертонічних контрольних тварин, які не одержували лікування, релаксація, викликана введенням 10-4 Μ ацетилхоліну, зменшувалась до 71% внаслідок пошкодження ендотелію, спричиненого гіпертензією. Досліджені сполуки значно покращували цю знижену здатність до вазодилатації, що свідчить про поліпшення ендотеліальної функції. Морфологічні дослідження грудної аорти за допомогою електронного мікроскопа Цей аналіз здійснювали за методикою, описаною у літературі (Br. J. of Pharmacol., 1995, 115; 415-420). Вирізували сегменти стінки аорти розміром 1мм2 з грудної аорти щурів і фіксували їх при кімнатній температурі 2,5%-ним глутаральдегідом. Після цього робили повторну фіксацію 1%-нит тетроксидом осмію, яка тривала протягом 1 години. Потім сегменти тканини дегідратувалиетанолом і поміщали до Durcupan ACM. Вирізані фрагменти оцінювали кількісно по фотографіям, зробленим за допомогою електронного мікроскопа Hitachi 7100. Результати цих аналізів наведені в Таблиці 2. Результати морфологічних аналізів виражали за шкалою від 1 до 5, в залежності від ступеню, у якому курс лікування дослідженими сполуками відновлював пошкодження ендотелію, спричинені гіпертензією, тобто ступеню регенеративної активності. За цією шкалою, 1 означає випадки, коли регенерація не спостерігалась, 2 означає слабку, 3 -середню, 4 - добру, і 5 - сильну регенерацію. Порівняно з контрольною групою, яка не одержувала лікування, після проведення курсу лікування похідними гідроксиламіну загальних формул (І) та (II) за винаходом спостерігався значний захисний чи регенеративний ефект. Внаслідок курсу лікування на пошкодженому субендотелії утворювався тонкий захисний шар, що складався з клітин, які містили активне ядро та збагачену цитоплазму. У більшості випадків регенерація виглядала вельми ефективною. Таблиця 2 Електронномікроскопічне визначення ефекту сполук за винаходом на грудну аорту SH-щурів (морфологічний аналіз) Речовини / Дози Контрольна група SH-щурів (фізіологічний сольовий розчин) Сполука №13, 20мг/кг перорально Сполука №5, 5мг/кг перорально Сполука №4, 20мг/кг перорально Сполука №10, 10мг/кг перорально Сполука №1, 20мг/кг перорально Сполука №11, 20мг/кг перорально Сполука №8, 5мг/кг перорально Сполука №9, 10мг/кг перорально Сполука №12, 10мг/кг перорально Сполука №14, 5мг/кг перорально Каптопріл, 100мг/кг перорально Ступень регенерації 1 5 5 5 4 3 4 3 3 4 3 3 Ці експериментальні дані підтверджують припущення про те, що сполуки загальних формул (І) та (II) здатні регенерувати ендотелій не лише функціонально, але також і морфологічно. При лікуванні хронічних захворювань ці сполуки забезпечували більш виражену морфологічну регенерацію, ніж еталонна сполука каптопріл. Дослідження ураженої інфарктом ділянки у спонтанно гіпертензивних (SH) щурів після одного місяця курса лікування перорально Експериментальні групи 1. Відібрана за віком контрольна група SH-тварин. 2. Верапаміл (як еталонний лікарський засіб), 50мг/кг перорально. 3. Сполука №13, 20мг/кг перорально. 4. Сполука №13, 50мг/кг перорально. 5. Сполука №5, 5мг/кг перорально. 6. Сполука №4, 5мг/кг перорально. Індукування інфаркту Ішемію міокарда індукували шляхом тимчасової оклюзії головної лівої коронарної артерії за методикою Griswold та ін. (J. Pharmacol. Methods, 1988, 20: 225-35). SH-щурів усипляли пентобарбіталом натрію (50мг/кг інтраперітонеально). Після трахеоктомії тваринам робили штучну вентиляцію легень кімнатним повітрям за допомогою респіратора для дрібних гризунів (модель Harvard 552), при ударному об'ємі серця 1,5-2мл/100г і частоті скорочень 55 ударів/хвилину для підтримування нормальних значень параметрів рО2, рСО2 та рН. Праву сонну артерію катетеризували та приєднували до датчика тиску (Р236В Stetham) для вимірювання системного артеріального кров'яного тиску (ВР) за допомогою передпідсилювача (Hg-O2D Experimetriaâ). Частоту серцевих скорочень (HR) вимірювали кардіотахометром (HR-01, Experimetriaâ). Електрокардіограму (ЕКГ, стандартний відвід ІІІ) записували автоматичним самописом (ER-14, Micromedâ) з використанням підшкірних стальних голчастих електродів. Грудну клітку вскривали лівосторонньою торакотомією і серце виводили назовні обережним натисканням на праву сторону грудної клітки. Під головну ліву коронарну артерію швидко підводили шовкову лігатуру 4/0. Серце повертали до грудної клітки і тварин залишала видужувати. Ректальну температуру контролювали і підтримували постійною на 37°С. Експериментальний протокол починався з 15-хвилинного періоду стабілізації, під час якого спостереження сталого кров'яного тиску на рівні нижче 70мм ртутного стовпчика та/або вияви аритмії призводили до виключення тварини. Ішемію міокарда індукували оклюзією коронарної артерії протягом 1 години з наступною реперфузією протягом 1 години. Тварин з симульованою операцією піддавали усім вищеописаним хірургічним процедурам, за винятком оклюзії коронарної артерії та реперфузії. Кількісна оцінка інфаркту міокарда Наприкінці експерименту серце швидко видаляли. Лівий шлуночок розсікали на секції товщиною 2мм паралельно атріовентрикулярній борозні. Зрізи інкубували у 0,1% розчині тетразолію нітроблакитного (чистота grade III), pH 7,4 протягом 15 хвилин. Не уражена інфарктом ділянка забарвлювалась у синє завдяки утворенню осаду внаслідок реакції тетразолію нітроблакитного з ферментами дегідрогенази. Втрата цих ферментів в ураженому інфарктом міокарді попереджала утворенню осаду; таким чином, уражена інфарктом ділянка у ділянці риску залишалась блідо-жовтою. Секції лівого шлуночка фотографували (Practica) і уражену інфарктом ділянку вимірювали планіметрично. Змертвілу ділянку виражали у відсотках відносно поверхні лівого шлуночка. Статистичний аналіз Усі величини виражено як середні значення ± стандартну похибку вимірювань. Порівняння груп здійснювали за допомогою односпрямованого дисперсійного аналізу за критерієм “t” Стьюдента. Статистична значущість визначалась як р