Комбінаційна терапія раку підшлункової залози з використанням антигенного пептиду та хіміотерапевтичного засобу – гемцитабіну

Реферат: Винахід стосується комбінаційної терапії, що є придатною для лікування раку підшлункової залози та йому подібного, яка передбачає застосування пептиду з гемцитабіном. UA 100702 C2 (12) UA 100702 C2 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пріоритет Для цієї заявки заявляється пріоритет попередньої патентної заявки США за серійним номером 60/957,923, поданої 24 серпня 2007 року, зміст якої включено сюди шляхом посилання. Галузь техніки Цей винахід стосується новітньої комбінаційної терапії раку підшлункової залози, в якій використовується антигенний пептид та хіміотерапевтичний засіб. Попередній рівень техніки Рак підшлункової залози має один з найвищих показників смертності від злоякісних хвороб, та коефіцієнт виживаності протягом 5 років становить 4 %. Кожного року приблизно у 28000 пацієнтів діагностують рак підшлункової залози, та майже усі пацієнти помирають від цієї хвороби (Greenlee, R. T., et al., (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36). Поганий прогноз цієї злоякісної хвороби є результатом складності раннього діагностування та поганої сприйнятливості до сучасних терапевтичних способів (Greenlee, R. T., et al. (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36, Klinkenbijl, J. H., et al. (1999) Ann Surg, 230: 776-82; discussion 782-4.). Зокрема, у цей час не існує жодних ідентифікованих пухлинних маркерів, які б дозволили виконувати надійний скринінг на ранній потенційно виліковній стадії хвороби. Дослідження, метою якого було роз'яснення канцерогенних механізмів, виявило ряд кандидатур молекул-мішеней для розробки протипухлинних засобів. Наприклад, було продемонстровано, що інгібітор фарнезилтрансферази (FTI) є ефективним при лікуванні Rasзалежних пухлин на тваринних моделях (Sun J et al., (1998) Oncogene, 16:1467-73.). Цей фармацевтичний засіб було згодом розроблено для інгібування шляхів сигналів росту, пов'язаних з Ras, що є залежними від пост-транскрипційного фарнезилування. Під час клінічних випробувань на людях, під час яких протипухлинні засоби застосовували у комбінації з моноклональним антитілом анти-HER2, трастузумабом, з метою протидіяти прото-онкогенному HER2/neu, досягли успіху у покращенні клінічної реакції та покращили загальний коефіцієнт виживаності пацієнтів з раком молочної залози. Інгібітор тирозинкінази STI-571 - це інгібітор, що селективно інактивує злитий білок bcr-ab1. Цей фармацевтичний засіб було згодом розроблено для терапії хронічного мієлоїдного лейкозу, де постійна активація тирозинкінази bcr-abl відіграє суттєву роль у перетворенні лейкоцитів. Такі фармацевтичні засоби розроблено для інгібування канцерогенної активності специфічних генних продуктів (Molina MA, et al., (2000) Cancer Res, 16:4744-9). Отже, у ракових клітинах генні продукти з активованою експресією зазвичай служать як потенційні мішені для розробки новітніх протипухлинних засобів. Альтернативно, інгібітори синтезу нуклеїнових кислот можна також застосовувати як протипухлинні засоби. Наприклад, R гемцитабін (Gemzar ) - це препарат першого вибору для лікування раку підшлункової залози. Комбінаційну терапію гемцитабіном та паклітакселом також застосовували для лікування раку підшлункової залози. Тим часом, суттєву роль у прогресуванні пухлин відіграє ангіогенез пухлини. Раніше було продемонстровано, що ефективну вакцину проти пухлинного ангіогенезу можна розробити згідно з підходом, який спирається на ендотеліальні клітини та який націлений на рецептори 1 та 2 судинного ендотеліального фактору росту (VEGFR), оскільки HLA-молекули І класу не регулюються на зниження на ендотеліальних клітинах (Wada S et al., Cancer Res 2005 Jun 1, 65(11): 4939-46; Ishizaki H et al., Clin Cancer Res 2006 Oct 1, 12(19): 5841-9). Раніше було також описано пептиди, що індукують цитотоксичні Т-лімфоцити (CTL), що є специфічними для клітин, які експресують VEGFR та, внаслідок цього, пригнічують пухлинний ангіогенез завдяки специфічній та ефективній реакції CTL (дивись WO/2004/024766, яку включено до цього опису шляхом посилання). Цей винахід спрямований на існуючу у галузі потребу удосконалити терапію раку підшлункової залози шляхом запропонування новітньої комбінаційної терапії раку підшлункової залози, під час якої застосовуються антигенний пептид, зокрема, антигенні пептиди та протиракові вакцини, що націлені на VEGFR2, та хіміотерапевтичний засіб, такий як гемцитабін. Суть винаходу Враховуючи стан галузі протиракової терапії, завданням цього винаходу було винайти засіб для підвищення терапевтичного ефекту хіміотерапії. VEGFR2 сильно експресується в ендотеліальних клітинах пухлинної тканини, та вважається, що він бере участь у проліферації ендотеліальних клітин на сигнал VEGF. Отже, цей винахід зосереджено на можливих способах терапії із застосуванням протиракових вакцин, що націлені на VEGFR2 (KDR/flk-1; далі позначається "KDR"). Згодом було визначено, що терапевтичний ефект хіміотерапевтичних засобів, таких як гемцитабін, підсилюється завдяки пептидам VEGFR2 (KDR/flk-1; далі позначається "KDR"), які індукують цитотоксичні Т-клітини проти клітин, що експресують VEGFR2. Отже, завданням цього винаходу є наступне: 1 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [1]. Спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає етап введення суб'єктові (і) та (іі), а саме: (і) одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (а) одного або більше пептидів, що мають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO: 1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO: 2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO: 3), SYMISYAGM (SEQ ID NO: 4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO: 5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO: 6), (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (c), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) одного або більше пептидів, що мають амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO: 7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO: 8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO: 9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10), YMISYAGMV (SEQ ID NO: 11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO: 12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO: 13); (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин; (іі) одного або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. [2]. Спосіб за [1], де суб'єкт є HLA-A24-позитивним або HLA-A02-позитивним. [3]. Спосіб за [1], де рак - це рак підшлункової залози. [4]. Набір для лікування раку у суб'єкта, який містить фармацевтичні композиції, які включають (і) та (іі) як активний інгредієнт, відповідно, та фармацевтично прийнятний носій, а саме (і) один або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з (a)-(h) за [1]-(i); та (іі) один або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. [5]. Набір за [4], де згаданий суб'єкт є HLA-A24-позитивним або HLA-A02-позитивним. [6]. Набір за [4], де рак - це рак підшлункової залози. [7]. Протираковий засіб для лікування раку у суб'єкта, який включає (і) у комбінації з (іі), а саме (і) один або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з (a)-(h) за [1]-(i); та (іі) один або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. [8]. Протираковий засіб за [7], де суб'єкт є HLA-A24-позитивним або HLA-A02-позитивним. [9]. Протираковий засіб за [7], де рак - це рак підшлункової залози. [10]. Застосування комбінації (i) та (ii) під час лікування раку у суб'єкта, а саме (і) одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з (a)-(h) за [1]-(i); та (іі) одного або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. [11]. Застосування за [10], де суб'єкт є HLA-A24-позитивним або HLA-A02-позитивним. [12]. Застосування за [10], де рак - це рак підшлункової залози. [13]. Застосування одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з (a)-(h) за [1]-(i) для виготовлення фармацевтичної композиції, яка підвищує терапевтичний ефект гемцитабіну. [14]. Застосування за [13], де терапевтичний ефект, який слід підвищити, - це терапевтичний ефект гемцитабіну під час лікування раку у суб'єкта, де суб'єкт є HLA-A24-позитивним або HLAA02-позитивним. [15]. Застосування за [14], де рак - це рак підшлункової залози. Фахівці у галузі зрозуміють, що один або більше аспектів цього винаходу можуть відповідати певним цілям, проте один або більше інших аспектів можуть відповідати іншим цілям. Кожна ціль може не застосовувати у рівній мірі, в усіх її відношеннях, кожен аспект цього винаходу. Також, цілі, що передують, можна розглядати з точки зору, що є альтернативною відносно будьякого аспекту цього винаходу. Ці та інші цілі та ознаки винаходу будуть більш зрозумілими, якщо прочитати наступний докладний опис у зв'язку з фігурами та прикладами, що його супроводжують. Проте, слід розуміти, що як суть винаходу, яка передує, так і наступний докладний опис складають переважний варіант здійснення та не є обмежувальними для винаходу або інших альтернативних варіантів здійснення винаходу. 2 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стислий опис ілюстративного матеріалу Різні аспекти та варіанти застосування цього винаходу стануть зрозумілими фахівцю після врахування стислого опису фігур та докладного опису цього винаходу та його переважних варіантів здійснення, що є наступними. Фіг. 1. Фігура 1 презентує протокол введення антигенного пептиду та хіміотерапевтичного засобу, які використовуються у представлених прикладах. Фіг. 2. Фігура 2 презентує результати проточного цитометричного аналізу початкових (naive) Т-клітин, Т-клітин пам'яті та ефекторних Т-клітин серед CD8-позитивних Т-клітин, де функціональні фракції лімфоцитів визначили шляхом забарвлення перфорином. Фіг. 3. Фігура 3 презентує кількісну зміну регуляторних Т-клітин (наприклад, CD25-високих та Foxp3-позитивних клітин серед CD4-позитивних Т-клітин) до та після введення вакцини, що вимірювали шляхом проточного цитометричного аналізу після забарвлення 4 кольорами. Фіг. 4. Фігура 4 презентує результати сканування шляхом позитронно-емісійної томографії (РЕT) у Випадку 3, зокрема лімфаденопатії поруч з місцем інокуляції після вакцинації. Фіг. 5. Фігура 5 презентує зміни у часі концентрації пухлинних маркерів у Випадку 3. Фіг. 6. Фігура 6 презентує рівні специфічної реакції CTL, яка виникала у Випадку 3 до та після вакцинації. Фіг. 7. Фігура 7 презентує ряд комп'ютерно-томографічних (CT) зображень у Випадку 4, що показують відновлювальний ефект лікування на первинному осередку раку підшлункової залози. Фіг. 8. Фігура 8 презентує ряд комп'ютерно-томографічних (CT) зображень у Випадку 4, що показують ефект зменшення пухлини на метастатичному осередку 1 у печінці при раку підшлункової залози. Фіг. 9. Фігура 9 презентує ряд комп'ютерно-томографічних (CT) зображень у Випадку 4, що показують ефект зменшення пухлини на метастатичному осередку 2 у печінці при раку підшлункової залози. Фіг. 10. Фігура 10 презентує зміни у пухлинних маркерах, СЕА та СА19-9, що мали місце у Випадку 4 протягом курсу лікування. Фіг. 11. Фігура 11 презентує специфічну реакцію CTL, яка виникала у Випадку 4 до та після вакцинації. Фіг. 12. Фігура 12 презентує ряд комп'ютерно-томографічних (CT) зображень у Випадку 6, що показують ефект зменшення пухлини на первинному осередку раку підшлункової залози. Фіг. 13. Фігура 13 презентує ряд сканованих зображень, зроблених шляхом позитронноемісійної томографії (РЕT) у Випадку 6, що показують ефект зменшення пухлини на первинному осередку раку підшлункової залози. Фіг. 14. Фігура 14 презентує специфічну реакцію CTL, яка виникала у Випадку 6 до і після вакцинації. Фіг. 15. Фігура 15 презентує ряд комп'ютерно-томографічних (CT) зображень у Випадку 7, що показують зміни у первинному осередку раку підшлункової залози. Фіг. 16. Фігура 16 презентує зміни у пухлинному маркері СА125, що виникали у Випадку 7 протягом курсу лікування. Фіг. 17. Фігура 17 презентує специфічну реакцію CTL, яка виникала у Випадку 7 до і після вакцинації. Фіг. 18. Фігура 18 презентує ряд комп'ютерно-томографічних (CT) зображень у Випадку 10, що показують зміни у первинному осередку раку підшлункової залози. Фіг. 19. Фігура 19 презентує зміни у пухлинному маркері СА125, що виникали у Випадку 10 протягом курсу лікування. Докладний опис винаходу Незважаючи на те, що способи та матеріали, подібні або еквівалентні способам або матеріалам, описаним у цьому описі, можна застосовувати на практиці або під час тестування варіантів здійснення цього винаходу, далі буде описано переважні способи та матеріали. Проте, слід розуміти, що цей винахід не обмежується певними молекулами, композиціями, методологіями або протоколами, описаними у цьому описі, оскільки вони можуть варіюватися залежно від повсякденних експериментів та оптимізації. Слід також розуміти, що термінологія, яка застосовується у цьому описі, призначена тільки описувати певні версії або варіанти здійснення, проте вона не призначена обмежувати обсяг цього винаходу, який буде обмежено тільки формулою винаходу, що додається. Якщо інше не визначено, усі технічні та наукові терміни, що застосовуються у цьому описі, мають такі ж значення, які зазвичай розуміє будь-який звичайний фахівець у галузі, до якої належить цей винахід. Проте, у випадку конфлікту, цей опис винаходу, включаючи визначення, 3 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буде це контролювати. Отже, у контексті цього винаходу застосовуються наступні визначення. Визначення Слова "будь-який один" (а, an) та "цей" (the), як застосовуються у цьому описі, означають "принаймні один", якщо інше особливо не вказано. У контексті цього винаходу термін "декілька", як застосовується до амінокислотного додавання, стирання та/або заміщення, означає 3-7, переважно 3-5, більш переважно 3-4, навіть більш переважно 3 амінокислотні залишки. Як застосовується у цьому описі, термін "організм" означає будь-який живий об'єкт, що складається з принаймні однієї клітини. Живий організм може бути настільки простим як, наприклад, єдина еукаріотна клітина, або настільки складним, як ссавець, включаючи людину. Як застосовується у цьому описі, термін "біологічний зразок" означає увесь організм або підгрупу його тканин, клітин або складових частин (наприклад, рідини тіла, які включають, проте не обмежуються тільки ними, кров, слиз, лімфатичну рідину, синовіальну рідину, цереброспінальну рідину, слину, амніотичну рідину, амніотичну кров спинного мозку, сечу, вагінальну рідину та сперму). Термін "біологічний зразок" далі означає гомогенат, лізат, екстракт, клітинну культуру або тканинну культуру, отримані з суцільного організму або підгрупи його клітин, тканин або складових частин або його фракцій та частин. Нарешті, "біологічний зразок" означає середовище, таке як поживний бульйон або гель, у якому організм розмножувався та який містить клітинні компоненти, такі як білки або полінуклеотиди. Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок" застосовуються у цьому описі як взаємозамінні терміни, що означають полімер з амінокислотних залишків. Ці терміни застосовуються до амінокислотних полімерів, у яких один або більше амінокислотних залишків є модифікованими залишками або залишками, що виникають неприродно, такими як штучний хімічний міметик відповідної природно виникаючої амінокислоти, а також до природно виникаючих амінокислотних полімерів. Терміни "полінуклеотиди", "олігонуклеотиди", "нуклеотиди", "нуклеїнові кислоти" та "молекули нуклеїнової кислоти" застосовуються у цьому описі як взаємозамінні терміни, що означають полімер із залишків нуклеїнової кислоти та, якщо інше особливо не вказано, є подібними до амінокислот, що позначаються їхніми зазвичай прийнятими однолітерними кодами. Подібно до амінокислот вони охоплюють як природно виникаючі, так і неприродно виникаючі полімери нуклеїнових кислот. Термін "хіміотерапевтичний засіб", як застосовується у цьому описі, означає хімічну сполуку, що є корисною під час лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають, проте не обмежуються тільки ними, наступні засоби та їх фармацевтично прийнятні солі, кислоти та похідні: алкілувальні засоби, такі як тіотепа та циклосфосфамід; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан та піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа та уредопа; етиленіміни та метиламеламіни, що включають альтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфаорамід та триметилоломеламін; азотні гірчиці, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, мехлоретаміну оксиду хлоргідрат, мелфалан, новембієхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урацилова гірчиця; нітросечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі як аклациномізини, актиноміцин, автраміцин, азасерин, блеоміцини, кактіноміцин, каліхеаміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоініцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлеуцин, доксорубіцин, епірубіцин, езорубіцин, ідамбіцин, марцеломіцин, мітоміцини, мікофенолова кислота, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, пофіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат та 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дідезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин, 5-FU; андрогени, такі як калустерон, дромостанолону пропіонат, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; анти-надниркові гормони, такі як аміноглутетимід, мітотан, трилостан; репленішер фолієвої кислоти, такий як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфаміду глікозид; амінолевулінова кислота; амзакрин; бестрабуцил; бізантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елфорнітин; еліптинію ацетат; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентінан; лонідамін; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; подофілінова кислота; 2-етилгідразид; прокарбазин; PSK&комат; разоксан; сизофран; спірогерманій; тенуазонова кислота; триазиквон; 2, 2', 2"трихлортриетиламін; уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; 4 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ara-C"); циклофосфамід; тіотепа; таксоїди, наприклад, паклітаксел (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) та доксетаксел (TAXOTEW, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабін; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин та карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоміцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін; навелбін; новантрон; теніпозид; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; СРТ-11; топоізомерази інгібітор RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноєва кислота; еспераміцин та капецитабін. Також включено до цього визначення антигормональні засоби, які діють для регулювання або інгібування дії гормонів на пухлини, такі як анти-естрогени, які включають, наприклад, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-імідазоли, що інгібують ароматазу, 4 гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, онапристон та тореміфен (Фарестон); та анти-андрогени, такі як флутамід, нілутамід; бікалутамід, леупролід та гозерелін; та їх фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого засобу, згаданого вище. Антигенні пептиди Як зазначається вище, цей винахід стосується засобів, які підсилюють або покращують терапевтичний ефект хіміотерапії, більш конкретно, антигенних пептидів, що націлені на VEGFR2, індукують цитотоксичні Т-клітини проти клітин, що експресують VEGFR2, та згодом підвищують або покращують терапевтичний ефект хіміотерапевтичних засобів, таких як гемцитабін. Антигенні пептиди, що мають суб-послідовності VEGFR2, можна застосовувати для способу, набору або композиції цього винаходу. Антигенні пептиди, що є придатними для застосування у контексті цього винаходу, переважно мають амінокислотну послідовність, вибрану з послідовностей, наведених нижче. VYSSEEAEL (SEQ ID NO: 2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO: 3), SYMISYAGM (SEQ ID NO: 4), RFVPDGNRI (SEQ ID NO: 1), KWEFPRDRL (SEQ ID NO: 5) або DFLTLEHLI (SEQ ID NO: 6). Відомо, що мутовані або модифіковані пептиди, пептиди, що мають амінокислотні послідовності, модифіковані шляхом стирання, додавання та/або заміщення одного або більше амінокислотних залишків певної амінокислотної послідовності, зберігають первинну біологічну активність (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413). Отже, цей винахід передбачає варіанти та модифікації вищевказаних послідовностей. Зокрема, антигенні пептиди, у яких одна, дві або декілька амінокислот заміщені або додані до однієї з амінокислотних послідовностей, згаданих вище, також знаходять застосування у контексті цього винаходу, за умовою, що отримані модифіковані пептиди зберігають необхідну спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини. Такі модифіковані пептиди, що мають активність індукувати CTL, а також амінокислотні послідовності, які згадано вище, у яких одна, дві або декілька амінокислот заміщені або додані, передбачаються у цьому описі, за умовою, що вони не відповідають амінокислотній послідовності іншого білка. Отже, в одному переважному варіанті здійснення друга амінокислота від N-закінчення переважно заміщена фенілаланіном, тирозином, метіоніном або триптофаном, або С-кінцева амінокислота переважно заміщена фенілаланіном, лейцином, ізолейцином, триптофаном або метіоніном; або одна або дві амінокислоти додані до N-закінчення та/або С-закінчення. Альтернативно, нонапептиди та декапептиди, що вибрані з пептидів, які мають амінокислотну послідовність, наведену нижче, є також переважними як пептид, що має високу активність індукувати CTL. AMFFWLLLV (SEQ ID NO: 7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO: 8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO: 9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10), YMISYAGMV (SEQ ID NO: 11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO: 12) або VLAMFFWLL (SEQ ID NO: 13). У контексті цього винаходу можна також застосовувати пептиди зі спроможністю індукувати цитотоксичні Т-клітини, де одна, дві або декілька амінокислот заміщені або додані до однієї з амінокислотних послідовностей, як згадано вище. Пептиди, що мають амінокислотні 5 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, які складаються з 9 або 10 амінокислот, як згадано вище, у яких одна, дві або декілька амінокислот заміщені або додані, можуть мати спроможність індукувати CTL, доки вони не відповідають амінокислотній послідовності іншого білка. Зокрема, наприклад, друга амінокислота від N-закінчення переважно заміщена лейцином або метіоніном, або С-кінцева амінокислота переважно заміщена валіном або лейцином; або одна або дві амінокислоти додані до N-закінчення та/або С-закінчення. Приклад такого модифікованого пептиду - це пептид VIAMFFWLL (SEQ ID NO: 8), у якому друга амінокислота від N-закінчення заміщена лейцином (VLAMFFWLL (SEQ ID NO: 13)); проте, цей винахід не обмежується цим прикладом. Клони CTL, отримані внаслідок стимуляції цими модифікованими пептидами, можуть розпізнавати оригінальні пептиди та спричиняють руйнування. Приклади передбачених вставок амінокислотних послідовностей включають аміно- та/або карбоксил-кінцеві злиття, які різняться у довжині від одного до декількох залишків, а також вставки внутрішніх послідовностей одного або численних амінокислотних залишків. Приклади кінцевих вставок включають N-кінцевий залишок метіоніну або антитіло, злите з цитотоксичним поліпептидом. Пептиди, що застосовуються для цього винаходу, можуть також містити модифікації, такі як глікозилування, окиснення бічного ланцюга або фосфорилування, доки модифікації не руйнують біологічну активність пептидів, як описано у цьому описі. Інші модифікації включають злиття ферменту або поліпептиду, що подовжує період напіврозпаду антитіла у сироватці, з N- або С-закінченням пептиду. Приклади останніх включають Dамінокислоти або інші амінокислотні міметики. У контексті амінокислотних вставок, де один або більше амінокислотних залишків додаються до пептиду цього винаходу, цей винахід також передбачає злиті білки. Злиті білки зазвичай складаються з поліпептиду або білка, що представляє інтерес, при цьому застосування поліпептиду або білка є відомим. Злиті білки може отримати фахівець у галузі за добре відомими способами, такими як зшивання ДНК, що кодує пептид цього винаходу, з ДНК, що кодує інші пептиди або білки, так що рамки є відповідними, вставка злитої ДНК у вектор експресії та експресування його у хазяїні. Не існує обмежень щодо пептидів або білків, злитих з білком цього винаходу. Однак, приклади відомих пептидів, які можна застосовувати у контексті злитих білків, включають, проте не обмежуються тільки ними, FLAG (Hopp, T. P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6хHis, що містить шість залишків His (гістидину), 10хHis, аглютинін грипу (НА), фрагмент c-myc людини, фрагмент VSP-GP, фрагмент p18HIV, Т7-мітку, HSV-мітку, Е-мітку, фрагмент антигену SV40T, lck-мітку, фрагмент альфа-тубуліну, В-мітку, фрагмент С-білка та їм подібне. Приклади білків, які можна злити з білком цього винаходу, включають GST (глютатіон-S-трансферазу), аглютинін грипу (НА), константну ділянку імуноглобуліну, бета-галактозидазу, МВР (мальтоза-зв'язувальний білок) тощо. У контексті амінокислотних заміщень амінокислотний залишок, який слід замістити, переважно мутується у відмінну амінокислоту, у якій властивості амінокислотного бічного ланцюга зберігаються (процес, відомий як консервативне амінокислотне заміщення). Приклади властивостей амінокислотних бічних ланцюгів - це гідрофобні амінокислоти (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гідрофільні амінокислоти (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) та бічні ланцюги, що разом мають наступні функціональні групи або характеристики: аліфатичний бічний ланцюг (G, A, V, L, I, P); бічний ланцюг, що містить гідроксильну групу (S, T, Y); бічний ланцюг, що містить атом сірки (С, М); бічний ланцюг, що містить карбонову кислоту та амід (D, N, E, Q); бічний ланцюг, що містить основу (R, K, H); та бічний ланцюг, що містить ароматичну групу (H, F, Y, W). Слід відзначити, що великі літери вказують на однолітерні коди амінокислот. Антигенні пептиди цього винаходу можна отримати, застосовуючи добре відомі способи. Наприклад, пептиди можна отримати за способами синтезу, застосовуючи або метод рекомбінантних ДНК, або хімічний синтез. Пептиди можна синтезувати окремо або у вигляді більш довгих поліпептидів, що складаються з двох або більше пептидів. Ці пептиди є переважно виділеними, тобто суттєво вільними від інших природно виникаючих білків клітини-хазяїна та їх фрагментів. Антигенні пептиди цього винаходу можуть бути у вигляді коктейлю, або їх можна кон'югувати один з одним, застосовуючи стандартні способи. Наприклад, пептиди можна експресувати як єдину поліпептиду послідовність. Пептиди у комбінації можуть бути однаковими або відмінними. Внаслідок введення пептидів цього винаходу пептиди є презентованими з високим ступенем щільності на HLA-антигенах антиген-презентуючих клітин, які, у свою чергу, індукують CTL, які специфічно реагують на комплекс, утворений між презентованим пептидом та HLA-антигеном. Альтернативно, антиген-презентуючі клітини, які імобілізували пептиди цього винаходу на своїй клітинній поверхні та які отримали шляхом видалення дендритних клітин з суб'єкта, можна 6 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стимулювати пептидами цього винаходу. Внаслідок зворотного введення цих клітин відповідним суб'єктам індукуються CTL, та, як наслідок, можна підвищити агресивність до клітин-мішеней. Фармацевтичні композиції та способи їх застосування Цим винаходом пропонуються ліки для лікування та/або профілактики раку підшлункової залози, які застосовуються у комбінації з хіміотерапевтичним засобом, таким як гемцитабін. Пептиди, що застосовуються для цього винаходу, знаходять особливе застосування при лікуванні раку підшлункової залози. Стимуляцію in vivo та in vitro дендритних клітин антигенними пептидами цього винаходу можна легко виконувати шляхом піддавання клітин дії пептидів у високій концентрації, що примушує ці пептиди заміщувати пептиди, первинно імобілізовані на цих клітинах. Отже, для того, щоб бути корисними у контексті цього винаходу, антигенні пептиди мусять мати принаймні певний рівень афінітету зв'язування з HLA-антигенами. Фармацевтичні препарати, що містять такі пептиди, можна вводити безпосередньо у вигляді самих пептидів або їх можна вводити як фармацевтичні композиції, які були вироблені за звичайними для отримання фармацевтичних композиції способами. У таких випадках фармацевтичні препарати можуть відповідним чином, без особливих обмежень, включати, окрім пептидів, носії, наповнювачі тощо, які зазвичай використовуються для отримання фармацевтичних препаратів. Ці фармацевтичні препарати можна застосовувати для лікування та профілактики раку підшлункової залози у комбінації з гемцитабіном. Фармацевтичні препарати для лікування та/або профілактики раку підшлункової залози, які включають антигенний пептид цього винаходу як активний інгредієнт, можна вводити з ад'ювантами, які ефективно індукують клітинний імунітет; можна вводити з іншими активними інгредієнтами, такими як протипухлинні засоби; можна вводити у формі гранул. Придатні ад'юванти описано у літературі (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994). Крім того, фармацевтичні препарати цього винаходу можна вводити як ліпосомні фармацевтичні склади, як сипучі фармацевтичні склади, зв'язані з гранулами, діаметр яких становить декілька мікрометрів, та як фармацевтичні склади, з якими зв'язані ліпіди. Введення можна здійснювати за різними способами, наприклад, перорально, внутрішньошкірно або підшкірно або шляхом внутрішньовенної ін'єкції тощо. Можна застосовувати системне введення або місцеве введення поблизу пухлини-мішені або безпосередньо у пухлину-мішень. Дози пептидів цього винаходу можна відповідним чином пристосувати залежно від хвороби, яку слід лікувати, віку та ваги пацієнтів, способів введення тощо. Зазвичай, 0,001 мг - 1000 мг, переважно 0,001 мг - 1000 мг, більш переважно 0,1 мг - 10 мг пептидів переважно вводять один раз у від декілька днів до декількох місяців. Більш докладно, з метою підсилення терапевтичного ефекту гемцитабіну у переважному варіанті здійснення від 0,5 мг до 2,0 мг пептидів можна вводити один раз у від декілька днів до декількох місяців, більш переважно один раз на тиждень (7 днів) у комбінації з гемцитабіном. Фахівець у галузі може відповідним чином вибрати придатні дози. Альтернативно, у контексті цього винаходу, внутрішньоклітинні везикули, які представляють комплекси, утворені між пептидами цього винаходу та HLA-антигенами на їхній поверхні, можна застосовувати для здійснення мети цього винаходу. Ці внутрішньоклітинні везикули називаються екзосомами. Екзосоми можна приготувати, наприклад, згідно зі способами, докладно описаними в опублікованому японському перекладі міжнародної публікації № Hei 11510507 та 2000-512161. Екзосоми можна переважно отримати, застосовуючи антигенпрезентуючі клітини, отримані від суб'єктів, на яких слід спрямувати лікування або профілактику. Екзосоми цього винаходу можна інокулювати як протиракові вакцини так само, як пептиди цього винаходу. Тип HLA-антигенів, які слід застосовувати, мусить збігатися з типом суб'єкта, якому потрібне лікування та/або профілактика. Наприклад, для японської національності часто відповідними є HLA-A24 або HLA-A02, зокрема HLA-A2402 або HLA-0201. Подібно до цього, у контексті цього винаходу, виділені цитотоксичні Т-клітини, що індукуються цими пептидами, можна також застосовувати для здійснення мети цього винаходу. Цитотоксичні Т-клітини, які були індуковані шляхом стимуляції антиген-презентуючими клітинами, які презентують пептиди цього винаходу, переважно походять від суб'єктів, які мусять бути ціллю терапії та/або профілактики. Ці цитотоксичні Т-клітини можна вводити окремо або, для отримання протипухлинного ефекту, у комбінації з іншими ліками, включаючи пептиди, екзосоми та їм подібне цього винаходу. Отримані цитотоксичні Т-клітини діють специфічно проти клітин-мішеней, що презентують пептиди цього винаходу або переважно проти клітинмішеней, що презентують такі ж самі пептиди, які застосовувалися для індукції. Клітини-мішені можуть бути клітинами, які ендогенно експресують KDR, або клітинами, примушеними 7 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресувати KDR. Крім того, мішенями можуть також бути клітини, які презентують пептиди цього винаходу на своїй клітинній поверхні внаслідок стимуляції цими пептидами. У контексті цього винаходу антиген-презентуючі клітини, які презентують комплекси, утворені між HLA-антигенами та цими пептидами, можна також застосовувати для здійснення мети цього винаходу. Антиген-презентуючі клітини, отримані внаслідок контактування з цими пептидами або з нуклеотидами, що кодують ці пептиди, переважно походять від суб'єктів, які мусять бути ціллю лікування та/або профілактики. Антиген-презентуючі клітини можна вводити окремо як вакцини або у комбінації з іншими ліками, такими як пептиди цього винаходу, екзосоми та цитотоксичні Т-клітини. У контексті цього винаходу пептиди переважно вводять у комбінації з гемцитабіном. Гемцитабін - це загальна назва сполуки 2’-дезокси-2",2’-дифторцитидину моногідрохлориду (bізомер). Фармацевтична композиція, що складена з використанням хлоргідратної солі гемцитабіну (гемцитабін HCl), є зазвичай комерційно доступною під назвою Гемзар (Gemzar) (торгівельна назва). У контексті цього винаходу принаймні одне з наступного: гемцитабін, фармацевтично прийнятну сіль гемцитабіну або його проліки можна вводити у комбінації з вищезгаданими пептидами. Отже, якщо інше не стверджується, посилання у цьому описі на гемцитабін включають його сіль або його проліки. Гемцитабін - це хіміотерапевтичний засіб, який вже знаходиться у клінічному застосуванні як терапевтичний засіб для лікування декількох видів раку, включаючи і рак підшлункової залози. Стандартний терапевтичний протокол введення гемцитабіну дорослому пацієнту для лікування 2 раку підшлункової залози передбачає введення 1000 мг/м гемцитабіну один раз на тиждень протягом 7 тижнів. Гемцитабін зазвичай вводять шляхом внутрішньовенної інфузії. При лікуванні раку підшлункової залози розклад зазвичай є наступним: три тижні введення з наступним одним тижнем без введення, встановлено як один цикл, та лікування триває та повторюється за необхідністю. Під час цього періоду дозу гемцитабіну можна регулювати, застосовуючи як індикатор гематологічну токсичність або їй подібне. У цьому винаході пептиди вводять узгоджено з розкладом введення гемцитабіну. Антигенні пептиди цього винаходу можна вводити на будь-якому етапі під час періоду введення гемцитабіну. Альтернативно, доки CTL, які індукуються антигенними пептидами цього винаходу, зберігають свою активність in vivo, такі пептиди можна вводити до початку введення гемцитабіну. Взагалі, доречно вводити їх за таким самим розкладом, що і гемцитабін, тим самим зводячи до мінімуму часові затрати пацієнта. Як визначено у цьому описі, введення пептидів, що походять від VEGFR2, які мають амінокислотні послідовності, такі як RFVPDGNRI (SEQ ID NO: 1), може підвищити терапевтичний ефект гемцитабіну. Амінокислотні послідовності прикладів пептидів, які походять від VEGFR2, які можна застосовувати у контексті цього винаходу, знов наведено нижче. У контексті цього винаходу модифіковані або мутовані варіанти цих амінокислотних послідовностей можна також застосовувати у цьому винаході, доки вони зберігають бажану спроможність індукувати CTL: VYSSEEAEL (SEQ ID NO: 2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO: 3), SYMISYAGM (SEQ ID NO: 4), RFVPDGNRI (SEQ ID NO: 1), KWEFPRDRL (SEQ ID NO: 5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO: 6), AMFFWLLLV (SEQ ID NO: 7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO: 8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO: 9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10), YMISYAGMV (SEQ ID NO: 11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO: 12) або VLAMFFWLL (SEQ ID NO: 13). Отже, цим винаходом пропонуються засоби, які підсилюють терапевтичний ефект гемцитабіну проти раку підшлункової залози, при цьому такі засоби включають вищеописані пептиди, що походять від VEGFR2, як активний інгредієнт. Альтернативно, цим винаходом пропонується застосування пептидів, що походять від VEGFR2, для виробництва фармацевтичних композицій, які підсилюють терапевтичний ефект гемцитабіну проти раку підшлункової залози. Крім того, цим винаходом пропонується комбіноване застосування (комбінацію) пептидів, що походять від VEGFR2, під час лікування раку підшлункової залози із застосуванням гемцитабіну. 8 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Згідно з цим винаходом пептиди, що походять від VEGFR2, можна застосовувати у комбінації з гемцитабіном для лікування раку підшлункової залози. Більш докладно, цим винаходом пропонується набір для лікування раку підшлункової залози, який складається з фармацевтичної композиції, що містить як активні інгредієнти фармацевтично прийнятний носій, вищезгадані пептиди, що походять від VEGFR2, та гемцитабін. Крім того, цим винаходом пропонуються протиракові засоби для лікування раку підшлункової залози, які включають комбінацію вищезгаданих пептидів, що походять від VEGFR2, та гемцитабіну. Альтернативно, цим винаходом пропонується набір для лікування раку підшлункової залози, який включає вищезгадані пептиди, що походять від VEGFR2, та інструкцію, у якій вказується, що терапевтичний ефект гемцитабіну підсилюється, коли пептиди вводять у комбінації з гемцитабіном пацієнтам з раком підшлункової залози. В іншому варіанті здійснення цим винаходом пропонується застосування комбінації пептидів, що походять від VEGFR2, та одного або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків, для виробництва фармацевтичної композиції для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози. Альтернативно, в іншому варіанті здійснення цим винаходом пропонується застосування пептидів, що походять від VEGFR2, для виробництва фармацевтичної композиції для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози, де фармацевтична композиція застосовується у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. В іншому варіанті здійснення цим винаходом далі пропонується застосування пептидів, що походять від VEGFR2, для виробництва фармацевтичної композиції для підвищення терапевтичного ефекту одного або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків, для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози. Альтернативно, цим винаходом далі пропонується спосіб або процес виробництва фармацевтичної композиції для підвищення терапевтичного ефекту одного або більше хіміотерапевтичних засобів, які вибрані з групи, що складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків, для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози, де спосіб або процес включає етап змішування фармацевтичного складу фармацевтично або фізіологічно прийнятного носія з пептидами, що походять від VEGFR2, як активними інгредієнтами. В іншому варіанті здійснення цим винаходом далі пропонується спосіб або процес виробництва фармацевтичної композиції для підвищення терапевтичного ефекту одного або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних з групи, що складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків, для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози, де спосіб або процес включає етап змішування пептидів, що походять від VEGFR2, з фармацевтично або фізіологічно прийнятним носієм. В іншому варіанті здійснення цим винаходом також пропонується спосіб або процес виробництва набору для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози, де спосіб або процес включає етап поєднання або пакування фармацевтичної композиції, яка включає пептиди, що походять від VEGFR2, та фармацевтично або фізіологічно прийнятний носій, разом з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. Альтернативно, в іншому варіанті здійснення цим винаходом також пропонується застосування комбінації пептидів, що походять від VEGFR2, та одного або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків, для виробництва набору для лікування раку, включаючи рак підшлункової залози. У вищезгаданих варіантах здійснення цього винаходу суб'єкт, у якого слід лікувати рак, може бути HLA-A24-позитивним або HLA-A02-позитивним. Рак, який слід лікувати, включає рак підшлункової залози. Приклади У цьому описі цей винахід докладно описано з посиланням на приклади, конкретніше - на клінічні випробування, у яких здійснювався аналіз застосування епітопного пептиду, який націлений на нові кровоносні судини пухлини, у комбінації з гемцитабіном для лікування рецидиву раку підшлункової залози на розвинутій стадії, який не можна видалити хірургічним способом. Проте, матеріали, способи та їм подібне, описані у цьому описі, тільки ілюструють аспекти винаходу, та в жодному разі їх не можна розглядати як такі, що обмежують обсяг цього винаходу. Також, матеріали, способи тощо, які є подібними або еквівалентними до тих, які описано у цьому описі, можна застосовувати на практиці або для випробування цього винаходу. 60 9 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Введення У цьому описі описано клінічне випробування новітнього вакцинного хіміотерапевтичного способу для лікування рецидиву раку підшлункової залози на розвинутій стадії, який не можна лікувати хірургічним способом, при якому епітопні пептиди, що походять від рецептора 2 судинного ендотеліального фактору росту (VEGFR2/KDR), змішують з неповним ад'ювантом Фрейнда (IFA), потім вводять пацієнтам підшкірно. Очікують, що пептидні вакцини продемонструють протипухлинні ефекти внаслідок інгібування утворення нових судин пухлини. Їх застосовують тут у комбінації з гемцитабіном, який є сучасним стандартним препаратом для хіміотерапії раку підшлункової залози. Це клінічне випробування призначено для визначення безпечності новітньої вакцинної хіміотерапії, метою якої є інгібування нових кров'яних судин пухлини та отримання протипухлинних ефектів внаслідок хіміотерапії, при цьому випробування проводиться шляхом нарощування дози епітопних пептидів, які вводяться контингенту з трьох пацієнтів. Друга мета - це визначення коефіцієнту реакції, тривалості виживаності та оцінка імунних реакцій. Хірургічна резекція - це необхідна терапія для лікування раку підшлункової залози; проте, раннє виявлення є складним, та у час діагностування приблизно 60 % пацієнтів знаходяться у ситуації, коли резекція є неможливою [Matsuno S et al. Int J Clin Oncol. 5:153-157, 2000, Pantalone D et al. 18:41-46, 2001.]. У наш час гемцитабін застосовується як стандартна терапія проти неоперабельного раку підшлунккової залози; проте, хоча середній період виживаності та коефіцієнт виживаності протягом 1 року покращилися порівняно з групами, яким вводили тільки 5-FU, вони становлять 5,7 місяця та 18 %, відповідно, та в жодному разі їх не можна вважати задовільними. Крім того, коефіцієнт реагування становить від 5,4 % до 14,3 %, що не є високим [Burris HA et al. J.Clin Oncol. 15: 2403-2413, 1997, Casper ES et al. 12:29-34, 1994, Carmichael J et al. Br J Cancer.;73:101-105, 1996, Rothenberg ML et al. Ann Oncol. 7: 347-53, 1996.], та існує необхідність дослідити новітні терапевтичні способи, які можуть покращити коефіцієнт реагування та період виживаності внаслідок застосування у комбінації з гемцитабіном. З іншого боку, за останні роки відкрили механізм, завдяки якому Т-клітини розпізнають антигени, та окрім цього, було відкрито білки, що розпізнаються CTL, як пухлинні антигени, та було розпочато дослідження терапевтичних способів, в яких застосовуються пухлинні антигени або антигенні гени. Імунотерапію, що застосовує цей ідентифікований антигенний пептид пригнічення пухлини, було швидко впроваджено для лікування злоякісної меланоми, та про досягнення цієї терапії повідомлялося з 1998 року здебільшого Rosenberg et al. [Celis E. et al. Cancer Biology 6:329-336, 1995, Marchard M, et al. Int. J. Cancer 63:883-885, 1995.]. Після цього було здійснено комбіноване застосування з IL-2 або GM-CSF, розробку протоколів для введення ряду антигенних пептидів пригнічення пухлини, розробку модифікованих пептидів та клінічні випробування імпульсно мічених пептидом дендритних клітин, та протипухлинна імунотерапія, що застосовує антигенні пептиди пригнічення пухлини, пригортає увагу навіть на сьогодні як терапевтичний спосіб, який служить доповненням до традиційних терапевтичних способів, таких як хірургічна операція та хіміотерапія. Були відкриті пухлинні антигени, що розпізнаються та атакуються цитотоксичними Тклітинами (CTL), а потім один за одним ідентифікували специфічні для пухлин антигени, та зараз тривають клінічні випробування протиракової вакцинної терапії, яка застосовує епітопні пептиди, яка є специфічною імунотерапією, що націлена на ці антигени. Проте, виникли також нові проблеми. Навіть якщо можна індукувати сильні CTL, зменшення або втрата експресії молекул МНС у пухлинних клітинах, відсутність молекул-мішеней у пухлинних клітинах тощо можуть стати причиною втрати протипухлинних ефектів CTL. Крім того, пухлинні антигенні пептиди, які ідентифіковано на сьогодні, є присутніми у певних типах пухлин, проте вони не охоплюють усі пухлини. Отже, щоб подолати ці проблеми, клітини-мішені CTL при вакцинній терапії було спрямовано на ендотеліальні клітини нових пухлинних судин замість самих пухлинних клітин, та було розроблено вакцинну терапію, що націлена на молекули, які походять з нових кров'яних судин пухлини. Як молекула-мішень привернув увагу рецептор 2 судинного ендотеліального фактору росту (VEGFR2/KDR), який ледь експресується у здорових ендотеліальних клітинах, проте надзвичайно експресується у пухлинних клітинах нового судинного ендотелію, та який є рецептором фактору росту судинних ендотеліальних клітин, який є необхідним для росту цих клітин. Відомо, що VEGFR2 експресується у пухлинних тканинах багатьох твердих пухлин, таких як рак молочної залози, рак товстої кишки, рак нирки, злоякісна меланома та рак легенів [Folkman J. Nature Biotechnol. 15, 510, 1997, Folkman J. EXS 79, 1-8, 1997.]. Також виявили, що експресія VEGFR2 є сильно пов'язаною з проліферацією ракових клітин [Kranz A, et al. Int J Cancer 84: 293-298, 1999, Nakopoulou L, et al. Hum Pathol 33:863-870, 2002, Reden L, et al. Breast Cancer 10 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Res. and Treat. 82:147-154, 2003.]. З іншого боку, з точки зору того, чи може або не може VEGFR2 стати мішенню для імунотерапії, результати фундаментального дослідження вакцинації ДНК та білком VEGFR2 продемонстрували, що протипухлинні ефекти розпізнавалися завдяки пригніченню нових кров'яних судин пухлини, незважаючи на тип пухлини; отже, було підтверджено, що VEGFR2специфічні цитотоксичні Т-клітини відповідають за цей протипухлинний ефект. Згадане вище продемонструвало, що VEGFR2 може стати мішенню для протипухлинної імунотерапії [Yiwen, Li. et al. J. Exp. Med. 195, 1575-1584, 2002. Niethammer, A.G. et al. Nature Med. 8, 1369-1375, 2002.]. Крім того, завдяки нашому фундаментальному аналізу на людях було підтверджено присутність клонів CTL, які розпізнають та руйнують VEGFR2, та були ідентифіковані декілька типів HLA-A24 або A02-обмежених епітопних пептидів, спроможних індукувати сильні CTL. CTL, індуковані цими епітопними пептидами, руйнували культивовані ендотеліальні клітини пупкової вени людини (HUVEC), які ендогенно експресують VEGFR2 HLA-обмеженим чином. Крім того, завдяки дослідженню протипухлинних ефектів in vivo із застосуванням трансгенних мишей A2/Kb, які експресують HLA, сильні протипухлинні ефекти незалежно від типу раку було підтверджено завдяки протиракової вакцинної терапії із застосуванням епітопних пептидів, що походять від VEGFR2. Оскільки такі CTL можна також індукувати з периферійної крові ракових пацієнтів, застосовуючи пептиди, які застосовуються у цьому клінічному випробуванні, було визначено, що клітини-попередники CTL також існують у ракових пацієнтів [Wada S, Cancer Res. 65, 4939-4946, 2005.]. Згідно з вищевказаним, внаслідок введення цих пептидів та внаслідок індукування VEGFR2-специфічних CTL у пацієнтів, можна інгібувати утворення нових судин у пухлині та можна отримати сильні протипухлинні ефекти. Отже, було розроблено нову вакцинну хіміотерапію, при якій очікують, що пептидна вакцина буде демонструвати протипухлинні ефекти завдяки інгібуванню утворення нових пухлинних судин та яку застосовують у комбінації з гемцитабіном, який є сучасним стандартним хіміотерапевтичним препаратом проти раку підшлункової залози. RFVPDGNRI (SEQ ID NO: 1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO: 2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO: 3), SYMISYAGM (SEQ ID NO: 4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO: 5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO: 6), AMFFWLLLV (SEQ ID NO: 7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO: 8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO: 9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10), YMISYAGMV (SEQ ID NO: 11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO: 12) або VLAMFFWLL (SEQ ID NO: 13) [Wada S, Cancer Res. 65, 4939-4946, 2005., WO2004/024766], які походять від VEGFR2 та є HLAA24- або HLA-A02-обмеженими епітопними пептидами, застосовуються у вакцинному складі для комбінованого застосування. Суть пояснення полягає у наступному: 1. VEGFR2 - це важлива молекула, що залучається у зростання нових судинних ендотеліальних клітин пухлини, та цей пептид можна застосовувати для індукування специфічних CTL in vitro [Wada S, Cancer Res. 65, 4939-4946, 2005, WO2004/024766]; 2. Специфічні CTL можна індукувати in vitro також з мононуклеарів периферійної крові ракових пацієнтів, застосовуючи HLA-A24- або HLA-A02-обмежені епітопні пептиди, що походять від VEGFR2 [Wada S, Cancer Res. 65, 4939-4946, 2005.]; 3. Більшість японців є носіями HLA-A24 або HLA-A02 [Date Y, et al. Tissue Antigen, 47, 93101, 1996.]; 4. Вони є біохімічно стійкими та придатними для клінічних випробувань [Wada S, Cancer Res. 65, 4939-4946, 2005.]; 5. Гемцитабін вже ухвалено як хіміотерапевтичний засіб проти раку підшлункової залози; 6. Відомо, що гемцитабін підвищує імунокомпетентність, таку як спроможність індукувати CTL [Correale P, et al. J Immunol. 175, 820-828, 2005, Dauer M, et al. J Immunother. 28, 332-342, 2005.], та можна очікувати ефекти від його комбінованого застосування з вакцинними складами. Це клінічне випробування виконували, спираючись на вищезгадане пояснення. Матеріали та способи Суб'єкти Пацієнтів-суб'єктів вибирали за наступними критеріями відбору та критеріями виключення. Критерії відбору 1. Первинний рак підшлункової залози, радикальну резекцію для якого вважали неможливою внаслідок: віддаленого метастазу, такого як метастаз печінки, черевинний метастаз та кістковий метастаз, які виявлено за різними способами діагностики, такими як комп'ютерна томографія або ультразвукове дослідження; віддаленого метастазу лімфатичних вузлів, як визначено у "Класифікації карциноми підшлункової залози" (5-те видання) (Classification of Pancreatic Carcinoma, 5th Ed), виданій Японською спілкою з питань підшлункової залози (Japan Pancreas Society); або інфільтрації у великі судини (черевну аорту, 11 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 власне печінкову артерію, ліву та праву печінкові артерії, верхню мезентеріальну артерію та верхні мезентеріальні вени, які не можна відновити); рецидиву раку підшлункової залози. 2. У той час, коли присутність або відсутність уражень, які можна виміряти за допомогою RECIST, не є метою, оцінювання клінічних ефектів на пухлину повинно бути можливим. 3. Статус виконання ECOG становить від 0 до 2. 4. Вік 20 років або більше та 80 років або менше у час отримання згоди. 5. Очікуваний проноз тривалості життя мусить становити 3 місяці або більше в момент початку терапії гемцитабіном та вакциною. 6. Якщо пацієнту робилася будь-яка операція, пацієнт мусить відновитися від дії цієї операції. Альтернативно, чотири тижні або більше повинно минути після попередньої терапії. 7. Функції головних органів повинні бути збереженими: функція кісткового мозку (білі кров'яні 3 3 клітини нараховують 2000/мм або більше та 15000/мм або менше, та кількість тромбоцитів 3 становить 7,5/мм або більше); печінкова функція (GOT 150 МО/л або менше, GPT 150 МО/л або менше, а Т-bil 3,0 г/дл або менше); та ниркова функція (Cr 3,0 або менше). 8. Наявність придатного HLA. 9. Ніякої історії лікування із застосуванням гемцитабіну проти первинної хвороби. Критерії виключення 1. Вагітні жінки (жінки, спроможні завагітніти повинні застосовувати контрацептивні засоби після початку цього клінічного дослідження). 2. Жінки, що годують груддю (годування слід припинити після початку цього клінічного дослідження). 3. Пацієнти, що намагаються завагітніти (відповідні контрацептивні засоби слід застосовувати як чоловікам, так і жінкам протягом періоду випробування). 4. Пацієнти, що мають активну інфекцію, яку важко регулювати. 5. Пацієнти, яким під час випробування слід вводити наступні фармацевтичні засоби: системне введення надниркових стероїдних засобів або системне введення імуносупресивних засобів. 6. Пацієнти, що мають неконтрольований подвійний рак. 7. Пацієнти, що мають травматичні пошкодження, які іще не вилікувано. 8. Пацієнти з підозрою на парез кишечнику або інтерстиціальну пневмонію. 9. Пацієнти, які, з точки зору лікаря або головного лікаря, не відповідають умовам випробування. План лікування Вибір ракових пацієнтів-суб'єктів Пацієнтами-суб'єктами були ті пацієнти, які були носіями придатного HLA та які мали первинний рак підшлункової залози, радикальну резекцію якого вважали неможливою, або які мали рецидив раку підшлункової залози. Випадки, де внаслідок діагностики шляхом томографії існувала найбільша підозра раку підшлункової залози, також було включено до пацієнтівсуб'єктів. Спосіб дослідження експресії HLA Зовнішнє дослідження замовили SRL, Inc. (Токіо). Доза гемцитабіну 2 1000 мг/мм гемцитабіну (гемцитабіну HCl), яка є стандартною дозою для лікування та введення, ухваленою страховим покриттям, вводили протягом трьох тижнів з наступним одним тижнем без введення. Доза та спосіб введення пептидів та ад'юванту 0,5 мг, 1 мг та 2 мг синтезованого пептиду змішували з 0,5 мл, 1 мл та 2 мл неповного ад'юванту Фрейнда (MONTANIDE*ISA51VG, SEPPIC, Франція), відповідно, та вводили підшкірно у передпліччя або біля пахової ділянки пацієнтів. Розклад введення Розклад наведено на Фіг. 1. Один курс тривав 28 днів від початкового введення. Спосіб нарощування дози та контингент з трьох пацієнтів 2 Установили дозування та розклад введення гемцитабіну (1000 мг/м , введення протягом трьох тижнів та один тиждень без введення), та дозу введення вакцини нарощували щодо дози пептиду до 0,5 мг, 1 мг та 2 мг. Докладніше, 0,5 мг пептиду вводиться трьом пацієнтам. Якщо жоден пацієнт не демонструє безсумнівно пов'язану гематологічну токсичність Ступеню 4 (версія 3.0 NCI-CTC) або вище (виключно нудота/блювання) або гематологічну токсичність Ступеню 3 (версія 3.0) або вище, пептид на наступній дозі (1 мг) вводиться трьом пацієнтам. Якщо побічні ефекти виявляються у двох або більше окремих пацієнтів, це клінічне випробування припиняється. Якщо побічні ефекти виявляються в одного окремого пацієнта, іще 12 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 три пацієнти додатково реєструються на такій самій дозі, та якщо побічні ефекти виявляються в одному випадку з шести випадків, випробування переходить на наступну дозу. Якщо побічні ефекти спостерігаються у навіть одного окремого пацієнта на цій стадії, це клінічне випробування припиняється. Нарощування дози від 1 мг до 2 мг здійснювали таким самим чином. Контроль якості Щодо пептиду, який вводиться, пептиди ступеню сGMP (Neo-MPS, San Diego) отримали як подарунок від Human Genome Center, Institute of Medical Science, University of Tokyo (Центр геному людини, Інститут медичних наук, університет Токіо). Щодо ад'юванту, сумісний неповний ад'ювант Фрейнда ступеню GMP (MONTANIDE*ISA51VG) купили у SEPPIC Co., Франція. Зберігання пептидів та приготування пептидних вакцин здійснювали у Pharmaceutical Department of Wakayama Medical University Hospital (Фармацевтичному відділенні лікарні медичного університету Вакайама). Стосовно "Попереднього пробного введення" З метою запобігання несподіваним шкідливим подіям, таким як анафілактичний шок, 10 мг пептиду підшкірно вводять як попереднє пробне введення до початку першого введення вакцини на ділянці, відмінній від ділянки справжнього введення, та контроль здійснюється протягом 30 хвилин. Якщо місцева реакція Ступеню 3 або вище або системна шкідлива подія не спостерігається, виконують справжнє введення. Стосовно "попереднього пробного введення" в жодному випадку не спостерігали місцевої шкідливої реакції або системної шкідливої реакції. Результати Оцінка даних випробування Оцінка безпечності Оцінка безпечності була спрямована на пацієнтів, які отримали принаймні одне введення гемцитабіну та пептидів. Присутність та ступінь шкідливих реакцій визначили, посилаючись на версію 3 загальних критеріїв токсичності Національного інституту раку (NCI-CTC) (видання JCOG японського перекладу). Імунологічна оцінка Перед введенням вакцини 50 мл периферійної крові брали після завершення кожного курсу (на 28 день після початкового введення) та відокремлювали мононуклеари периферійної крові (РВМС) та вимірювали за допомогою центрифугування у градієнті щільності Ficoll-paque. Аналіз реакції CTL Реакцію CTL, отриману за допомогою введених пептидів, вимірювали із застосуванням імуноферментного спот-аналізу (ELISPOT) IFN-γ (набір IFN-γ людини для імуноферментного спот-аналізу (ELISPOT), BD). Більш докладно, стимулятор приготували шляхом імпульсного мічення A24-LCL (HLA-A*2402-позитивні) пептидами VEGFR2-169 (SEQ ID NO: 1) та HIV-A24, та пептид HIV застосовували як негативний контрольний. Аналіз виконували у трьох комірках в певний час для кожного співвідношення R/S та стимулятора і підрахували середнє значення кількості плям на єдину комірку. Кількість плям визначали на планшет-ридері для імуноферментного спот-аналізу (ELISPOT) (IMMUNO SPOT, Cellular Technology Ltd.). Значення, отримане внаслідок віднімання кількості плям внаслідок імпульсного мічення HIV від кількості плям внаслідок імпульсного мічення VEGFR2-169, визнали як плями, специфічні щодо виробництва IFN-γ відносно VEGFR2-169 (специфічні плями). Якщо після одного курсу та після двох курсів спостерігали збільшення кількості плям, специфічних щодо виробництва IFN-γ, то вважали, що внаслідок введення вакцини відбулася імунна реакція. Аналіз популяції CD8-позитивних Т-клітин (Фіг. 2) Шляхом проточної цитометрії (FACS Calibur, BD) з забарвленням чотирма кольорами проаналізували, чи відбуваються зміни у співвідношенні в кожній фракції початкових (naive) клітин, клітин пам'яті, ефекторних клітин пам'яті та ефекторних Т-клітин серед CD8-позитивних Т-клітин. Як показано на Фіг. 2, лімфоцитна фракція РВМС була у вікні, та CD8-позитивна фракція була у вікні. CD8-позитивну фракцію далі розвинули, застосовуючи CD27(BD) та CD45RA(SD), внаслідок чого отримали фракцію ефекторних клітин (CD27-негативні / CD45RAпозитивні), фракцію ефекторних клітин пам'яті (CD27-негативні / CD45RA-негативні), фракцію клітин пам'яті (CD27-позитивні / CD45RA-негативні) та фракцію початкових (naive) клітин (CD27позитивні / CD45RA-позитивні). Одночасно з цим функціональні фракції лімфоцитів визначили шляхом забарвлення перфорином (Cytofix/Cytoperm kit, BD). Аналіз регуляторних Т-клітин (Фіг. 3) Клітини з високим вмістом CD25 та Foxp3-позитивні клітини серед CD4-позитивних Т-клітин визначили як регуляторні Т-клітини, а їхні кількісні зміни перед та після введення вакцини вимірювали за допомогою проточної цитометрії (FACS Calibur, BD) після забарвленнячотирма 13 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кольорами. Більш докладно, як показано на Фіг. 3, лімфоцитна фракція РВМС була у вікні, а після її розвитку із застосуванням CD4 та CD25, підрахували пропорцію клітин з високим вмістом CD25 та Foxp3-позитивних клітин (Human Regulatory Staining kit, eBioscience) серед CD4-позитивних Т-клітин. Оцінка клінічної ефективності Цитовідновлювальні ефекти Пацієнтів, для яких передбачався принаймні один курс, визначений цим протоколом, вибрали як суб'єктів. Для пухлин, які можна визначити за допомогою томографії, клінічні ефекти оцінювали після останньої вакцинації у кожному курсі, здебільшого згідно з "New Guidelines to Evaluate the Effect of Treatment in Solid Tumors (RECIST guideline Version 2) Japanese Translation, JCOG Edition". Навіть у випадках, коли чотиритижневий курс не виконувався на час клінічного оцінювання, їх визначали як цільові реакції, а їхню клінічну значимість оцінювали як контрольні дані. Комп'ютерну томографію (СТ) та позитронно-емісійну томографію (РЕТ) використовували для оцінки протипухлинних ефектів. Час виживаності Здійснювали довготривале дослідження після застосування та досліджували тривалість виживаності та коефіцієнт виживаності. Результати пацієнтів Три людини брали участь на кожному рівні, та оцінка безпечності стала можливою. Випадки від 31 липня наведено у Таблиці 1 (дивись нижче). Випадок 1 (Рівень І / 0,5 мг) Випадок 1 - це 68-річна жінка, яку раніше лікували шляхом хіміотерапії із застосуванням TS1 та яка не реагувала на лікування, а потім її зареєстрували у даному випробуванні. Здійснювали два курси, проте системні шкідливі події були відсутніми, та місцеві шкідливі реакції на ділянці вакцинації були також відсутніми (Таблиця 1, дивись нижче). Оцінка зображення була PD. Пухлинні маркери також підвищилися. Згідно з імунологічним моніторингом специфічна реакція CTL проти введеного пептиду не спостерігалася (Таблиця 2, дивись нижче). Перед вакцинацією регуляторні Т-клітини були у нормальному діапазоні (середня норма - 3,9 +/- 1,2 %), проте підвищення за межами нормального діапазону спостерігали після одного курсу та також після двох курсів (Таблиця 6, дивись нижче). Пацієнтка померла внаслідок погіршення первинної хвороби через 3,3 місяці після початкової вакцинації. Випадок 2 (Рівень І / 0,5 мг) Випадок 2 - це 66-річний чоловік, який отримав дві вакцинації, проте його було переведено до іншої лікарні за його власним бажанням, та далі він не брав участь у випробуванні (Таблиця 1, дивись нижче). Системні шкідливі реакції були відсутні, та місцеві шкідливі реакції на ділянці вакцинації були також відсутні. Випадок 3 (Рівень І / 0,5 мг) Випадок 3 - це 64-річний чоловік. Здійснили один курс. Нейтропенію та дисфункцію печінки зі Ступенем 3 спостерігали як системні шкідливі події (Таблиця 1, дивись нижче). Усунення гемцитабіну на один тиждень дозволило подолати ці два стани, та введення потім продовжували. Як місцеві шкідливі події спостерігали індурацію та почервоніння зі Ступенем 2 на ділянці інокуляції, а лімфаденопатію (набряк у паху) - біля ділянки інокуляції. Зображення, що демонструє сильне акумулювання, спостерігали на набряклій ділянці за допомогою РЕТ (Фіг. 4), а сильне з точки зору гістопатології запалення спостерігали як результат біопсії, що дозволяє припустити виникнення імунної реакції у відповідь на інокуляцію пептиду. Оцінка зображення була SD, а пухлинні маркери (СА 19-9) зменшилися (Фіг. 5). Згідно з імунологічним моніторингом спостерігали специфічну реакцію CTL проти введених пептидів (Фіг. 6), а під час аналізу фракції CD8-позитивних Т-клітин спостерігали підвищення фракції початкових (naive) Тклітин та фракції ефекторних Т-клітин (Таблиця 3, дивись нижче). Регуляторні Т-клітини перевищували нормальний діапазон (нормальне середнє значення становить 3,9 +/- 1,2 %) перед початком вакцинації, проте їх кількість зменшилася до звичайного діапазону після одного курсу (Таблиця 6, дивись нижче). Згодом пацієнт помер внаслідок погіршення первинної хвороби через 7,3 місяці після початкової вакцинації. Випадок 4 (Рівень І / 0,5 мг) Випадок 4 - це 61-річний чоловік. Здійснювали два курси. Системні шкідливі реакції були відсутніми, а місцеві шкідливі події, індурація та почервоніння Ступеню 2 спостерігалися на ділянці інокуляції (Таблиця 1, дивись нижче). Оцінка зображення була "об'єктивна реакція" (явний ефект зменшення пухлини). Більш докладно, було визначено, що первинний осередок у ділянці хвоста підшлункової залози був SD після одного курсу, а після двох курсів він явно зменшився, та цей ефект зберігався протягом майже 2 місяців (Фіг. 7). Осередок метастазу у 14 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гепатопортальній ділянці печінки став повністю непомітним після двох курсів (Фіг. 8). Осередок метастазу у печінці біля жовчного міхура став непомітним після одного курсу та майже зник після двох курсів (Фіг. 9). З іншого боку, пухлинні маркери (СА 19-9 та СЕА), які мали високі рівні перед вакцинацією, знизилися після одного курсу та після двох курсів, та тенденція зниження пухлинних маркерів тривала навіть протягом іще одного місяця (Фіг. 10). Згідно з імунологічним моніторингом спостерігали специфічну реакцію CTL проти введених пептидів (Фіг. 11). Регуляторні Т-клітини були у межах нормального діапазону до початку вакцинації, після одного курсу та після двох курсів (Таблиця 6, дивись нижче). Через 6,3 місяців після першої вакцинації суб'єкт був живий. Випадок 5 (Рівень ІІ / 1 мг) Випадок 5 - це 65-річний чоловік. Здійснювали два курси. Системні шкідливі події та місцеві шкідливі події були відсутніми (Таблиця 1, дивись нижче). Оцінка зображення була PD. Пухлинні маркери також підвищилися. Згідно з імунологічним моніторингом спостерігали специфічну реакцію CTL проти введених пептидів (Таблиця 2, дивись нижче), та під час аналізу фракції CD8-позитивних Т-клітин спостерігали збільшення у фракції початкових (naive) Т-клітин та у фракції ефекторних Т-клітин (Таблиця 4, дивись нижче). Регуляторні Т-клітини були у межах нормального діапазону перед початком вакцинації, після одного курсу та після двох курсів (Таблиця 6, дивись нижче). Згодом пацієнт помер внаслідок погіршення первинної хвороби через 4,5 місяці після початкової вакцинації. Випадок 6 (Рівень ІІ / 1 мг) Випадок 6 - це 57-річна жінка. Здійснювали два курси. Як системну шкідливу подію спостерігали нейтропенію Ступеню 3 (Таблиця 1, дивись нижче). Усунення GEM на один тиждень дозволило відновити стан, та введення потім продовжували. Як місцеві шкідливі події спостерігали індурацію та почервоніння Ступеню 2 на ділянці інокуляції та лімфаденопатію (набряк у паху) біля ділянки інокуляції. Оцінка зображення була "об'єктивна реакція". Більш докладно, первинний осередок у ділянці головки підшлункової залози зменшився після двох курсів, та цей ефект зберігався майже протягом 2,5 місяців (Фіг. 12). Порівнювали скановані зображення РЕТ, отримані перед початком вакцинації та після завершення двох курсів. Акумуляція до пухлини явно знизилася після двох курсів (Фіг. 13). Внаслідок порівняння значень SUV, які об'єктивно вказують на кількість акумуляції до пухлини, зменшення з 6 до 4,5 явно дозволяє припустити, що мав місце протипухлинний ефект. Крім того, пухлинний маркер (пухлинні маркери, відмінні від DUPAN2, були у нормі з часу реєстрації) знизився після двох курсів, та ефекти зниження тривали навіть 2 місяці потому (Таблиця 7, дивись нижче). Згідно з імунологічним моніторингом спостерігали специфічну реакцію CTL проти введених пептидів (Фіг. 14), та при аналізі фракції CD8-позитивних Т-клітин спостерігали збільшення у фракції початкових (naive) Т-клітин та зменшення у фракції ефекторних Т-клітин (Таблиця 4, дивись нижче). Регуляторні Т-клітини були у межах нормального діапазону перед початком вакцинації, після одного курсу та після двох курсів (Таблиця 6, дивись нижче). Через шість місяців після першої вакцинації показник якості життя (QOL) залишився добрим, та суб'єкт був живий. Випадок 7 (Рівень ІІ / 1 мг) Випадок 7 - це 69-річний чоловік. Здійснювали два курси. Як системну шкідливу подію спостерігали нейтропенію Ступеню 3 (Таблиця 1, дивись нижче). Усунення GEM на один тиждень дозволило відновити стан, та введення потім продовжували. Як місцеві шкідливі події спостерігали індурацію та почервоніння Ступеню 2 на ділянці інокуляції та лімфаденопатію (набряк у паху) біля ділянки інокуляції. Оцінка зображення була SD (Фіг. 15). Більш докладно, первинний осередок у ділянці головки підшлункової залози не демонстрував жодних змін у розмірі після двох курсів, та цей ефект зберігався протягом майже 2 місяців (Фіг. 15). Крім того, пухлинний маркер (пухлинні маркери, відмінні від СА125, були у нормі з часу реєстрації) знизився після одного курсу, та ефекти зниження тривали навіть 2 місяці потому (Фіг. 16). Згідно з імунологічним моніторингом спостерігали специфічну реакцію CTL проти введених пептидів (Фіг. 17), та при аналізі фракції CD8-позитивних Т-клітин спостерігали зниження у фракції початкових (naive) Т-клітин та збільшення у фракції ефекторних Т-клітин (Таблиця 4, дивись нижче). Регуляторні Т-клітини були у межах нормального діапазону перед початком вакцинації, після одного курсу та після двох курсів (Таблиця 6, дивись нижче). Через 4,3 місяці після першої вакцинації QOL залишився добрим, а суб'єкт був живий. Випадок 8 (Рівень ІІІ / 2 мг) Випадок 8 - це 58-річний чоловік. Один курс було завершено, та у той час, коли другий курс тривав, зі збільшеної пухлини виникла шлунково-кишкова кровотеча. Вважали, що причиною було збільшення пухлини, та випробування припинили (Таблиця 1, дивись нижче). Дисфункцію печінки спостерігали як системну шкідливу подію. Місцеві шкідливі події були відсутні. Оцінка 15 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 зображення після завершення одного курсу була PD. Пухлинні маркери також підвищилися. Випадок 9 (Рівень ІІІ / 2 мг) Випадок 9 - це 73-річний чоловік. Після одного введення дослідження відклали внаслідок шлунково-кишкового звуження, спричиненого збільшенням пухлини (Таблиця 1, дивись нижче). Випадок 10 (Рівень ІІІ / 2 мг) Випадок 10 - це 62-річний чоловік. Здійснили один курс. Системні шкідливі події були відсутні, та спостерігали місцеві шкідливі події, індурацію та почервоніння Ступеню 2 або менше (Таблиця 1, дивись нижче). Оцінка зображення була SD (Фіг. 18). Крім того, пухлинний маркер (пухлинні маркери, відмінні від СА125, були у нормі з часу реєстрації) знизився, та зниження пухлинного маркера тривало приблизно протягом 1 місяця (Фіг. 19). Згідно з імунологічним моніторингом спостерігали специфічну реакцію CTL проти введених пептидів (Таблиця 2, дивись нижче), та при аналізі фракції CD8-позитивних Т-клітин спостерігали збільшення у фракції початкових (naive) Т-клітин та зниження у фракції ефекторних Т-клітин (Таблиця 5, дивись нижче). Регуляторні Т-клітини становили високе значення 6,4 перед початком вакцинації, проте вони знизилися до нормального діапазону 2,1 після одного курсу (Таблиця 6, дивись нижче). Порівняння з лікуванням тільки гемцитабіном У Таблиці 8 (дивись нижче) з точки зору протипухлинних ефектів у випадках та з точки зору реакції DTH, яка є однією з імунних реакцій, виконували порівняння з даними, отриманими досі тільки з гемцитабіном. Протипухлинні ефекти порівнювали з точки зору коефіцієнту контролю хвороби (кількість CR + кількість PR + кількість SD / усі випадки) та коефіцієнту прояву явного протипухлинного ефекту ("об'єктивна реакція"). У той час, коли коефіцієнт залишався на рівні 45 % - 48 % у випадку тільки GEM, цей коефіцієнт значно перебільшував 62,5 % за цим протоколом. "Об'єктивна реакція" також збільшилася у два рази або більше. Реакцію DTH, яка є однією з імунних реакцій, спостерігали надзвичайно часто. Оскільки це ледь спостерігалося при застосуванні тільки VEGFR2 (особисте спілкування), вважали, що гемцитабін підвищує імунні реакції. Насправді, у випадках, коли відбувалася реакція DTH, реакції SD або вище отримали клінічним способом, та випадки PD та випадки, при яких DTH була відсутньою, відповідали повністю. Отже, випадки, у яких виникає деякий тип імунної реакції, вважають також клінічно ефективними. Таблиці Таблиця 1 Підсумки випадків клінічних випробувань Статус ВипадПептиди Вік/стать вакцинаки ції 1 2 3 4 Системні шкідливі події Заверше68/жінка но 2 Не було курси Припинена (2 66/чоловік Не було введення) НейтроРівень І пенія/ 0,5 мг Заверше64/чоловік пошкодно 1 курс ження печінки Заверше61/чоловік но 2 Не було курси Місцеві шкідливі події Ураження, що можна оцінити Оцінка Пухлинні маркери Період спостереження, виживаність Первинний осередок PD Підвищені 3,3 місяці, померла Індурація/ почервоніння/ лімфаденопатія Первинний осередок SD Знижені 7,3 місяці, помер Індурація/ почервоніння Первинний/ Об'єктивна осередок Знижені реакція метастазу у печінці 6,3 місяці, живий Не було Не було 16 UA 100702 C2 Продовження таблиці 1 5 Заверше65/чоловік но 2 Не було курси 6 ЗавершеНейтро57/жінка но 2 пенія курси 7 8 9 10 Рівень ІІ 1 мг Не було Первинний PD осередок Індурація/ почервоніння/ лімфаденопатія Первинний осередок Об'єктивна Знижені реакція 6,0 місяців, жива Первинний осередок SD Знижені 4,3 місяці, живий Первинний осередок PD Підвищені 3,7 місяців, живий ЗавершеНейтроНабряк у 69/чоловік но 2 пенія паху курси НейтроТриває пенія/ 58/чоловік Не було курс 2 кровотеча з пухлини Припинили внаслідок Рівень (1 шлунково-кишкового ІІІ 2 мг 73/жінка введензвуження, зумовленого ня) збільшенням пухлини Індурація/ Заверше62/чоловік Не було почервоно 1 курс ніння Підвищені Первинний осередок/ метастаз у печінці Первинний SD осередок 4,5 місяці, помер 2,8 місяців, жива Знижені 2,4 місяці, живий Таблиця 2 Специфічна реакція CTL/реакція DTH проти введених пептидів Рівень І 0,5 мг Рівень ІІ 1 мг Рівень ІІІ 2 мг Випадок 1 Випадок 3 Випадок 4 Випадок 5 Випадок 6 Випадок 7 Випадок 8 Випадок 9 Випадок 10 Перед введенням Н.Т. Н.Т. Н.Т. Після введення Реакція DTH + + + + + Н.Т. + + + + + + Клінічна оцінка PD SD Об'єктивна реакція PD Об'єктивна реакція SD PD Н.Т. SD Н.Т. - не тестували. Таблиця 3 Аналіз фракцій CD8-позитивних Т-клітин для Рівня І Перед введенням Випадок 1 Випадок 3 Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Після 1 курсу Після 2 курсів Клінічна оцінка Н.Т. 12,5 11,8 3,7 60,9 5 17 PD 16,9 10,9 2,4 64,0 SD UA 100702 C2 Продовження таблиці 3 Випадок 4 Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Об'єктивна реакція Н.Т. Випадок 3 - припинили після одного курсу. Н.Т. - не тестували. Таблиця 4 Аналіз фракцій CD8-позитивних Т-клітин для Рівня ІІ Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Випадок 5 Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Випадок 6 Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Випадок 7 Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Перед введенням 0 0,1 21,5 14,0 54,3 25,8 1,2 10,2 9,4 4,4 10,6 14,4 Після 1 курсу 11,9 11,5 22,3 11,2 64,5 22,1 0,4 5,9 1,1 0,1 12,0 17,8 Після 2 курсів 3,9 8,8 24,3 19,2 69,3 20,6 0,3 3,9 0,1 0 8,3 18,0 Клінічна оцінка PD Об'єктивна реакція SD Таблиця 5 Аналіз фракцій CD8-позитивних Т-клітин для Рівня ІІІ Перед введенням Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Випадок 8 Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Випадок 9 Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Naive/CD8+ (%) Клітини пам'яті/CD8+ (%) Випадок 10 Еф. клітини пам'яті/CD8+ (%) Ефекторні клітини/CD8+ (%) Після 1 курсу Після 2 курсів Клінічна оцінка Н.Т. Н.Т. 51,0 10,7 4,7 18,2 Випадки 8, 10 - припинили після одного курсу. Н.Т. - не тестували. 5 18 PD Н.Т. 57,2 11,4 3,4 14,8 SD UA 100702 C2 Таблиця 6 Аналіз CD4-позитивних / CD25-високих / Foxp3-позитивних регуляторних Т-клітин 1 3 Перед введенням 2,4 10,6 Після 1 курсу 9,5 4,4 Після 2 курсів 7,8 4 3,2 2,2 1,5 5 4,6 2,3 1,8 6 3,1 3,9 4,1 7 8 9 10 Рівні 3,1 Н.Т. Н.Т. 6,4 3,3 Н.Т. Н.Т. 2,1 3,1 Випадки I II III Клінічна оцінка PD SD Об'єктивна реакція PD Об'єктивна реакція SD PD Н.Т. SD SD - середнє значення здорових пацієнтів. високий CD4+CD25 Foxp3+: 3,9 % (±1,2). Н.Т. - не тестували. Таблиця 7 Зміни у пухлинному маркері, які виникли у Випадку 6 протягом курсу лікування DUPAN2 1/26 за 4 тижні перед здійсненням 1600< 2/8 перед здійсненням 3/15 після 1 курсу 4/24 після 2 курсів 5/29 після 1 місяця 6/26 після 2 місяців 1600< 1600< 1200 960 880 (CEA, CA19-9, CA125; нормальний діапазон) Таблиця 8 Підсумки протипухлинних ефектів та реакцій DTH, пов'язаних з лікуванням згідно з цим винаходом Тільки гемцитабін Коефіцієнт контролю хвороби (SD або вище) Явний ефект зменшення пухлини (об'єктивна реакція) Реакція DTH 5 10 45-48 % 10 % Н.Т. Гемцитабін+R2-169 (позитивні випадки/усі випадки) 62,5 % (5/8) 25 % (2/8) 62,5 % (5/8) Обговорення Не виникає питання про те, що рак підшлункової залози - це важка хвороба та пухлина з найгіршим прогнозом. У наш час єдиним фармацевтичним терапевтичним засобом проти раку підшлункової залози є гемцитабін, проте, при клінічному застосуванні він досі залишається незадовільним. З іншого боку, після ідентифікації епітопних пептидів щодо пухлинних антигенів було багато очікувань стосовно протиракової вакцинної терапії; проте, добре відомим фактом є те, що клінічне застосування на сьогодні зазнало поразки та не виправдало таких очікувань. Головна причина полягає у низькій експресії або недостатній кількості молекул МНС у пухлинних клітинах. Більш докладно, навіть якщо завдяки застосуванню вакцин індукуються сильні CTL, 19 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 якщо кількість молекул МНС є недостатньою, протипухлинні ефекти не можуть демонструватися. Засоби для подолання проблеми низької експресії або недостатньої кількості молекул МНС - це дуже важливі цілі, враховуючи той факт, що навіть коли реакції CTL, викликані вакцинами, можна виявити за допомогою імунологічного моніторингу, вони не пов'язані напряму з протипухлинними ефектами. Крім того, гетерогенність пухлин - це також важлива проблема. Навіть коли CTL можна індукувати проти одного пухлинного антигену у випадку, коли експресована молекула не є молекулою, необхідною для пухлинного росту, ця молекула стирається, так що вона більше не є мішенню CTL, та пухлина може продовжувати зростати. З метою подолання важливих проблем, пов'язаних з протипухлинними ефектами цих вакцинних способів терапії, автори цього винаходу зосередили свою увагу на VEGFR2, що значно експресується у нових судинних ендотеліальних клітинах пухлини, та ідентифікували епітопні пептиди, які можна застосовувати як вакцини [Wada S, Cancer Res. 65, 4939-4946, 2005, WO 2004/024766]. Традиційно комбіноване застосування вакцинної терапії та хіміотерапії вважали несумісним, спираючись на їхні біологічні характеристики. Проте, з точки зору протипухлинного імунітету, такого як відкриття регуляторних Т-клітин та їх пригнічення, припустили можливість комбінованого застосування з хіміотерапією. Отже, було заплановано, що клінічні випробування дозволять визначити, чи можна очікувати для раку підшлункової залози ефектів від комбінованого застосування гемцитабіну та терапії на основі пептидних вакцин, які націлені на нові кров'яні судини пухлини. Внаслідок цього, по-перше, було визначено що це є повністю прийнятним з точки зору безпечності. Стосовно нарощування дози аналізи системних шкідливих подій Ступеню 3 або вище (після завершення одного курсу) продемонстрували, що нейтропенія та дисфункція печінки виникали в одному випадку з трьох випадків на рівні І, у двох випадках з трьох випадків на рівні ІІ та в одному випадку з двох випадків на рівні ІІІ; проте, скасування ліків або введення G-CSF дозволило продовжувати введення. Згідно з вищевказаним, сьогодні усі рівні знаходяться у межах прийнятного діапазону. Оскільки ця терапія - це вакцинна терапія, спрямована на нові судинні ендотеліальні клітини пухлини, слід враховувати тенденцію до кровотечі та інші шкідливі події; проте, було доведено, що теоретичне підґрунтя перед здійсненням цієї процедури, таке як низька експресія у здорових судинних ендотеліальних клітинах, було правильним до деякого ступеню. Коли нарощування дози аналізували за допомогою імунологічного моніторингу та клінічні ефекти аналізували з точки зору реакції DTH, реакції CTL та коефіцієнту контролю хвороби, усі вони були позитивними у двох випадках з трьох випадків на рівні І та в одному випадку з двох випадків на рівні ІІІ. На рівні ІІ тільки реакція CTL була позитивною у трьох випадках з трьох випадків (реакція DTH та коефіцієнт контролю хвороби були такими самими, як і на рівні І та ІІІ). Незважаючи на те, що кількість випадків є малою, вищевказане дозволяє припустити можливість того, що рівень ІІ буде рекомендованою дозою. Стосовно протипухлинних ефектів, незважаючи на те, що ефект комбінованого застосування спостерігався явно стосовно вакцинної хіміотерапії, обговоримо можливість того, що вакцина підсилює протипухлинний ефект гемцитабіну. Посилаючись на порівняння у Таблиці 8, явний ефект зменшення пухлини перебільшував у двічі або більше порівняно із застосуванням тільки гемцитабіну. Це означає, що прямий протипухлинний ефект гемцитабіну підсилювався вакциною. Більш докладно: очевидно, що CTL, індуковані вакциною, руйнували нові судинні ендотеліальні клітини пухлини, так що гемцитабін був спроможним досягти протипухлинної ефективності, внаслідок чого спостерігався сильний протипухлинний ефект. Далі, обговоримо можливість того, що гемцитабін підсилював протипухлинні ефекти вакцини. Аналіз імунної реакції проти введеного пептиду підтвердив, що сильна реакція CTL індукується здебільшого у клінічно ефективних випадках, включаючи випадки SD. Крім того, оскільки реакція DTH підсилилася, це з великою долею ймовірності дозволяє припустити можливість того, що гемцитабін підсилює реакцію CTL, яка є ключовим елементом протипухлинних ефектів вакцини. Також, посилаючись на клінічні випробування, у 4 з 5 випадків протипухлинні ефекти тривали протягом довгого періоду часу, включаючи SD (Випадок 4: один місяць; Випадок 6: два місяці; Випадок 7: два місяці та Випадок 10: один місяць), та це вважають результатом довготривалих протипухлинних ефектів вакцини. Більш докладно: це дозволяє припустити можливість того, що CTL ефективно індукувалися гемцитабіном, та що CTL спричиняють довготривалі протипухлинні ефекти. Крім того, існує можливість того, що пухлина зазнає смерті клітин завдяки гемцитабіну, та це є синергійною дією з протипухлинними імунними реакціями, активованими вакциною. Таким чином, підсилення протипухлинних ефектів, включаючи 20 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подовження тривалості життя, без підвищення побічних ефектів можна з високою долею ймовірності очікувати завдяки вакцинній хіміотерапії із застосуванням у комбінації гемцитабіну та пептидів VEGFR2. Це можна вважати великою новиною стосовно покращення результату лікування раку підшлункової залози з поганим прогнозом. Промислова придатність У цьому описі було визначено, що терапевтичний ефект хіміотерапевтичних засобів проти раку підшлункової залози, наприклад, гемцитабіну, можна суттєво покращити або підсилити внаслідок комбінованого застосування разом з відповідним антигенним пептидом, наприклад, пептидом KDR, ідентифікованим як протиракова вакцина у публікації WO 2004/024766, зміст якої включено до цього опису шляхом посилання у її повному обсязі. Отже, цим винаходом пропонується удосконалений спосіб лікування раку підшлункової залози у суб'єкта, якому це необхідно. Усі публікації, бази даних, послідовності, патенти та патентні заявки, процитовані у цьому описі, включено до цього опису шляхом посилання. Незважаючи на те, що винахід було описано докладно та с посиланням на його специфічні варіанти здійснення, фахівцю у галузі буде зрозуміло, що можна виконати будь-які зміни та модифікації, не відхиляючись від духу та обсягу винаходу, межі та границі якого встановлено формулою винаходу, що додається. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення згаданому суб'єктові (і) та (іі), а саме (і) одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (a) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (е) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); (f) пептиду за (е), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин; (іі) одного або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. 2. Спосіб за п. 1, де суб'єкт є НLА-А24-позитивним або НLА-А02-позитивним. 3. Спосіб за п. 1, де рак - це рак підшлункової залози. 4. Набір для лікування раку у суб'єкта, який містить фармацевтичні композиції, які включають (і) та (іі) як активний інгредієнт, відповідно, та фармацевтично прийнятний носій, а саме (і) один або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (а) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); 21 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин; (іі) один або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. 5. Набір за п. 4, де згаданий суб'єкт є НLА-А24-позитивним або HLA-A02-позитивним. 6. Набір за п. 4, де рак - це рак підшлункової залози. 7. Протираковий засіб для лікування раку у суб'єкта, який включає (і) у комбінації з (іі), а саме (і) один або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (a) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин; (іі) один або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. 8. Протираковий засіб за п. 7, де суб'єкт є НLА-А24-позитивним або HLA-A02-позитивним. 9. Протираковий засіб за п. 7, де рак - це рак підшлункової залози. 10. Застосування комбінації (і) та (іі) під час лікування раку у суб'єкта, а саме (і) одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (a) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин; (іі) одного або більше хіміотерапевтичних засобів, що вибрані з групи, яка складається з гемцитабіну, його фармацевтично прийнятної солі та його проліків. 11. Застосування за п. 10, де суб'єкт є НLА-А24-позитивним або HLA-A02-позитивним. 12. Застосування за п. 10, де рак - це рак підшлункової залози. 13. Спосіб підсилення терапевтичного ефекту гемцитабіну для лікування раку, який включає етап введення суб'єктові одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (a) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); 22 UA 100702 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) пептидів, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин. 14. Спосіб за п. 13, де згаданий суб'єкт є НLА-А24-позитивним або HLA-A02-позитивним. 15. Спосіб за п. 13, де згаданий рак - це рак підшлункової залози. 16. Застосування одного або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (a) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин, для виробництва фармацевтичної композиції для підсилення терапевтичного ефекту гемцитабіну при лікуванні раку у суб'єкта. 17. Застосування за п. 16, де згаданий суб'єкт є НLА-А24-позитивним або HLA-A02-позитивним. 18. Застосування за п. 16, де згаданий рак - це рак підшлункової залози. 19. Засіб, що підсилює терапевтичний ефект гемцитабіну, який включає один або більше пептидів, що вибрані з групи, яка складається з: (a) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6); (b) пептиду за (а), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (c) пептиду за (b), де друга амінокислота від N-закінчення - це фенілаланін, тирозин, метіонін або триптофан; (d) пептиду за (b) або (с), де С-кінцева амінокислота - це фенілаланін, лейцин, ізолейцин, триптофан або метіонін; (e) пептиду, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) та VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13); (f) пептиду за (e), де 1, 2 або декілька амінокислот заміщені, стерті або додані та де згаданий пептид має спроможність індукувати цитотоксичні Т-клітини; (g) пептиду за (f), де друга амінокислота від N-закінчення - це лейцин або метіонін; та (h) пептиду за (f) або (g), де С-кінцева амінокислота - це валін або лейцин, як активний інгредієнт. 23 UA 100702 C2 20. Засіб за п. 19, де терапевтичний ефект, який слід підсилити, - це терапевтичний ефект гемцитабіну при лікуванні раку у суб'єкта, де згаданий суб'єкт є HLA-A24-позитивним або НLАА02-позитивним. 21. Засіб за п. 20, де згаданий рак - це рак підшлункової залози. 5 10 24 UA 100702 C2 5 25 UA 100702 C2 5 10 26 UA 100702 C2 5 10 27 UA 100702 C2 5 28