Аматоксиновий кон’югат з покращеними лінкерами

Реферат: Винахід належить до протипухлинної терапії, а саме до кон'югату аматоксину та мішеньзв'язуючого фрагмента, наприклад антитіла, з'єднаних за допомогою лінкера, що містить фрагмент сечовини, ефективного при лікуванні раку. В додатковому аспекті даний винахід належить до фармацевтичної композиції, яка включає зазначений кон'югат. UA 111341 C2 (12) UA 111341 C2 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу [001] Даний винахід відноситься до протипухлинної терапії. В одному аспекті даний винахід відноситься до кон'югатів аматоксину та мішень-звязуючого фрагменту, наприклад, антитіла, зв'язаних за допомогою лінкера, що містить фрагмент сечовини, які є ефективними при лікуванні раку. В додатковому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичних композицій, які містять такі кон'югати. Передумови винаходу [002] Аматоксини представляють собою циклічні пептиди, що складаються з 8 амінокислот. Вони можуть бути виділені з грибів Amanita phalloides або одержані штучно. Аматоксини, зокрема, інгібують ДНК-залежну РНК полімерaзу II клітин ссавців і внаслідок цього також транскрипцію та біосинтез білка уражених клітин. Інгібування транскрипції в клітині викликає припинення росту та проліферації. Хоча комплекс між аманітином та РНК-полімерaзою II не зв’язаний ковалентно, він є дуже міцним (KD = 3 нM). Дисоціація аманітину з ферменту є дуже повільним процесом, що таким чином робить відновлення ураженої клітини малоймовірним. Якщо інгібування транскрипції триває надто довго, тоді клітина зазнає запрограмованої смерті (апоптозу). [003] Застосування аматоксинів в якості цитотоксичних фрагментів для терапії пухлин досліджували уже в 1981 році зшиванням антитіла з Thy 1.2 з -аманітином, за допомогою лінкера, прикріпленого до індольного кільця Trp (амінокислота 4; дивись Фігуру 1), шляхом діазотування (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). [004] В заявці на європейський патент 1859811 A1 (опублікованій 28 листопада 2007 року) описані кон'югати, у яких  C-атом амінокислоти 1 аматоксину -аманітину безпосередньо зшитий, тобто без лінкерної структури, з альбуміном або моноклональним антитілом HEA125, OKT3 або PA-1. Крім того, показана інгібіторна дія таких кон'югатів на проліферацію клітин пухлини молочних залоз (MCF-7), клітин лімфоми Беркіта (Raji) та клітин T-лімфоми (Jurkat). Запропоноване застосування лінкерів, включаючи лінкери, які містять такі елементи, як фрагменти аміду, естеру, ефіру, тіоефіру, дисульфіду, сечовини, тіосечовини, вуглеводню та подібні, але такі конструкти фактично не показані, та не запропоновані більш докладні дані, такі як сайти приєднання на аматоксинах. [005] Відомо, що аматоксини є відносно нетоксичними, коли зшиті з носіями великих біомолекул, такими як молекули антитіл, а також що вони проявляють свою цитотоксичну активність тільки після того, як носій біомолекули відщепиться. З урахуванням токсичності аматоксинів, зокрема для клітин печінки, винятково важливе значення має те, що кон'югати аматоксину для націленої протипухлинної терапії залишаються високо стійкими після введення в плазму, а також, що вивільнення аматоксину відбувається після інтерналізації в намічені клітини. В даному контексті незначні покращення стабільності кон'югатів можуть мати тяжкі наслідки для “терапевтичного вікна” та безпеки кон'югатів аматоксину для терапевтичних підходів. Мета даного винаходу [006] Таким чином, у даному рівні техніки існувала велика потреба у кон'югатах аматоксину з мішень-звязуючим фрагментом, які були б стійкими в плазмі, і за умов зведення до мінімуму шкідливих побічних ефектів на нецільові клітини. Короткий опис даного винаходу [007] В першому аспекті даний винахід відноситься до кон'югату, що містить мішеньзвязуючий фрагмент, з'єднаний через лінкер L з аматоксином, де лінкер L приєднаний до аматоксину через (i)  C-атом амінокислоти 1 аматоксину, зокрема через амідний місток; (ii) атом кисню, зв’язаний з  C-атомом амінокислоти 3 аматоксину, зокрема через естерний місток, ефірний місток або уретановий місток; або (iii) 6'C-атом амінокислоти 4 аматоксину, зокрема через атом кисню, зв’язаний з 6'C-атомом амінокислоти 4 аматоксину; в кожному випадку, де лінкер L приєднаний до мішень-звязуючого фрагменту через фрагмент сечовини. [008] В другому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить кон'югат за даним винаходом. [009] В іншому аспекті даний винахід відноситься до молекули аматоксин-кон’югації, що містить лінкер L, приєднаний до аматоксину через: (i)  C-атом амінокислоти 1 аматоксину, зокрема через амідний місток; (ii) атом кисню, зв’язаний з  C-атомом амінокислоти 3 аматоксину, зокрема через естерний зв'язок, ефірний зв'язок або уретановий зв'язок; або 1 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (iii) 6'C-атом амінокислоти 4 аматоксину, зокрема через атом кисню, зв’язаний з 6'C-атомом амінокислоти 4 аматоксину; в кожному випадку, де лінкер L містить похідне карбамінової кислоти -NH-C(О)-X, де X представляє собою групу, що відходить, котра може бути заміщеною первинним аміном мішеньзв'язуючого фрагменту. [0010] В ще одному аспекті даний винахід відноситься до способу синтезу кон'югату даного винаходу, що включає етап реакції кон’югаційної молекули аматоксину даного винаходу з мішень-зв'язуючим фрагментом, що містить первинну аміногрупу. Короткий опис графічних матеріалів [0011] На Фіг. 1 показані структурні формули різних аматоксинів. Числа жирним шрифтом (18) позначають стандартну нумерацію восьми амінокислот, які утворюють аматоксин. Також показані стандартні позначення атомів в амінокислотах 1, 3 та 4 (грецькі літери a-, грецькі літери a- та числа від 1' до 7', відповідно). [0012] На Фіг. 2 показана цитотоксична активність різних кон'югатів аманітин-герцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів на клітинах SKOV-3 в аналізі BrdU після інкубації впродовж 72 годин. [0013] На Фіг. 3 показана цитотоксична активність різних кон'югатів аманітин-герцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів на клітинах SK-BR-3 в аналізі BrdU після інкубації впродовж 72 годин. [0014] На Фіг. 4 показана цитотоксична активність різних кон'югатів аманітин-герцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів на клітинах NCI-N87 в аналізі BrdU після інкубації впродовж 72 годин. [0015] На Фіг. 5 показана цитотоксична активність різних кон'югатів аманітин-герцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів на клітинах MDA-MB231 в аналізі BrdU після інкубації впродовж 72 годин. [0016] На Фіг. 6 та Фіг. 7 показана кількість аманітину, що вивільнився з різних кон'югатів аманітин-герцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів, після інкубації в плазмі впродовж 14 днів. [0017] На Фіг. 8 показане порівняння цитотоксичних активностей різних кон'югатів аманітингерцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів на клітинах SKOV-3 в аналізі BrdU до та після інкубації в плазмі. [0018] На Фіг. 9 показане порівняння активностей двох різних кон'югатів аманітин-герцептину із застосуванням різних лінкерних фрагментів in vivo у ксенотрансплантатної моделі SKOV-3. Детальний опис даного винаходу [0019] Перш ніж даний винахід буде докладно описаний нижче, треба відзначити, що даний винахід не обмежений конкретним способом, протоколами та реагентами, описаними в даному документі, оскільки їх можна змінювати. Варто також розуміти, що термінологія, яку використали в даному документі, наявна тільки з метою описати конкретні варіанти здійснення, та не призначена обмежувати обсяг даного винаходу, який буде обмежуватися тільки прикладеною формулою винаходу. Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, використані в даному документі, мають такі самі значення, які зазвичай зрозумілі фахівцеві в даній галузі. [0020] Терміни, які використані в даному документі, переважно визначені як описано в "Баготомовний словник біотехнологічних термінів: (Рекомендації IUPAC)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland). [0021] В усьому даному описі та формулі винаходу, яка надана далі, крім випадків, якщо за контекстом вимагається інше, слово "містити" та варіації, такі як "містить" та "що містить", слід розуміти як такі, що передбачають включення заданого цілого числа або етапу або групи цілих чисел або етапів, але не виключення будь-якого іншого цілого числа або етапу або групи цілих чисел або етапів. [0022] В тексті даного опису процитовані декілька документів. Кожний з документів, процитованих в даному документі (включаючи всі патенти, заявки на патенти, наукові публікації, нормативи виробників, інструкції, записи послідовностей з номером доступу до GenBank і т. д.), будь то вище, або нижче, таким чином включені за допомогою посилань в їх повному об'ємі, наскільки це можливо за відповідним патентним законом. Нічого з даного документу не варто розцінювати як визнання того, що даний винахід не дає права датувати таке розкриття більш раннім числом відповідно до більш раннього винаходу. [0023] Далі описується даний винахід. В нижчеприведених абзацах різні аспекти даного винаходу визначені більш детально. Кожний аспект, визначений таким чином, можна поєднати з будь-яким іншим аспектом або аспектами, крім випадків, коли чітко вказане протилежне. Зокрема, будь-яку рису, вказану як переважну або корисну, можна поєднати з будь-якою іншою 2 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рисою або рисами, вказаними як переважні або корисні. [0024] В першому аспекті даний винахід відноситься до кон'югату, що містить мішеньзв'язуючий фрагмент, зв’язаний через лінкер L з аматоксином, де лінкер L приєднаний до аматоксину через: (iv)  C-атом амінокислоти 1 аматоксину, зокрема через амідний зв'язок; (v) атом кисню, зв’язаний з  C-атомом амінокислоти 3 аматоксину, зокрема через естерний зв'язок, ефірний зв'язок або уретановий зв'язок; або (vi) 6'C-атом амінокислоти 4 аматоксину, зокрема через атом кисню, зв’язаний з 6'C-атомом амінокислоти 4 аматоксину; в кожному випадку, де лінкер L приєднаний до фрагменту, який зв’язується з мішенню, через фрагмент сечовини. [0025] В контексті даного винаходу термін "кон'югат" відноситься до молекули, включаючи щонайменше дві різні молекули, зв’язані ковалентним зв’язком. [0026] Термін "мішень-зв'язуючий фрагмент", як використовується у даному документі, відноситься до будь-якої молекули або частини молекули, яка може специфічно зв’язуватися з молекулою-мішенню або епітопом-мішенню. Переважні фрагменти, які зв’язуються з мішенню, в контексті даної заявки представляють собою (i) антитіла або їх антиген-зв’язуючі ділянки, (ii) подібні антитілам білки та (iii) аптамери нуклеїнових кислот. Придатні для застосування в даному винаході "фрагменти, які зв’язуються з мішенню", як правило, мають молекулярну масу 40000 Да (40 кДа) або більше. [0027] Як застосовується у даному документі, першу сполуку (наприклад, антитіло) розглядають стосовно "специфічного зв’язування" з другою сполукою (наприклад, антигеном, таким як білок-мішень), якщо вона має константу дисоціації KD по відношенню до вказаної другої сполуки 100 мкΜ або менше, переважно 50 мкΜ або менше, переважно 30 мкΜ або менше, переважно 20 мкΜ або менше, переважно 10 мкΜ або менше, переважно 5 мкΜ або менше, більш переважно 1 мкΜ або менше, більш переважно 900 нM або менше, більш переважно 800 нM або менше, більш переважно 700 нM або менше, більш переважно 600 нM або менше, більш переважно 500 нM або менше, більш переважно 400 нM або менше, більш переважно 300 нM або менше, більш переважно 200 нM або менше, ще більш переважно 100 нM або менше, ще більш переважно 90 нM або менше, ще більш переважно 80 нM або менше, ще більш переважно 70 нM або менше, ще більш переважно 60 нM або менше, ще більш переважно 50 нM або менше, ще більш переважно 40 нM або менше, ще більш переважно 30 нM або менше, ще більш переважно 20 нM або менше та ще більш переважно 10 нM або менше. [0028] В контексті даної заявки терміни "молекула-мішень" та "епітоп-мішень", відповідно, стосуються антигена та епітопа антигена, відповідно, що специфічно зв’язаний мішеньзв'язуючим фрагментом. Переважно молекулою-мішенню є асоційований з пухлиною антиген, зокрема антиген або епітоп, що присутній на поверхні пухлинних клітин одного або декількох типів у підвищеній концентрації та/або у відмінній просторовій конфігурації в порівнянні з поверхнею клітин, які не є пухлинними. Переважно вказаний антиген або епітоп присутній на поверхні пухлинних клітин одного або декількох типів, але не на поверхні клітин, які не є пухлинними. В конкретних варіантах здійснення фрагмент, який зв’язується з мішенню, специфічно зв’язується з епітопом HER-2/neu або молекулою адгезії епітеліальних клітин (EpCAM). В інших варіантах здійснення вказаний антиген або епітоп, переважно експресований на клітинах, задіяний в аутоімунних захворюваннях. В таких конкретних варіантах здійснення мішень-зв'язуючий фрагмент специфічно зв’язується з епітопом рецептора IL-6 (IL-6R). [0029] Термін "антитіло або його антиген-зв’язуюча ділянка", як використовується у даному документі, відноситься до молекул імуноглобуліну та імунологічно активних частин молекул імуноглобуліну, тобто молекул, які містять антиген-зв’язуючий сайт, який імуноспецифічно зв’язує антиген. Також містяться білки, подібні імуноглобуліну, які вибирають завдяки технікам, включаючи, наприклад, фаговий дисплей специфічного зв’язування з молекулою-мішенню, наприклад з білком-мішенню Her-2/neu або EpCAM. Молекули імуноглобуліну даного винаходу можуть бути будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA та IgY), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 та IgA2) або підкласу молекули імуноглобуліну. "Антитіла та їх антигензв’язуючі ділянки”, придатні для застосування в даному винаході, включають, але без обмеження, поліклональні, моноклональні, неповні, біспецифічні, гетерокон'югатні, мультиспецифічні антитіла, антитіла людини, гуманізовані (зокрема CDR-прищеплені), деімунізовані або химерні антитіла, одноланцюгові антитіла (наприклад, scFv), Fab ділянки, F(ab')2 ділянки, ділянки, отримані з Fab експресійної бібліотеки, діатіла або тетратіла (Holliger P. зі співавт., 1993), нанотіла, антиідіотипові (до Id) антитіла (включаючи, наприклад, антитіла до Id 3 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до антитіл даного винаходу) та епітоп-зв’язуючі ділянки будь-чого з вищенаведеного. [0030] В деяких варіантах здійснення антиген-зв’язуючі ділянки представляють собою антиген-зв’язуючі ділянки антитіл людини даного винаходу та включають, але без обмеження, Fab, Fab' та F(ab')2, Fd, одноланцюгові Fv (scFv), одноланцюгові антитіла, Fv, зв’язані дисульфідними містками (dsFv), та ділянки, що містить або VL, або VH домен. Антиген-зв’язуючі ділянки антитіл, включаючи одноланцюгові антитіла, можуть включати тільки варіабельний домен(и) або в комбінації з усім або ділянкою з наступного: «шарнірна» область, CL, CH1, CH2 та CH3 домени. Також в даний винахід включені антиген-зв’язуючі ділянки, що також включають будь-яку комбінацію варіабельного домену(ів) з «шарнірною» областю, CL, CH1, CH2 та CH3 доменами. [0031] Антитіла придатні для використання в даному винаході, можуть походити від будьякої тварини, включаючи птахів та ссавців. Переважно антитіла мають походження від людини, гризуна (наприклад, миші, криси, морської свинки або кроля), курки, свині, вівці, кози, верблюда, корови, коня, осла, кота або собаки. Особливо переважно, щоб антитіла мали походження від людини або мишей. Як використовується у даному документі, "антитіла людини" включають антитіла, що мають послідовність амінокислот імуноглобуліну людини, та включають антитіла, вибрані з бібліотек імуноглобулінів людини або від тварин, трансгенних стосовно одного або декількох імуноглобулінів людини, та що не експресують ендогенні імуноглобуліни, як описано, наприклад, в патенті США № 5939598 Kucherlapati & Jakobovits. [0032] Термін "подібний антитілу білок" відноситься до білка, який сконструйовано (наприклад, шляхом мутагенезу петель) для специфічного зв’язування з молекулою-мішенню. Як правило, такий подібний антитілу білок містить щонайменше одну варіабельну пептидну петлю, прикріплену з обох кінців до каркасу білка. Таке подвійне структурне обмеження суттєво підвищує зв’язувальну афінність подібного антитілу білка до рівнів, порівнюваних з рівнями антитіла. Довжина варіабельної пептидної петлі складає, як правило, від 10 до 20 амінокислот. Каркасним білком може бути будь-який білок, що має хороші властивості розчинності. Переважно, каркасний білок представляє собою малий глобулярний білок. Подібні антитілам білки включають без обмеження афітіла, антикаліни та сконструйовані білки з анкіриновим повтором (для огляду дивись: Binz зі співавт, 2005). Подібні антитілам білки можуть бути отримані з великих бібліотек мутантів, наприклад, розділені методом пенінга завдяки великим бібліотекам фагового дисплея, та можуть бути виділені аналогічно нормальним антитілам. Також подібні антитілам зв’язуючі білки можуть бути одержані шляхом комбінаторного мутагенезу поверхневих залишків глобулярних білків. [0033] Вираз "аптамер нуклеїнової кислоти" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що сконструйована за допомогою повторюваних циклів селекції in vitro або SELEX (систематичної еволюції лігандів експоненціальним збагаченням) для зв’язування з молекулоюмішенню (для огляду дивись: Brody and Gold, 2000). Аптамер нуклеїнової кислоти може бути молекулою ДНК або РНК. Аптамери можуть містити модифікації, наприклад, модифіковані нуклеотиди, такі як 2'-фтор-заміщені піримідини. [0034] Як використовується у даному документі, "хімічне похідне" (або коротше: "похідне") сполуки відноситься до зразку, який має хімічну структуру, схожу до сполуки, крім того містить щонайменше одну хімічну групу, не присутню в сполуці, та/або позбавлений щонайменше однієї хімічної групи, що присутня в сполуці. Сполука, з якою порівнюють похідне, відома як "вихідна" сполука. Як правило, "похідне" можна отримати з вихідної сполуки за один або декілька етапів хімічних реакцій. [0035] Як застосовується у даному документі, "аналог" сполуки є структурно спорідненим, але не ідентичним сполуці, та проявляє щонайменше одну активність сполуки. Сполука, з якою порівнюють аналог, відома як "вихідна" сполука. Вищезгадані активності включають, без обмеження: активність зв’язування з іншою сполукою; активність інгібування, наприклад, активність інгібування ферменту; токсичну дію; активність активізації, наприклад, активність активізації ферменту. Не вимагається, щоб аналог проявляв таку активність в тій же мірі, що вихідна сполука. Сполуку розглядають як аналог в контексті даної заявки, якщо вона проявляє відповідну активність у величині щонайменше 1 % (більш переважно щонайменше 5%, більш переважно щонайменше 10%, більш переважно щонайменше 20%, більш переважно щонайменше 30%, більш переважно щонайменше 40% та більш переважно щонайменше 50%) від активності вихідної сполуки. Таким чином, "аналог аматоксину", як використовується в даному документі, відноситься до сполуки, яка по своїй структурі є спорідненою до будь-якого з -аманітину, -аманітину, -аманітину, -аманітин, аманіну, аманінаміду, амануліну та аманулінової кислоти, як показано на Фіг. 1, та яка проявляє щонайменше 1% (більш переважно щонайменше 5%, більш переважно щонайменше 10%, більш переважно щонайменше 20%, 4 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більш переважно щонайменше 30%, більш переважно щонайменше 40%, та більш переважно щонайменше 50%) активність інгібування щодо РНК полімерaзи II ссавців у порівнянні щонайменше з одним з -аманітину, -аманітину, -аманітину, -аманітину, аманіну, аманінаміду, амануліну та аманулінової кислоти. "Аналог аматоксину", придатний для застосування в даному винаході, може проявляти навіть більшу активність інгібування стосовно РНК полімерaза II ссавців, ніж будь-який з -аманітину, -аманітину, -аманітину, -аманітину, аманіну, аманінаміду, амануліну або аманулінової кислоти. Активність інгібування можна виміряти шляхом визначення концентрації, при якій відбувається 50% інгібування (величина IC50). Активність інгібування щодо РНК полімерaзи II ссавців можна визначити опосередковано шляхом вимірювання активності інгібування клітинної проліферації. Придатний аналіз для вимірювання інгібування клітинної проліферації описаний в прикладах. [0036] "Напівсинтетичний аналог" відноситься до аналога, який можна одержати шляхом хімічного синтезу із застосуванням сполук з природних джерел (наприклад, рослинних матеріалів, культур бактерій або культур клітин) в якості вихідних матеріалів. Як правило, "напівсинтетичний аналог" даного винаходу синтезували, виходячи зі сполуки, виділеної з гриба родини Аманітових. На відміну від цього, "синтетичний аналог" відноситься до аналога, синтезованого шляхом так званого повного синтезу з малих (як правило, нафтохімічних) складових. Як правило, такий повний синтез проводять без допомоги біологічних процесів. [0037] Як застосовується у даному документі, "кон'югат аптамера" відноситься до кон'югату токсину з мішень-зв'язуючим фрагментом, в якому мішень-зв'язуючий фрагмент представляє собою аптамер нуклеїнової кислоти, згідно вищеприведеного варіанту (iii). [0038] "Лінкер" в контексті даного винаходу відноситься до молекули, яка з'єднує два компоненти, при цьому кожний прикріплений до одного кінця лінкера, та яка збільшує відстань між двома компонентами та послаблює просторовий вплив цих компонентів, у даному випадку, наприклад, мішень-зв'язуючий фрагмента на аматоксин. За відсутності лінкера безпосередній зв’язок аматоксину з мішень-зв'язуючим фрагментом може зменшити здатність аматоксину взаємодіяти з РНК полімерaзою II. В конкретних варіантах здійснення лінкер має безперервні ланцюги з 1-30 атомами (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 атомами) в його скелеті, тобто довжину лінкера визначають як найкоротше з’єднання, вимірюване числом атомів або зв’язків між фрагментом аматоксину та мішень-зв'язуючим фрагментом, де одна сторона скелета лінкера вступає в реакцію з аматоксином, а інша сторона - з мішень-зв'язуючим фрагментом. В контексті даного винаходу лінкер переважно представляє собою C 1-20-алкіленову, C1-20-гетероалкіленову, C2-20алкеніленову, C2-20-гетероалкеніленову, C2-20-алкініленову, C2-20-гетероалкініленову, циклоалкіленову, гетероциклоалкіленову, ариленову, гетероариленову, аралкіленову або гетероаралкіленову групу, необов’язково заміщену. Лінкер може включати один або декілька структурних елементів, таких як фрагменти карбоксаміду, естеру, ефіру, тіоефіру, дисульфіду, сечовини, тіосечовини, вуглеводню і т. п. Лінкер також може містити комбінації з двох або більше таких структурних елементів. Кожний з таких структурних елементів може бути присутнім в лінкері більше одного разу, наприклад, двічі, три рази, чотири рази, п’ять разів або шість разів. В деяких варіантах здійснення лінкер може містити дисульфідний зв’язок. Зрозуміло, що лінкер має приєднатися до аматоксину та до фрагмента, який зв’язується з мішенню, або за один етап, або за два або більше послідовних етапів. В зв’язку з цим лінкер буде нести дві групи, переважно на проксимальному та дистальному кінці, і може (i) утворювати ковалентний зв’язок з групою, присутньою у одного з компонентів, що має бути приєднаним, переважно з активованою групою на аматоксині або з пептидом, що зв’язується з мішенню, або (ii) є або може бути активованим для утворення ковалентного зв’язку з групою на аматоксині. Таким чином переважним є те, щоб хімічні групи знаходились на дистальному та проксимальному кінці лінкера, що є результатом такої реакції зв'язування, як наприклад, естерний, ефірний, уретановий, пептидний зв’язок і т.д. [0039] В контексті даного винаходу термін "аматоксин" включає всі циклічні пептиди, що складаються з 8 амінокислот, які виділені з роду Аманіта та описані Wieland, T. та Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3): 185-260), та крім того включає всі його хімічні похідні, додатково всі його напівсинтетичні аналоги, додатково всі його синтетичні аналоги, складені зі складових згідно основної структури природних сполук (циклічних, 8 амінокислот), додатково всі синтетичні або напівсинтетичні аналоги, що містять негідроксильовані амінокислоти замість гідроксильованих амінокислот, додатково всі синтетичні або напівсинтетичні аналоги, у яких фрагмент сульфоксиду тіоефіру заміщений сульфідом, сульфоном або атомами, відмінними від сірки, наприклад, атомом вуглецю, як в карбо-аналога аманітину, в кожному випадку, де будь-яке таке похідне або аналог є функціонально активним 5 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щодо інгібування РНК полімерaзи II ссавців. [0040] Функціонально аматоксини визначені як пептиди або депсипептиди, які інгібують РНК полімерaзу II ссавців. Переважними є аматоксини з функціональною групою (наприклад, карбоксильною групою, аміногрупою, гідроксигрупою, тіоловою або тіол-захоплюючою групою), що може вступати в реакцію з лінкерними молекулами або мішень-зв'язуючими фрагментами, як визначено вище. Аматоксинами, особливо придатними для кон'югатів даного винаходу, є аманітин, -аманітин, -аманітин, -аманітин, аманін, аманінамід, аманулін та аманулінова кислота, як показано на Фіг. 1, а також їх солі, хімічні похідні, напівсинтетичні аналоги та синтетичні аналоги. Особливо переважними аматоксинами для застосування в даному винаході є -аманітин, -аманітин та аманінамід. [0041] В контексті даного винаходу термін "приєднаний до мішень-зв'язуючого фрагменту через фрагмент сечовини" відноситься до з’єднання між лінкером та мішень-зв'язуючим фрагментом, де мішень-зв'язуючий фрагмент безпосередньо приєднаний до лінкера через -NHC(О)-NH- групу. [0042] В переважних варіантах здійснення даного винаходу кон'югат має структуру, вибрану з наступних структур: аматоксин-C(О)-NH-L-NH-C(О)-NH-мішень-зв'язуючий фрагмент; аматоксин-C-О-C(О)-L-NH-C(О)-NH-мішень-зв'язуючий фрагмент; аматоксин-C-О-L-NH-C(О)-NH-мішень-зв'язуючий фрагмент; аматоксин-C-О-C(О)-NH-L-NH-C(О)-NH-мішень-зв'язуючий фрагмент та аматоксин-6'C-О-L-NH-C(О)-NH-мішень-зв'язуючий фрагмент. [0043] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу мішень-зв'язуючий фрагмент приєднаний до лінкера L через аміногрупу, присутню в мішень-зв'язуючому фрагменті, де вказана аміногрупа утворює частину вказаного фрагменту сечовини. [0044] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу аматоксин вибраний з аманітину, -аманітину, -аманітину, -аманітину, аманіну, аманінаміду, амануліну або аманулінової кислоти або з їх солей або аналогів. [0045] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу лінкер L містить одну або декілька груп, зокрема одну, дві або три групи, вибрані зі списку з: алкіленової, алкеніленової, алкініленової, циклоалкіленової, гетероалкіленової, гетероалкеніленової, гетероалкініленової, гетероциклоалкіленової, ариленової, гетероариленової, аралкіленової та гетероаралкіленової групи, де кожна група окремо може бути необов’язково заміщеною. [0046] Термін "алкілен" відноситься до двовалентного прямого ланцюга, насиченого вуглеводневими групами, що мають від 1 до 20 атомів вуглецю, включаючи групи, що мають від 1 до 10 атомів вуглецю. У деяких варіантах здійснення алкіленові групи можуть бути нижчими алкіленовими групами. Вираз "нижчий алкілен" відноситься до алкіленових груп, що мають від 1 до 6 атомів вуглецю, та у деяких варіантах здійснення від 1 до 5 або від 1 до 4 атомів вуглецю. Приклади алкіленових груп включають, але без обмеження, метилен (-CH2-), етилен (-CH2-CH2), н-пропілен, н-бутилен, н-пентилен та н-гексилен. [0047] Термін "алкенілен" відноситься до груп двовалентних прямих ланцюгів, що мають від 2 до 20 атомів вуглецю, де щонайменше один зі зв’язків вуглець-вуглець є подвійним зв’язком, тоді як інші зв’язки можуть бути одинарними зв’язками або також подвійними зв’язками. Термін "алкінілен" в даному документі відноситься до груп, що мають від 2 до 20 атомів вуглецю, де щонайменше один зі зв’язків вуглець-вуглець є потрійним зв’язком, тоді як інші зв’язки можуть бути одинарними, подвійними або також потрійними зв’язками. Приклади алкеніленових груп включають етенілен (-CH=CH-), 1-пропенілен, 2-пропенілен, 1-бутенілен, 2-бутенілен, 3бутенілен і т. п. Приклади алкініленових груп включають етинілен, 1-пропінілен, 2-пропінілен і т. д. [0048] Як використовується у даному документі, "циклоалкілен" призначений для позначення двовалентного кільця, що являється частиною будь-якої стійкої моноциклічної або поліциклічної системи, де таке кільце має від 3 до 12 атомів вуглецю, але не гетероатом, та де таке кільце повністю насичене, і вираз "циклоалкенілен" призначений для позначення двовалентного кільця, що являється частиною будь-якої стійкої моноциклічної або поліциклічної системи, де таке кільце має від 3 до 12 атомів вуглецю, але не гетероатомів, та де таке кільце щонайменше частково ненасичене (але за виключенням будь-якого ариленового кільця). Приклади циклоалкіленів включають, але без обмеження, циклопропілен, циклобутилен, циклопентилен, циклогексилен та циклогептилен. Приклади циклоалкеніленів включають, але без обмеження, циклопентенілен та циклогексенілен. [0049] Як використовується у даному документі, вирази "гетероциклоалкілен" та "гетероциклоалкенілен" призначені для позначення двовалентного кільця, що являється 6 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частиною будь-якої стійкої моноциклічної або поліциклічної кільцевої системи, де таке кільце має від 3 до приблизно 12 атомів, та де таке кільце складається з атомів вуглецю та щонайменше одного гетероатома, зокрема щонайменше одного гетероатома, незалежно вибраного з групи, що складається з N, O та S, при цьому гетероциклоалкілен відноситься до такого кільця, яке повністю насичене, та гетероциклоалкенілен відноситься до кільця, яке щонайменше частково ненасичене (але за виключенням будь-якого ариленового або гетероариленового кільця). [0050] Термін "арилен" призначений для позначення двовалентного кільця або кільцевої системи, що є частиною будь-якої стійкої моноциклічної або поліциклічної системи, де таке кільце або кільцева система має від 3 до 20 атомів вуглецю, але не має гетероатому, чиє кільце або кільцева система складається з ароматичного фрагменту, як визначено завдяки "4n+2" правилу -електронів, включаючи фенілен. [0051] Як використовується у даному документі, термін "гетероарилен" відноситься до двовалентного кільця або кільцевої системи, що являється частиною будь-якої стійкої моно- або поліциклічної системи, де таке кільце або кільцева система має від 3 до 20 атомів, чиє кільце або кільцева система складається з ароматичного фрагменту, як визначено завдяки "4n+2" правилу -електронів, та містить атоми вуглецю та один або декілька гетероатомів азоту, сірки та/або кисню. [0052] В контексті даного винаходу термін "заміщений" призначений для позначення того, що один або декілька атомів водню, присутніх в скелеті лінкера, заміщені на вибір вказаною групою (групами), за умови, що нормальна валентність позначеного атому або відповідного атому групи, яка заміщена, не перевищує заданого значення, та що заміщення приводить до стійкої сполуки. Термін "необов’язково заміщений" призначений для позначення, що лінкер є або незаміщеним, або заміщеним, як визначено в даному документі, одним або декількома замісниками, як визначено в даному документі. Якщо замісником є кетогрупа (або оксо, тобто =О), тіо- або іміногрупа або подібна, тоді два атоми водню з атомів на лінкерному скелеті є заміщеними. Типові замісники включають, наприклад, алкіл, алкеніл, алкініл, циклоалкіл, гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, аралкіл, гетероаралкіл, ацил, ароїл, гетероароїл, карбоксил, алкокси, арилокси, ацилокси, ароїлокси, гетероароїлокси, алкоксикарбоніл, галоген, тіоестер, ціано, фосфорил, аміно, іміно, (тіо)амідо, сульфгідрил, алкілтіо, ацилтіо, сульфоніл, сульфат, сульфонат, сульфамоїл, сульфонамід, нітро, азидо, галогеналкіл, включаючи перфторалкіл (такий як трифторметил), галогеналкокси, алкілсульфаніл, алкілсульфініл, алкілсульфоніл, алкілсульфоніламіно, арилсульфонаміно, фосфорил, фосфат, фосфонат, фосфінат, алкілкарбокси, алкілкарбоксиамід, оксо, гідрокси, меркапто, аміно (необов’язково моно- або двозаміщений, наприклад, алкілом, арилом або гетероарилом), іміно, карбоксамід, карбамоїл (необов’язково моно- або двозаміщений, наприклад, алкілом, арилом або гетероарилом), амідіно, аміносульфоніл, ациламіно, ароїламіно, (тіо)уреїдо, арил(тіо)уреїдо, алкіл(тіо)уреїдо, циклоалкіл(тіо)уреїдо, арилокси, аралкокси або -О(CH2)n-OH, -О(CH2)n-NH2, О(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(О)О(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(О)OR або -N(R)S(О)2R, де n дорівнює 1-4, та R незалежно вибраний з водню, -алкілу, -алкенілу, -алкінілу, -циклоалкілу, циклоалкенілу, -(C-зв’язаного гетероциклоалкілу), -(C-зв’язаного гетероциклоалкенілу), -арилу та -гетероарилу з багатократними ступенями дозволеного заміщення. Фахівцю в даній галузі буде зрозумілим, що замісники, такі як гетероциклоалкіл, арил, гетероарил, алкіл і т. п., або функціональні групи, такі як -OH, -NHR і т. д., самі по собі можуть бути заміщені, якщо це доцільно. Також фахівцю в даній галузі буде зрозумілим, що заміщені фрагменти самі по собі можуть бути також заміщені, коли це доцільно. [0053] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу лінкер L, зокрема лінкер L, як вказано в абзаці [0042] або абзаці [0081], містить m груп, вибраних із списку з: алкіленової, алкеніленової, алкініленової, циклоалкіленової, гетероалкіленової, гетероалкеніленової, гетероалкініленової, гетероциклоалкіленової, ариленової, гетероариленової, аралкіленової та гетероаралкіленової групи, де кожна група окремо необов’язково може бути заміщеною, при цьому лінкер додатково містить n фрагментів, незалежно вибраних з наступних фрагментів: фрагменту дисульфіду (-S-S-), ефіру (-О-), тіоефіру (-S-), аміну (-NH-), естеру (-О-C(=О)- або C(=О)-О-), карбоксаміду (-NH-C(=О)- або -C(=О)-NH-), уретану (-NH-C(=О)-О- або -О-C(=О)-NH-) та сечовини (-NH-C(=О)-NH-), де m = n+1. В конкретних варіантах здійснення m дорівнює 2, та n дорівнює 1, або m дорівнює 3, та n дорівнює 2. В конкретних варіантах здійснення лінкер включає 2 або 3 незаміщені алкіленові групи та 1 або 2, відповідно, фрагменти дисульфіду, ефіру, тіоефіру, аміну, естеру, карбоксаміду, уретану або сечовини, зв’язуючи незаміщені алкіленові групи. [0054] В конкретних варіантах здійснення лінкер L, зокрема лінкер L, як показано в абзаці 7 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0042], представляє собою лінійний ланцюг з 2-20 атомами, незалежно вибраними з C, O, N та S, зокрема з 2-16 атомами, конкретніше 5-14 атомами, та ще більш конкретно 6-12 атомами. В конкретних варіантах здійснення щонайменше 60% атомів в лінійному ланцюзі представляють собою атоми C. В конкретних варіантах здійснення атоми в лінійному ланцюзі зв’язані одинарними зв’язками. [0055] В конкретних варіантах здійснення атоми C в лінійному ланцюзі незалежно являються частиною необов’язково заміщених метиленових груп (-CH2-). В таких конкретних варіантах здійснення необов’язкові замісники незалежно вибрані з галогену та С 1-6-алкілу, зокрема метилу. [0056] В конкретних варіантах здійснення лінкер L, зокрема лінкер L, як вказано в абзаці [0042] або абзаці [0081], вибраний з наступної групи лінкерів: сторона аматоксину: -(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)3- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)4- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)5- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)6- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)7- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)8- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)9- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)10- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)11- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)12- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)16- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-S-S-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)3-S-S-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-S-S-(CH2)3- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)3-S-S-(CH2)3- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)4-S-S-(CH2)4- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-О-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-О-(CH2)2-О-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-О-(CH2)2-О-(CH2)2-О-(CH2)2- сторона мішень-зв'язуючого фрагменту; сторона аматоксину: -(CH2)2-О-(CH2)2-О-(CH2)2-О-(CH2)2-О-(CH2)2сторона мішеньзв'язуючого фрагменту. [0057] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу мішень-зв'язуючий фрагмент специфічного зв’язується з епітопом, що присутній на пухлинній клітині. [0058] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу мішень-зв'язуючий фрагмент специфічно зв’язується з епітопом Her-2/neu або молекулою адгезії епітеліальних клітин (EpCAM). [0059] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу мішень-зв'язуючий фрагмент, вибраний з групи, що складається з антитіла або його антиген-зв’язуючої ділянки, подібного антитілу білка та аптамера нуклеїнової кислоти. [0060] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу антитіло або його антигензв’язуюча ділянка вибрані з диатіла, тетратіла, нанотіла, химерного антитіла, деімунізованого антитіла, гуманізованого антитіла або антитіла людини. [0061] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу антиген-зв’язуюча ділянка вибрана з групи, що складається з Fab, F(ab') 2, Fd, Fv, одноланцюгового Fv та дисульфідзв’язаних Fv (dsFv). [0062] В конкретних варіантах здійснення антитіло представляє собою герцептин або HEA125, або ділянку антитіла, що містить антиген-зв’язуючу ділянку герцептину або HEA125. [0063] В конкретних варіантах здійснення більш ніж одна молекула аматоксину зшита з однім мішень-зв'язуючим фрагментом. Підвищення числа аматоксинів на кон'югат також буде підвищувати токсичність. Таким чином, в конкретному варіанті здійснення співвідношення мішень-зв'язуючих фрагментів до аматоксину складає від 1 мішень-зв'язуючого фрагменту до 215 молекул аматоксину, зокрема 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15. З метою розрахунку співвідношення у випадку димерів антитіл, таких як IgG, димер розглядають як один мішень-звязуючий фрагмент. [0064] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу кон'югат призначений для 8 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування в якості лікарського препарату. [0065] В конкретних варіантах здійснення даного винаходу кон'югат призначений для лікування раку у пацієнта, де рак вибраний з групи, що складається з раку підшлункової залози, холангіокарциноми, раку молочної залози, раку прямої і ободової кишки, раку легені, раку передміхурової залози, раку яєчника, раку шлунка, раку нирки, злоякісної меланоми, лейкозу та лімфосаркоми. [0066] Як використовується у даному документі, "пацієнт" означає будь-якого ссавця або птаха, що може отримати користь від лікування за допомогою кон'югатів токсину з мішеньзв'язуючим фрагментом, описаних в даному документі. Переважно "пацієнт" вибраний з групи, що складається з лабораторних тварин (наприклад, мишей або щурів), домашніх тварин (включаючи, наприклад, морську свинку, кроля, курку, свиню, вівцю, козу, верблюда, корову, коня, осла, кота або собаку) або приматів, а також людей. Особливо переважно, щоб "пацієнтом" була людина. [0067] Як застосовується у даному документі, "лікувати", "курс лікування" або "лікування" захворювання або розладу означає виконання одного або декількох з наступного: (a) послаблення тяжкості розладу; (b) обмеження або попередження розвитку вираженості симптомів розладу(ів), що підлягає лікуванню; (c) затримку наростання вираженості симптомів розладу(ів), що підлягає лікуванню; (d) обмеження або попередження повторного прояву розладу(ів) у пацієнтів, які раніше мали розлад(и), та (e) обмеження або попередження повторного прояву симптомів у пацієнтів, які раніше були з клінічними проявами розладу(ів). [0068] Як використовується у даному документі, лікування може включати прийом кон'югату або фармацевтичної композиції за даним винаходом пацієнтом, де "прийом" включає введення in vivo, а також введення безпосередньо в тканину ex vivo, наприклад, венозних трансплантатів. [0069] В конкретних варіантах здійснення застосовують терапевтично ефективну кількість кон'югату даного винаходу. [0070] "Терапевтично ефективна кількість" представляє собою достатню кількість терапевтичного засобу для досягнення наміченої мети. Ефективна кількість даного терапевтичного засобу буде змінюватися в залежності від факторів, таких як природа засобу, спосіб введення, розмір та вид тварини, що отримує терапевтичний засіб, та мета введення. Ефективна кількість у кожному окремому випадку може бути встановлена емпірично фахівцем у даній галузі згідно загальновизнаних способів в даній галузі техніки. [0071] В другому аспекті даний винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить кон'югат за даним винаходом, додатково містить один або декілька фармацевтично прийнятних розріджувачів, носіїв, наповнювачів, заповнювачів, зв’язуючих речовин, змащувальних засобів, засобів, що забезпечують плинність, розпушувачів, адсорбентів та/або консервантів. [0072] "Фармацевтично прийнятний" означає схвалений контролюючим органом федерального уряду або уряду держави або занесений до списку Фармакопеї США або іншої загальноприйнятої фармакопеї для застосування у тварин та більш конкретно у людей. [0073] В конкретних варіантах здійснення фармацевтичну композицію застосовують у вигляді лікарського препарату, який вводять системно. Такий охоплює парентеральні препарати, які включають серед інших препарати для ін'єкцій та інфузії. Препарати для ін'єкцій складені або у вигляді ампул, або так званих готових для застосування препаратів для ін'єкцій, наприклад, готових для застосування шприців або одноразових шприців, та за виключенням цього у вигляді флаконів з пробками що проколюються для багаторазового забору. Введення препаратів для ін'єкцій може бути у вигляді підшкірного (s.c), внутрішньом'язового (i.m.), внутрішньовенного (i.v.) або внутрішньошкірного (i.e.) використання. Зокрема, можна отримувати відповідно придатні ін'єкційні склади в якості суспензії кристалів, розчинів, систем у вигляді наночастинок або колоїднодисперсних систем, таких як, наприклад, гідрозолі. [0074] Склади для ін'єкцій також можна отримати у вигляді концентратів, які можуть бути розчинені або дисперговані у водних ізотонічних розріджувачах. Інфузію також можна отримати у вигляді ізотонічних розчинів, жирових емульсій, ліпосомальних складів та мікроемульсій. Подібно препаратам для ін'єкцій склади для інфузій також можна отримати у вигляді концентратів для розведення. Склади для ін'єкцій також можуть бути використані у вигляді тривалих вливань як при стаціонарному, так і при амбулаторному лікуванні, наприклад, за допомогою міні-насосів. [0075] До парентеральних лікарських складів можна додавати, наприклад, альбумін, плазму, речовину для збільшення об'єму, поверхнево-активні речовини, органічні розріджувачі, речовини, які впливають на pH, комплексоутворюючі речовини або полімерні речовини, зокрема в якості речовин, які впливають на адсорбцію кон'югатів токсину з мішень-зв'язуючим 9 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагментом даного винаходу білками або полімерами, або їх можна також додавати з метою зменшити адсорбцію кон'югатів токсину мішень-зв'язуючим фрагментом даного винаходу матеріалами, подібними до інструментів для ін'єкцій або пакувальних матеріалів, наприклад, пластиком або склом. [0076] Кон’югати токсину з мішень-зв'язуючим фрагментом даного винаходу можуть бути зв’язані з мікроносіями або наночастинками в парентеральних препаратах, подібних, наприклад, тонкодисперсним частинкам, на основі полі(мет)акрилатів, полілактатів, полігліколятів, поліамінокислот або поліефіроуретанів. Парентеральні склади також можуть бути модифіковані як депо-препарати, наприклад, основані на "системі доставки на основі множинних одиниць дозування", якщо кон’югати токсину з мішень-зв'язуючим фрагментом даного винаходу введені в тонкодисперсні, дисперговані та суспендовані форми, відповідно, або як суспензія кристалів в лікарському препараті або основані на "системі доставки на основі однієї дозувальної одиниці", якщо кон'югат токсину з мішень-зв'язуючим фрагментом даного винаходу включений в склад, наприклад, в таблетку або стержень, який потім вживлюють. Такі імплантати або депо-лікарські препарати пролонгованої дії в складах однократної дози та багатократної дози часто складаються з так званих полімерів, які піддаються біологічному розкладанню, таких як, наприклад, поліестери молочної кислоти та гліколевої кислоти, поліефіруретани, поліамінокислоти, полі(мет)акрилати або полісахариди. [0077] Допоміжні засоби та носії, додані під час одержання фармацевтичних композицій даного винаходу, складених як парентеральні препарати, переважно представляють собою aqua sterilisata (стерилізовану воду), речовини, які впливають на величину pH, такі як, наприклад, органічні або неорганічні кислоти або основи, а також їх солі, буферні речовини для доведення pH величин, речовини для ізотонізації, такі як, наприклад, хлорид натрію, гідрокарбонат натрію, глюкоза та фруктоза, тензиди та поверхнево-активні речовини, відповідно, та емульгатори, такі як, наприклад, неповні естери жирних кислот і поліоксиетиленсорбітанів (наприклад, Tween®), або, наприклад, естери жирних кислот і поліоксиетиленів (наприклад, Cremophor®), жирні масла, такі як, наприклад, арахісова олія, соєва олія або рицинова олія, синтетичні естери жирних кислот, такі як, наприклад, етилолеат, ізопропілміристат та нейтральне масло (наприклад, Miglyol®), а також полімерні допоміжні засоби, такі як, наприклад, желатин, декстран, полівінілпіролідон, добавки, які підвищують розчинність органічних розчинників, такі як, наприклад, пропіленгліколь, етанол, Ν,Νдиметилaцетамід, пропіленгліколь, або речовини, які утворюють комплекси, такі як, наприклад, цитрат та сечовина, консерванти такі як, наприклад, гідроксипропіловий естер бензойної кислоти та метиловий естер, бензиловий спирт, антиоксиданти, такі як, наприклад, сульфіт натрію, та стабілізатори, такі як, наприклад, EDTA. [0078] При складанні фармацевтичних композицій даного винаходу в якості суспензій, в переважному варіанті здійснення додають загусники для попередження осадження кон'югатів токсину з мішень-зв'язуючим фрагментом або тензиди та поліелектроліти для забезпечення ресуспендованості осадів, та/або засоби, що утворюють комплекси, такі як, наприклад, EDTA. Також можна забезпечити комплекси активного інгредієнту з різноманітними полімерами. Прикладами таких полімерів є поліетиленгліколь, полістирол, карбоксиметилцелюлоза, Pluronics® або естер поліетиленглікольсорбіту та жирної кислоти. Кон’югати токсину і мішеньзв'язуючого фрагменту даного винаходу також можуть бути включені в рідкі склади у вигляді сполук включення, наприклад, з циклодекстринами. В конкретних варіантах здійснення диспергуючі засоби можна додавати в якості додаткових допоміжних засобів. Для одержання ліофілізатів можна застосовувати засоби для утворення каркасу, такі як маніт, декстран, сахароза, альбумін людини, лактоза, PVP або різновиди желатину. [0079] В додатковому аспекті даний винахід направлений на спосіб лікування раку підшлункової залози, холангіокарциноми, раку молочної залози, раку прямої і ободової кишки, раку легені, раку передміхурової залози, раку яєчника, раку шлунка, раку нирки, злоякісної меланоми, лейкозу або лімфосаркоми у пацієнта, який потребує цього, який включає прийом пацієнтом ефективної кількості кон'югату або фармацевтичної композиції даного винаходу. [0080] В іншому аспекті даний винахід відноситься до кон’югаційної молекули аматоксину в якості посередника для синтезу кон'югатів даного винаходу, де кон’югаційна молекула аматоксину включає лінкер L, з'єднаний з аматоксином через (i)  C-атом амінокислоти 1 аматоксину, зокрема через амідний місток; (ii) через атом кисню, зв’язаний з  C-атомом амінокислоти 3 аматоксину, зокрема через естерний місток, ефірний місток або уретановий місток; або (iii) 6'C-атом амінокислоти 4 аматоксину, зокрема через зв’язок через атом кисню з 6'Cатомом амінокислоти 4 аматоксину; 10 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 в кожному випадку, де лінкер L включає похідне карбамінової кислоти -NH-C(О)-X, де X представляє собою групу, що відходить, яка може бути заміщеною первинним аміном мішеньзв'язуючого фрагменту. [0081] В одному варіанті здійснення кон'югаційна молекула аматоксину має структуру, вибрану з наступних структур: (i) аматоксин-C(О)-NH-L-NH-C(О)-X; (ii) аматоксин-C-О-C(О)-L-NH-C(О)-X; (iii) аматоксин-C-О-L-NH-C(О)-X; (iv) аматоксин-C-О-C(О)-NH-L-NH-C(О)-X та (v) аматоксин-6'C-О-L-NH-C(О)-X. [0082] У певних варіантах здійснення аматоксин вибраний з -аманітину, -аманітину, аманітину, -аманітину, аманіну, аманінаміду, амануліну або аманулінової кислоти або з їх солей або аналогів. [0083] У певних варіантах здійснення лінкер L представляє собою алкіленову, гетероалкіленову, алкеніленову, гетероалкеніленову, алкініленову, гетероалкініленову, циклоалкіленову, гетероциклоалкіленову, ариленову, гетероариленову, аралкіленову або гетероаралкіленову групу, необов’язково заміщену. [0084] У певних варіантах здійснення лінкер L включає фрагмент, вибраний з наступних фрагментів: фрагменту дисульфіду, ефіру, аміну, естеру, карбоксаміду, уретану та сечовини. [0085] У певних варіантах здійснення функціональна група X вибрана з: t - бутилокси, -сукцинімідилокси, -1-О-сукцинімідилокси-3-сульфонату (-сульфо-NHS), -О-(4нітрофенілокси), -О-(3-нітрофенілокси), -О-(2,4-динітрофенілокси), -О-(2,4-дихлор-6нітрофенілокси), -пентафторфенілокси, -пентахлорфенілокси, -О-(2,4,5-трихлорфенілокси), -О-(3,4-дигідро-3-гідрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин-3-ілу), -О(ендо-1-гідрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксімід-1-ілу), -1-фталімідоїлокси, -1бензотриазолілокси, -1-(7-аза-бензотриазоліл)окси) та -N-імідазолілу. [0086] В ще одному аспекті даний винахід відноситься до способу синтезу кон’югату аматоксину даного винаходу, який включає етап реакції кон’югаційної молекули аматоксину даного винаходу з мішень-зв’язуючим фрагментом, що містить первинну аміногрупу. Приклади Нижче даний винахід пояснюється більш детально за допомогою необмежуючих прикладів. Приклад 1 Синтез кон'югату антитіла герцептин з -аманітином, Her-DSC-30.0134 1.1 Синтез 6´-NH-boc-(6-аміногексил)--аманітину HDP 30.0132 35 40 45 [0087] Під аргоном та при кімнатній температурі 30,00 мг (32,6 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину розчинили в 900 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO). Додали 3,66 мг (32,6 мкмоль) трет-бутилату калію та 73,18 мг (261,2 мкмоль, 8 екв.) NH-boc-аміногексилброміду (Fluka 89171). Через 6 годин при кімнатній температурі реакційну суміш підкислили до pH = 5 за допомогою 50 мкл 0,33 M розчину оцтової кислоти в DMSO. Леткі компоненти випарили у вакуумі, розчинили залишок в 1000 мкл метанолу та розвели 20 мл диетилового ефіру. Зібрали осад та помістили в 1000 мкл метанолу. Даний розчин розвели 1000 мкл води та застосували для очищення на LaPrep-ВЕРХ: (колонка: Kromasil 100-C18, 250 мм x 20 мм, 10 мкм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм). Розчинник A: 95% води : 5% метанолу : 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу : 0,05% трифтороцтової кислоти. 11 UA 111341 C2 Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-40 хвилин 0% A. [0088] Зібрали фракцію з часом утримування 19,8 хвилин та випарили розчинники. + + [0089] 15,9 мг порошку (вихід 43%). MS: 1119 (M+H ); 1141 (M+Na ). 1.2 Синтез 6`-(-6-аміногексил)--аманітину HDP 30.0134 5 10 15 20 [0090] В 250 мкл трифтороцтової кислоти розчинили 9,90 мг (8,85 мкмоль) 6'-NH-boc-6аміногексил--аманітину HDP 30.0132. Реакційну суміш перемішали під аргоном при температурі навколишнього середовища. Через 2 хвилини кислоту видалили у вакуумі при 20°C та висушили залишок. Неочищений ефір аманітину очистили на LaPrep-ВЕРХ: [0091] (колонка: Kromasil 100-C18, d = 10 мм, 10 мкм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 6 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм). Розчинник A: 95% води : 5% метанолу : 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу : 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-25 хвилин 50% A; 25-30 хвилин 0% A; 30-35 хвилин 0% A ; 35-40 хвилин 100% A, 40-45 хвилин 100% A. [0092] Зібрали фракції з однаковим часом утримування (14,5 хвилин) та випарили розчинники. + + [0093] 9,10 мг білого порошку (вихід 99%). MS: 1019 (M+H ); 1041 (M+Na ). 1.3 Синтез похідного HDP 30.0134 з антитілом, Her-DSC-30.0134 Схема 1 25 30 [0094] На схемі 1 (та інших схемах, показаних в прикладах) герцептин представлений схематичною формулою, в якій показаний один лізиновий бічний ланцюг з R3 та R4, що представляють решту білка антитіла герцептину. 1.3.1 Синтез кон'югату 6`-(-6-аміногексил-6-гідроксисукцинімідил)--аманітин-герцептину Her-DSC-30.0134 з різними навантаженнями токсину (Таблиця 2) [0095] В 538 мкл безводного диметилформаміду (DMF) розчинили 5,00 мг 6`-(-6аміногексил)--аманітину HDP 30.0134. Під аргоном та перемішуючи при кімнатній температурі 12 UA 111341 C2 5 10 одночасно додали 18,6 мкл розчину дигідроксисукцинімідокарбонату (DSC) в DMF (2,56 мг в 100 мкл DMF) та 10,0 мкл триетиламіну. Реакційну суміш перемішали при кімнатній температурі. Через 12 годин додали 60 мл холодного диетилового ефіру. Зібрали осад -аманітин-6'-(-6аміногексил-6-гідроксисукцинімідилкарбонату), промили кілька раз диетиловим ефіром та висушили у вакуумі. Тверду речовину, що залишилася, помістили в 750 мкл DMF = розчин A. [0096] Розчинили 114,0 мг герцептину в 19,0 мл фосфатного буферного розчину (PBS, pH = 7,4) = розчин B. Таблиця 2 [0097] До 3 зразків розчину герцептину внесли різні кількості розчинів -аманітин-6'-(-6аміногексил-6-гідроксисукцинімідилкарбонату): Розчин А 152 мкл 242 мкл 290 мкл 15 20 25 30 Розчин В 11,0 мл 5,0 мл 3,0 мл Герцептин: аманітин-лінкер навантаження 1:1,3 1:4,3 1:7,5 Назва зразку Her-DSC-30.0134 [1.3] Her-DSC-30.0134 [4.3] Her-DSC-30.0134 [7.5] [0098] Три розчини герцептина з аманітин-лінкером струшували при 4°C впродовж 14 годин та розділили кожний шляхом гель-фільтраційної хроматографії на Sephadex G-25 (колонка XK16; 2 мл/хвилина). Колонку G-25 попередньо промили 500 мл розчинів PBS, pH = 7,4. Фракцію кон'югату Her-DSC-30.0134 визначили за допомогою УФ поглинання. Концентрацію білка визначили за допомогою RotiQuant-аналізу (Carl Roth; Німеччина). Навантаження герцептину аманітином визначили шляхом визначення УФ поглинання при A = 280 нм та A = 310 нм. Приклад 2 Синтез кон'югату антитіла герцептин з -аманітином, Her-DSC-30.0256 2.1 Одержання 1-ізоціанат-6-BocNH-аміногексану HDP 30.0247 [0099] В 35 мл дихлорметану розчинили 2,50 г (11,56 ммоль) NH-Boc-1,6гексаметилендиаміну (Aldrich 79229). Додали 35 мл насиченого розчину NaHCО 3 у воді. Після додавання 1,143 г (3,85 ммоль) біс-трихлорметилкарбонату (трифосгену) реакційну суміш інтенсивно перемішували при 0°C впродовж 30 хвилин. Відділили органічний шар та тричі екстрагували водну фазу 15 мл дихлорметану. Об'єднані органічні фази висушили над МgSO 4 та випарили. Залишок масла фракціонували при 150°C та 0,59 мбар в печі Kugelrohr. Чистого масла 2,23 г (80%) MS: 242 (M+). 2.2 Синтез -О-(NH-boc-6-аміногексилкарбамоїл)--аманітину HDP 30.0253 35 кат.: дибутилдилаурилстанат n-Bu2Sn[OCO(CH2)10CH3]2 [00100] В атмосфері аргону 13,43 мг (14,6 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину розчинили в 1000 мкл безводного диметилформаміду (DMF). Додали 7,08 мг (29,2 мкмоль) NHBoc-6-ізоціанатаміногексану та 18,46 мг (29,2 мкмоль) дибутилдилаурилстанату та перемішали 13 UA 111341 C2 5 10 15 20 реакційну суміш при температурі навколишнього середовища. Через 23 години додали додаткові 13,43 мг (14,6 мкмоль) NH-Boc-6-ізоціанатаміногексану. Через 52 години реакційну суміш гідролізували 200 мкл метанолу та випарили насухо. Залишок розчинили в 1200 мкл DMSO та очистили на LaPrep-ВЕРХ колонці: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води: 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 520 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. Зібрали фракції з однаковим часом утримування та випарили розчинники. + + [00101] 9,06 мг білої твердої речовини (вихід 53%). MS: 1161 (M+H ); 1183 (M+Na ). 2.3 Синтез -О-(6-аміногексилкарбамоїл)--аманітину HDP 30.0256 [00102] В 250 мкл трифтороцтової кислоти розчинили 9,06 мг (7,8 мкмоль) HDP 30.0253 та перемішували впродовж 2 хвилин при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш насухо випарили та залишок двічі випарили разом з 1,5 мл ацетонітрилу. Тверду речовину очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з ацетонітрилом/водою, потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води: 5% ацетонітрилу. Розчинник B: 5% води: 95% ацетонітрилу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00103] Зібрали фракції з часом утримування 12-17 хвилин та випарили до білої твердої речовини. + + [00104] 8,75 мг (вихід 95%). MS: (1061 M+H ); 1083 (M+Na ). 2.4 Синтез похідного HDP 30.0256 з антитілом, Her-DSC-30.0256 Схема 2 25 14 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 2.4.1 Синтез кон'югату герцептину з HDP-30.0256, Her-DSC-30.0256 [3.3] [00105] В 108 мкл безводного диметилформаміду (DMF) розчинили 1,00 мг HDP 30.0256. Під аргоном та перемішуючи при кімнатній температурі одночасно додали 10,0 мкл розчину дигідроксисукцинімідкарбонату (DSC) в DMF (2,56 мг в 100 мкл DMF) та 2,0 мкл триетиламіну. Реакційну суміш перемішали при кімнатній температурі. Після витримування протягом ночі додали 30 мл холодного диетилового ефіру. Зібрали осад, промили декілька разів диетиловим ефіром та висушили в вакуумі. Тверду речовину, що залишилася, помістили в 143 мкл DMF = розчин A. В 6,0 мл фосфатного буферного розчину (PBS, pH = 7,4) = розчин B розчинили 12,0 мг герцептину. Об'єднали розчин A та розчин B. Розчин герцептину з аманітин-лінкером збовтували при 4°C впродовж 14 годин та розділили шляхом гель-фільтраційної хроматографії на Sephadex G-25 (колонка XK-16; 2 мл/хвилина). Колонку G-25 попередньо промили 500 мл PBS розчину, pH = 7,4. Фракцію кон'югату Her-DSC-30.0256 визначили за допомогою УФ поглинання. Концентрацію білка визначили за допомогою RotiQuant-аналізу (Carl Roth; Німеччина). Навантаження герцептину аманітином визначили шляхом визначення УФ поглинання при A = 280 нм та A = 310 нм. Розрахували навантаження токсину 3,3 молекул аманітину для кожної молекули герцептину. Приклад 3 Синтез кон'югату антитіла герцептин з D-аманітином, Her-DSC-30.0304 3.1 BocNH-гексаметилендиаміно--аманітинамід HDP 30.0299 [00106] Під аргоном 4,65 мг (5,05 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину розчинили в 1000 мкл безводного диметилформаміду (DMF). При температурі навколишнього середовища додали 100 мкл 0,15 M розчину BocNH-гексаметилендиаміну в DMF та 100 мкл 0,15 M розчину диізопропілетиламіну (DIPEA) в DMF. Після останнього додавання 100 мкл 0,30 M розчину бензотриазол-1-іл-окситрипіролідинфосфонію гексафторфосфату (PyBOP) в DMF реакційну суміш перемішували впродовж 20 годин та гідролізували за допомогою 100 мкл води. Реакційну суміш випарили насухо в вакуумі та залишок розчинили в 1000 мкл диметилсульфоксиду (DMSO). Очищення провели на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00107] Зібрали фракції з однаковим часом утримування та випарили розчинники. + + [00108] 4,45 мг білої твердої речовини (вихід 80%). MS: 1119 M+H ; 1141 M+Na . 3.2 6'-Гексаметилендиаміно--аманітину амід HDP 30.0304 15 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 [00109] В 500 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 4,14 мг (3,70 мкмоль) BocNHгексаметилендиаміно--аманітину аміду HDP 30.0299 та перемішували впродовж 2 хвилин. Надлишок TFA випарили у вакуумі та залишок випарили разом з 2 частинами 1000 мкл ацетонітрилу. Тверду речовину, що залишилася, очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при A = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5- 20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00110] Зібрали фракції з однаковим часом утримування (13,43-14,02 хвилин) та випарили розчинники. Залишок помістили в 2000 мкл води та розчин заморозили за допомогою рідкого азоту та сушили ліофілізацією протягом ночі. + + [00111] 4,00 мг білої піни (вихід 95%). MS: 1018 (M+H ); 1041 (M+Na ). 3.3 Синтез похідного HDP 30.0304 з антитілом, Her-DSC-30.0304 Схема 3 3.3.1 Синтез кон'югату герцептину з HDP-30.0304, Her-DSC-30.0304 [4.7] [00112] В 144 мкл безводного диметилформаміду (DMF) розчинили 1,33 мг HDP 30.0304. Під аргоном та перемішуючи при кімнатній температурі одночасно додали 13,4 мкл розчину дигідроксисукцинімідкарбонату (DSC) в DMF (2,56 мг в 100 мкл DMF) та 2,6 мкл триетиламіну. Реакційну суміш перемішали при кімнатній температурі. Через 12 годин додали 30 мл холодного диетилового ефіру. Зібрали осад, промили кілька раз диетиловим ефіром та висушили в вакуумі. Тверду речовину, що залишилася, помістили в 200 мкл DMF = розчин A. В 4,0 мл фосфатного буферного розчину (PBS, pH = 7,4) = розчин B розчинили 12,0 мг 16 UA 111341 C2 5 10 герцептину. Об'єднали розчин A та розчин B. Розчин герцептин аманітин-лінкер збовтували при 4°C впродовж 14 годин та розділили шляхом гель-фільтраційної хроматографії на Sephadex G25 (колонка XK-16; 2 мл/хвилина). Колонку G-25 попередньо промили 500 мл розчинів PBS, pH = 7,4. Фракцію кон'югату Her-DSC-30.0134 визначили за допомогою УФ поглинання. Концентрацію білка визначили за допомогою RotiQuant-аналізу (Carl Roth; Німеччина). Навантаження герцептину аманітином визначили шляхом визначення УФ поглинання при A = 280 нм та A = 310 нм. Розрахували навантаження токсином 4,7 молекул аманітину для кожної молекули герцептину. Приклад 4 Інші структури кон'югатів аманітин-герцептин естер 15 Приклад 5 Цитотоксичність in vitro кон'югатів герцептин-аманітин на різні лінії HER2-позитивних та HER2-негативних пухлинних клітин 17 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [00113] Цитотоксичну активність Her-DSC-30.0134, Her-DSC-30.0256, Her-естер-30.0001, HerDCC-30.0252 та Her-DCC-30.0127 оцінили in vitro за допомогою HER2-позитивних пухлинних клітин ліній SKOV-3 (яєчників), SK-BR-3 (молочних залоз), NCI-N87 (шлунка) та HER2негативних пухлинних клітин лінії MDA-MB231 (молочних залоз) та хемілюмінісцентного аналізу із введенням BrdU (Roche Diagnostics). Життєздатність клітин визначили через 72-96 годин інкубації з різними концентраціями кон'югатів герцептин-аманітин при 37°C та 5% CО2 шляхом вимірювання фіксованих та пермеабілізованих клітин з антитілом до BrdU-HRP на BМG Labtech Optima планшет-рідері. Величини EC50 кривих доза-ефект розрахували за допомогою програмного забезпечення Graphpad Prism 4.0 (дивись Фігури 2-5). Стабільність in vitro кон'югатів герцептин-аманітин в плазмі 5.1 Вивільнення аманітину після інкубації в плазмі [00114] Впродовж періоду до 14 днів інкубували 35 мкΜ кон’югати герцептин-аманітин в плазмі мишей на водяній бані при 37°C. Зразки відібрали в різні моменти часу та проаналізували стосовно сполук малих молекул аманітину, що вивільнились, за допомогою способу ELISA. Для цього аманітин, що вивільнився, та метаболіти аманітину екстрагували в різні моменти часу 80% EtOH. Розчини освітлили центрифугуванням при 10000 g впродовж 5 хвилин та надосадову рідину зберігали при -70°C. Білий мікролунковий планшет Lumitrac (Greiner) покрили антисироваткою кроля до аманітину на ніч при 4°C. Планшет блокували 3% BSA в PBS впродовж 1 години при 37°C та тричі промили 0,05% Tween/PBS. Зразки аманітину та розчини аманітину з визначеними концентраціями змішали з 1 нM біотиніл-аманітином в 1% BSA/PBS та інкубували в покритих лунках впродовж 1 години при 37°C. Лунки тричі промили 0,05% Tween/PBS. Основний розчин стрептавідин-HRP (Sigma-Aldrich) (1 мг/мл в PBS) розвели 1:1000 в 3% BSA/PBS та додали в кожну лунку по 50 мкл. Після інкубації впродовж 1 години при 37°C лунки тричі промили 0,05% Tween/PBS. В кожну лунку додали по 50 мкл розчину люмінола (Applichem) та виміряли сигнал люмінісценції за допомогою рідера BМG Labtech Optima. Кількості сполук аманітину, що вивільнились, розрахували шляхом лінійної регресії (дивись Фігури 6-7). 5.2 Цитотоксична активність після інкубації в плазмі [00115] Кон’югати герцептин-аманітин інкубували впродовж періоду до 11 днів в плазмі людини на водяній бані при 37°C. Зразки відібрали в різні моменти часу та проаналізували in vitro стосовно залишкової цитотоксичної дії на HER2-позитивних SKOV-3 клітинах шляхом хемілюмінісцентного аналізу із введенням BrdU (Roche Diagnostics). Життєздатність клітин визначили через 72 години інкубації з різними концентраціями кон'югатів герцептин-аманітин при 37°C та 5% CО2 шляхом вимірювання фіксованих та пермеабілізованих клітин з антитілом до BrdU-HRP на планшет-рідері BМG Labtech Optima. Величини EC50 кривих доза-ефект розрахували за допомогою програмного забеспечення Graphpad Prism 4.0 (дивись Фігуру 8). Протипухлинна активність кон'югатів герцептин-аманітин на ксенотрансплантатних моделях мишей з HER2-позитивними пухлинними клітинами [00116] Придбали інтактних самиць шеститижневого віку безтимусних мишей BALB/c nu/nu (Janvier) та довільно розділили на три групи по вісім мишей в кожну. У бік кожної миші ввели за 6 допомогою s.c. ін'єкції 2,5 x 10 клітин SKOV-3. На 19 день після інокуляції пухлинних клітин за допомогою i.v ін'єкції один раз ввели кон’югати герцептин-аманітин в дозі 50 мкг/кг, тоді як негативній контрольній групі ввели за допомогою ін'єкцій плацебо (буфер NaCI). Записали такі параметри, як виживаність, вага та розмір пухлини (дивись Фігуру 9). Приклад 6: Одержання додаткових сполук -аманітин-лінкеру HDP 30.0353, HDP 30.0354, HDP 30.0355, HDP 30.0409, HDP 30.0410, HDP 30.0411 та HDP 30.0412 6.1 Аманітин-лінкер HDP 30.0353 6.1.1. Синтез 6'О-(NH-boc-6-аміно-3,4-дитіа-гексил)--аманітину HDP 30.0341 50 18 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 [00117] В 500 мкл диметилсульфоксиду (DMSO) розчиняли 6,78 мг (7,38 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину. Під аргоном додали 18,67 мг (59,02 мкмоль, 8 екв.) NH-bocаміно-3,4-дитіа-гексилброміду та 73,8 мкл (7,38 мкмоль, 1 екв.) LiOH (0,1 M) в воді/DMSO (1:1). Через 1 годину, 3,5 години, 4,5 години, 6,5 години та 8 годин додали додаткові еквіваленти 0,1 M розчину LiOH. Неочищену реакційну суміш очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 10 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 6,5 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00118] Зібрали фракцію з часом утримування 20,8-21,4 хвилин та випарили розчинники у вакуумі. + [00119] 1,29 мг білої твердої речовини (вихід 15%). MS: 1154 M+H 6.1.2 Синтез 6'-О-(-6-аміно-3,4-дитіа-гексил)--аманітину HDP 30.0353 [00120] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 1,29 мг (1,12 мкмоль) 6'-О-(-6аміно-3,4-дитіа-гексил)--аманітину HDP 30.0341. Реакційну суміш перемішали під аргоном при температурі навколишнього середовища. Через 1 хвилину трифтороцтову кислоту розвели 1000 мкл толуолу та випарили насухо. Температура не повинна перевищувати 20°C. Цей процес повторювали з 1000 мкл толуолу та 1000 мкл ацетонітрилу (2x). Неочищений ефір аманітину очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 10 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 6,5 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-25 хвилин 50% A; 25-30 хвилин 0% A; 30-35 хвилин 0% A; 35-40 хвилин 100% A, 40-45 хвилин 100% A. [00121] Зібрали фракцію з часом утримування 16,1-17,0 хвилин та випарили розчинники. В залишку виморожували воду. + [00122] Жовтої твердої речовини 0,39 мг (вихід 30%, TFA сіль). MS: 1054 M+H . 6.2 Аманітин-лінкер HDP 30.0354 6.2.1 Синтез 6'О-(NH-boc-7-аміно-4,5-дитіа-гептил)--аманітину HDP 30.0349 19 UA 111341 C2 5 10 15 [00123] В 250 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO) розчинили 5,67 мг (6,17 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину. При кімнатній температурі в атмосфері аргону додали 19,00 мг (58,00 мкмоль, 9,3 екв.) NH-boc-7-аміно-4,5-дитіа-гептилброміду HDP 30.0345. Одночасно додали 61,7 мкл (6,10 мкмоль, 1 екв.) 0,1 M LiOH в воді/DMSO (1:1). Реакційну суміш перемішували впродовж 3,5 годин та додали додаткові 10 мкл (13,00 мг; 39,7 мкмоль; 6,3 екв.) NH-boc-7-аміно-4,5-дитіа-гептилброміду HDP 30.0345 та 61,7 мкл 0,1 M LiOH в воді/DMSO (1:1). Через 8 годин неочищену реакційну суміш очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-30 хвилин 0% A; 30-35 хвилин 100% A; 35-40 хвилин 100% A. [00124] Зібрали фракцію з часом утримування 19,4-21,0 хвилин та випарили насухо при кімнатній температурі. + [00125] 4,83 мг білого порошку (вихід 67%). MS: 1168 M+H . 6.2.2 Синтез 6'О-(7-аміно-4,5-дитіа-гептил)--аманітину HDP 30.0354 20 25 30 35 [00126] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 4,83 мг (4,13 мкмоль) 6'O-(NHboc-7-аміно-4,5-дитіа-гептил)--аманітину HDP 30.0349. Реакційну суміш перемішували впродовж 1 хвилини під аргоном та випарили насухо при температурі навколишнього середовища. Залишок випарили разом з 1000 мкл толуолу та 1000 мкл ацетонітрилу. Тверду речовину, що залишилася, очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 10 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 6,5 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00127] Зібрали фракцію з часом утримування 17,1-17,5 хвилин та випарили. В залишку виморожували воду. + [00128] Жовтої твердої речовини 0,36 мг (вихід 7,0%, сіль TFA). MS: 1068 M+H . 6.3 Аманітин-лінкер HDP 30.0355 6.3.1 Синтез 6'О-(NH-boc-7-аміно-3,3-диметил-4,5-дитіа-гептил)--аманітину HDP 30.0350 20 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 [00129] В 250 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO) розчинили 5,67 мг (6,17 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину. Під аргоном додали 18,00 мг (51,62 мкмоль, 9,8 екв.) NH-boc7-аміно-3,3-диметил-4,5-дитіа-гептилброміду HDP 30.0348 та 61,7 мкл (6,10 мкмоль, 1 екв.) 0,1 M LiOH у воді/DMSO (1:1). Через 2 години реакційну суміш повторно обробили 10 мкл (12,00 мг; 34,4 мкмоль; 5,6 екв.) NH-boc-7-аміно-3,3-диметил-4,5-дитіа-гептилброміду HDP 30.0345 та 61,7 мкл 0,1 M LiOH. Через 8 годин суміш розвели DMSO та очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-30 хвилин 0% A; 30-35 хвилин 100% A; 35-40 хвилин 100% A. [00130] Зібрали фракцію з часом утримування 20,5-21,0 хвилин та випарили розчинники. + [00131] 0,51 мг (вихід 7%; вихід 48% на основі перетвореного -аманітину). MS: 1196 M+H . 6.3.2 Синтез 6'О-(7-аміно-3,3-диметил-4,5-дитіа-гептил)--аманітину HDP 30.0355 [00132] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 0,51 мг (0,43 мкмоль) HDP 30.0350 та перемішували впродовж 1 хвилини при температурі навколишнього середовища. Трифтороцтову кислоту розвели 1000 мкл толуолу та насухо випарили при 20°C. Цей процес повторили з 1000 мкл толуолу та 1000 мкл ацетонітрилу (2x). Реакційну суміш очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 10 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 6,5 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Розчинник B: 10% води : 90% метанолу, 0,05% трифтороцтової кислоти. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00133] Зібрали фракцію з часом утримування 18,2-18,6 хвилин та випарили розчинники. В залишку виморожували воду. + [00134] 0,15 мг жовтої твердої речовини (вихід 27%, сіль TFA). MS: 1096 M+H . 6.4 Аманітин-лінкер HDP 30.0409 6.4.1 Синтез 6'О-(NH-boc-12-аміно-додецил)--аманітину HDP 30.0404 21 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 [00135] В 250 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO) розчинили 6,67 мг (7,26 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину. Додали 21,00 мг (58,10 мкмоль, 8 екв.) NH-boc-12-амінододецилброміду HDP 30.0383 та 72,6 мкл (7,26 мкмоль, 1 екв.) 0,1 M LiOH у воді/DMSO (1:1). Через 6 годин додали 36,5 мкл 0,1 M LiOH та погасили суміш 72,6 мкл 0,1 M розчину оцтової кислоти в DMSO двома годинами пізніше. Неочищений продукт реакції очистили на LaPrepВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00136] Зібрали фракцію з часом утримування 22,0-22,7 хвилин та випарили розчинники. + [00137] 5,96 мг білої твердої речовини (вихід 68%). MS: 1202 M+H . 6.4.2 Синтез 6'-О-(12-амінододецил)--аманітину HDP 30.0409 [00138] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 5,96 мг (4,96 мкмоль) HDP 30.0404 та перемішували 1 хвилину при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш випарили разом з 1000 мкл толуолу та ацетонітрилу та тверду речовину, що залишилася, очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з ацетонітрилом/водою, потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% ацетонітрилу. Розчинник B: 5% води : 95% ацетонітрилу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00139] Зібрали фракцію з часом утримування 18,6-19,2 хвилин та випарили до білої твердої речовини. + [00140] 6,03 мг (вихід 99%, сіль TFA). MS: 1102 M+H . 6.5 Аманітин-лінкер HDP 30.0410 6.5.1 Синтез 6'О-(NH-boc-11-аміно-3,6,9-триокса-ундецил)--аманітину HDP 30.0405 30 22 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 [00141] В 250 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO) розчинили 6,67 мг (7,26 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину. Додали 20,51 мг (58,10 мкмоль, 8 екв.) NH-boc-11-аміно3,6,9-триокса-ундецилброміду HDP 30.0391 та 72,6 мкл (7,26 мкмоль, 1 екв.) 0,1 M LiOH у воді/DMSO (1:1). Реакцію проводили при температурі навколишнього середовища в атмосфері аргону. Через 6 годин додали додаткову основу LiOH (0,5 екв.). Через 8 годин суміш погасили 72,6 мкл 0,1 M розчину оцтової кислоти в DMSO та очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00142] Зібрали фракцію з часом утримування 18,1-18,6 хвилин та випарили розчинники. + [00143] 4,68 мг твердої речовини (вихід 54%). MS: 1194 M+H . 6.5.2 Синтез 6'Ό-(11-аміно-3,6,9-триокса-ундецил)--аманітину HDP 30.0410 [00144] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 4,68 мг (3,92 мкмоль) HDP 30.0405 та перемішували впродовж 1 хвилини при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш випарили разом з толуолом та ацетонітрилом та неочищену тверду речовину очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00145] Зібрали фракцію з часом утримування 18,6-19,2 хвилин та випарили. В залишку твердої речовини виморожували воду. + [00146] 2,44 мг (вихід 52%, сіль TFA). Білий порошок MS: 1102 M+H . 6.6 Аманітин-лінкер HDP 30.0411 6.6.1 Синтез 6'О-(NH-boc-16-аміно-гексадецил)--аманітину HDP 30.0406 30 23 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 [00147] В 750 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO) розчинили 6,67 мг (7,26 мкмоль) висушеного в вакуумі -аманітину. При кімнатній температурі під аргоном додали 24,00 мг (58,10 мкмоль, 8 екв.) NH-boc-16-аміно-гексадецилброміду HDP 30.0398. Додали 72,6 мкл (7,26 мкмоль, 1 екв.) 0,1 M LiOH у воді/DMSO (1:1) та нагріли реакційну суміш до 50°C. Через 6 годин додали додаткову основу LiOH (36,5 мкл) та через 8 годин погасили реакційну суміш 72,6 мкл 0,1 M розчину оцтової кислоти в DMSO. Затверділу реакційну суміш розвели DMSO та очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00148] Зібрали фракцію з часом утримування 23,4-24,1 хвилин та випарили розчинники. + [00149] 4,41 мг білої твердої речовини (вихід 48%). MS: 1258 M+H . 6.6.2 Синтез 6'О-(16-аміно-гексадецил)--аманітину HDP 30.0411 [00150] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 4,41 мг (3,50 мкмоль) HDP 30.0406 та перемішували впродовж 2 хвилин при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш двічі випарили разом з 1000 мкл толуолу та 1000 мкл ацетонітрилу та твердий залишок очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00151] Зібрали фракцію з часом утримування 20,5-21,2 хвилин та випарили. В залишку виморожували воду. + [00152] 2,44 мг (вихід 52%, сіль TFA). MS: 1102 M+H . 6.7 Аманітин-лінкер HDP 30.0412 6.7.1 Синтез 6'О-(NH-boc-2-аміно-етил)--аманітину HDP 30.0317 24 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 [00153] В 900 мкл безводного диметилсульфоксиду (DMSO) розчинили 20,00 мг (21,8 мкмоль) висушеного у вакуумі -аманітину. При кімнатній температурі додали 100,0 мкл (21,8 мкмоль, 1 екв.) 0,218 M розчину калій-трет-бутилату в DMSO та 39,00 мг (174,1 мкмоль, 8 екв.) NH-boc-2-аміноетилброміду (одержаного від Fluka). Через 4 та 6 годин додали 1 та 2 додаткові еквіваленти калій-трет-бутилату та NH-boc-2-аміноетилброміду. Через 23 години суміш погасили 72,6 мкл 0,1 M розчину оцтової кислоти в DMSO та очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00154] Зібрали фракцію з часом утримування 13,2-14,5 хвилин та випарили розчинники. + [00155] 3,86 мг білої твердої речовини (вихід 16%). MS: 1062 M+H . 6.7.2 Синтез 6'O-(2-аміно-етил)--аманітину HDP 30.0412 [00156] В 200 мкл трифтороцтової кислоти (TFA) розчинили 3,86 мг (3,36 мкмоль) HDP 30.0317 та перемішували впродовж 2 хвилин при кімнатній температурі. Реакційну суміш випарили разом з 1000 мкл толуолу та 1000 мкл ацетонітрилу та тверду речовину очистили на LaPrep-ВЕРХ: колонка: Kromasil 100-C18, 10 мкм, 250 мм x 20 мм, з метанолом/водою (0,05% TFA), потік: 26 мл/хвилина, виявлення при  = 295 нм. Розчинник A: 95% води : 5% метанолу. Розчинник B: 5% води : 95% метанолу. Градієнт: 0-5 хвилин 100% A; 5-20 хвилин 0% A; 20-25 хвилин 0% A; 25-27 хвилин 100% A; 27-35 хвилин 100% A. [00157] Зібрали фракцію з часом утримування 20,5-21,2 хвилин та випарили. В залишку виморожували воду. + [00158] 1,54 мг білої твердої речовини (вихід 44%, сіль TFA). MS: 962 M+H . ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 1. Кон'югат, що включає мішень-зв'язуючий фрагмент, зв'язаний через лінкер L з аматоксином, де лінкер L приєднаний до аматоксину через: (і) С-атом амінокислоти 1 аматоксину, зокрема через амідний місток; (іі) через атом кисню, зв'язаний з С-атомом амінокислоти 3 аматоксину, зокрема через естерний місток, ефірний місток або уретановий місток; або 25 UA 111341 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ііі) 6'С-атом амінокислоти 4 аматоксину, зокрема через атом кисню, зв'язаний з 6'С-атомом амінокислоти 4 аматоксину; в кожному випадку, де лінкер L приєднаний до мішень-звязуючого фрагмента через фрагмент сечовини. 2. Кон'югат за п. 1, де кон'югат має структуру, вибрану з наступних структур: (і) аматоксин-С(О)-NН-L-NН-С(О)-NН-мішень-зв'язуючий фрагмент; (іі) аматоксин-С-О-С(О)-L-NН-С(О)-NН-мішень-зв'язуючий фрагмент; (ііі) аматоксин-С-О-L-NН-С(О)-NH-мішень-зв'язуючий фрагмент; (iv) аматоксин-С-О-С(О)-NН-L-NН-С(О)-NН-мішень-зв'язуючий фрагмент; та (v) аматоксин-6'С-О-L-NН-С(О)-NН-мішень-зв'язуючий фрагмент. 3. Кон'югат за п. 1 або п. 2, де мішень-зв'язуючий фрагмент приєднаний до лінкера L через аміногрупу, присутню в мішень-зв'язуючому фрагменті, де вказана аміногрупа утворює частину вказаного фрагмента сечовини. 4. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-3, де аматоксин вибраний з -аманітину, -аманітину, аманітину, -аманітину, аманіну, аманінаміду, амануліну або аманулінової кислоти, або їх солей або аналогів. 5. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-4, де лінкер L являє собою алкіленову, гетероалкіленову, алкеніленову, гетероалкеніленову, алкініленову, гетероалкініленову, циклоалкіленову, гетероциклоалкіленову, ариленову, гетероариленову, аралкіленову або гетероаралкіленову групу, необов'язково заміщену. 6. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-5, де лінкер L включає фрагмент, вибраний з наступних фрагментів: фрагмента дисульфіду, ефіру, аміну, естеру, карбоксаміду, уретану та сечовини. 7. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-6, де мішень-зв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з епітопом, який присутній на пухлинній клітині, зокрема, де мішень-зв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з епітопом молекули адгезії епітеліальних клітин (ЕрСАМ). 8. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-7, де мішень-зв'язуючий фрагмент, вибраний з групи, що складається з: (і) антитіла або його антиген-зв'язуючої ділянки; (іі) подібного антитілу білка; та (ііі) аптамеру нуклеїнової кислоти. 9. Кон'югат за п. 8, де антитіло або його антиген-зв'язуюча ділянка вибрані з диатіла, тетратіла, нанотіла, химерного антитіла, деімунізованого антитіла, гуманізованого антитіла або антитіла людини. 10. Кон'югат за п. 8 або п. 9, де антиген-зв'язуюча ділянка вибрана з групи, що складається з Fab, F(ab')2, Fd, Fv, одноланцюгового Fv та зв'язаних дисульфідними містками Fv (dsFv). 11. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-10 для застосування як лікарського препарату. 12. Кон'югат за будь-яким з пп. 1-11 для лікування раку у пацієнта, де пухлина вибрана з групи, що складається з раку підшлункової залози, холангіокарциноми, раку молочної залози, раку прямої та ободової кишки, раку легені, раку передміхурової залози, раку яєчника, раку шлунка, раку нирки, злоякісної меланоми, лейкозу та лімфосаркоми. 13. Фармацевтична композиція, яка включає кон'югат за будь-яким з пп. 1-10 та додатково включає один або декілька фармацевтично прийнятних розріджувачів, носіїв, наповнювачів, заповнювачів, зв'язуючих речовин, змащувальних засобів, засобів, що забезпечують плинність, розпушувачів, адсорбентів та/або консервантів. 14. Кон'югаційна молекула аматоксину, яка включає лінкер L, приєднаний до аматоксину через: (і) С-атом амінокислоти 1 аматоксину, зокрема через амідний місток; (іі) атом кисню, звязаний з С-атомом амінокислоти 3 аматоксину, зокрема через естерний місток, ефірний місток або уретановий місток; або (ііі) 6'С-атом амінокислоти 4 аматоксину, зокрема через атом кисню, зв'язаний з 6'С-атомом амінокислоти 4 аматоксину; в кожному випадку, де лінкер L включає похідне карбамінової кислоти -ΝΗ-С(О)-Х, де X являє собою групу, що відходить, котра може бути заміщена первинним аміном мішень-зв'язуючого фрагмента. t 15. Кон'югаційна молекула аматоксину за п. 14, де X вибраний з: - бутилокси, -сукцинімідилокси, -1-О-сукцинімідилокси-3-сульфонату (-сульфо-NHS), -О-(4-нітрофенілокси), -О-(3нітрофенілокси), -О-(2,4-динітрофенілокси), -О-(2,4-дихлор-6-нітрофенілокси), пентафторфенілокси, -пентахлорфенілокси, -О-(2,4,5-трихлорфенілокси), -О-(3,4-дигідро-3гідроксі-4-оксо-1,2,3-бензотриазин-3-ілу), -О-(ендо-1-гідрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксімід-1ілу), -1-фталімідоїлокси, -1-бензотриазолілокси, -1-(7-аза-бензотриазоліл)окси) та -Nімідазолілу. 26 UA 111341 C2 16. Спосіб синтезу кон'югату за будь-яким з пп. 1-12, який включає етап реакції кон'югаційної молекули аматоксину за п. 14 або п. 15 з мішень-зв'язуючим фрагментом, що містить первинну аміногрупу. 27 UA 111341 C2 28