Варіант апротиніну з покращеними властивостями

Даний винахід стосується варіантів апротиніну, що є кращими інгібіторами ферментів, мають поліпшені імунологічні та фармакокінетичні властивості. Апротинін, який також позначається як інгібітор трипсину підшлункової залози бика (ВРТІ), відноситься до родини інгібіторів серинових протеаз типу Кунітца. Спектр серинових протеаз, що піддаються інгібуванню,включає, наприклад, трипсин, хімотрипсин, плазмін та калікреїн плазми ((W.Gebhard, H.Tschesche, H.Fritz Proteinase Inhibitors, Barrett and Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV 375-387, 1986). Апротинін складається з 58 амінокислот. Тривимірна структура білка була встановлена за допомогою рентгеноструктурного аналізу та ЯМР-спектроскопії (Wlodawer et al., J.Vol. Biol. 198(3), 469-480, 1987; Wagner et al., J. Mol. Biol. 196 (1), 227-231, 1987; Berndt et al., Biochemistry 32 (17), 4564-4570, 1993). Під торговою назвою Трасилол® природний апротинін давно використовується для лікування панкреатиту. Зараз Трасилол® використовується при серцевій хірургії, після того, як клінічні дослідження показали, що обробка апротиніном суттєво знижує потребу у переливанні крові при подібних операціях та приводить до зменшення вторинних кровотеч (D.Royston, J. Cardiothorac. Vase. Anesth. 6; 76-100, 1992). Вдалось показати, що заміна амінокислоти, яка відповідає за специфічність інгібування, у положенні 15 приводить до одержання цінних варіантів апротиніну з поліпшеними інігібіторними властивостями (патент ФРН 3 339 693). В залежності від введеної амінокислоти можна, таким чином, одержати активні інгібітори, які, наприклад, інгібують еластазу підшлункової залози або лейкоцитів. Далі було показано, що інгібіторні властивості апротиніну та одержаних при заміні у положенні 15 варіантів визначаються також іншими амінокислотами у місці контакту цільової протеази, що піддається інгібуванню, та молекули інгібітора. Сюди відносяться, перш за все додаткові амінокислотні залишки у положеннях 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 та 39. Варіанти апротиніну з поліпшеними властивостями, одержані в результаті заміни одного або декількох з цих амінокислотних залишків в області контакту, були серед інших описані, наприклад, у наступних матеріалах: міжнародна заявка на патент 89/01968, міжнародна заявка на патент 89/10374, заявка на європейський патент 0307592, заявка на європейський патент 683 229. Цікавим способом могли бути поліпшені фармакокінетичні властивості апротиніну та його варіантів шляхом заміни амінокислот, що визначають фізико-хімічні властивості речовини. Так, вдалося шляхом зниження загального позитивного заряду молекули значно зменшити зв'язування нирками. Такі варіанти були описані у міжнародній заявці на патент 92/06111. Базуючись на поліпшених технічних можливостях одержання, вигідно в окремих випадках проводити модифікацію N-кінця молекули інгібітора. Такі модифікації можуть вкорочувати N-кінці або подовжувати їх, або приводити до видалення однієї або декількох амінокислот. Модифіковані по N-кінцю варіанти апротиніну були описані у європейському патенті 419 878. Задачею винаходу є одержання варіанта апротиніну з поліпшеними властивостями. Задача вирішується запропонованим варіантом апротиніну з сумарним зарядом від +3 до -3 при pH 7 та з амінокислотами Arg15 або Arg15-АІа17 на ділянці зв'язування. Бажано, щоб варіант апротиніну використовували для інгібування серинових протеаз. Бажано, щоб варіант апротиніну мав змінену N-кінцеву послідовність та подовження або вкоречення на Nкінці, або подовжені амінокислоти на N-кінці. Амінокислотна послідовність, наприклад, для деяких варіантів апротиніну представлена на фіг. 1. Задача також вирішується запропонованим варінатом апротиніну, що вибирається з групи дез-Pro2-Ser10Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-апротиніну, дез-Pro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53anpотиніну, дез-Pro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-anpoтиніну, дез-Pro2-Ser10-Arg15-Ala17Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-апротиніну, дез-Рго2-8ег10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-апротиніну, Ser10Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41 -СІибЗ-апротиніну, Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53апротиніну, Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41–Glu53-апротиніну, Ser10-Arg15-Alal 7-Thr26-Glu31 Asn41-Glu53-апротиніну, Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-апротиніну. Ці варіанти апротиніну можуть також мати амінокислоту пролін у положенні 2. Варіанти апротиніну згідно з винаходом, проте, не обмежуються вказаними на фіг. 1 прикладами. До варіантів апротиніну згідно з винаходом відносяться також варіанти з подовженням на N-кінці Ala(2)-Gln(-1), з залишком природної амінокислоти проліну у положенні 2, з заміною інших амінокислот, які мають позитивний заряд по відношенню до нейтральних або тих, що несуть негативний заряд, амінокислотним залишкам, або з заміною інших нейтральних амінокислот по відношенню до негативно заряджених амінокислотних залишків. Вибір заміни амінокислотних залишків здійснюють при цьому згідно з таким принципом, щоб одержана речовина мала при фізіологічному значенні pH зменшений сумарний позитивний заряд, бажано в області від +2 до -2. Згадані зміни в амінокислотній послідовності, включаючи подовження або вкорочення, або видалення М-кінця, можуть використовуватись у будь-яких комбінаціях одна з одною. До варіантів апротиніну згідно з винаходом відносяться, таким чином, усі сполуки, для яких характерна комбінація згаданих вище ознак, та які мають при фізіологічному значенні pH знижений загальний позитивний заряд. Варіанти апротиніну мають наступні ознаки: 1. Заміна однієї або декількох амінокислот в активному центрі молекули для підвищення активності. 2. Заміна амінокислот для зниження загального позитивного заряду з метою поліпшення імунологічних та фармакокінетичних властивостей. 3. Модифікація N-кінцевої амінокислотної послідовності на основі технічних можливостей одержання. Несподівано було виявлено, що комбінація двох або трьох згаданих вище ознак приводить не тільки до одержання, але навіть до посилення чітко виражених окремих ознак. У доповнення до цього можуть виявлятись нові властивості речовин, що, наприклад, відносяться до імунологічних, фармакокінетичних або поверхневих властивостей сполук. Нові варіанти виявляють знижену реактивність по відношенню до поліклональних людських та кролячих антисироваток, які одержували при використанні апротиніну. Далі було знайдено, що нові варіанти поводять себе як менш активні імуногени у порівнянні з апротиніном, тобто вони викликають знижену імунну відповідь. Далі було показано, що варінати згідно з винаходом індукують незначне вивільнення гістаміну з клітин крові. Далі нові варіанти чітко показали незначне акумулювання у нирках у порівнянні з апротиніном. Кінетичні константи інгібування ферменту (значення Кі) несподівано були поліпшені, незважаючи на велику кількість змін у молекулі по відношенню до первинних варіантів молекули. Бажані такі, що мають загальний заряд від +2 до -2, особливо бажані ті, що мають заряд від +1 до -1. Описані нові інгібітори протеїназ придатні для лікування хворобливих станів, при яких, а також в результаті комплексних хірургічних операцій, як, наприклад, при хірургії серця або алоартропластичній заміні суставів у трансплантаційній медицині, це є прийнятним також для активування плазматичних ферментних систем завдяки тривалому або інтенсивному контакту крові з чужерідними поверхнями. Інгібітори знижують втрату крові при операціях, пов'язаних з підвищеним ризиком кровотечі (наприклад, операції на серці, хірургія кісток та суставів). Вони прийнятні для терапії при шоку, множинних травмах та черепно-мозкових травмах, сепсисі, дессимінованій внутрішньосудинній коагулопатії, ураженнях багатьох органів, запальних захворюваннях за участю системи калікреїну, як наприклад, захворювання суглобів, та при астмі. Вони запобігають інвазійному росту пухлин та метастазуванню внаслідок інгібування плазміну. Вони також придатні для терапії болей та набряків, завдяки інгібуванню синтезу брадикініну, а також для лікування інсультів. Вони також корисні при терапії діалізом та при штучних органах для запобігання запаленням та коагуляції, а також для зменшення ризику кровотечі. Для одержання варіантів апротиніну згідно з винаходом зручно використовувати способи генетичної інженерії. Для цього за допомогою загальноприйнятих молекулярнобіологічних способів вводять у прийнятний мікробний експресійний організм генноінженерну інформацію для синтезу у кожному окремому випадку варіантів апротиніну, що розглядаються. Рекомбінантний мікроорганізм піддають ферментації; шляхом вибору прийнятних умов вводять гетерологічну спадкову інформацію для експресії. Експресовані варіанти апротиніну одержують після закінчення з культурального середовища. Прийнятні організми-хазяїї для продукування варіантів апротиніну згідно з винаходом можуть бути бактеріями, дріжджами або грибами. Експресія може відбуватися внутрішньоклітинно або поза клітиною при використанні прийнятних секреторних систем. Варінати апротиніну можуть бути при правильно процесовані або злиті у пептидах або білках. Прийнятні системи для експресії варіантів апротиніну були описані в заявці на європейський патент 683 229, в міжнародних заявках на патент 89/02463, 90/10075 та в різних інших патентних заявках, що були згадані раніше. Способи виконання винаходу Ферменти Ферменти, що використовували (рестрикційні ендонуклеази, лужні фосфатази з кишечника теляти, полінуклеотидкіназа фага Т4 та ДНК-лігаза фага Т4), були одержані від фірм Бьорінгер Маннхайм та Гібко, Бразилія, їх використовували згідно з інструкціями виробника. Молекулярнобіологічні методики Звичайні операції клонування, як наприклад, виділення плазмідної ДНК з E.coli (так звана мініпідготовка) та трансформацію E.coli за допомогою плазмідної ДНК здійснювали по Sambrook та інш. (Молекулярне клонування, Колд Спрінг, Харбор, 1989). Як організм-хазяїн для трансформації виводили штам DH5a бактерій E.coli (Гібко, Бразилія). Для виділення великої кількості плазмідної ДНК використовували Qiagen-кінці (Qiagen). Екстракцію фрагментів ДНК з агарозних гелів проводили за допомогою струменевої сорбції згідно з вказівками виробника (Геномед). Олігонуклеотиди для експериментів з сайт-специфічним мутагенезом та праймер для полімеразної ланцюгової реакції та реакції секвенування були одержані за допомогою "ДНК-синтезатора 380 А" фірми Еплайд Байєсістемс. Дослідження мутагенезу проводили за способом Deng та Nickoloff (Deng та інш., Anal. Biochem. 200, 81-88,1992) при використанні набору фірми Фармація Байєтек („Унікальний сайт-елімінаційний мутагенез"). Усі векторні конструкції та експерименти по мутагенезу були підтверджені за допомогою циклу секвенування ДНК Taq з використанням термінаторів з флуоресцентною міткою на секвенаторі ABI 373A (Еплайд Байесистемс). Трансформація Saccharomvces cerevisiae Клітини дріжджів, наприклад, штаму JC34.4D (МАТа, ura3-52, suc2) вносили в 10мл YEPD (2% глюкоза; 2% пептин; 1% дріжджовий екстракт Difco) та одержували значення оптичної густини від 0,16 до 0,8 при 600нм. Клітини промивали 5мл розчину А (1М сорбіт, 10 мМ біцин, pH 8,35; 3% етиленгліколь) повторно суспендували у 0,2мл розчину А та витримували при -70°С. Плазмідну ДНК (5 мкг) та носій ДНК (50 мкг ДНК із сперми оселедця) додають до заморожених клітин. Потім клітини шляхом струшування протягом 5 хвилин розморожують при температурі 37°С. Після додавання 1,5мл розчину В (40% PEG 1000; 200мМ біцин pH 8,35) клітини протягом 60 хвилин інкубують при температурі 30°С, промивають 1,5мл розчину С (0,15 M NaCI; 10мМ біцин, pH 8,35) і ресуспендують в 100мкл розчину С. Посів здійснюють на селективному середовищі, що містить 2%-ний агар. Трансформанти одержують після інкубування протягом 3 діб при 30°С. Живильні середовища для ферментації 1. Середовище SD2: Bacto Yeast Nitrogen Base Глюкоза* KH2PO4 2. Середовище SC5: Глюкоза* Дріжджовий екстракт Difco КН2РО4 6,7г/л 20г/л 6,7г/л pH6,0 20г/л 20г/л 6,7г/л (NH4 )2S04 MgS04 x 7 H2O Розчин мікроелементів SL4 Miкроелементиий розчин SL4: Titriplex III FeSO4 x 7 H2O ZnSO4 x 7 H2O MnCI 2 x 4 H2O Н3ВО3 CoCI 2 x 6 H2О CuCI 2 x 2 H2О NiCI 2 x 6 H2О Na2 MoO4 x 2H2O * = автоклавують окремо 3. Ферментативне середовище: Глюкоза* Соєвий пептон КН2Р04 MgS04 x 7 Н2О Тіамін хлорид Інозит Мікроелементний розчин Вітамінний розчин (NH4 )2S04 Живильний розчин: Глюкоза* (NH4 )2S04 КН2Р04 MgS04 x 7 Н2О Тіамінхлорид Інозит Розчин мікроелементів Розчин вітамінів Розчин мікроелементів: FеСІ 3 х 6 Н2О ZnCI 2 х 4 Н2О Н3ВО3 CoCI 2 x 6 H2О CuS04 х 5 Н20 Na2 MoO4 x 2 H2O НСІ конц. * = автоклавують окремо Вітамінний розчин: Рибофлавін Са-пантотенат Нікотинова кислота Гідрохлорид піридоксину Біотин Фолієва кислота 2,0г/л 1,0г/л 1,0мл/л рН6,0 5г/л 2г/л 0,1г/л 0,03г/л 0,3г/л 0,2г/л 0,01г/л 0,02г/л 0,03г/л 2,0г/л 25г/л 1,4г/л 1,0г/л 5,1мг/л 20мг/л 3,0мл/л 3,0мл/л 2,0г/л рН5,5 530г/л 5,0г/л 2,9г/л 3,8г/л 13мг/л 70мг/л 6,8мл/л 6,8мл/л 13,5г/л 2г/л 0,5г/л 2,0г/л 1,9г/л 1,0г/л 100мл 0,42г/л 5,9г/л 6,1г/л 1,7г/л 0,06г/л 0,04г/л Приготування консервованих робочих матеріалів 200мл середовища SD2 в колбі Ерленмейєра на 1 літр інокулюють консервованим робочим матеріалом до концентрації 1%. Культуру протягом 72 годин інкубують при 28°С при струшуванні (260об/хв). Потім по 2мл наливають в контейнери для консервування і заморожують рідким азотом. Ферментація в колбах для струшування Як попередню культуру 200мл середовища SD2 в 1-літровій колбі інокулюють консервованим робочим матеріалом і протягом 72 годин ферментують при струшуванні (260об/хв). Використовуючи попередню культуру, основні культури (200мл середовища SC5 в 11 пробірках) інокулювали до концентрації 1% і протягом 72-96 годин інкубують при 28°С при струшуванні. Ферментація в 10-лігровому біореакторі Як попередню культуру 200мл середовища SD2 в 1-літровій колбі інокулюють консервованим робочим матеріалом і протягом 72 годин ферментують при струшуванні (260об/хв). Основна культура в 10-літровому ферментаторі піддається «Іеа-ЬаІсп»-ферментації протягом 96 годин. Як живильне середовище використовують ферментативне середовище, початковий об'єм якого становить 7л. Ферментатор інокулюють 200 мілілітрами попередньої культури. Умови ферментації Температура:28°С Швидкість обертання мішалки: 500об/хв Вентиляція: 10л/хв pH: 5,5 Тиск в головці: 200мбар Після 7 годин ферментування починають підживлення. Швидкість підживлення регулюють за респіраторним коефіцієнтом (Respiratorische Quotient = RQ = утворений СО2/спожитий кисень). Якщо значення RQ стає більшим, ніж 1,15, швидкість підживлення зменшують, якщо значення RQ стає меншим, ніж 1,05, швидкість підживлення підвищують. Через однакові проміжки часу беруть проби із ферментатора і шляхом вимірювання оптичної густини при 700нм визначають ріст клітин. Крім того, шляхом вимірювання активності визначають концентрацію Bay 19-8757 у надосадовій рідині. Після закінченні ферментації значення pH знижують до 3,0 додаванням 50% (вага/об"єм) лимонної кислоти і ферментатор протягом 10 хвилин нагрівають при 70°С. Потім клітини відокремлюють шляхом центрифугування при 7500g і надосадову рідину подають на очистку білка. Матеріали для хімічного аналізу білків Аналіз послідовностей здійснювався за допомогою білкового секвентора моделі 473А фірми Applied Biosystems (м. Форстер-Сіті, США). Використовувалась стандартна програма секвенування. Секвентор, різні програми секвенування, а також РТН-система детектування докладно описані в інструкції користувача (User's manual protein sequencing system model 473A) (1989) Applied Biosystems Forster City, CA 94404, USA). Реагенти для роботи секвентора та хроматографічні колонки для РТН детектування постачаються фірмою Applied Biosystems. Аналіз за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском (HPLC) здійснювався HPLC-системою HP 1090 фірми Hewlett Packard (D-Waldbronn). Для відокремлення застосовувалась HPLC-колонка RP-18 (250мм х 4,6мм, 5-мікронний матеріал, діаметр пор 300 Ангстрем) Backerbond (D-Gross Gerau). Використовувалась установка для капілярного електрофорезу моделі 270 А-НТ фірми Applied Biosystems (Forster City, CA 94404, USA). Проби вводились, як правило, гідродинамічно через різні проміжки часу. Використовувалась капілярна колонка (50мкм х 72см) фірми Applied Biosystems. Аналіз амінокислот здійснювався аналізатором LC3000 фірми Eppendorf Biotronik (D-Maintal). Використовувалась легко модифікована стандартна програма розділення від Biotronik. Програма розділення та робота аналізатора вичерпно описані в довіднику до приладу. Молекулярна вага визначалась за допомогою системи MALDI І фірми Kratos/Shimadzu (D-Duisburg). SDSелектрофорез здійснювався за допомогою електрофорезної системи фірми Pharmacia (D-Freiburg). Визначення кінетичних параметрів здійснювалось за допомогою зчитувача для мікротитрувальних планшетів фірми SLT (D-Creilsheim). Промивання мікротитрувальних планшетів здійснювалось за допомогою промивного апарату фірми Dynatec (D-Denkendorf). Використовувались ферменти та живильні середовища фірми Calbiochem (D-Bad Soden). Всі інші хімікати та реагенти постачались фірмою Merck (D-Darmstadt) або фірмою Sigma (D-Deisenhofen). Планшети на 96 комірок були від фірми Greiner. Поліклональні анти-апротинінантитіла кроликів одержувались в кроликах шляхом імунізації апротиніном. Поліклональні анти-апротинінантитіла людини походять від пацієнтів, що лікуються апротиніном. Хімічний аналіз білків Аналіз N-термінальних кінців 1-3нмоль розчиненого у воді інгібітора протеаз завантажують на пластину секвентора, попередньо інкубовану полібреном. Протеїн секвенують з майже нормальним циклом. РТН-амінокислоти ідентифікують шляхом безпосередньої хроматографії за допомогою 50 пмоль РТН-стандарту. Аналіз амінокислот 200мкг протеїну розчиняли в 200мкл 6N НСІ і протягом 1 години гідролізують при температурі 166°С. Близько 1нмоль проби подають на аналізатор амінокислот. Кількість амінокислоти визначають за допомогою 5нмоль стандарту. SDS-електрофорез SDS-електрофорез здійснюють за умовами Лемлі (Laemmli). 10мкг інгібітора протеаз аналізують за допомогою 10-20-процентного SDS-гелю і проявляють за допомогою фарбування сріблом (Мерріл (МеггіІ) та інші). U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970). C.R. Merril, M.L Dunau, D. Goldmann, Anal. Biochem. 100: 201-207 (1981). Капілярний електрофорез 8нг інгібітора протеаз досліджують за допомогою капілярного електрофорезу на скляній колонці (довжина 72см, внутрішній діаметр 50мкм). Умови: сила струму 90мкА, температура колонки 25°С, 100нМ фосфатний буфер pH3,0, детектування при довжині хвилі 210нм, подача під тиском протягом 3сек. Хроматографія зі зворотною фазою 5нмоль інгібітора протеаз піддають хроматографії на HPLC-колонці RP-18 (250мм х 4,6мм, 5-мікронний матеріал, діаметр пор 300 Ангстрем) фірми Backerbond. Як елюент використовують градієнт ацетонітрил/TFA. Умови: потік 0,7мл/хв, температура колонки 40°С, детектування 40°С, розчинник А: 0,1% TFA, розчинник В: 0,1% TFA/60% ацетонітрил; градієнт: 0хв. 0% В, 10 хв. 0% В, 70хв. 100% В, 80хв. 0%В. Визначення молекулярної ваги 1мкг інгібітора протеаз аналізують системою MALDI. Як матрикс використовують синапінову кислоту. Як стандартні білки для калібрування маси використовують бичачий інсулін, цитохром С та меліттин. Вміст протеїну Вміст протеїну визначають ВСА-методом. При цьому методі наявними протеїнами здійснюється перетворення іонів С2+ в іони С1+, які з біцинхоніновою кислотою утворюють комплекс, що має поглинання при 560нм. Ліофілізований протеїн доводять до рівноважної вологості і в концентрації 1мг/мл розчиняють в 0,9% розчині NaCI. Готують ряд розведень. До 50мкл розчину зразка додають 1000мкл ВСА-тест-реагента, реакційну трубочку щільно закривають пробкою і точно 30 хвилин інкубують при 60°С. Після охолодження зразків на льодяній бані протягом 5 хвилин здійснюють вимірювання при температурі 25°С та довжині хвилі 560нм. Активність: (тест на гальмування трипсину, титрометричний) Активність визначають модифікованим F.І.Р.-тестом гальмування трипсину. Bay у 19-8757 гальмує каталізований трипсином гідроліз Na-бензоїл-І-аргінінетилового ефіру (ВАЕЕ). Карбонільні групи, що звільняються при реакції, визначають шляхом лужного титрування. Залишкова активність трипсину є мірою інгібіторної активності тестованої речовини. Ліофілізований білок доводять до рівноважної вологості і в концентрації 1мг/мл розчиняють в 0,9% розчині NaCI. Готують ряд розведень. До 1мл розчину зразка додають 2мл буфера (15мМ боратного буфера, pH 8,0 з 200мМ СаСІ 2) та 0,8мл розчину трипсину (2мг/мл) і інкубують 5 хвилин при 25°С. На закінчення додають 0,2мл розчину ВАЕЕ (6,8мг/мл) і через 5 хвилин вимірюють споживання КОН. Визначення перехресної реакції інгібіторів протеаз з поліклональними анти-апротинінантитілами кроликів та людини. 0,5-10нг інгібітора протеаз або апротиніну, розчиненого в буфері зв'язування, протягом ночі звхязують на мікротитрувальному планшеті при температурі 4°С. Комірки чотири рази промивають кожного разу 200 мікролітрами промивного буфера, а потім додають 100мкл розчину для блокування. Планшет накривають і протягом години інкубують при 37°С. Після промивання описаним вище чином додають поліклональні антиапротинінантитіла кролика (0,2мкл/мл в 1% BSA в PBS-буфері) або поліклональні антитіла людини (20мкл/мл в 1% HSA в PBS-буфері). Планшет накривають і протягом години інкубують при 37°С, а потім промивають описаним вище чином. Потім додають 100мкл біотинільованих анти-антитіл кролика чи людини (25мкл+ 10мл 1% BSA чи 1% HSA в PBS-буфері) і протягом години інкубують при 37°С. Пластинку промивають описаним вище чином і до кожного заглиблення додають 100 мклстрептавідіно-пероксидазного комплексу (50мкл+ 10мл 1% BSA чи 1% HSA в PBS-буфері). Планшет накривають і годину інкубують при 37°С, а потім промивають описаним вище чином. Субстратну реакцію здійснюють за допомогою ТМВ-субстрату + розчину пероксидази (1+1; 100 мкл на кожну комірку). Реакцію припиняють через 10 хвилин 2М фосфорною кислотою (100 мкл/комірку) і вимірюють абсорбцію при 450 нм (еталон 570нм). Розчини: 1. Інкубаційний буфер: 15нМ Na2C03, 35нМ NaHCO3, pH9,6 2. Буфери для зразків: Проби розчиняють в потрібній концентрації в інкубаційному буфері. 3. Промивний розчин: 0,1% (об'єм/об'єм) Tween-20 в PBS 4. Розчин для 3% (вага/об'єм) BSA або HSA в PBS блокування: Приклади Приклад 1 Одержання вектора експресії дріжджів для секреції рекомбінантного апротиніну DesPro2-Ser10-Arq15-Ala17Asp24-Thr26-Giu31-Asn41-Glu53 Вихідним матеріалом для одержання гена апротиніну DesPro2-Ser10-Arg 15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41Glu53 служить ген DesPro2-Arg15-Ala17, через рестрикційні ферменти HindIll та ВаmНІ клонований у вектор pUC18. Результуючий вектор (рЕМб.61) піддають реакції дволанцюгового мутагенезу за допомогою мутагенного праймера А та селекційного праймера Scal/Mlul методом U.S.Е. (Pharmacia Biotech). Мутагенний праймер А має таку послідовність: Праймер А 5'GCTGCAGAGCTAACCGTAACACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGGAAACTT GCGGTGGTGCTTAG 3'. Цей праймер генерує мутації Asn41 Glu53 в гені апротиніну DesPro2-Arg15-Ala17. Аналіз клону здійснюють шляхом рестрикційного перетравлювання ферментами Seal та Sphl. Крім того, бажану послідовність підтверджують секвенуванням ДНК клону pEM31.8.L Подальші заміни в області 5і гена (Ser10-Asp24-Thr26-Glu31) здійснюють за допомогою технології ПЛР із застосуванням праймера В та 'зворотного 24-mer M 13' праймера, виходячи із рЕМ31.8.L плазмідної ДНК. Праймер В 5'TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACT TCTACGATGCAACTGCAGGCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC 3'. Послідовність впізнання Xhol підкреслена. Набір ПЛР містить 20нг pEM31.8.L плазмідної ДНК, 20пмоль зворотного 24-mer М13 праймера, 60пмоль праймера В, 200мкМ dNTPs, 1 х ПЛР реакційного буфера II (Perkin Elmer), 4мМ MgCI2 та 2,5 одиниці Tag ДНК полімерази (Perkin Elmer) в загальному об'ємі 100мкл. Умови циклування були такими: інкубування 3хв. при 94°С, 30 циклів по 1хв. при 94°С, 1хв. при 55°С та 1хв. при 72°С і заключні 5хв. при 72°С. Набір ПЛР розводять у співвідношенні 1:5 і лігують з вектором pCRII (Інвітроджен). Використовуючи лігаційну суміш трансформують клітини Е. coli DH5α. Позитивні клони після рестрикційного перетравлювання ферментами Xhol та ВаmНІ ідентифікують і секвенують кілька клонів. Клон pES9.10.L містить бажану послідовність і використовується для подальшої роботи. Човниковий вектор Е.соli/дріжджі (наприклад, рА202) використовують для конструкції секреторного вектора дріжджів, в якому послідовність апроти-ніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 зв'язана з пре-про-послідовністю альфа-фактору дріжджів. Вектор рА202 несе ген стійкості до ампіциліну (ЬІа) та ген URA3 як селектований мічений ген для Е.соli та дріжджів. Подальшими суттєвими елементами вектора є Соl Е1 та 2 ц початкової точки реплікації (огі). Місце REP3 також знаходиться в цій області. Фрагмент EcoRI-Hindlll розміром 1200 пар основ несе промотор MFαl та Nкінцеву пре-про-послідовність альфа-фактора білка-посередника дріжджів (Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982). Шляхом введення модифікованого апротиніну DesPro2-Arg15 сДНК як фрагменту Hindlll-BamHI, відновлюється розпізнавальна позиція для Kexll-протеази ('Lys-Arg') всередині пре-про-послідовності альфафактора (ЕР 0 419 878). На 3'-кінці послідовності апротиніну DesPro2-Arg15 вектор несе фрагмент BamHI-Sall гена URA3 дріжджів, що в цій позиції функціонує як сигнал закінчення для транскрипції (Yarger et al., Mol. Cell. Biol. 6,1095-1101, 1986). Фрагмент ДНК розміром 180 пар основ за допомогою Xhol та ВаmНІ вирізають із вектора pES9.10.L , очищають електрофорезом на агарозному гелі і клонують в також розрізаний за допомогою Xhol та ВатНІ вектор рА202 та дефосфорилюють. Шляхом такого клонування апротинін DesPro2-Arg15 у векторі рА202 замінюють апротиніном DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41-Glu53. Клітини дріжджів (JC34.4D) трансформують вектором pES13.10.L, одержаним в результаті цього клонування. Інші човникові вектори Е. соІі/дріжджі з різними промоторами, наприклад, конститутивним GAPDH або індукованим GAL 10 промоторами, можуть бути одержані таким же чином і також ведуть до секреції апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53. Зрозуміло, що поряд з цим можна також використовувати човникові вектори з іншим походженням реплікації дріжджів, наприклад, сегмент, що реплікується автономно (ars). Придатними селективними маркерними генами поряд із геном URA3 є також гени, які сприяють ауксотрофним мутантам дріжджів для прототрофи, такі, наприклад, як LEU2, HIS3 або TRP1. Крім того, можуть бути використані також гени, продукти яких визначають стійкість до різних антибіотиків, наприклад, до аміноглікозиду G418. Інші дріжджі, наприклад, метилотрофні дріжджі Pichia pastoris або Hansenula polymorpha, після трансформації придатними векторами також в змозі продукувати апротинін DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 Asn41 -Glu53. Приклад 2 Одержання вектора експресії дріжджів для секреції рекомбінантного апротиніну Ser10-Arq15-Ala17-Asp24Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53 з природною N-кінцевою послідовністю 'Arg-Pro-Asp' Для одержання вектора експресії дріжджів, що дозволяє одержати секрецію рекомбінантного апротиніну Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 з природною N-кінцевою послідовністю 'Arg-Pro-Asp', спочатку за допомогою ПЛР підсилюють і клонують промотор MFα1 з α-фактором пре-послідовності та 57-кінцем гена апротиніну (до послідовності впізнання рестрикційного ферменту Xhol). Праймери, що використовуються, мають такі послідовності: Праймер С: 5'GGGATACTATTGATAAGATTTTAAAGGTATTTGACAAG 3'. Послідовність розпізнавання EcoRV підкреслена. Праймер D: 5'GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAA CAAGACAGCAGTGAAAATAGATGGAATCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT 3'. Послідовність розпізнавання Xhol підкреслена. Набір ПЛР містить 200нг рА202 плазмідної ДНК, 0,2мкМ праймера С, 0,2мкМ праймера D, 200мкМ dNTPs, 1 х ПЛР реакційного буфера 11 (Stratagene, Opti-Prime™) та 2,5 одиниці Taq полімерази (Perkin Elmer) загальним об'ємом 50мкл. Умови циклування: інкубування 1 хв. при 94°С, 30 циклів по 1хв. при 94°С, 1хв. при 50°С та 2хв. при 72°С і заключні 5хв. при 72°С. ПЛР-набір розводять у співвідношенні 1:5 і лігують з вектором pCRII (Інвітроджен). Сумішшю для лігування трансформують клітини E. coli DH5α Позитивні клони ідентифікують після рестрикційного перетравлювання ферментом EcoRI і секвенують кілька клонів. Клон plU20.11.L використовують для подальшої роботи. Човниковий вектор pYES2 (Інвітроджен) Е.соІІУдріжджі використовують для конструкції вектора секреції дріжджів, в якому послідовність апротиніну SerlO-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 безпосередньо зв'язана з альфа-фактором пре-послідовності дріжджів. Спочатку вектор pYES2 вирізають рестрикційними ферментами Sspl та ВатНІ, дефосфорилюють і очищають у гелі. При цьому наявні у векторі pYES2 промотор GAL1 та fl ori видаляють. Фрагмент ДНК розміром близько 1030 пар основ за допомогою ферментів EcoRV та Xhol вирізають із вектора plU20.11.L, очищають електрофорезом на агарозному гелі і разом з фрагментом Xhol та ВатНІ розміром близько 180 пар основ із вектора pES9.10.L клонують у векторі pYES2, розрізаному ферментами Sspl та ВатНІ. Лігаційною сумішшю трансформують клітини E.coli DH5a. Позитивні клони після рестрикційного перетравлювання ферментом Xhol ідентифікують і секвенують. Клітини дріжджів (JC34.4D) трансформують вектором plU28.11.L, одержаним в результаті цього клонування. Експресійний вектор plU28.11.L більше не містить ос-фактора про-послідовності, так що процесування апротиніну Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31Asn41-Glu53 здійснюється виключно завдяки сигнальній пептидазі і незалежно від розщеплення протеазою КехІІ. Приклад 3 Ферментація Saccharomyces cerevisiae Експресійний штам Saccharomyces cerevisiae ферментують описаним вище чином. Приклад 4 Очищення похідних апротиніну без сумарного зарядупри нейтральному значенні pH 1. Огляд придатних способів очищення Після ферментації клітини відокремлюють центрифугуванням, а надосадову рідину фільтрують з метою видалення клітин, що ще залишились. Звільнену від клітин надосадову рідину підкислюють концентрованою лимонною кислотою до значення pH 3,0. Розчин розводять очищеною водою до досягнення електропровідності меншої, ніж 8мСм/см. Потім розчин подають на колонку катіонного обмінника, попередньо врівноважену кислим буфером. Не зв'язаний матеріал видаляють шляхом промивання великою кількістю стартового буфера. Продукт елююють за допомогою сольового градієнта. Одержані фракції досліджують на вміст продукту за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском зі зворотною фазою (RP-HPLC) та біологічного тесту активності, який виявляє інгібування протеаз. Фракції, що містять продукт, очищують і безпосередньо подають на препаративну RP-HPLC-колонку. Перед цим колонку врівноважують кислим буфером. Продукт елююють за допомогою градієнта органічного розчинника. Фракції описаним вище чином знову досліджують на наявність продукту і фракції, що містять продукт, очищають. В залежності від досягнутої чистоти продукту, можливо знадобиться очищення на другій RP-HPLC-колонці. Умови в основному аналогічні описаним вище. Одержаний розчин продукту розводять водою для ін'єкцій, розливають порціями і висушують заморожуванням. Для очищення похідних апротиніну без сумарного заряду при нейтральному значенні pH з описаними вище процесами можуть бути комбіновані також афінна хроматографія за допомогою трипсину, (мобілізованого на сефарозі та гельпроникна хроматографія. 2. Очищення апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31 -Asn41 -Glu53 Матеріал із 10-літрового ферментатора очищують таким способом. Після закінчення ферментації вміст ферментатора підкислюють концентрованою лимонною кислотою до значення pH 3,0 і 10 хвилин витримують при 70 °С. Потім шляхом центрифугування (15 хвилин, 7500g, Heraeus Zentrifuge) видаляють клітини і одержану надосадову рідину фільтрують (8мкм-0,2мкм, МіІІіроге, Німеччина). Надосадова рідина із цієї стадії після заморожування при -18°С може зберігатись до наступного використання. Потім розчин розводять очищеною водою до досягнення електропровідністі менше 8мСм/см і подають на колонку SP-Sepharose FF (Pharmacia, Швеція). Колонку попередньо врівноважують 50нМ цитрат-МаОН-буфером, pH3. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Потім продукт елююють за допомогою сольового градієнта (1М NaCI). Одержані фракції досліджують на вміст продукту за допомогою рідинної хроматографії під високим тиском зі зворотною фазою (RP-HPLC, С4) та шляхом тестування протеазоінгібіторної активності. Фракції, що містять бажаний продукт, очищають. Потім розчин продукту безпосередньо подають на першу RP-HPLC-колонку (Source 15 RPC, Pharmacia, Швеція), попередньо врівноважену 0,1% розчином трифтороцтової кислоти у воді. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Продукт елююють за допомогою лінійного ацетонітрильного градієнта (0-70%). Одержані фракції знову досліджують на вміст продукту описаними вище способами і ті з них, що містять продукт, очищають. Для заключного очищення розчин, що містить продукт, розводять водою для ін'єкцій і подають на другу RP-HPLC-колонку (Vydac C8, Vydac, США), попередньо врівноважену 0,1% розчином трифтороцтової кислоти у воді. Не зв'язаний протеїн видаляють інтенсивним промиванням таким же буфером. Продукт елююють за допомогою лінійного ацетонітрильного градієнта (0-70%). Одержані фракції знову досліджують на вміст продукту описаними вище способами і ті з них, що містять продукт, очищають. Одержаний розчин продукту розводять водою для ін'єкцій, розливають потрібними порціями (20,10, 1 та 0,2мг), ліофілізують та аналізують. Приклад 5 Визначення Кі-значення калікреїну плазми крові людини з апротиніном DesPro2-Ser10-Arq15-Ala17-Asp24Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 Приклад: 1 одиницю калікреїну плазми розводять до 16мл буфером (0,05M Tris/0,1 M NaCI, 0,05 % Tween-20, pH 8,2). 200мкл цього ферментативного розчину змішують з об'ємами, що зменшуються, тест-буфера (250, 240, 230,220,200, 180, 170, 150, 100, 50мкл), а потім додають кількість інгібітора, що збільшується, в буфері для визначення (10, 20, ЗО, 50, 70, 80, 100, 150, 200 і 250 мкл, концентрація 0,7мкг/мкл). Розчин інгібітора ферментів попередньо інкубують протягом 4 годин при кімнатній температурі. Потім 180 мкл кожного розчину поміщують у комірку мікротитрувального планшету і змішують з 20 мкл субстратного розчину. Вимірюють зміну абсорбції на хвилі 405нм за 10 хвилин. Визначають швидкість ферментної реакції, а також значення Кі за методом Bieth (Biochemical Medicine 32: 387-97(1984)). Розчин сирового субстрату: 0,1 M в DMSO Субстратний розчин: 1 х 10'3М S-2302 в буфері для визначення Буфер для визначення: 0,05M тріс-(гідроксиметил)-амінометан), 0,1 M NaCI, 0,05 % Tween-20; pH 8,2; 1 мл бензилового спирту/л. Кінетичні константи комплексування з ферментним фактором Хіа плазміну, бичачим трипсином та хімотрипсином визначають таким же способом. Субстратами служили: Хромозим PL для плазміну, HD-Pro-PheArg-pNA для фактора XI, S-2444 для трипсину та Suc-Phe-Leu-Phe-pNA для хімотрипсину. Приклад 6 Результати хімічної характеристики білка anpотиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-AsD24-Thr26-Glu31-Asn41Glu53 Інгібітор протеаз апротинін DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 одержують за допомогою дріжджевих організмів, змінених методами генної інженерії. Із надосадової рідини його очищують до однорідності за допомогою різних хроматографічних способів. Ідентичність інгібітора з клонованої послідовністю підтверджують подальшими аналітичними дослідженнями білка. Аналіз N-термінальних послідовностей Інгібітор протеаз повністю секвенують у 57 стадій. Наведений нижче запис показує визначену послідовність білка, ідентичну з клонованою послідовністю. 1 Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-lle-lle-Arg-Tyr21 Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala40 Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala Аналіз послідовностей апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 здійснюють у 57 стадій. Аналіз амінокислот Аналіз амінокислот представляє важливий кількісний параметр для характеристики білка. Поряд із вмістом білка при відомій первинній структурі визначають кількість амінокислот. Аналіз амінокислот апротиніну DesPro2Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 добре узгоджується з теоретичними знаннями про первинну структуру (табл. 1). Таблиця 1 Аналіз амінокислот апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu3 l-Asn41-Glu53. Експериментальні значення взяті відносно АІа=7 Амінокислоти Експериментальні значення Теоретичні значення CysS03H 5,28 6 Asp 6,27 6 Ihr 3,49 4 Ser 1,58 2 Glu 4,25 4 Gly 6,16 6 Ala 7,00 7 Val 0,98 1 Met 1,10 1 He 1.66 2 Leu 1,89 2 Tyr 2,49 3 Phe 4,11 4 Lys 1,05 1 Arg 4,73 5 Pro 3,23 3 *) Цистеїни та метіоніни визначались після оксидування пермурашиною кислотою. Хроматографія зі зворотною фазою При HPLC-хроматографії білків на хімічно зв'язаній зворотній фазі зв'язування з фазою, що використовується відбувається за рахунок гідрофобної взаємодії білків. Протеїни переміщуються в залежності від сили їх зв'язування зі стаціонарною фазою органічних розчинників (мобільна фаза). На цій підставі цей метод є добрим критерієм для оцінки чистоти протеїну. Апротинін DesPro2-Ser10-ATgl5-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 елююється як єдиний пік RP-18-фази. Виявилось, що ізольований інгібітор протеаз дуже чистий. СЕ-Хроматографія Капілярний електрофорез робить можливим відокремлення пептидів та білків на підставі їх заряду в електричному полі. При цьому якість відокремлення залежить від буфера, значення pH, температури та використовуваних домішок. Як капіляри застосовують колонки з так званим злитим кремнеземом з внутрішнім діаметром 50-100мкм. Апротинін DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Giu31-Asn41-Glu53 відокремлюють на колонці зі злитим кремнеземом в електричному полі. Електроферограма має один гострий пік. Визначення молекулярної ваги Молекулярну вага апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 була визначена за допомогою системи MALDI: 6223 Дальтон. Виміряна молекулярна вага перебуває у відповідності з теоретичним значенням 6215 Дальтон в рамках точності методу вимірювання. Як матрикс використовують синапінову кислоту. SDS-гель-електросЬорез Апротинін DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 аналізували за допомогою SDSелектрофорезу за умов відновлення та у невідновлювальних умовах. Електроферограма має смугу в області близько 6,5кД. Приклад 7 Визначення значень Кі для комплексування ферментів запротиніном DesPro2-Ser10-Arq15-Ala17-Asp24-Thr26Giu31-Asn41-Glu53 Інгібіторні константи апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53 визначались для різних ферментів. В табл. 2 наведені значення Кі. Таблиця 2 Інгібіторні константи комплексування апротиніну DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41Glu53 з ферментами та калікреїном плазми, фактором Хіа, бичачим хімотрипсином та бичачим трипсином. Фермент Калікреін плазми Плазмін Фактор Хіа Трипсин Значення Кі [М] 2x1 0-11 5x10-10 5x1 0'10 2x1 0"11 Хімотрипсин 9x1 0'9 Приклад 8 Взаємодія інгібіторів протеаз з поліклональними антитілами кроликів і, відповідно, людини Рекомбінантно одержані інгібітори протеаз досліджувались на їх перехресну активність з поліклональними анти-апротинін-антитілами кроликів та, відповідно, людини. Було встановлено, що різні варіанти інгібіторів протеаз мають слабку взаємодію з апротинін-антисироватками. ПРОТОКОЛ СЕКВЕНУВАННЯ (1) ЗАГАЛЬНІ ДАНІ: (і) ЗАЯВНИК: (A) ІМ’Я: BAYER AG (B) ВУЛИЦЯ: BAYERWERK (C) МІСТО: ЛЕВЕРКУЗЕН (D) КРАЇНА: НІМЕЧЧИНА (Е) ПОШТОВИЙ ІНДЕКС: 51368 (F) ТЕЛЕФОН: 0214-3061455 (G) ТЕЛЕФАКС: 0214303482 (іі) НАЗВА ВИНАХОДУ: Похідні апротиніну з покращеними властивостями (ііі) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ: 5 (iv) КОМПЧЮТЕРНІ ДАНІ: (A) НОСІЙ ІНФОРМАЦІЇ: Гнучкий диск (B) КОМП’ЮТЕР: IBM PC сумісний (C) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА: PC-DOS/MS DOS (D) ПРОГР. ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ: Patentin Release #1.0, Версія #1.30В (ЕРА) (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ №:1: (і) ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 69 Пар основ (B) ВИД: Нуклеотид (C) ФОРМА: Одноланцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (iv) АНТИСМИСЛОВА: НІ (v) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер А (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 1: GGCTGCAGAG CTAACCGTAA СААСТТСААА TCCGCGGAAG ACTGCATGGA AACTTGCGGT 60 GGTGCTTAG 69 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ №: 2: (і) ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) LANGE: 93 Пар основ (B) ВИД: Нуклеотид (C) ФОРМА: Одналанцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (iv) АНТИСМИСЛОВА: НІ (v) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер В (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 2: TGCCTCGAGC CGCCGTCTAC TGGGCCCTGC AGAGCTATCA TCCGTTACTT CTACGATGCA 60 ACTGCAGGCC TGTGTGAAAC CTTCGTATAC GGC 93 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ №: 3: (і) ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) LANGE: 38 Пар основ (B) ВИД: Нуклеотид (C) ФОРМА: Одналанцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (v) ВИД ФРАГМЕНТА: лінійна (vi) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер С (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 3: GGGATATCTA TTGATAAGAT TTAAAGGTAT TTGACAAG 38 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ №: 4: (і) ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 99 Пар основ (B) ВИД: Нуклеотид (C) ФОРМА: Одноланцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ВИД МОЛЕКУЛИ: Геномна ДНК (ііі) ГІПОТЕТИЧНІ: НІ (iv) АНТИСМИСЛОВА: HI (vi) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: Праймер D (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 4: GGGCTCGAGG CAGAAATCTG GTCTAGCCAA AGCAGAAGAA GCAGCGAACA AGACAGCAGT 60 GAAAATAGAT GGAATCTCAT ТСТТТТААТС GTTTATATT 99 (2) ДАНІ ПОСЛІДОВНОСТІ №: 5: (і) ПАРАМЕТРИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (A) ДОВЖИНА: 57 амінокислот (B) ВИД: амінокислота (C) ФОРМА: Одноланцюгова (D) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (іі) ВИД МОЛЕКУЛИ: пептид (v) ВИД ФРАГМЕНТА: лінійний (vi) ПЕРВИННЕ ПОХОДЖЕННЯ: (А) ОРГАНІЗМ: варіант апротиніну (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: SEQ ID NO: 5: Фіг.1