Антитіло, яке специфічно зв’язується з tnf-альфа людини

Реферат: Винахід належить до антитіла, яке специфічно зв’язується з TNF-α та має зменшену здатність до агрегації, нуклеїнової кислоти, вектора та клітини-хазяїна для експресії вказаних антитіл та способів їх застосування у медицині. UA 111340 C2 (12) UA 111340 C2 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання на споріднені заявки Згідно §119 розділу 35 зведення законів США щодо даної заявки заявляється пріоритет попередньої заявки на патент США № 61/405798, поданої 22 жовтня 2010 року, та 61/484749, поданої 11 травня 2011 року, повні змісти яких приведено у даному документі як посилання. Галузь техніки Даний винахід відноситься до способів зменшення здатності антитіл до агрегації та до антитіл, які модифіковані таким чином, щоб зменшити здатність агрегуватися. Даний винахід також відноситься до антитіл, які зв'язуються з фактором альфа некрозу пухлин (TNFα). Зокрема, даний винахід відноситься до стабільних та розчинних антитіл, що містять модифікацію, що зменшує здатність до агрегування, у тому числі до антитіл у вигляді scFv та Fab-фрагментів, які містять специфічні послідовності легкого ланцюгу та важкого ланцюгу, які оптимізовані у відношенні стабільності, розчинності та низької імуногенності. Крім того, даний винахід відноситься до способів діагностики та/або лікування TNF-опосередкованих порушень. Передумови створення винаходу Фактор альфа некрозу пухлин (TNFα, також відомий як кахектин) є природним цитокіном ссавців, що продукується численними типами клітин, в тому числі моноцитами та макрофагами у відповідь на ендотоксин або інші стимули. TNFα є основним медіатором запалення, імунологічних та патофізіологічних реакцій (Grell, M., et al. (1995) Cell, 83: 793-802). Розчинний TNFα утворюється в результаті розщеплення трансмембранного білкупопереднику (Kriegler, et al. (1988) Cell 53: 45-53), а секретуємі поліпептиди з молекулярною масою 17 кДа збираються у розчинні гомотримерні комплекси (Smith, et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; для оглядів TNFα див. Butler, et al. (1986), Nature 320: 584; Old (1986), Science 230: 630). Ці комплекси потім зв'язуються з рецепторами, що знаходяться на множині клітин. Зв'язування викликає велике число прозапальних ефектів, у тому числі (i) викид інших прозапальних цитокінів, таких як інтерлейкін (IL)-6, IL-8 та IL-1, (ii) вивільнення матриксних металопротеїназ та (iii) підвищення експресії молекул, що залучаються у адгезію до ендотелію, які додатково збільшують каскад запальних та імунних реакцій у результаті залучення лейкоцитів у позасудинні тканини. Велика кількість порушень пов'язана з підвищеними рівнями TNFα, багато з них мають важливе значення у галузі медицини. Встановлено, що експресія TNFα підвищена при ряді захворювань людини, що включають хронічні захворювання, такі як ревматоїдний артрит (RA), запальні захворювання кишечнику, у тому числі хвороба Крона та неспецифічний виразковий коліт, сепсис, застійну серцеву недостатність, бронхіальну астму та розсіяний склероз. Трансгенні миші, що несуть ген для TNFα людини, продукують високі рівні TNFα конститутивно, та у них розвивається деструктивний поліартрит, що носить спонтанний характер, який має схожість з RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). Тому TNFα називають прозапальним цитокіном. У даний час загально прийнято, що TNFα є ключовим фактором у патогенезі RA, який представляє собою хронічне, прогресуюче та ослаблююче захворювання, що характеризується запаленням та руйнуванням множини суглобів, при цьому системними симптомами є лихоманка та нездужання та утомленість. RA також приводить до хронічного запалення синовіальної сумки, звичайно з прогресуванням до суглобного хряща та руйнування кістки. Підвищені рівні TNFα виявлені як у синовіальній рідині, так і у периферичній крові пацієнтів, що страждають на RA. При введенні пацієнтам, що страждають на RA, засобів, що блокують TNFα, вони зменшують запалення, ослаблюють симптоми та уповільнюють руйнування суглобів (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42: 1204-1208). Фізіологічно TNFα також зв'язують із захистом від конкретних інфекцій (Cerami et al. (1988), Immunol. Today 9:28). TNFα вивільнюється макрофагами, які були активовані ліпополісахаридами грамнегативних бактерій. Як такий, TNFα, очевидно, є ендогенним медіатором, що має основне значення, залученим у розвиток та патогенез ендотоксичного шоку, зв'язаного з бактеріальним сепсисом (Michie, et al. (1989), Br. J. Surg. 76: 670-671; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, p. 463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 2747; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum p. 715-718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17: 489-497; Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161: 982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123: 162-170). Встановлено, що, як і у випадку інших систем органів, TNFα також грає ключову роль у центральній нервовій системі, зокрема, при запальних та аутоімунних порушеннях нервової системи, включаючи розсіяний склероз, синдром Гійєна-Барра та важкої міастенії, та при дегенеративних порушеннях нервової системи, що включають хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона та хворобу Хантінгтона. TNFα також залучений у порушення зв'язаних систем 1 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сітківки та м'язу, що включають неврит зорового нерву, дегенерацію жовтої плями, діабетичну ретинопатію, дерматоміозит, аміотрофічний бічний склероз та м'язову дистрофію, а також в ушкодження нервової системи, у тому числі травматичне ушкодження головного мозку, гостру травму спинного мозку та інсульт. Гепатит є іншим, зв'язаним з TNFα запальним захворюванням, яке може бути викликане, серед інших пускових механізмів, хвороботворними вірусами, у тому числі вірусом ЕпштейнаБара, цитомегаловірусом та вірусами гепатиту A-E. Гепатит є причиною гострого запалення печінки у області воротної вени та області дольок, після чого слідує фіброз та розвиток пухлини. TNFα може також опосередковувати кахексію при раку, яка є найчастішою причиною смертності при раку (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389: 299-305). Ключова роль, яку відіграє TNFα при запаленні, у клітинних імунних реакціях та патології багатьох захворювань, привела до пошуку антагоністів TNFα. Одним з класів антагоністів TNFα, призначених для лікування TNFα-опосередкованих захворювань, є антитіла або фрагменти антитіл, які специфічно зв'язуються з TNFα та тим самим блокують їх дію. При використанні антитіл проти TNFα було встановлено, що блокування TNFα може усувати ефекти, що приписують TNFα, у тому числі, зменшує IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, адгезивні молекули та руйнування тканин (Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997: 283-350). Серед специфічних інгібіторів TNFα, які недавно з'явилися у продажу, моноклональное, химерне антитіло мишіTM людини, спрямоване проти TNFα, (інфліксимаб, Remicade ; Centocor Corporation/Johnson & Johnson) продемонструвало клінічну ефективність у лікуванні RA та хвороби Крона. Незважаючи на ці досягнення, зберігається необхідність у нових та ефективних формах антитіл або інших антитілах для лікування зв'язаних з TNFα порушень, таких як RA. Зокрема, існує нагальна необхідність у антитілах з оптимальними функціональними властивостями для ефективного та тривалого лікування артриту та інших TNFα-опосередкованих порушень. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід відноситься до антитіл, що містять щонайменше одну мутацію, що зменшує агрегацію, та до способів одержання таких антитіл. У одному з аспектів даний винахід відноситься до способів зменшення здатності антитіл до агрегації, що включає введення однієї або більше зменшуючих агрегацію модифікацій у положенні залишку, що приймає участь у взаємодії між варіабельним доменом легкого ланцюгу та варіабельним доменом важкого ланцюгу антитіла, причому заміна зменшує вільну енергію між варіабельним доменом легкого ланцюгу та варіабельним доменом важкого ланцюгу щонайменше на 0,5 ккал/моль, у зв'язку з чим зменшується здатність до агрегації модифікованого антитіла у порівнянні з такою вихідного антитіла, у якому немає зменшуючої(их) агрегацію модифікації(й). У одному з аспектів спосіб згідно з даним винаходом включає введення однієї або більше амінокислотних замін у галузь контакту варіабельного домену легкого ланцюгу (VL) та варіабельного домену важкого ланцюгу (VH) антитіла, причому одна або більше замін знаходяться у положеннях залишків, вибраних для зменшення вільної енергії між VL та VH щонайменше на 10 %, у зв'язку з чим зменшується здатність до агрегації антитіла у порівнянні з вихідним антитілом. У конкретному аспекті послідовність варіабельного домену легкого ланцюгу антитіла щонайменше на 65 % ідентична послідовності SEQ ID NO:1. У інших аспектах послідовність варіабельного домену важкого ланцюгу щонайменше на 85 % ідентична послідовності SEQ ID NO:3 або послідовності SEQ ID NO:4. У деяких аспектах спосіб згідно з даним винаходом включає модифікування залишку у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo та/або залишку у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу антитіла, у зв'язку з чим зменшується здатність до агрегації антитіла у порівнянні з вихідним антитілом. У інших аспектах спосіб згідно з даним винаходом, крім того, включає модифікування залишків у положеннях 12, 103 та 144 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену важкого ланцюгу. Даний винахід також відноситься до антитіл із зниженою здатністю до агрегації, що містять одну або декілька зменшуючих агрегацію модифікацій. У деяких аспектах антитілом згідно з даним винаходом є Fab, Fab', F(ab)'2, одноланцюговий Fv (scFv), Fv-фрагмент або лінійне антитіло. У інших аспектах даний винахід відноситься до біспецифічної або двовалентної молекули, що містить антитіло згідно з даним винаходом. У інших аспектах зменшуюча агрегацію модифікація знаходиться у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. У конкретному аспекті зменшуюча агрегацію модифікація містить аргінін (R) у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. Тим не менше, у іншому 2 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аспекті зменшуюча агрегацію модифікація містить заміну лізину (K) на аргінін (R) у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. Тим не менше, у інших аспектах зменшуюча агрегацію модифікація знаходиться у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. У конкретному аспекті зменшуюча агрегацію модифікація містить аргінін (R) у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. Тим не менше, у іншому аспекті зменшуюча агрегацію модифікація містить заміну лізину (K) на аргінін (R) у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. Даний винахід також відноситься до стабільних та розчинних антитіл, специфічних для TNFα, які містять незвичайні послідовності легкого ланцюгу та важкого ланцюгу, які оптимізовані у відношенні стабільності, розчинності, in vitro та in vivo зв'язування з TNFα, та низької імуногенності. Зазначені антитіла призначені для діагностики та/або лікування TNFαопосередкованих порушень. Також винахід відноситься до нуклеїнових кислот, векторів та клітин-хазяїв для експресії рекомбінантних антитіл, варіабельних доменів легких ланцюгів та варіабельних доменів важких ланцюгів згідно з даним винаходом, та до способів їх виділення та до застосування зазначених антитіл у медицині. Даний винахід також відноситься до способів лікування TNFα-опосередкованого порушення, що включають введення індивіду фармацевтичної композиції, що містить антитіло проти TNFα згідно з даним винаходом. У деяких аспектах TNF-альфа-опосередкованим порушенням є очна хвороба, вибрана з групи, що складається з увеїту, хвороби Бехчета, ретиніту, сухості очей, глаукоми, синдрому Шегрена, діабетичної невропатії, склериту, вікової дегенерації жовтої плями та кератиту. Конкретні кращі варіанти здійснення даного винаходу стануть очевидними з наступного більш детального опису деяких кращих варіантів здійснення та формули винаходу. Короткий опис креслень На фіг. 1 представлені титраційні криві для положень залишків VL47 (суцільні лінії) та VL50 (пунктирні лінії) у двох різних молекулах scFv, 34rFW1.4 (чорний колір) та 578rFW1.4 (сірий колір). Фіг. 2A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 60 мг/мл. Фіг. 2B демонструє стабільність 34rFW1.4_VLK50R_DHP у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 60 мг/мл. Фіг. 3A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 40 мг/мл. Фіг. 3B демонструє стабільність 34rFW1.4_VLK50R_DHP у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 40 мг/мл. Фіг. 4A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 20 мг/мл. Фіг. 4B демонструє стабільність 34rFW1.4_VLK50R_DHP у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 20 мг/мл. Фіг. 5A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 60 мг/мл. Фіг. 5B демонструє стабільність 34rFW1.4_VL_K50R у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 60 мг/мл. Фіг. 6A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 40 мг/мл. Фіг. 6B демонструє стабільність 34rFW1.4_VLK50R у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 40 мг/мл. 3 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 7A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 20 мг/мл. Фіг. 7B демонструє стабільність 34rFW1.4_VLK50R у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 20 мг/мл. Фіг. 8A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 60 мг/мл. Фіг. 8B демонструє стабільність 34rFW1.4_K47R у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 60 мг/мл. Фіг. 9A демонструє стабільність 34rFW1.4 у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 20 мг/мл. Фіг. 9B демонструє стабільність 34rFW1.4_K47R у прискорених умовах, що визначається за допомогою аналізу з використанням ексклюзивної HPLC після інкубації впродовж 2 тижнів при 40ºC та з використанням концентрації, що становить 20 мг/мл. Детальний опис даного винаходу Загальною метою даного винаходу є одержання стабільних та розчинних антитіл, що мають знижену здатність до агрегації у розчині. У кращому варіанті здійснення зазначеним антитілом є антитіло у вигляді scFv або Fab-фрагмент. Антитіла згідно з даним винаходом, переважно, включають легкий та важкий ланцюги, розкриті у даному описі. Представлений у даному описі детальний опис служить прикладом та призначено лише для ілюстративного обговорення кращих варіантів здійснення даного винаходу, та приведено для надання того, що, як мають на увазі, є найбільш раціональним та цілковито зрозумілим описом принципів та концептуальних аспектів різних варіантів здійснення даного винаходу. У зв'язку з цим не робиться спроба показати структурні деталі даного винаходу більш детально, ніж необхідно для розуміння принципів даного винаходу, при цьому на основі опису у поєднанні з кресленнями та/або прикладами спеціалісту у даній області буде зрозуміло, яким чином можуть бути здійснені на практиці деякі форми даного винаходу. Для розуміння даного винаходу нижче визначені деякі терміни. Додаткові визначення приведені впродовж всього детального опису. Наступні визначення та пояснення, як мається на увазі та передбачається, є кращими при будь-якому подальшому тлумаченні, якщо тільки вони явно та однозначно не змінені у наступних прикладах, або крім випадків, коли їх використання робить яке-небудь тлумачення безглуздим або по суті безглуздим. У тих випадках, коли тлумачення терміну буде безглуздим або по суті безглуздим, тоді визначення слід брати із словника Webster, 3-тє видання або словника, відомого спеціалістам у даній галузі, такого як Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004). Використовуваний у даному описі термін "антитіло" включає повнорозмірні антитіла та будьякий антигензв'язуючий фрагмент (тобто "антигензв'язуючу частину", "антигензв'язуючий поліпептид" або "імунну зв'язуючу речовину") або їх одиночний ланцюг. "Антитіло" включає глікопротеїн, що містить щонайменше два важкі (H) ланцюги та два легкі (L) ланцюги, взаємно з'єднані дисульфідними зв'язками, або його антигензв'язуючу частину. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюгу (у даному описі скорочено як V H) та константної області важкого ланцюгу. Константна область важкого ланцюгу складається з трьох доменів, CH1, CH2 та CH3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюгу (у даному описі скорочено як VL) та константної області легкого ланцюгу. Константна область легкого ланцюгу складається з одного домену, CL. V H- та VL-області можна далі розділити на ділянки гіперваріабельності, що називаються визначаючими компліментарність ділянками (CDR), розташовані впереміж з областями, які є більш консервативними, що називаються каркасними областями (FR). Кожна V H та VL складається з трьох CDR та чотирьох FR, розташованих від аміно-кінця до карбоксильного кінця у наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важкого та легкого ланцюгів містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, що включають різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) та перший компонент (Clq) класичної системи комплементу. 4 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "антигензв'язуюча частина" антитіла (або просто "частина антитіла") відноситься до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (наприклад, TNF). Було встановлено, що функцію антитіла, що відноситься до зв'язування антигену, можуть виконувати фрагменти повнорозмірного антитіла. Приклади зв'язуючих фрагментів, що включаються у термін "антигензв'язуюча частина" антитіла, включають (i) Fab-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з V L-, VH-, CL- та CH1доменів; (ii) F(ab')2-фрагмент, двовалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, зв'язані дисульфідним містком у шарнірній області; (iii) Fd-фрагмент, що складається з VH- та CH1доменів; (iv) Fv-фрагмент, що складається з VL- та VH-доменів одного плеча антитіла, (v) один домен або dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), який складається з VHдомену; та (vi) виділену визначаючу компліментарність ділянку (CDR) або (vii) комбінацію двох або більше виділених CDR, які можуть бути необов'язково з'єднані за допомогою синтетичного лінкеру. Крім того, хоча два домени Fv-фрагменту, VL та VH, кодуються окремими генами, їх можна з'єднати, використовуючи способи створення рекомбінантних молекул, за допомогою синтетичного лінкеру, який дозволяє створити їх у вигляді одного білкового ланцюгу, у якому V Lта VH-області спарені з утворенням одновалентних молекул (відомих як одноланцюговий Fv (scFv); див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; та Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Передбачається, що такі одноланцюгові антитіла також включені у термін "антигензв'язуюча частина" антитіла. Ці фрагменти антитіл отримують, використовуючи звичайні способи, відомі спеціалістам у даній галузі, та фрагменти піддають скринінгу на предмет корисності таким же чином, як і інтактні антитіла. Антигензв'язуючі частини можуть бути отримані способами рекомбінантних ДНК або за допомогою ферментативного або хімічного розщеплення інтактних імуноглобулінів. Антитіла можуть бути антитілами різних ізотипів, наприклад, антитілом ізотипу IgG (наприклад, підтипу IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE або IgM). Термін "каркасні області" відноситься до прийнятих у даній галузі частин варіабельної області антитіла, які знаходяться між більш дивергентними CDR-ділянками. Такі каркасні області звичайно називають каркасними областями з 1 по 4 включно (FR1, FR2, FR3 та FR4) та забезпечують остов для утримання, у тримірному просторі, трьох CDR, що виявляються у варіабельній області важкого або легкого ланцюгу антитіла, таким чином, що CDR можуть утворювати антигензв'язуючу поверхню. Такі каркасні області можна також назвати остовами, оскільки вони слугують опорою для презентації більш дивергентних CDR. Як антигензв'язуючі молекули можуть використовуватися інші CDR та каркасні області суперсімейства імуноглобулінів, такі як анкіринові повтори та фібронектин (див. також, наприклад, патенти США № 6300064 та 6815540 та публікацію заявки на патент США № 20040132028). Термін "епітоп" або "антигенна детермінанта" відноситься до місця на антигені, у якому імуноглобулін або антитіло специфічно зв'язується (наприклад, з TNF). Епітоп звичайно включає щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Див., наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). Терміни "специфічне зв'язування", "селективне зв'язування", "селективно зв'язується" та "специфічно зв'язується" відносяться до зв'язування антитіла з епітопом заданого антигену. -7 Звичайно антитіло зв'язується з афінністю (KD), що становить приблизно менше ніж 10 M, -8 -9 -10 наприклад, приблизно менше ніж 10 M,10 M або 10 M або навіть менше, як визначено, використовуючи технологію з використанням поверхневого плазмонного резонансу (SPR) в інструментальному засобі BIACORE. Термін "KD" відноситься до константи рівноваги при дисоціації конкретної взаємодії антитіла з антигеном. У деяких варіантах здійснення деякі антитіла згідно з даним винаходом зв'язуються з TNF з константою рівноваги при дисоціації (KD), що становить менше ніж -7 -8 -9 -10 приблизно 10 M, наприклад, менше ніж приблизно 10 M, 10 M або 10 M або навіть менше, наприклад, як визначено, використовуючи технологію з використанням поверхневого плазмонного резонансу (SPR) у інструментальному засобі BIACORE. Як використовується у даному описі, "ідентичність" відноситься до співпадіння послідовностей двох поліпептидів, молекул або двох нуклеїнових кислот. Якщо положення у обох з двох порівнюваних послідовностей займає одна і та ж мономерна субодиниця у вигляді основи або амінокислоти (наприклад, якщо положення у кожній з двох молекул ДНК займає аденін, або положення у кожному з двох поліпептидів займає лізин), тоді відповідні молекули є ідентичними у цьому положенні. "Процент ідентичності" двох послідовностей залежить від числа положень, що співпадають, розділюваних двома послідовностями, розділеного на число порівнюваних положень, x 100. Наприклад, якщо співпадають 6 з 10 положень у двох 5 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностях, тоді дві послідовності є ідентичними на 60 %. Як приклад, послідовності ДНК CTGACT та CAGGTT ідентичні на 50 % (співпадають 3 з всього 6 положень). Як правило, порівняння здійснюють після вирівнювання двох послідовностей для досягнення максимальної ідентичності. Таке вирівнювання можна забезпечити, використовуючи, наприклад, спосіб Needleman та др. ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453), просто реалізований комп'ютерними програмами, такими як програма Align (DNAstar, Inc.). Процент ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна також визначити, використовуючи алгоритм E. Meyers та W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), який включений у програму ALIGN (версії 2.0), використовуючи таблицю маси залишків PAM120, штраф за довжину пропуску = 12 та штраф за пропуск = 4. Крім того, процент ідентичності двох амінокислотних послідовностей можна визначити, використовуючи алгоритм Needleman та Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), який включений у програму GAP у пакеті програм GCG (доступному на сайті http://www.gcg.com), використовуючи або матрицю Blossum 62, або матрицю PAM250, та масовий коефіцієнт для пропуску, рівний 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4, та масовий коефіцієнт для довжини, рівний 1, 2, 3, 4, 5 або 6. "Схожими" послідовностями є послідовності, які, при вирівнюванні, мають ідентичні та схожі амінокислотні залишки, причому схожими залишками є консервативні заміни для відповідних амінокислотних залишків у вирівняній контрольній послідовності. У зв'язку з цим, "консервативною заміною" залишку у контрольній послідовності є заміна на залишок, який фізично або функціонально схожий з відповідним залишком у контрольній послідовності, наприклад, який має схожий розмір, форму, електричний заряд, хімічні властивості, включаючи здатність до утворення ковалентних або водневих зв'язків, та т.п. Таким чином, "модифікованою у результаті консервативної(их) заміни (замін)» послідовністю є послідовність, яка відрізняється від контрольної послідовності або послідовності дикого типу тим, що присутня одна або більше консервативних замін. "Процент ідентичності" двох послідовностей залежить від числа положень, у яких знаходяться співпадаючі залишки або консервативні заміни, що розділяються двома послідовностями, розділеного на число порівнюваних положень, x 100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень у двох послідовностях співпадають, а у 2 з 10 положень знаходяться консервативні заміни, тоді дві послідовності схожі на 80 %. Використовуваний у даному описі термін "консервативні модифікації послідовності", як мається на увазі, відноситься до модифікацій амінокислот, які не роблять негативного впливу на характеристики зв'язування антитіла, що містить цю амінокислотну послідовність, або не змінюють їх. Такі консервативні модифікації послідовності включають заміни, додавання та делеції нуклеотидів та амінокислот. Наприклад, модифікації можна ввести за допомогою стандартних способів, відомих у даній галузі, таких як сайт-спрямований мутагенез та мутагенез з використанням ПЛР. Консервативні амінокислотні заміни включають заміни, у випадку яких амінокислотний залишок замінюють на амінокислотний залишок, що має подібний бічний ланцюг. У даній галузі були встановлені сімейства амінокислотних залишків, що мають схожі бічні ланцюги. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глютамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глютамін, серін, треонін, тирозин, цистеїн, триптофан), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін), бетарозгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, завбачений замінний амінокислотний залишок у конкретному антитілі, переважно, замінюють на інший амінокислотний залишок з того ж сімейства бічних ланцюгів. Способи визначення нуклеотидних та амінокислотних консервативних замін, які не анулюють зв'язування з антигеном, добре відомі у даній галузі (див., наприклад, Brummell et al, Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); та Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)). Як використовується у даному описі, "амінокислотна консенсусна послідовність" відноситься до амінокислотної послідовності, яку можна одержати, використовуючи матрицю з щонайменше двох, а, переважно, більше, вирівняних амінокислотних послідовностей, та передбачаючи пропуски при вирівнюванні, таким чином, що у кожному положенні можна визначити амінокислотний залишок, що найбільш часто зустрічається. Консенсусна послідовність представляє собою таку послідовність, яка містить амінокислоти, які представлені з найбільшою частотою у кожному положенні. У тому випадку, коли дві або більше амінокислоти представлені у рівному ступені у одному положенні, консенсусна послідовність включає обидві або всі з цих амінокислот. 6 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Амінокислотну послідовність білку можна досліджувати на різних рівнях. Наприклад, збережуваність або варіабельність може проявлятися на рівні одного залишку, рівні множини залишків, множини залишків з пропусками тощо. Залишки можуть проявляти збережуваність ідентичного залишку або можуть бути збережуваними на рівні класу. Приклади класів амінокислот включають полярні, але незаряджені R-групи (серін, треонін, аспарагін та глютамін); позитивно заряджені R-групи (лізин, аргінін та гістидин); негативно заряджені R-групи (глютамінова кислота та аспарагінова кислота); гідрофобні R-групи (аланін, ізолейцин, лейцин, метіонін, фенілаланін, триптофан, валін та тирозин) та особливі амінокислоти (цистеїн, гліцин та пролін). Спеціалісту у даній галузі відомі інші класи, та їх можна визначити, використовуючи детермінанти структури або інші дані для визначення замінюваності. У деякому сенсі замінювана амінокислота може відноситися до будь-якої амінокислоти, яку можна замінити та яка зберігає функціональний консерватизм у цьому положенні. Однак буде зрозуміло, що біофізичні властивості амінокислот того самого класу можуть відрізнятися ступенем. Наприклад, буде зрозуміло, що деякі гідрофобні R-групи (наприклад, аланін, серін або треонін) є більш гідрофільними (тобто мають більшу гідрофільність або меншу гідрофобність), ніж інші гідрофобні R-групи (наприклад, валін або лейцин). Відносну гідрофільність або гідрофобність можна визначити, використовуючи визнані в даній галузі способи (див., наприклад, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) і Cornette et al., J. Mol. Biol, 195: 659-685 (1987)). Як використовується в даному описі, у випадку вирівнювання однієї амінокислотної послідовності (наприклад, першої послідовності VH або VL) з однією або більше додатковими амінокислотними послідовностями (наприклад, однією або більше послідовностями VH або VL у базі даних) положення амінокислоти у одній послідовності (наприклад, першій послідовності VH або VL) можна зрівняти з "відповідним положенням" у одній або більше додаткових амінокислотних послідовностей. Як використовується у даному описі, "відповідне положення" являє собою еквівалентне положення у порівнюваній(их) послідовності(ях) після оптимального вирівнювання послідовностей, тобто після вирівнювання послідовностей для досягнення найбільшого відсотку ідентичності або відсотку схожості. Термін "молекула нуклеїнової кислоти" відноситься до молекул ДНК або молекул РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але, переважно, є дволанцюговою ДНК. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли встановлений її функціональний зв'язок з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, промотор або енхансер є функціонально зв'язаним з послідовністю, що кодує, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності. У деяких варіантах здійснення даний винахід відноситься до виділених молекул нуклеїнових кислот, які кодують антитіло відповідно до даного винаходу, варіабельний домен легкого ланцюгу згідно з даним винаходом та/або варіабельний домен важкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом кодує поліпептид, що містить варіабельну область легкого ланцюгу, яка щонайменше на 97 % ідентична SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:14; поліпептид, що містить варіабельну область важкого ланцюгу, яка щонайменше на 95 % ідентична SEQ ID NO:5; або антитіло, яке щонайменше на 96 % ідентичне SEQ ID NO:10 або SEQ ID NO:17. Термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної до переносу іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона з'єднана. Одним типом вектору є "плазміда", яка відноситься до петлі кільцевої, дволанцюгової ДНК, у яку можна лігувати додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектору є вірусний вектор, у випадку якого додаткові сегменти ДНК можна лігувати у геном вірусу. Деякі вектори здатні до автономної реплікації у клітині-хазяїні, у яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний початок реплікації, та епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть інтегруватися у геном клітини-хазяїна після введення у клітину-хазяїна та у силу цього реплікуються разом з геном хазяїна. Термін "клітина-хазяїн" відноситься до клітини, у яку був введений вектор експресії. Клітинихазяї можуть включати бактеріальні, мікробні клітини, клітини рослин або тварин. Бактерії, які піддаються трансформації, включають члени Enterobacteriaceae, такі як штами Escherichia coli або Salmonella; Bacillaceae, такі як Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus та Haemophilus influenzae. Підходящі мікроби включають Saccharomyces cerevisiae та Pichia pastoris. Підходящі лінії клітин тварин-хазяїв включають клітини CHO (лінії клітин яєчника китайського хом'ячку) та клітини NS0. Терміни "лікувати" та "лікування" відносяться до терапевтичних або профілактичних заходів, описуваних у даному описі. У способах "лікування" використовується введення антитіла 7 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до даного винаходу індивідові, при необхідності такого лікування, наприклад, індивідові з TNFα-опосередковуваним порушенням, або індивідові, у якого у підсумку може виникнути таке порушення, для профілактики, лікування, відтермінування настання, зменшення важкості або зменшення інтенсивності одного або декількох симптомів порушення, або повторного порушення, або для збільшення тривалості життя індивіда понад очікувану тривалість за відсутності такого лікування. Термін "TNF-опосередковане порушення" у цілому відноситься до хворобливих станів та/або симптомів, пов'язаних з TNF, включаючи будь-яке порушення, для виникнення, прогресування або персистування симптомів якого потрібна участь TNF. Приклади TNF-опосередкованих порушень включають, але ними не обмежуються, вікову дегенерацію жовтої плями, неоваскулярну глаукому, діабетичну ретинопатію, ретинопатію недоношених, ретролентальну фіброплазію, карциноми молочної залози, карциноми легені, карциноми шлунку, карциноми стравоходу, колоректальні карциноми, карциноми печінки, карциноми яєчника, коматозні стани, арренобластоми, карциноми шийки матки, карциному ендометрію, гіперплазію ендометрію, ендометріоз, фібросаркоми, хоріокарциноми, рак голови та шиї, карциному носоглотки, карциноми гортані, гепатобластому, саркому Капоши, меланому, карциноми шкіри, гемангіому, печеристу гемангіому, гемангіобластому, карциноми підшлункової залози, ретинобластому, астроцитому, гліобластому, шванному, олігодендрогліому, медулобластому, нейробластому, рабдоміосаркому, остеогенну саркому, лейоміосаркоми, карциноми сечових шляхів, карциноми щитовидної залози, пухлина Вільмса, нирково-клітинну карциному, карциному передміхурової залози, анормальну проліферації клітин судинної стінки, пов'язану з факоматозами, набряк (такий як той, який пов'язаний з пухлинами головного мозку), синдром Мейгса, ревматоїдний артрит, псоріаз та атеросклероз. TNF-опосередковані порушення також включають сухість очей та пов'язані з TNFα запальні процеси, такі як запалення ока, алергійний кон'юнктивіт, дерматит, риніт та астму, наприклад, та включають ті клітинні зміни, які є результатом активності TNFα, яка приводить безпосередньо або опосередковано до пов'язаного з TNFα запального процесу. Крім того, TNF-опосередковані порушення також включають ангіогенез у оці, хворобу Бехчета, ретиніт, глаукому, синдром Шегрена, діабетичну невропатію, склерит, кератит та увеїт. Термін "ефективна доза" відноситься до кількості, достатньої для досягнення або принаймні почасти досягнення бажаного ефекту. Термін "терапевтично ефективна доза" визначають як кількість, достатню для лікування або принаймні часткової зупинки захворювання та його ускладнень у пацієнта, що вже страждає на це захворювання. Кількості, ефективні у випадку цього застосування, будуть залежати від важкості порушення, у відношенні якого проводять лікування, та загального стану власної імунної системи пацієнта. Термін "індивід" відноситься до будь-якої людини або тварини, що не є людиною. Наприклад, способи та композиції відповідно до даного винаходу можуть використовуватися для лікування індивіда з TNF-опосередковуваним порушенням. Системи нумерації, використовувані у даному описі для визначення положень амінокислотних залишків у варіабельних областях важкого та легкого ланцюгів антитіла, відповідають тій, яка встановлена A. Honegger (J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670) (системі нумерації AHo). Таблиці співвідношень між системою нумерації AHo та найчастіше використовуваною системою, встановленою Kabat та ін. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), наведені у A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670. Використовуваний у даному описі термін "агрегація" відноситься до процесу міжмолекулярних взаємодій/об'єднань між мономерними молекулами у рідкому розчині, що приводить до утворення олігомерного стану. Агрегацію можна оцінити у погіршених умовах, використовуючи прискорені дослідження стабільності у концентрованому розчині. Прискорені дослідження стабільності призначені для збільшення ступеня деградації, агрегації або хімічних модифікацій сполуки в результаті використання екстремальних умов зберігання. Прискорені дослідження стабільності, також відомі дослідження у екстремальних умовах, звичайно проводять при 40ºC та кімнатній температурі. Ці дослідження стабільності надають цінну інформацію, що стосується ефекту піддавання впливу умов навколишнього середовища, що знаходяться за межами нормальних умов зберігання, зазначених на етикетці, що також називаються погіршеними умовами. Розчини з високими концентраціями білку широко використовуються у фармацевтичній промисловості. Поведінка білків у високих концентраціях у розчині може досить відрізнятися від такої, прогнозованої на основі аналізу розведеного розчину, внаслідок термодинамічної неідеальності у цих розчинах. Неідеальність, відмічувана у цих системах, пов'язана з білок-білковими взаємодіями (PPI). Різні типи сил відіграють ключову роль у визначенні загальної природи та ступені цих PPI, і на їхні відносні внески впливають 8 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 властивості розчиненої речовини та розчиннику. Роль PPI обумовлена цими міжмолекулярними силами з визначенням характеристик розчину, включаючи фізичну стабільність та самоасоціацію та агрегацію білків. Концентрованими розчинами є такі розчини, у яких PPI впливає на білки у розчині у результаті збільшення ступеню олігомеризації. Концентрований розчин може мати, наприклад, концентрацію білку, що становить принаймні 10 мг/мл. Розчинні продукти цього процесу можна виявити за допомогою аналітичних способів, таких як ексклюзивна HPLC. Використовуваний у даному описі термін "модифікація, що зменшує агрегацію" відноситься до модифікації, такої як амінокислотна заміна, яка зменшує здатність антитіла до агрегації у рідкому розчині у порівнянні з вихідним антитілом, описуваним у даному описі. "Вихідним" антитілом є антитіло, що містить по суті ту ж послідовність, що й відповідне антитіло, яке містить зменшуючі агрегацію модифікації. Наприклад, вихідне антитіло може мати ті ж CDR, що і модифіковане антитіло, та може мати точно таку ж послідовність, що і модифіковане антитіло, за винятком залишків у положенні 47 та/або 50 відповідно до системи нумерації AHo у послідовності варіабельного домену легкого ланцюгу та може, крім того, відрізнятися по положеннях 12, 103 та 144 відповідно до системи нумерації AHo у послідовності варіабельного домену важкого ланцюгу. Також можуть бути присутніми інші відмінності за умови, що вихідне антитіло не містить зменшуючих агрегацію модифікацій, що присутні у антитілі, модифікованому у відповідності зі способом відповідно до даного винаходу. Використовуваний у даному описі термін "взаємодія" відноситься до взаємодії між двома варіабельними доменами (варіабельними доменами легкого та важкого ланцюгів) антитіла. Область контакту включає амінокислотні залишки, які беруть участь безпосередньо або опосередковано у взаємодії між варіабельними доменами. Така взаємодія включає, але ними не обмежуються, усі види незв'язаних взаємодій, наприклад, сили Ван-дер-Ваальса, водневий зв'язок, електростатичні зв'язки та гідрофобні взаємодії між двома доменами. Крім особливо зазначених випадків, усі технічні та наукові терміни, використовувані у даному описі, мають значення, однакове з тим, у якому вони звичайно розуміються середнім фахівцем у галузі, до якої відноситься даний винахід. Хоча способи та матеріали, схожі з тими, які описуються у даному описі, або еквівалентні їм, можуть використовуватися при здійсненні на практиці або перевірці даного винаходу, нижче описуються підходящі способи та матеріали. У випадку протиріччя опис даного винаходу, включаючи визначення, буде домінувати. Крім того, матеріали, способи та приклади є лише ілюстративними та, як передбачається, не є обмежуючими. Різні аспекти даного винаходу описуються з додатковими деталями у наступних підрозділах. Зрозуміло, що різні варіанти здійснення, переваги та діапазони можна довільно об'єднати. Крім того, залежно від конкретного варіанту здійснення, вибрані визначення, варіанти здійснення або діапазони можуть не бути прийнятними. У одному з аспектів даний винахід відноситься до антитіл, які зв'язуються з TNFα і, таким чином, є підходящими для блокування функціонування TNFα in vivo. У деяких варіантах здійснення антитіла відповідно до даного винаходу оптимізована(і) модифікація(ії), що зменшує(ють) агрегацію, щодо вихідного антитіла, таким чином, що антитіло відповідно до даного винаходу має зменшену здатність до агрегації у порівнянні з вихідним/немодифікованим антитілом. Такі модифікації(я) включають заміни конкретних залишків амінокислот, які беруть участь у взаємодії варіабельного домену легкого ланцюгу (VL) та варіабельного домену важкого ланцюгу (VH). У деяких варіантах здійснення модифікація, що зменшує агрегацію, містить принаймні одну амінокислотну заміну, яка зменшує вільну енергію взаємодії VL-VH у порівнянні з вільною енергією взаємодії VL-VH вихідного антитіла у способі комп'ютерного моделювання, описуваного у даному описі. Такі модифікації включають амінокислотні заміни конкретних залишків, які вносять вклад у вільну енергію взаємодії VL-VH. У деяких варіантах здійснення модифікація, що зменшує агрегацію, згідно з даним винаходом включає заміну у положенні 50 відповідно до системи нумерації AHo у VL. У одному з варіантів здійснення заміною є аргінін (R) у положенні 50 відповідно до системи нумерації AHo. У іншому варіанті здійснення аргінін (R) у положенні 50 відповідно до системи нумерації AHo заміняє лізин (K). В інших варіантах здійснення модифікація, що зменшує агрегацію, згідно з даним винаходом включає заміну у положенні 47 відповідно до системи нумерації AHo у VL. У одному з варіантів здійснення заміною є аргінін (R) у положенні 47 відповідно до системи нумерації AHo. У іншому варіанті здійснення аргінін (R) у положенні 47 відповідно до системи нумерації AHo заміняє лізин (K). Система нумерації AHo докладно описана у Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670. Положення 50 відповідно до системи нумерації AHo у варіабельному домені 9 UA 111340 C2 5 10 легкого ланцюгу відповідає положенню 42 відповідно до системи нумерації Kabat. Положення 47 відповідно до системи нумерації AHo у варіабельному домені легкого ланцюгу відповідає положенню 39 відповідно до системи нумерації Kabat. Система нумерації Kabat описана, крім того, у Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Таблиці співвідношень між системою нумерації AHo та найчастіше використовуваною системою нумерації, встановленою Kabat та ін., наведені у A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670. Наступні таблиці співвідношень наведені для двох різних систем нумерації, використовуваних для визначення положень амінокислотних залишків у варіабельних областях важкого та легкого ланцюгів антитіла. Система нумерації Kabat описана, крім того, у Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Система нумерації AHo описана, крім того, у Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J Mol. Biol.309: 657-670). Нумерація у варіабельній області важкого ланцюгу 15 Таблиця 1 Таблиця співвідношень для положень залишків у варіабельному домені важкого ланцюгу Kabat 1 2 3 4 5 6 7 * 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 * 27 28 29 30 31 32 33 34 35 35a 35b AHo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Kabat 44 45 46 47 48 49 50 51 52 52a 52b 52c * 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 AHo 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 10 Kabat 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 100a 100b 100c 100d 100e 100f 100g 100h 100i * * * * * * * * * * * * * 101 102 103 AHo 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 UA 111340 C2 Продовження таблиці 1 * * * 36 37 38 39 40 41 42 43 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 79 80 81 82 82a 82b 82b 83 84 85 86 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 Стовпчик 1: положення залишку у системі нумерації Kabat. Стовпчик 2: відповідне число у системі нумерації AHo для положення, зазначеного у стовпчику 1. Стовпчик 3: положення залишку у системі нумерації Kabat. Стовпчик 4: відповідне число у системі нумерації AHo для положення, зазначеного у стовпчику 3. Стовпчик 5: положення залишку у системі нумерації Kabat. Стовпчик 6: відповідне число у системі нумерації AHo для положення, зазначеного у стовпчику 5. Нумерація у варіабельній області легкого ланцюгу Таблиця 2 Таблиця співвідношень для положень залишків у варіабельному домені легкого ланцюгу Kabat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 * 27a 27b AHo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kabat 43 44 45 46 47 48 49 50 * * * * * * * * 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 AHo 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 11 Kabat 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 95a 95b 95c 95d 95e 95f * * * * * * * * * * * AHo 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 UA 111340 C2 Продовження таблиці 2 27c 27d 27e 27f * 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 65 66 67 68 * * 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 * * * * * * 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 Стовпчик 1: положення залишку у системі нумерації Kabat. Стовпчик 2: відповідне число у системі нумерації AHo для положення, зазначеного у стовпчику 1. Стовпчик 3: положення залишку у системі нумерації Kabat. Стовпчик 4: відповідне число у системі нумерації AHo для положення, зазначеного у стовпчику 3. Стовпчик 5: положення залишку у системі нумерації Kabat. Стовпчик 6: відповідне число у системі нумерації AHo для положення, зазначеного у стовпчику 5. 5 10 15 20 25 30 Антитіла згідно з даним винаходом можуть містити додаткові модифікації за бажанням. Наприклад, антитіло згідно з даним винаходом може містити амінокислотні заміни для зменшення його імуногенності in vivo у відповідності зі способами, описаними, наприклад, у заявці на патент США № 12/973968, та/або заміни для збільшення розчинності антитіла, як описано у WO 09/155725. Таким чином, у одному з варіантів здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить серін (S) у положенні 12 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo); серін (S) або треонін (T) у положенні 103 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo) та/або серін (S) або треонін (T) у положенні 144 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo). Крім того, антитіло може містити серін (S) або треонін (T) у положеннях 97, 98 та/або 99 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo). Переважно, антитіло містить серін (S) у положенні 12 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo), треонін (T) у положенні 103 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo) та треонін (T) у положенні 144 важкого ланцюгу (відповідно до системи нумерації AHo). У одному з варіантів здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюгу, що містить SEQ ID NO:1: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50 WYQQKPGRAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50 FGQGTKLTVLG У кращому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюгу (CDR підкреслені), що містить SEQ ID NO:2: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGRAPKLLIYQASKLASGVPSRFS GSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG У іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюгу, що містить SEQ ID NO:3 (каркасна область варіабельного домену важкого ланцюгу): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=1-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=1-50 RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=1-50 WGQGTLVTVSS Тим не менше, у іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить каркасну область варіабельного домену важкого ланцюгу: SEQ ID NO:4: каркасна область варіабельного домену важкого ланцюгу 12 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=1-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=1-50 RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=1-50 WGQGTLVTVSS У кращому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен важкого ланцюгу (CDR підкреслені), що містить SEQ ID NO:5: EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYAN WAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS Як використовуються у даному описі, залишки X є місцями вставки CDR. X може представляти собою будь-яку природну амінокислоту; можуть бути присутніми щонайменше три та аж до 50 амінокислот. У одному з варіантів здійснення каркасна область варіабельного домену легкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом містить SEQ ID NO:1, а каркасна область варіабельного домену важкого ланцюгу включає SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4. У іншому варіанті здійснення каркасна область варіабельного домену легкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом містить послідовність, яка щонайменше на 65 %, більш переважно, щонайменше на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:1. Найбільш переважно, коли зазначена послідовність містить аргінін (R) у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo. У іншому варіанті здійснення зазначена послідовність містить аргінін (R) у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo. У іншому варіанті здійснення каркасна область варіабельного домену важкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом містить послідовність, яка щонайменше на 80 %, більш переважно, щонайменше на 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NО:3. Переважно, коли зазначене антитіло містить серін (S) у положенні 12 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo), треонін (T) у положенні 103 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo) та треонін (T) у положенні 144 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo). У іншому варіанті здійснення каркасна область варіабельного домену легкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом містить послідовність, яка щонайменше на 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:14. У іншому варіанті здійснення каркасна область варіабельного домену важкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом містить послідовність, яка щонайменше на 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:5. У іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність, яка щонайменше на 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:10 або SEQ ID NO:17. У іншому варіанті здійснення каркасна область варіабельного домену легкого ланцюгу антитіла згідно з даним винаходом містить SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:14, а каркасна область варіабельного домену важкого ланцюгу містить SEQ ID NO:5. У одному з варіантів здійснення антитілами або фрагментами антитіл згідно з даним винаходом є одноланцюгові антитіла (scFv) або Fab-фрагменти. У випадку scFv антитіл VLдомен може бути пов'язаний з VH-доменом у тій або іншій орієнтації за допомогою гнучкого лінкеру. Підходяща структура лінкеру рівня техніки складається з повторюваних амінокислотних послідовностей GGGGS (SEQ ID NO:6) або їх варіантів. У кращому варіанті здійснення даного винаходу використовується лінкер у вигляді (GGGGS)4 (SEQ ID NO:7) або його похідна, але також можливі варіанти з 1-3 повторів (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 64446448). Інші лінкери, які можуть використовуватися для даного винаходу, описані у Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 і Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50: 51-59. Розташуванням може бути або VL-лінкер-VH, або VHлінкер-VL, при цьому перше розташування є кращим. У випадку Fab-фрагментів відібрані варіабельні домени легкого ланцюгу VL злиті з константною областю легкого ланцюгу капа Ig людини, у той час як підходящі варіабельні домени важкого ланцюгу VH злиті з першим (Nкінцевим) константним доменом CH1 IgG людини. На C-кінці міжланцюговий дисульфідний місток утворюється між двома константними доменами. Таким чином, у одному з варіантів здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:8 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50WYQQKPGRAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=1-50 13 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=1-50RFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR(X)n=150WGQGTLVTVSS У іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:9 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=1-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=1-50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR AEDTAVYYCAR(X)n=150WGQGTLVTVSS У кращому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:10 (34rFW1.4_VL_K50R_DHP): EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGRAPKLLIYQASKLASGVPSRFS GSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYA NWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS У одному з варіантів здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюгу, що містить SEQ ID NO:11 (каркасна область варіабельного домену легкого ланцюгу FW1.4 (KI27)): EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50 FGQGTKLTVLG У іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюгу, що містить SEQ ID NO:12 (каркасна область варіабельного домену легкого ланцюгу FW1.4, що містить заміни)): EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50 WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50 FGQGTKLTVLG Тим не менше, у іншому переважному варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:13 EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50 FGQGTKLTVLG У іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить варіабельний домен легкого ланцюгу (CDR підкреслені), що містить SEQ ID NO:14: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQRPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFS GSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVL Таким чином, у одному з варіантів здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:15: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=1-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=1-50RFTISRDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCAR(X)n=1WGQGTLVTVSS 50 У іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:16: EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=1-50WYQQRPGKAPKLLIY(X)n=1-50 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=1-50FGQGTKLTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=1-50 WVRQAPGKGLEWVG(X)n=1-50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR AEDTAVYYCAR(X)n=150WGQGTLVTVSS У одному з варіантів здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO: 17 (34rFW1.4_VL_K47R_DHP): EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQRPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFS GSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYA NWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS Тим не менше, у іншому варіанті здійснення антитіло згідно з даним винаходом містить послідовність: SEQ ID NO:18 14 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (34rFW1.4) EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLASGVPSRFS GSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVGCIYGDNDITPLYA NWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARLGYADYAYDLWGQGTTVTVSS У одному з варіантів здійснення VL вихідного антитіла представляє собою або містить SEQ ID NO:11 або SEQ ID NO:12, або послідовність, яка щонайменше на 65 %, більш переважно, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:11 або SEQ ID NO:12. У іншому переважному варіанті здійснення VH вихідного антитіла представляє собою або містить SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4, або послідовність, яка щонайменше на 80 %, більш переважно, на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4. Антитіло згідно з даним винаходом, яке містить зменшуючу агрегацію модифікацію, переважно, включає один або більше CDR з антитіла кролика. Як відомо у даній галузі, CDR кролика відрізняються від CDR людини або гризуна: вони можуть містити залишки цистеїну, які стають зв'язаними дисульфідними містками з каркасною областю або утворюють між-CDR S-Sмістки. Більше того, кролячі CDR часто не відносяться до якої-небудь раніше відомої канонічної структури. Відмітною ознакою даного винаходу також є двовалентні та біспецифічні молекули, що містять антитіло проти TNFα, або його фрагмент, даного винаходу. Антитіло згідно з даним винаходом, або його антигензв'язуючі частини, може бути піддане дериватизації або пов'язане з іншої функціональною молекулою, наприклад, іншим пептидом або білком (наприклад, іншим антитілом або лігандом для рецептора) для створення біспецифічної молекули, яка зв'язується із принаймні двома різними сайтами зв'язуваннями або молекулами-мішенями. Антитіло згідно з даним винаходом може бути піддане дериватизації або пов'язане з більш ніж однією іншою функціональною молекулою для створення поліспецифічних молекул, які зв'язуються з більш ніж двома різними сайтами зв'язування та/або молекулами-мішенями; такі поліспецифічні молекули, як передбачається, також охоплюються терміном "біспецифічна молекула", використовуваним у даному описі. Не обмежуючі приклади біспецифічних молекул включають діатіло, одноланцюгове діатіло та тандемне антитіло, як відомо фахівцям у даній області. Для створення біспецифічної молекули згідно з даним винаходом антитіло відповідно до даного винаходу можна функціонально зв'язати (наприклад, за допомогою хімічного зв'язку, генетичного злиття, нековалетного зв'язку або інакше) з однією або більше зв'язуючих молекул, таких як інше антитіло, фрагмент антитіла, пухлиноспецифічні або специфічні для патогену антигени, пептидоміметик або міметик зв'язування, таким чином, що результатом є біспецифічна молекула. Відповідно, даний винахід включає біспецифічні молекули, що містять принаймні одну зв'язуючу молекулу, що має специфічність у відношенні TNFα, та другу зв'язуючу молекулу, що має специфічність у відношенні одного або більше додаткових епітопівмішеней. В одному з варіантів здійснення біспецифічні молекули відповідно до даного винаходу мають специфічність зв'язування принаймніодного антитіла, або фрагменту антитіла, включаючи, наприклад, Fab, Fab', F(ab')2, Fv або одноланцюговий Fv. Антитіло також може бути димером легкого ланцюгу або важкогоу ланцюгу, або будь-яким його мінімальним фрагментом, таким як Fv або одноланцюгова конструкція, описана Ladner та ін. у патенті США № 4946778, зміст якого в словесній формі включений як посилання. Хоча кращими є моноклональні антитіла людини, іншими антитілами, які можуть використовуватися у біспецифічних молекулах відповідно до даного винаходу, є мишачі, химерні та гуманізовані моноклональні антитіла. Біспецифічні молекули відповідно до даного винаходу можна одержати за допомогою з'єднання специфічностей зв'язування, що входять до складу, використовуючи відомі у даній галузі способи. Наприклад, кожну специфічність зв'язування біспецифічної молекули можна одержати окремо, а потім з'єднати одну з одною. Коли специфічностями зв'язування є білки або пептиди, безліч агентів для з'єднання або зшивання можна використовувати для ковалентного з'єднання. Приклади агентів, що зшивають, включають білок A, карбодіімід, N-сукцинімідил-Sацетилтіоацетат (SATA), 5,5'-дитіобіс(2-нітробензойну кислоту) (DTNB), ортофенілендималеімід (oPDM), N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (SPDP) та сульфосукцинімідил-4-(N-малеімідометил)циклогаксан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (див., наприклад, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Інші способи включають ті, які описані у Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83) та Glennie et al (1987) J. Immunol. 139: 15 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2367-2375). Кращими агентами для з'єднання є SATA та сульфо-SMCC, обидва з яких можна придбати у Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Коли специфічностями зв'язування є антитіла, їх можна з'єднати за допомогою зв'язування сульфгідрильних залишків, наприклад, через C-кінцеві шарнірні області двох важких ланцюгів або інші місця, або природні, або введені штучно. У особливо кращому варіанті здійснення шарнірну область піддають модифікації із включенням непарного числа сульфгідрильних залишків, переважно, одного, до з'єднання. Альтернативно, обидві специфічності зв'язування можуть кодуватися у тому самому векторі, та експресуватися та збиратися у одній і тій же клітині-хазяїні. Цей спосіб особливо застосуємо, коли біспецифічною молекулою є злитий білок мАт x мАт, мАт x Fab, Fab x F(ab')2 або ліганд x Fab. Біспецифічна молекула відповідно до даного винаходу може являти собою одноланцюгову молекулу, що містить одне одноланцюгове антитіло та детермінанту зв'язування, або одноланцюгову біспецифічну молекулу, що містить дві детермінанти зв'язування. Біспецифічні молекули можуть містити принаймні дві одноланцюгові молекули. Крім того, біспецифічною молекулою може бути scFv, який специфічно зв'язується з першою мішенню, причому VH та VL зазначеного scFv пов'язані з допомогою гнучкого лінкеру, що містить домен, що забезпечує специфічне зв'язування із другою мішенню. Підходящі лінкери описані, наприклад, у міжнародній заявці на патент WO 2010/006454. Способи одержання біспецифічних молекул описані, наприклад, у патенті США № 5260203; патенті США № 5455030; патенті США № 4881175; патенті США № 5132405; патенті США № 5091513; патенті США № 5476786; патенті США № 5013653; патенті США № 5258498 і патенті США № 5482858. Зв'язування біспецифічних молекул зі специфічними для них мішенями можна підтвердити за допомогою, наприклад, імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA), радіоімуноаналізу (RIA), аналізу з використанням клітинного сортеру з порушенням флуоресценції (FACS), біоаналізу (наприклад, інгібування росту) або за допомогою аналізу з використанням імуноблоту. За допомогою кожного із цих аналізів звичайно виявляється присутність комплексів білок-антитіло, що представляють особливий інтерес, за допомогою використання міченого реагенту (наприклад, антитіла), специфічного для комплексу, що представляє інтерес. Наприклад, комплекс TNF-Антитіло можна виявити, використовуючи, наприклад, пов'язане з ферментом антитіло або фрагмент антитіла, яке розпізнає та специфічно зв'язується з комплексами антитіло-TNF. Альтернативно, комплекси можна виявити, використовуючи будьякий з безлічі інших імуноаналізів. Наприклад, антитіло можна позначити радіоактивним ізотопом та використовувати у радіоімуноаналізі (RIA) (див., наприклад, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, який включений у даний опис як посилання). Радіоактивний ізотоп можна виявити таким способом, як використання γ-лічильнику або сцинтиляційного лічильнику, або за допомогою авторадіографії. В іншомуаспекті даний винахід відноситься до одержання антитіл, розкритих у даному описі. Способи одержання антитіл, що мають зменшену здатність до агрегації у розчині, забезпечувані у даному описі, основані на несподіваному результаті спостережень, що завдяки модуляції взаємодії між доменами легкого ланцюгу та важкого ланцюгу антитіла можна зменшити здатність антитіл до агрегації, і що зменшуючі агрегацію мутації можна з великою ймовірністю передбачити за допомогою визначення вільної енергії взаємодії VL/VH, обумовленої як різниця між енергією антитіла (такого як scFv) та енергіями окремих варіабельних доменів. Як продемонстровано у даному описі, зменшуючі агрегацію заміни, які модулюють взаємодію доменів антитіла в результаті зменшення вільної енергії між варіабельними доменами, можна здійснити без створення впливу на стабільність або активність зв'язування антитіла. У одному з варіантів здійснення спосіб згідно з даним винаходом включає стадії: (i) одержання антитіла, що містить варіабельний домен легкого ланцюгу (VL) та варіабельний домен важкого ланцюгу (VH); (ii) визначення одного або більше положень залишків, що приймають участь у взаємодії між варіабельним доменом легкого ланцюгу (VL) та варіабельним доменом важкого ланцюгу (VH) антитіла; та (iii) модифікування антитіла шляхом введення заміни у певному положенні(ях) залишку з умови, щоб заміна(и) зменшувала вільну енергію між VL- та VH-доменами щонайменше на 0,5 ккал/моль, переважно, щонайменше на 1,0 ккал/моль та, найбільш переважно, щонайменше на 2,0 ккал/моль (тобто вільна енергія між VL- та VH-доменами із заміною менше щонайменше на 0,5 ккал/моль вільної енергії між відповідними VL- та VH-доменами, які не містять 16 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотної заміни), зменшуючи тим самим здатність до агрегації модифікованого антитіла у порівнянні з такою вихідного антитіла. Як відмічено вище, антитілом може бути, наприклад, Fab, Fab', F(ab)' 2, одноланцюговий Fv (scFv), Fv-фрагмент, діатіло, одноланцюгове діатіло, тандемне антитіло або лінійне антитіло; у кращому варіанті здійснення антитілом є одноланцюговий Fv (scFv). У кращому варіанті здійснення визначення одного або більше положень залишків, що приймають участь у взаємодії між варіабельним доменом легкого ланцюгу та варіабельним доменом важкого ланцюгу антитіла, (тобто стадія (ii)) включає визначення вільної енергії взаємодії VL-VH. Це можна виконати шляхом використання загальновідомих біоінформатичних програм. Одним з прикладів підходящої біоінформатичної програми є CHARMM (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics). З метою визначення вільної енергії взаємодії VL-VH, звичайно забезпечується повне атомно-молекулярне представлення. Вільна енергія взаємодії представляє собою різницю між енергією всього антитіла, що містить обидва варіабельні домени VL та VH, та сумою енергій окремих доменів у межах способу з використанням неявно заданого розчиннику. Це включає розрахунки трьох окремих енергій: (1) G(a) антитіла; (2) G(b) VL та (3) G(c) VH. Відповідно, вільна енергія взаємодії дорівнює G взаємодії = G(a)-G(b)-G(c). У одному з варіантів здійснення способом з використанням неявно заданого розчиннику є GBMV або PBSA, відомий у даній галузі. Визначення вільної енергії може, крім того, включати стадію моделювання розподілу зарядів у білку. Моделювання зазначеного розподілу зарядів можна здійснити на основі електростатичних сил або сил Ван-дер-Ваальса. Для визначення підходящої модифікації можна вибрати для заміни один або більше амінокислотних залишків, що приймають участь у взаємодії. Наприклад, створюють молекулярну модель білку, що містить одну або більше замін (наприклад, заміну одного або більше залишків на аланін) у вибраних положеннях, та визначають вільну енергію взаємодії у представленні молекули із заміною(ами). Якщо вільна енергія взаємодії у моделі молекули із заміною(ами) менше вільної енергії взаємодії у вихідній молекулярній моделі, амінокислотний залишок вибирають для заміни. У межах CHARMm мутації можна сконструювати, наприклад, з використанням протоколу Build Mutants. Одна або більше замін у молекулярні моделі може знаходитися у положеннях, які, як відомо або мають на увазі, залучені у взаємодію VL/VH. У одному з варіантів здійснення проводять додаткову стадію мінімізації енергії молекулярної моделі, що містить одну або більше замін у вибраному положенні(ях), у області навколо мутації(ій). Зазначену область можна задати у значенні, рівному 10 ангстрем. У одному з варіантів здійснення визначене для заміни положення залишку займає заряджена амінокислота. Антитіло, отримане за способом згідно з даним винаходом, може містити будь-який підходящий варіабельний домен легкого ланцюгу або важкого ланцюгу, відомий у даній галузі, та, переважно, містить щонайменше один CDR з антитіла кролика. У даному описі описані деякі кращі варіабельні домени легкого та важкого ланцюгів. Наприклад, антитіло згідно з даним винаходом може містити каркасну область VL антитіла, яка щонайменше на 65 %, більш переважно, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:11 або SEQ ID NO:12, що містить, крім того, аргінін (R) у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo та/або у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу; та каркасну область VH антитіла, яка щонайменше на 80 %, більш переважно, на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:3. Модифікацію одного або більше положень залишків здійснюють, переважно, у відповідності із способами, викладеними у PCT/CH2008/000285, яка включена у даний опис як посилання у повному обсязі. Коротко, у випадку конкретного підтипу антитіла певні амінокислоти присутні у конкретних положеннях залишків каркасної області антитіла. Наприклад, a) у випадку варіабельної області важкого ланцюгу сімейства VH3 людини кращими амінокислотами є: (i) глютамін (Q) у положенні 1 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (ii) глютамін (Q) у положенні 6 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iii) треонін (T) або аланін (A) у положенні 7 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; 17 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (iv) аланін (A), валін (V) або фенілаланін (F) у положенні 89 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 78 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); та/або (v) аргінін (R), глютамін (Q), ізолейцин (I), лейцин (L), метіонін (M) або фенілаланін (F) у положенні 103 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 89 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); b) у випадку варіабельної області важкого ланцюгу сімейства VH1а людини кращими амінокислотами є: (i) глютамінова кислота (E) у положенні 1 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (ii) глютамінова кислота (E) у положенні 6 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iii) лейцин (L) у положенні 12 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 11 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (iv) метіонін (M) у положенні 13 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 12 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (v) глютамінова кислота (E) або глютамін (Q) у положенні 14 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 13 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (vi) лейцин (L) у положенні 19 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 18 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (vii) ізолейцин (I) у положенні 21 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 20 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (viii) фенілаланін (F), серін (S), гістидин (H) або аспарагінова кислота (D) у положенні 90 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 79 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (ix) аспарагінова кислота (D) або глютамін (Q) у положенні 92 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 81 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (x) гліцин (G), аспарагін (N) або треонін (T) у положенні 95 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 82b амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); та/або (xi) треонін (T), аланін (A), пролін (P) або фенілаланін (F) у положенні 98 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 84 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); с) у випадку варіабельної області важкого ланцюгу сімейства VH1b людини кращими амінокислотами є: (i) глютамінова кислота (E) у положенні 1 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (ii) треонін (T), пролін (P), валін (V) або аспарагінова кислота (D) у положенні 10 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 9 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (iii) лейцин (L) у положенні 12 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 11 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (iv) валін (V), аргінін (R), глютамін (Q) або метіонін (M) у положенні 13 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 12 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (v) глютамінова кислота (E), аргінін (R) або метіонін (M) у положенні 14 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 13 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (vi) аргінін (R), треонін (T) або аспарагін (N) у положенні 20 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 19 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (vii) ізолейцин (I), фенілаланін (F) або лейцин (L) у положенні 21 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 20 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (viii) лізин (K) у положенні 45 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 38 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); 18 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ix) треонін (T), пролін (P), валін (V) або аргінін (R) у положенні 47 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 40 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (x) лізин (K), гістидин (H) або глютамінова кислота (E) у положенні 50 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 43 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (xi) ізолейцин (I) у положенні 55 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 48 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (xii) лізин (K) у положенні 77 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 66 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (xiii) аланін (A), лейцин (L) або ізолейцин (I) у положенні 78 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 67 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (xiv) глютамінова кислота (E), треонін (T) або аланін (A) у положенні 82 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 71 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (xv) треонін (T), серін (S) або лейцин (L) у положенні 86 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 75 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (xvi) аспарагінова кислота (D), аспарагін (N) або гліцин (G) у положенні 87 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 76 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); та/або (xvii) аспарагін (N) або серін (S) у положенні 107 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 93 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); d) у випадку варіабельної області легкого ланцюгу сімейства Vкапа1 людини кращими амінокислотами є: (i) глютамінова кислота (E) або ізолейцин (I) у положенні 1 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (ii) валін (V) або ізолейцин (I) у положенні 3 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iii) валін (V), лейцин (L) або ізолейцин (I) у положенні 4 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iv) глютамін (Q) у положенні 24 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (v) аргінін (R) або ізолейцин (I) у положенні 47 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 39 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (vi) аргінін (R), глютамінова кислота (E), треонін (T), метіонін (M) або глютамін (Q) у положенні 50 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 42 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (vii) гістидин (H), серін (S) або фенілаланін (F) у положенні 57 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 49 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (viii) фенілаланін (F) у положенні 91 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 73 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); та/або (ix) валін (V), серін (S), гліцин (G) або ізолейцин (I) у положенні 103 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 85 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); e) у випадку варіабельної області легкого ланцюгу сімейства Vкаппа3 людини кращими амінокислотами є: (i) треонін (T) у положенні 2 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (ii) треонін (T) у положенні 3 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iii) ізолейцин (I) у положенні 10 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iv) тирозин (Y) у положенні 12 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (v) серін (S) у положенні 18 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (vi) аланін (A) у положенні 20 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; 19 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (vii) метіонін (M) у положенні 56 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 48 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (viii) валін (V) або треонін (T) у положенні 74 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 58 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (ix) аспарагін (N) у положенні 94 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 76 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (x) тирозин (Y) або серін (S) у положенні 101 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 83 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); та/або (xi) лейцин (L) або аланін (A) у положенні 103 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 85 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); f) у випадку варіабельної області легкого ланцюгу сімейства Vлямбда1 людини кращими амінокислотами є: (i) лейцин (L), серін (S) або глютамінова кислота (E) у положенні 1 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (ii) аланін (A), пролін (P), ізолейцин (I) або тирозин (Y) у положенні 2 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iii) валін (V) або метіонін (M) у положенні 4 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (iv) глютамінова кислота (E) у положенні 7 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (v) аланін (A) у положенні 11 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (vi) треонін (T) або серін (S) у положенні 14 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo або Kabat; (vii) гістидин (H) у положенні 46 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 38 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (viii) треонін (T), серін (S), аспарагін (N), глютамін (Q) або пролін (P) у положенні 53 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 45 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (ix) аргінін (R) або глютамін (Q) у положенні 82 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 66 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); (x) гліцин (G), треонін (T) або аспарагінова кислота (D) у положенні 92 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 74 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat); та/або (xi) валін (V), треонін (T), гістидин (H) або глютамінова кислота (E) у положенні 103 амінокислоти, використовуючи систему нумерації AHo (у положенні 85 амінокислоти, використовуючи систему нумерації Kabat). Відповідно, заміни, введені у способі згідно з даним винаходом, підпорядковуються ідеям, викладеним у PCT/CH2008/000285. Визначення підтипу відомо спеціалісту у даній галузі. У одному з варіантів здійснення спосіб згідно з даним винаходом включає модифікування антитіла у положенні 47 та/або 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу, зокрема, варіабельного домену легкого ланцюгу Vкапа1. Переважно, антитіло піддають модифікації з включенням аргініну (R) у положенні 47 у відповідності з системою нумерації AHo та/або у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. У деяких варіантах здійснення лізин (К) замінюють на аргінін (R) у положенні 47 та/або положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. Оскільки антитіла згідно з даним винаходом можуть містити додаткові модифікації при бажанні, способи згідно з даним винаходом можуть включати додаткову стадію модифікування антитіла, наприклад, з включенням серіну (S) у положенні 12 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo); серіну (S) або треоніну (T) у положенні 103 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo) та/або серіну (S) або треоніну (T) у положенні 144 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo). Крім того, антитіло може бути модифіковане з включенням серіну (S) або треоніну (T) у положеннях 97, 98 та/або 99 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo). Краще, коли спосіб включає стадію модифікування антитіла з включенням серіну (S) у положенні 12 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo), треоніну (T) у положенні 103 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo) та треоніну (T) у положенні 144 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo). Даний винахід, крім того, відноситься до способу створення гуманізованого антитіла з низькою здатністю до агрегації у розчині, що включає відбір каркасної області варіабельного 20 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 домену легкого ланцюгу, яка містить аргінін (R) у положенні 47 та/або положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo. Спосіб може, крім того, включати відбір каркасної області варіабельного домену важкого ланцюгу, яка містить серін (S) у положенні 12 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo); серін (S) або треонін (T) у положенні 103 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo) та/або серін (S) або треонін (T) у положенні 144 важкого ланцюгу (у відповідності з системою нумерації AHo). У одному з варіантів здійснення каркасна область, ідентифікована на основі вибраного критерію відбору, може бути додатково модифікована за допомогою модифікації даного винаходу, що зменшує агрегацію. Наприклад, у випадку ідентифікації каркасної області варіабельного домену легкого ланцюгу, яка містить аргінін (R) у положенні 50, залишок у положенні у відповідності з системою нумерації AHo може бути замінений на відмінну амінокислоту, таку як аргінін (R), або у випадку ідентифікації каркасної області варіабельного домену важкого ланцюгу, яка містить серін (S) у положенні 12 у відповідності з системою нумерації AHo, залишки у положеннях 103 та 144 у відповідності з системою нумерації AHo можуть бути замінені на треонін. Як використовується у даному описі, "гуманізоване" антитіло представляє собою антитіло, яке містить CDR, що не є людськими, та людські або такі, що походять від людини, послідовності каркасних областей варіабельного домену важкого ланцюгу та/або варіабельного домену легкого ланцюгу. Гуманізація антитіл добре відома у даній галузі. У одному з варіантів здійснення гуманізоване антитіло містить щонайменше один, а, переважно, шість CDR з антитіла, що продукується у кролика або відібраного з бібліотеки CDR. Каркасні області варіабельного домену антитіла можна відібрати, наприклад, з бази даних (такої як база даних Kabat, Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), VBASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/), VBASE2 (http://www.vbase2.org/), бази даних Kabat, що стосуються послідовностей білків, що представляють імунологічний інтерес (http://www.kabatdatabase.com/index.html), всесвітніх білкових ресурсів (UniProt; http://pir.georgetown.edu/) та бази даних Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abs/), на основі ідентичності та/або схожості з послідовностями каркасних областей варіабельного домену антитіла, від якого пішли CDR, або на основі кращих у іншому відношенні послідовностей(і) каркасних областей. Існують різні комп'ютерні програми для пошуку підходящих послідовностей каркасних областей людини, які задовольняють обраній вимозі(ам). Наприклад, "KabatMan" є версією, що допускає можливість пошуку за допомогою комп'ютера в даних про послідовності антитіл Kabat із книги Sequences of Immunological Interest. Програма Kabatman описана у статті: Martin (1996) Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25, 130-133, і є на сайті http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html та http://www.bioinf.org.uk/abs/kabatman.html. У базі даних Abysis, на сайті http://www.bioinf.org.uk/abysis/, об'єднані дані про послідовності від Kabat, з IMGT та PDB зі структурними даними з PDB. Вона забезпечує повний інтерфейс "вказав та клацнув", який дозволяє перебирати дані про послідовності згідно з різними критеріями та виводить на екран результати у різних форматах. У випадку даних з PDB перебір послідовностей може сполучатися зі структурними обмеженнями. У іншому аспекті даний винахід відноситься до антитіла, отриманого з використанням способу, описуваного у даному описі. У кращому варіанті здійснення зазначене антитіло містить каркасну область VL антитіла, яка принаймні на 80 %, більш переважно, на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:12 або SEQ ID NO:13; переважно, антитіло містить аргінін (R) у положенні 47 та/або у положенні 50 у відповідності з системою нумерації AHo варіабельного домену легкого ланцюгу. Додатково або альтернативно, каркасна область VH антитіла являє собою або містить SEQ ID NO:3, або послідовність, яка щонайменше на 80 %, більш переважно, на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, більш переважно, на 99 % ідентична SEQ ID NO:3. У деяких варіантах здійснення даний винахід, крім того, відноситься до: (1) Способу зменшення здатності до агрегації антитіла, що представляє собою гетеродимерний комплекс, яке містить варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів, який включає стадії: (a) одержання повного атомно-молекулярного представлення антитіла; (b) визначення вільної енергії взаємодії між обома доменами; (c) вибору одного або більше амінокислотних залишків, що беруть участь у взаємодії, для заміни за допомогою надання молекулярної моделі антитіла, що містить одну або більше замін у обраних положеннях, та визначення вільної енергії взаємодії у представленні молекули із заміною(ами); 21 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (d) вибору амінокислотного залишку для заміни, якщо вільна енергія взаємодії в моделі молекули із заміною(ами) менше вільної енергії взаємодії у вихідній молекулярній моделі; (2) Способу за (1), у якому вільну енергію взаємодії визначають за допомогою розрахунків різниці між енергією комплексу та сумою енергій окремих доменів у рамках способу з використанням неявно заданого розчиннику; (3) Способу за (2), у якому розчинником є GBMV або PBSA; (4) Способу за будь-яким з попередніх (1)-(3), що додатково включає стадію (i) моделювання розподілу зарядів у білку, причому цю стадію виконують у рамках стадії a та b; (5) Способу за (4), у якому моделювання розподілу зарядів здійснюють на основі електростатичних сил або сил Ван-дер-Ваальса; (6) Способу за будь-яким з попередніх (1)-(5), у якому стадія (c) включає додаткову стадію мінімізації енергії у області навколо мутації; (7) Способу за будь-яким з попередніх (1)-(7), у якому антитілом є одноланцюговий FvФрагмент (scFv). Антитіла відповідно до даного винаходу можна одержати, використовуючи звичайні способи в області рекомбінантної генетики. Знаючи послідовності поліпептидів, можна одержати кДНК, що кодують їх, за допомогою синтезу генів з використанням відомих у даній області способів. Ці кДНК можна клонувати у підходящі векторні плазміди. Стандартні способи клонування та мутагенезу, добре відомі фахівцеві у даній галузі, можуть використовуватися для приєднання лінкерів, перетасування доменів або створення злиттів для одержання Fab-фрагментів. Основні методики, що описують загальні способи цього винаходу, rd описані у Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, 3 ed. 2001) і в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999). Послідовність ДНК, що містить ген, що кодує поліпептид scFv, або у випадку Fabфрагментів, що містить або два окремі гени, або біцистронний оперон, що містить два гени для злиттів VL-Cκ та VH-CH1, клонують у підходящий вектор експресії, переважно, вектор з індукованим промотором. Необхідно подбати, щоб перед кожним геном був присутній відповідний сайт зв'язування рибосом, який забезпечує трансляцію. Слід розуміти, що антитіла відповідно до даного винаходу містять описані послідовності, а не складаються з них. Наприклад, стратегії клонування можуть пропонувати створення конструкції, з якої експресується антитіло, у якому є присутнім один або невелике число додаткових залишків на N-кінці. Зокрема, метіонін, що походить від старт-кодону, може бути присутнім у кінцевому білку у випадках, коли він не відщеплюється післятрансляційно. Більшість конструкцій для антитіл у вигляді scFv обумовлює додатковий аланін на N-кінці. У кращому варіанті здійснення даного винаходу вибирають вектор експресії для періплазматичної експресії у E. coli (Krebber, 1997). Зазначений вектор містить промотор перед сигнальною послідовністю, що розщеплюється. Послідовність, що кодує пептид антитіла, потім зливають у рамці зчитування із сигнальною послідовністю, що розщеплюється. Це уможливлює спрямовану доставку експресованого поліпептиду у періплазму бактерії, де сигнальна послідовність відщеплюється. Потім антитіло згортається. У випадку Fab-фрагментів обидва пептиду злиття VL-Cκ та VH-CH1 повинні бути пов'язані із сигналом експортування. Після досягнення пептидами періплазми утворюється ковалентний S-S зв'язок між C-кінцевими цистеїнами. Якщо кращою є експресія антитіл у цитоплазмі, зазначені антитіла можна звичайно одержати з високими виходами з тілець включення, які можна легко відокремити від інших клітинних фрагментів та білку. У цьому випадку тільця включення розчиняють у денатурируючому агенті, такому як, наприклад, гуанідину гідрохлорид (GndHC1), і потім піддають рефолдингу за допомогою процедур ренатурації, добре відомих спеціалістам у даній галузі. Плазміди, що експресують поліпептиди scFv або Fab, вводять у підходящий хазяїн, переважно, бактеріальну, дріжджову клітину або клітину ссавця, найбільше переважно, у підходящий штам E. coli, наприклад, JM83 для періплазматичної експресії або BL21 для експресії у вигляді тілець включення. Поліпептид можна одержати або з періплазми, або з тілець включення та піддати очищенню, використовуючи стандартні способи, такі як іонообмінна хроматографія, хроматографія з оберненою фазою, афінна хроматографія та/або гель-фільтрація, які добре відомі фахівцеві у даній галузі. Антитіла відповідно до даного винаходу можна охарактеризувати відносно виходу, розчинності та стабільності in vitro. Наприклад, здатності до зв'язування з TNF, переважно, TNFα людини, можна досліджувати in vitro за допомогою ELISA або поверхневого плазмонного резонансу (Biacore), використовуючи рекомбінантний TNF людини, як описано у WО9729131, 22 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при цьому останній з названих способів також дозволяє визначити константу швидкості k off, яка, -3 -1 переважно, повинна становити менше 10 сек . Кращими є значення Kd  10 нМ. У одномуз варіантів здійснення даний винахід відноситься до антитіл, які зв'язуються з TNFα та, відповідно, є підходящими для блокування функціонування TNFα in vivo. У конкретному варіанті здійснення антитіло проти TNFα містить послідовність SEQ ID NO:10 або SEQ ID NO:17. При терапевтичному застосуванні антитіла проти TNF відповідно до даного винаходу вводять ссавцеві, переважно, людині, у фармацевтично прийнятній лікарській формі, такій як ті, які обговорювалися вище, включаючи ті, які можна вводити людині внутрішньовенно у вигляді болюсної ін'єкції або за допомогою безперервної інфузії протягом періоду часу, з використанням внутрішньом'язового, внутрішньочеревинного, інтрацереброспінального, підшкірного, внутрішньосуглобного, інтрасиновіального, підоболонкового, перорального, місцевого, внутрішньоочного, інтраназального, вушного, сублінгвального, крізьшкірного шляху або шляхом інгаляції, наприклад. Антитіла також відповідно вводять всередину пухлин, біля пухлин, всередину уражень або близько уражень для прояву місцевих, а також системних терапевтичних ефектів. Для профілактики або лікування захворювання відповідна доза антитіла буде залежати від типу захворювання, у відношенні якого проводять лікування, визначене вище, важкості та перебігу захворювання, того, чи вводиться антитіло із превентивною або терапевтичною метою, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта та відповідної реакції на антитіло, та думки лікаря. Антитіла слід вводити пацієнтові один раз або протягом ряду лікувань. Антитіла проти TNF відповідно до даного винаходу можна використовувати для лікування TNF-опосередковуваних захворювань. Залежно від типу та важкості захворювання від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 50 мг/кг (наприклад, 0,1-20 мг/кг) антитіла становить первинна можлива доза для введення пацієнтові, наприклад, або з використанням одного або більше окремих введень, або з використанням безперервної інфузії. Типова добова або щотижнева доза, ймовірно, знаходиться у діапазоні від приблизно 1 мкг/кг до приблизно 20 мг/кг або більш залежна від факторів, відзначених вище. У випадку повторних введень протягом декількох днів або довше, залежно від стану, лікування повторюють до виникнення бажаного пригнічення симптомів захворювання. Однак можуть використовуватися інші схеми введення доз. За успіхами цієї терапії легко простежити за допомогою звичайних способів та аналізів, включаючи, наприклад, рентгенографію пухлин. Відповідно до іншого варіанту здійснення даного винаходу ефективність антитіла для профілактики або лікування захворювання можна підвищити шляхом введення антитіла періодично або у комбінації з іншим засобом, який є ефективним для цих цілей, таким як фактор росту судинного ендотелію (VEGF), антитіло, здатне до інгібування або нейтралізації ангіогенної активності кислотного та основного фактору росту фібробластів (FGF), або фактору росту гепатоцитів (HGF), антитіло, здатне до інгібування або нейтралізації коагулюючої активності тканинного фактору, білку C або білку S (див. Esmon et al., PCT-заявка на патент № WO 91/01753, опублікована 21 лютого 1991 року), антитіло, здатне до зв'язування з рецептором HER2 (див. Hudziak et al., PCT-заявка на патент № WO 89/06692, опублікована 27 липня 1989 року), або з одним або більше традиційних терапевтичних засобів, таких як, наприклад, алкілуючі агенти, антагоністи фолієвої кислоти, антиметаболіти метаболізму нуклеїнових кислот, антибіотики, аналоги піримідинів, 5-фторурацил, цисплатин, пуринові нуклеозиди, аміни, амінокислоти, триазолнуклеозид або кортикостероїди. Такі інші агенти можуть бути у композиції, що вводиться, або можуть вводитися окремо. Також антитіло слід вводити періодично або у комбінації з радіологічними лікуваннями, що включають або опромінення, або введення радіоактивних речовин. Антитіла відповідно до даного винаходу можуть використовуватися які засоби для афінного очищення. У цьому процесі антитіла піддають іммобілізації на твердій фазі, такій як смола Sephadex або фільтрувальний папір, використовуючи добре відомі у даній галузі способи. Піддане іммобілізації антитіло приводять у контакт зі зразком, що містить білок-мішень (або його фрагмент), з яким зв'язується антитіло, такий як TNF у випадку антитіл проти TNFα, що піддається очищенню, та згодом підкладку промивають підходящим розчинником, який буде видаляти по суті весь матеріал у зразку за винятком білка-мішені, який зв'язаний з іммобілізованим антитілом. Нарешті, підкладку промивають іншим підходящим розчинником, таким як гліциновий буфер, pH 5,0, який буде звільняти білок-мішень від антитіла. Антитіла також можуть використовуватися у діагностичних дослідженнях відносно білкамішені, наприклад, для виявлення його експресії у конкретних клітинах, тканинах або сироватці. Такі способи діагностики можуть використовуватися для діагностики раку. 23 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При застосуванні для діагностики антитіло звичайно мітять візуалізуємою молекулою. У наявності є численні мітки, які можна, як правило, розділити на наступні класи: 111 99 14 131 125 3 32 35 (a) Радіоізотопи, такі як In, Tc, C, I, I, H, P або S. Антитіло можна позначити радіоізотопом, використовуючи способи, описані у Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991), наприклад, та радіоактивність можна виміряти, використовуючи сцинтиляційні вимірювання. (b) Флуоресцентні мітки, такі як хелати рідкоземельних елементів (хелати європію) або флуоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, дансил, Ліссамін, фікоеритрин та Техаський червоний, є у наявності. Флуоресцентні мітки можна кон'югувати із антитілом, використовуючи способи, описані у Current Protocols in Immunology, вище, наприклад. Флуоресценцію можна виміряти, використовуючи флуориметр. (c) Різні мітки у вигляді комбінацій фермент-субстрат є у наявності, та огляд деяких з них представлений у патенті США № 4275149. Фермент звичайно каталізує хімічну зміну хромогенного субстрату, яку можна виміряти з використанням різних способів. Наприклад, фермент може каталізувати зміну кольору субстрату, яку можна виміряти спектрофотометрично. Альтернативно, фермент може змінювати флуоресценцію або хемілюмінесценцію субстрату. Способи визначення зміни флуоресценції описані вище. Хемілюмінесцентний субстрат стає електронно-збудженим у результаті хімічної реакції та може потім випромінювати світло, яке можна виміряти (використовуючи, наприклад, хемілюмінометр), та передавати енергію флуоресцентному акцептору. Приклади ферментних міток включають люциферази (наприклад, люциферазу світляків та бактеріальну люциферазу; патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазиндіони, малатдегідрогеназу, уреазу, пероксидазу, таку як пероксидаза хріну (HRPO), лужну фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамілазу, лізоцим, сахаридоксидази (наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу), оксидази гетероциклічних сполук (такі як уриказа та ксантиноксидаза), лактопероксидазу, мікропероксидазу тощо. Способи кон'югування ферментів з антитілами описані у O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73: 147-166 (1981). Приклади комбінацій фермент-субстрат включають, наприклад: (i) пероксидазу хріну (HRPO) з перекисом водню як субстратом, причому гідрогенпероксидаза окислює сухий попередник (наприклад, ортофенілендіамін (OPD) або 3,3',5,5'-тетраметилбензидину гідрохлорид (TMB)); (ii) лужну фосфатазу (AP) з пара-нітрофенілфосфатом як хромогенним субстратом та (iii) β-D-галактозидазу (β-D-Gal) із хромогенним субстратом (наприклад, пара-нітрофеніл-βD-галактозидазу) або 4-метилумбеліферил-β-D-галактозидазу із хромогенним субстратом. Інші численні комбінації фермент-субстрат добре відомі фахівцям у даній галузі. Їхній загальний огляд наведений у патентах США № 4275149 та 4318980. Іноді мітку опосередковано кон'югують з антитілом. Фахівець у даній галузі обізнаний про різні способи для досягнення цього. Наприклад, антитіло можна кон'югувати із біотином, а кожну із трьох широких класів міток, згаданих вище, можна кон'югувати із авідином, або навпаки. Біотин селективно зв'язується з авідином, і тому мітку можна кон'югувати із антитілом таким непрямим способом. Альтернативно, для досягнення непрямого кон'югування мітки з антитілом антитіло кон'югують з невеликим гаптеном (наприклад, дигоксином), а одну з різних типів міток, згаданих вище, кон'югують з антитілом проти гаптену (наприклад, антитілом проти дигоксину). Таким чином, може бути досягнуте непряме кон'югування мітки з антитілом. У деяких варіантах здійснення не потрібно мітити антитіло, а його присутність можна виявити, використовуючи мічене антитіло, яке зв'язується з антитілом-мішенню. Антитіла відповідно до даного винаходу можна використовувати у будь-якому відомому способі дослідження, такому як аналізи конкурентного зв'язування, прямі та непрямі сендвічаналізи та реакції імунопреципітації. Див. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Аналізи конкурентного зв'язування ґрунтуються на здатності міченого стандарту конкурувати з аналітом у досліджуваному зразку за зв'язування з обмеженою кількістю антитіла. Наприклад, кількість білку TNF у досліджуваному зразку обернено пропорційна кількості стандарту, яка зв'язується з антитілами. Для полегшення визначення кількості стандарту, яка зв'язується, антитіла звичайно переводять у нерозчинну форму до або після конкуренції, таким чином, що стандарт та аналіт, які пов'язані з антитілами, можна легко відокремити від стандарту та аналіту, які залишаються незв'язаними. Сендвіч-аналізи включають використання двох антитіл, кожне з яких здатне до зв'язування з різними імуногенними частинами, або епітопами білку, що виявляється. У випадку сендвіч 24 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аналізу аналіт у досліджуваному зразку зв'язується з першим антитілом, яке іммобілізоване на твердій підкладці, та згодом друге антитіло зв'язується з аналітом, утворюючи, таким чином, нерозчинний трикомпонентний комплекс. Див., наприклад, патент США № 4376110. Саме друге антитіло може бути позначене складовою, що виявляється (прямі сендвіч-аналізи), або його можна виміряти, використовуючи антитіло проти імуноглобуліну, яке позначене складовою, що виявляється (непрямі сендвіч-аналізи). Наприклад, одним типом сендвіч-аналізу є аналіз ELISA, у випадку якого складовою, що виявляється, є фермент. У випадку імуногістохімічного дослідження зразок тканини, такий як зразок пухлини, може бути свіжим або замороженим, або може бути поміщений у парафін та зафіксований з використанням фіксатору, такого як, наприклад, формалін. Антитіла також можуть використовуватися для in vivo діагностичних аналізів пухлин. Як 111 99 14 131 125 3 32 35 правило, антитіло мітять радіонуклідом (таким як In, Tc, C, I, I, H, P або S), таким чином, що місцезнаходження пухлини можна визначити, використовуючи імуносцинтиграфію. Антитіло відповідно до даного винаходу може бути у наборі, упакованому комбінацією реагентів у заданих кількостях разом з інструкцією з виконання діагностичного дослідження. У випадку, коли антитіло позначене ферментом, набір буде містити субстрати та кофактори, необхідні ферменту (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує виявлюваний хромофор або флуорофор). Крім того, можуть бути включені інші компоненти, такі як стабілізатори, буфери (наприклад, буфер для блокування або буфер для лізису) тощо. Відносні кількості різних реагентів можуть змінюватися у широкому діапазоні для досягнення певних концентрацій реагентів у розчині, які суттєво оптимізують чутливість аналізу. Зокрема, реагенти можуть бути у вигляді сухих порошків, звичайно ліофілізованих, що містять наповнювачі, які при розчиненні будуть створювати розчин реагенту з підходящою концентрацією. Даний винахід також відноситься до фармацевтичних препаратів, що містять одне або більше антитіл відповідно до даного винаходу, для терапевтичних цілей. У одному з варіантів здійснення даний винахід відноситься до антитіл проти TNF для лікування TNFопосередковуваних захворювань. Термін "фармацевтичний препарат" відноситься до препаратів, які знаходяться у такій формі, що створюється можливість для того, щоб біологічна активність антитіла була неухильно ефективною, та які не містять додаткових компонентів, які є токсичними для індивідів, яким препарат буде вводитися. "Фармацевтично прийнятними наповнювачами" (носіями, добавками) є наповнювачі, які можна мотивовано вводити розглянутому ссавцеві для досягнення ефективної дози використовуваного активного інгредієнту. "Стабільним" препаратом є препарат, у якому антитіло по суті зберігає свою фізичну стабільність та/або хімічну стабільність та/або біологічну активність при зберіганні. У даній галузі є різні аналітичні способи для визначення стабільності білку, та їх огляди наведені, наприклад, у Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) і Jones, A. (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90. Стабільність можна визначити при обраній температурі протягом обраного періоду часу. Краще, коли препарат є стабільним при кімнатній температурі (приблизно 30ºC) або при 40ºC протягом принаймні 1 місяця, та/або стабільним при приблизно 2-8ºC протягом принаймні 1 року або протягом принаймні 2 років. Крім того, препарат, переважно, є стабільним після заморожування (наприклад, до -70ºC) та відтавання препарату. Антитіло "зберігає свою фізичну стабільність" у фармацевтичному препараті, якщо воно не демонструє ознаки агрегації, преципітації та/або денатурації, обумовлені при візуальному дослідженні кольору та/або прозорості, або обумовлені за допомогою розсіювання УФ світла або гель-фільтрації. Антитіло "зберігає свою хімічну стабільність" у фармацевтичному препараті, якщо хімічна стабільність у конкретний момент часу є такою, що білок, як вважається, усе ще зберігає свою біологічну активність, обумовлену нижче. Хімічну стабільність можна визначити за допомогою виявлення та кількісного визначення хімічно змінених форм антитіла. Хімічна зміна може включати зміну розміру (наприклад, усічення), яке можна оцінити, використовуючи гельфільтрацію, електрофорез в SDS-ПААГ та/або іонізацію лазерної десорбції з використанням матриці/часопролітної мас-спектрометрії (MALDI/TOF MS), наприклад. Інші типи хімічної зміни включають зміну заряду (наприклад, що виникає в результаті дезамідування), оцінку якого можна здійснити за допомогою, наприклад, іонообмінної хроматографії. Антитіло "зберігає свою біологічну активність" у фармацевтичному препараті, якщо біологічна активність антитіла у конкретний момент часу знаходиться у межах приблизно 10 % (у межах помилок дослідження) біологічної активності, продемонстрованої у той момент часу, 25 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 коли фармацевтичний препарат був отриманий, як визначено, наприклад, у аналізі зв'язування антигену. Інші аналізи "біологічної активності" конкретизовані у даному описі нижче. Під "ізотонічним" мається на увазі, що препарат, який представляє інтерес, має по суті той же осмотичний тиск, що і кров людини. Ізотонічні препарати будуть, як правило, мати осмотичний тиск від приблизно 250 до 350 мОсм. Ізотонічність можна визначити, використовуючи, наприклад, паронаповнений або кріоскопічний осмометр. "Поліол" являє собою речовину з множиною гідроксильних груп та включає цукор (відновлюючі та невідновлюючі цукри), цукроспирти та цукрокислоти. Кращі у даному описі поліоли мають молекулярну масу, яка становить менше ніж приблизно 600 кДа (наприклад, знаходиться у діапазоні від приблизно 120 до приблизно 400 кДа). "Відновлюючим цукром" є цукор, який містить напівацетальну групу ОН, яка може зменшувати кількість іонів металу або реагувати з утворенням ковалентного зв'язку з лізином та іншими аміногрупами у білку, а "невідновлюючим цукром" є цукор, який не має цих властивостей відновлюючого цукру. Прикладами відновлюючих цукрів є фруктоза, манноза, мальтоза, лактоза, арабіноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза та глюкоза. Невідновлюючі цукри включають сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелецитозу та раффінозу. Маніт, ксиліт, еритрит, треїт, сорбіт та гліцерин є прикладами цукроспиртів. Як цукрокислоти вони включають сіль L-глюконової кислоти та їх солі металів. У випадку, коли бажано, щоб препарат був стійким до заморожування-відтавання, поліолом, переважно, є той, який не кристалізується при температурах заморожування (наприклад, -20ºC) з дестабілізацією антитіла у препараті. Невідновлюючі цукри включають, але ними не обмежуються, сахарозу та трегалозу. Як використовується у даному описі, "буфер" відноситься до забуференого розчину, який є стійким до змін pH завдяки дії його кислотно-основних з'єднаних компонентів. Буфер відповідно до даного винаходу має pH у діапазоні від приблизно 4,5 до приблизно 7; переважно, від приблизно 4,8 до приблизно 6,5. Приклади буферів, які будуть контролювати pH у цьому діапазоні, включають ацетатний (наприклад, натрійацетатний), сукцинатний (наприклад, натрійсукцинатний), глюконатний, гістидиновий, цитратний буфери та буфери, що включають інші органічні кислоти. Якщо бажаним є стійкий до заморожування-відтавання препарат, буфер переважно не є фосфатним. У фармакологічному значенні, у контексті даного винаходу, "терапевтично ефективна кількість" антитіла відноситься до кількості, ефективної для профілактики або лікування порушення, для лікування якого антитіло є ефективним. "Захворюванням/порушенням" є будьякий стан, лікування антитілом якого буде мати ефект. Воно включає хронічні та гострі порушення або захворювання, у тому числі ті патологічні стани, які викликають схильність ссавця до порушення, про який йде мова. "Консервантом" є сполука, яка може бути включена у препарат для істотного зменшення життєдіяльності бактерій, сприяючи тим самим одержанню препарату для багаторазового використання, наприклад. Приклади можливих консервантів включають октадецилдиметилбензиламонію хлорид, гексаметонію хлорид, бензалконію хлорид (суміш алкілбензилдиметиламонію хлоридів, у яких алкільними групами є довголанцюгові сполуки) та бензетонію хлорид. Інші типи консервантів включають ароматичні спирти, такі як фенол, бутиловий та бензиловий спирт, алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пенанол та м-крезол. Найбільш кращим консервантом є бензиловий спирт. Даний винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, що містять одне або більш антитіл разом принаймні з одним фізіологічно прийнятним носієм або наповнювачем. Фармацевтичні композиції можуть містити, наприклад, одне або більше з наступного: воду, буфери (наприклад, нейтральний забуферений сольовий розчин або забуферений фосфатом сольовий розчин), етанол, мінеральне масло, рослинна олія, диметилсульфоксид, вуглеводи (наприклад, глюкозу, манозу, сахарозу або декстрани), маніт, білки, допоміжні речовини, поліпептиди або амінокислоти, такі як гліцин, антиоксиданти, комплексоутворюючі засоби, такі як EDTA або глютатіон, та/або консерванти. Як відзначено вище, інші активні інгредієнти можуть (але необов'язково) бути включені у фармацевтичні композиції відповідно до даного винаходу. Носієм є речовина, яка може бути об'єднана з антитілом до введення пацієнтові, часто з метою контролювання стабільності або біодоступності сполуки. Носії для застосування у таких препаратах є звичайно біосумісними й також можуть бути такими, що біорозкладаються. Носії включають, наприклад, одновалентні або полівалентні молекули, такі як сироватковий альбумін (наприклад, людський або бичачий), овальбумін, пептиди, полілізин та полісахариди, такі як амінодекстран та поліамідоаміни. Носії також включають матеріали твердих підкладок, такі як гранули та мікрочастинки, що містять, наприклад, полілактат, полігліколят, співполімер лактиду 26 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 із гліколідом, поліакрилат, латекс, крохмаль, целюлозу або декстран. Носій може нести з'єднання рядом способів, включаючи ковалентний зв'язок (або безпосередньо, або через лінкерну групу), нековалентну взаємодію або змішування. Фармацевтичні композиції можуть бути отримані для будь-якого підходящого способу введення, включаючи, наприклад, очне, інтраназальне, вушне, сублінгвальне, крізьшкірне, місцеве, пероральне, назальне, ректальне або парентеральне введення. У деяких варіантах здійснення кращими є композиції у формі, що підходить для перорального застосування. Такі форми включають, наприклад, пігулки, таблетки, пастилки, коржі, суспензії на водній або масляній основі, дисперсні порошки або гранули, емульсію, тверді або м'які капсули, або сиропи, або еліксири. Проте, у інших варіантах здійснення композиції відповідно до даного винаходу можна одержати у вигляді ліофілізату. Використовуваний у даному описі термін "парентеральне(а)» включає підшкірну, внутрішньошкірну, внутрішньосудинну (наприклад, внутрішньовенну), внутрішньом'язову, спинномозкову, внутрішньочерепну, підоболонкову та внутрішньоочеревинну ін'єкцію, а також будь-який схожий спосіб ін'єкції або інфузії. У деяких варіантах здійснення антитіло відповідно до даного винаходу можна вводити безпосередньо у око шляхом ін'єкції у тканині ока, такої як періокулярна, кон'юнктивальна, субтенонова, інтракамеральна ін'єкція, ін'єкція у склоподібне тіло, всередину ока, субретинальна, субкон'юнктивальна, ретробульбарна або інтраканалікулярна ін'єкція; за допомогою безпосереднього введення у око, використовуючи катетер або інше обладнання для введення, таке як гранула для ретинального застосування, вставка всередину ока, супозиторій або імплантат, що містить пористий, непористий або гелеподібний матеріал; за допомогою очних крапель або мазей для місцевого застосування; або за допомогою обладнання для повільного вивільнення, розташованого у мішку або імплантованого поруч зі склерою (транссклеральне введення) або у склері (інтрасклеральне введення), або всередині ока. Інтракамеральна ін'єкція може здійснюватися через рогівку у передню камеру, щоб уможливити досягнення засобом трабекулярної сітки. Інтраканалікулярна ін'єкція може здійснюватися у венозні колекторні канали, що починаються біля шлеммова каналу, або у шлеммов канал. Для доставки у око антитіло відповідно до даного винаходу може бути об'єднане з офтальмологічно прийнятними консервантами, співрозчинниками, поверхнево-активними речовинами, збільшуючими в'язкість речовинами, збільшуючими проникнення речовинами, буферами, хлоридом натрію або водою для утворення водної, стерильної суспензії або розчину для офтальмологічного застосування. Продукти для місцевого офтальмологічного застосування можуть бути упаковані, наприклад, у багатодозовій формі. Тому можуть знадобитися консерванти для запобігання зараження мікробами під час застосування. Підходящі консерванти включають хлорбутанол, метилпарабен, пропілпарабен, фенілетиловий спирт, едедат динатрію, сорбінову кислоту, полікватерніум-1 або інші агенти, відомі фахівцям у даній галузі. Такі консерванти звичайно використовуються на рівні від 0,001 до 1,0 % відносно маси до об'єму. Композиції відповідно до даного винаходу у формі одноразової дози будуть стерильними, але звичайно без консервантів. Такі композиції, отже, не будуть, як правило, містити консерванти. У деяких варіантах здійснення композиції, призначені для місцевого введення у око, одержують у вигляді очних крапель або очних мазей, причому загальна кількість антитіла буде становити приблизно 0,001-1,0 % (у масовому відношенні). Переважно, кількість антитіла проти TNFα становить від приблизно 0,01 до приблизно 1,0 % (у масовому відношенні). Композиції відповідно до даного винаходу у деяких випадках будуть вводитися у вигляді розчинів для місцевого введення. Водні розчини є, як правило, кращими, виходячи з легкості одержання, а також можливості легкого введення таких композицій пацієнтом за допомогою введення однієї-двох крапель розчинів в уражені очі. Однак композиції можуть бути також суспензіями, в'язкими або напівв'язкими гелями, або іншими типами твердих або напівтвердих композицій. Композиції, призначені для перорального застосування, можна одержати відповідно до будь-якого способу, відомого у даній галузі для одержання фармацевтичних композицій, та можуть містити один або більше агентів, таких як підсолоджувачі, корригенти, барвники та консерванти для одержання привабливих та смачних препаратів. Таблетки містять активний інгредієнт у суміші з фізіологічно прийнятними наповнювачами, які підходять для виробництва таблеток. Такі наповнювачі включають, наприклад, інертні розріджувачі (наприклад, карбонат кальцію, карбонат натрію, лактозу, фосфат кальцію або фосфат натрію), агенти для гранулювання та поліпшення розпадаємості таблеток (наприклад, кукурудзяний крохмаль або альгінову кислоту), зв'язувальні речовини (наприклад, крохмаль, желатин або аравійську камедь) та лубриканти (наприклад, стеарат магнію, стеаринову кислоту або тальк). Таблетки 27 UA 111340 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути без покриття, або вони можуть бути покриті відомими способами для відстрочення розпаду та всмоктування у шлунково-кишковому тракті та тим самим забезпечують безперервну дію протягом більш тривалого періоду часу. Наприклад, матеріал із затримкою за часом, такий як гліцерилмоностеарат або гліцерилдистеарат, може використовуватися. Препарати для перорального застосування можуть бути також вводитися у вигляді твердих желатинових капсул, у яких активний інгредієнт змішаний з інертним твердим розріджувачем (наприклад, карбонатом кальцію, фосфатом кальцію або каоліном), або у вигляді м'яких желатинових капсул, у яких активний інгредієнт змішаний з водою або масляним середовищем (наприклад, арахісовим маслом, рідким парафіном або маслиновим маслом). Водні суспензії містять антитіло у суміші з наповнювачами, що підходять для одержання суспензій на водній основі. Такі наповнювачі включають суспендуючі засоби (наприклад, натрій карбоксиметилцелюлозу, метилцелюлозу, гідропропілметилцелюлозу, альгінат натрію, полівінілпіролідон, трагакантову камедь та аравійську камедь); та диспергатори або змочувальні засоби (наприклад, природні фосфатиди, такі як лецитин, продукти конденсації алкіленоксиду з жирними кислотами, такі як поліоксиетиленстеарат, продукти конденсації етиленоксиду із довголанцюговими аліфатичними спиртами, такі як гептадекаетиленоксицетанол, продукти конденсації етиленоксиду з неповними ефірами, одержуваними з жирних кислот та гекситолу, такі як поліоксиетиленсорбітмоноолеат, або продукти конденсації етиленоксиду з неповними ефірами, одержуваними з жирних кислот та гекситолових ангідридів, такі як поліетиленсорбітанмоноолеат). Водні суспензії також можуть містити один або кілька консервантів, наприклад, етил- або пропіл-пара-гідроксибензоат, один або більше барвників, один або більше коригентів, та один або більше підсолоджувачів, таких як сахароза або сахарин. Сиропи та еліксири можуть бути отримані з підсолоджувачами, такими як гліцерин, пропіленгліколь, сорбіт або сахароза. Такі препарати також можуть містити один або більше засобів, що зменшують подразнення, консервантів, коригентів та/або барвників. Суспензії на масляній основі можуть бути отримані шляхом суспендування активних інгредієнтів у рослинній олії (наприклад, арахісовому маслі, маслиновому маслі, кунжутному маслі або кокосовому маслі) або у мінеральному маслі, такому як рідкий парафін. Суспензії на масляній основі можуть містити загусник, такий як жовтий віск, твердий парафін або цетиловий спирт. Підсолоджувачі, такі як ті, які викладені вище, та/або коригенти можуть бути додані для одержання пероральних препаратів із привабливим смаком. Збереження таких суспензій можна забезпечити за допомогою додавання антиоксиданту, такого як аскорбінова кислота. Дисперсні порошки та гранули, що підходять для одержання суспензії на водній основі за допомогою додавання води, забезпечують активний інгредієнт у суміші з диспергатором або змочувальним агентом, суспендуючим агентом та одним або більше консервантів. Прикладами підходящих диспергаторів та змочувальних агентів слугують ті, які вже відзначені вище. Також можуть бути присутніми додаткові наповнювачі, наприклад, підсолоджувачі, коригенти та барвники. Фармацевтичні композиції можуть бути також у формі емульсій типу "масло-у-воді". Масляною фазою може бути рослинна олія (наприклад, маслинове масло або арахісове масло), мінеральне масло (наприклад, рідкий парафін) або їх суміш. Підходящі емульгатори включають природні камеді (наприклад, аравійську камедь або трагакантову камедь), природні фосфатиди (наприклад, сою, лецитин та ефіри або неповні ефіри, одержувані з жирних кислот і гекситолу), ангідриди (наприклад, сорбітмоноолеат) та продукти конденсації неповних ефірів, одержуваних з жирних кислот та гекситолу, з етиленоксидом (наприклад, поліоксиетиленсорбітанмоноолеат). Емульсія може також містити один або більше підсолоджувачів, та/або коригентів. Фармацевтична композиція може бути отримана у вигляді стерильної ін'єктуємої водної суспензії або суспензії, що містить масло, у якій модулятор, залежно від використовуваного носія та концентрації, або суспендований або розчинений у носії. Таку композицію можна одержати відповідно до відомого рівня, використовуючи підходящі диспергатори агенти, змочуючі та/або суспендуючі агенти, такі як ті, які відзначені вище. Серед підходящих носіїв та розчинників, які можуть використовуватися, є вода, 1,3-бутандіол, розчин Рінгера та ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, стерильні, нелеткі масла можуть використовуватися як розчинник або суспендуюче середовище. Із цією метою може використовуватися будь-яке несмачне нелетке масло, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди. Крім того, жирні кислоти, такі як олеїнова кислота, можуть використовуватися при одержанні ін'єктуємих композицій, та допоміжні засоби, такі як місцеві анестетики, консерванти та/або буферні речовини, можуть бути розчинені у носії. Фармацевтична композиція може бути отримана у вигляді препаратів з уповільненим вивільненням (тобто препарату, такого як капсула, який імітує повільне вивільнення модулятора 28