Конструкція днк, рекомбінантний експресуючий вектор, спосіб одержання гетерологічного поліпептиду

1. Конструкция ДНК, содержащая следующую последовательность C2 (54) КОНСТРУКЦІЯ ДНК, РЕКОМБІНАНТНИЙ ЕКСПРЕСУЮЧИЙ ВЕКТОР, СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ГЕТЕРОЛОГІЧНОГО ПОЛІПЕПТИДУ 40625 держащей эту конструкцию ДНК, и способа получения гетерологичных полипептидов в дрожжах с применением этой конструкции ДНК. Дрожжевые организмы продуцируют ряд белков, которые синтезируются внутриклеточно, но проявляют свою функцию вне клетки. Такие внеклеточные (экстрацеллюлярные) белки называют секретируемыми белками. Секретируемые белки экспрессируются исходно внутри клетки в виде предшественника или пре-белка, содержащего препоследовательность, обеспечивающую эффективное направление экспрессируемого продукта через мембрану эндоплазматического ретикулума (ER). Пре-последовательность, обычно называемая сигнальным пептидом, отщепляется от остальной части белка во время транслокации. После вступления в секреторный путь белок транспортируется к аппарату Гольджи. Из аппарата Гольджи белок может следовать различными путями, которые ведут к таким компартментам, как клеточная вакуоль или клеточная мембрана, или он может направляться из клетки для секреции в окружающую внешнюю среду (Pfeffer, S.R. and Rothman, J.E. Ann Rev. Biochem. 56, (1987), 829–852). Были предложены некоторые подходы для экспрессии и секреции в дрожжах белков, гетерологичных для дрожжей. European published patent application № 88 632 описывает способ, по которому гетерологичные для дрожжей белки экспрессируются, процессируются и секретируются путем трансформации организма дрожжей экспрессирующим вектором, несущим ДНК, кодирующую желаемый белок и сигнальный пептид, получения культуры трансформированного организма, выращивания этой культуры и извлечения белка из культуральной среды. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид самого желаемого (целевого) белка, гетерологичный сигнальный пептид или гибрид нативного и гетерологичного сигнального пептида. Проблема, с которой сталкиваются при использовании сигнальных пептидов, гетерологичных для дрожжей, может заключаться в том, что гетерологичный сигнальный пептид не обеспечивает эффективной транслокации и/или последующего отщепления сигнального пептида. MF a1 (a-фактор) S. cerevisial синтезируется в виде пре-проформы из 165 аминокислот, содержащей сигнальный или пре-пептид из 19 аминокислот, после которого следует "лидерный" пептид, или пропептид, из 64 аминокислот, охватывающий три соединенных с N-концом сайта гликозилирования, после которого следует (Lys Arg (Asp/Glu, Ala)2-3a-фактор)4 (Kurjan, J. and Herskowitz' J Cell 30 (1984), 933–943). Сигнальная лидерная часть пре-проMFa1 широко применялась для достижения синтеза и секреции гетерологичных белков в S. cerevisial. Применение сигнальных/лидерных пептидов, гомологичных для дрожжей, известно, например, из U.S. patent specification № 4 546 082, European published patent application №№ 116 201, 123 294, 123 544, 163 529, 123 289, и D.K. patent application № 3614/83. В ЕР 123 289 описано использование предшественника а-фактора S. cerevisial, тогда как WO 84/01153 описывает использование сигнального пептида инвертазы Saccharomyces cerevisial и DK 3614/83 использование сигнального пептида PHO5. S. cerevisial для секреции чужеродных белков. US patent specification № 4 546 082, Еp 16 201, 123 294, 123 544 и 163 529 описывают способы, по которым сигнальный-лидерный пептид aфактора из Saccharomyces cerevisial (MF a1 или MF a2) применяют в процессе секреции экспрессируемых гетерологичных белков в дрожжах. Посредством слияния последовательности ДНК, кодирующей сигнальную/лидерную последовательность MF a1 S. cerevisial на 5'-конце гена целевого белка, были продемонстрированы секреции и процессинг целевого белка. Ряд секретируемых белков направляются таким образом, чтобы они могли быть подвергнуты действию протеолитической системы процессинга, которая может расщеплять пептидную cвязь на карббокси-конце двух последовательных основных аминокислот. Такая ферментативная активность кодируется в S. cerevisial геном КЕХ 2 (Julius, D.A. et al., Cell 37 (1984 b), 1075). Процессинг продукта продуктом гена КЕХ 2 необходим для секреции активного фактора спаривания a (MFa или a-фактора) S. cerevisial, но он не участвует в секреции активного фактора спаривания а S. cerevisial. Применение сигнального пептида (или его мутанта) амилазы слюны мышей для обеспечения секреции гетерологичных белков, экспрессируемых в дрожжах, было описано в WO 89/02463 и WO 90/10075. Целью данного изобретения является обеспечение более эффективной экспрессии и/или секреции в дрожжах гетерологичных белков. Краткое изложение существа изобретения. Неожиданно было обнаружено, что сигнальный пептид дрожжевой аспарагиновой протеазы 3 способен обеспечивать улучшенную секрецию белков, экспрессируемых в дрожжах, по сравнению с сигнальным пептидом амилазы слюны мышей. Таким образом, данное изобретение касается конструкции ДНК, содержащей следующую последовательность S'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' где Р обозначает промоторную последовательность, SP обозначает последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид (УАРЗ) дрожжевой аспарагиновой протеазы 3, LP обозначает последовательность ДНК, кодирующую лидерный пептид, n обозначает 0 или 1, PS обозначает последовательность ДНК, кодирующую пептид, определяющий дрожжевой сайт процессинга, и НР обозначает последовательность ДНК, кодирующую полипептид, который является гетерологичным для выбранного организма-хозяина. Термин "сигнальный пептид" обозначает препоследовательность, которая преобладающим образом гидрофобна по ее природе и присутствует в виде N-концевой последовательности формы пред 2 40625 шественника внеклеточного (экстрацеллюлярного) белка, экспрессируемого в дрожжах. Функция сигнального пептида заключается в том, чтобы обеспечить вхождение гетерологичного белка, который должен секретироваться, в эндоплазматический ретикулум. Сигнальный пептид отщепляется в ходе этого процесса. Ранее сообщалось о сигнальной последовательности УАРЗ, слитой с его нативным геном (ср. М. Egel-Mitahi et al., Geast 6, 1990, pp. 127–137). Конструкция ДНК, в которой сигнальная последовательность УАРЗ слита с последовательностью ДНК, кодирующей гетерологичный полипептид, является, по-видимому, новой. Ранее не было сообщений о том, что сигнальный пептид УАРЗ обеспечивает эффективную секрецию гетерологичных полипептидов в дрожжах. В данном контексте выражение "лидерный пептид" обозначает пептид, функцией которого является обеспечение направления гетерологичного полипептида из эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи и далее к секреторному носителю для секреции в среду (т.е. экспорта экспрессированного полипептида через клеточную стенку или по меньшей мере через клеточную мембрану в пространство периплазмы клетки). Выражение "гетерологичный полипептид" предназначено для обозначения полипептида, который в природе не продуцируется дрожжевым организмом-хозяином. В другом аспекте данное изобретение касается рекомбинантного экспрессирующего вектора, содержащего конструкцию ДНК этого изобретения. В дальнейшем аспекте данное изобретение касается клетки, трансформированной рекомбинантным экспрессирующим вектором этого изобретения. Еще в одном аспекте данное изобретение касается способа получения гетерологичного полипептида, предусматривающего культивирование клетки, способной экспрессировать гетерологичный полипептид и трансформированной конструкцией ДНК изобретения, в подходящей среде для получения экспрессии и секреции гетерологичного полипептида, после чего гетерологичный полипептид извлекают из среды. Подробное описание изобретения. В характерном варианте сигнальный пептид дрожжевой аспарагиновой протеазы 3 (УАРЗ) кодируется следующей последовательностью ДНК ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGT TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC или ее подходящей модификацией, кодирующей пептид с высокой степенью гомологии (по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70% идентичности последовательности) относительно сигнального пептида УАРЗ. Примерами "подходящих модификаций" являются нуклеотидные замены, которые не вызывают появления другой аминокислотной последовательности этого пептида, но которые могут соответствовать использованию кодонов дрожжевым организмом, в которые введена эта последовательность, или нуклеотидные замены, которые приводят к отличающейся аминокислотной последовательности этого пептида (хотя аминокислотная последовательность не должна модифицироваться до такой степени, что она больше не способна функционировать в качестве сигнального пептида). Другими примерами возможных модификаций являются инсерции трех или множеств из трех нуклеотидов на любом конце или внутри этой последовательности или делеции трех или множеств из трех нуклеотидов на любом конце или внутри этой последовательности. В последовательности 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' n обозначает предпочтительно 1. Другими словами, хотя сигнальный пептид УАРЗ в некоторых случаях может обеспечить секрецию и/или процессинг гетерологичного пептида, предпочтительно должна присутствовать лидерная или пропептидная последовательность. Лидерная последовательность может быть лидерным пептидом MF a1 дрожжей или синтетическим лидерным пептидом, например, одним из лидерных пептидов, описанных в WO 89/02463 или WO 92/11378, или его производным, способным способствовать секреции гетерологичного полипептида в дрожжах. Термин "синтетический" предназначен для указания, что такие лидерные пептиды не обнаружены в природе. Например, синтетические дрожжевые (SEQ 1D № 1) лидерные пептиды могут быть сконструированы согласно процедуры, описанным в WO 89/02463 или WO 92/11378. Сайт процессинга дрожжей, кодируемый последовательностью ДНК PS, может быть любой парной комбинацией Lys и Arg, такой как Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys или Arg-Arg, которая делает возможным процессинг гетерологичного полипептида протеазой КЕХ2 Saccharomyces cerevisial или равноценной протеазой в другом виде дрожжей (D.A. Julius et. al., Cell, 37, 1984, 1075 ff). Если процессинг при помощи КЕХ2 неудобен, например, если он привел бы к расщеплению полипептидного продукта, то может быть выбран сайт процессинга для другой протеазы вместо сайта для КЕХ2, содержащий комбинацию аминокислот, которая не обнаружена в полипептидном продукте, например сайт процессинга для FXa, Ile-Glu-Gly-Arg (справ. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A.Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Jork, 1989). Гетерологичным белком, получаемым по способу этого изобретения, может быть любой белок, который может выгодно продуцироваться в дрожжах. Примерами таких белков являются апротинин, ингибитор пути тканевого фактора или другие протеазные ингибиторы, инсулин или предшественники инсулина, гормон роста человека или коров, интерлейкин, глюкагон, тканевый активатор плазминогена, трансформирующий фактор роста a или b тромбоцитарный фактор роста, ферменты или их функциональные аналоги. В данном контексте термин "Функциональный аналог" обозначает полипептид с функцией, подобной функции нативного белка (под этим понимают скорее природу, чем уровень биологической активности нативного белка). Полипептид может быть структурно похожим на нативный белок и может быть получен из нативного белка добавлением одной или 3 40625 нескольких аминокислот к любому или к обоим из С- и N-концов нативного белка, заменой одной или нескольких кислот в одном или в ряде различных сайтов в нативной аминокислотной последовательности, делецией одной или нескольких аминокислот на любом конце или на обоих концах нативного белка или в одном или нескольких сайтах в аминокислотной последовательности или инсерцией одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативной аминокислотной последовательности. Такие модификации хорошо известны для некоторых из упомянутых выше белков. Конструкцию ДНК этого изобретения можно получить синтетически установленными стандартными способами, например, фосфоамидитным способом, описанным S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, Tefrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859– 1869, или способом, описанным Matthes et al. EMBO Journal 3, 1984, рр. 801–805. Согласно фосфоамидитному способу, олигонуклеотиды синтезируются, например в автоматизированном синтезаторе ДНК, очищаются, отжигаются, лигируются и клонируются в дрожжевом экспрессирующем векторе. Следует заметить, что последовательность 5'P-SP(LP)n-PS-HP-3' не должна быть обязательно получена в одной операции, но может быть собрана из двух или более олигонуклеотидов, полученных синтетически указанным образом. Одна или более частей последовательности ДНК 5'-P-SP(LP)n-PS-HP-3' могут быть также геномного происхождения или происходящими из кДНК, например полученными путем получения геномной библиотеки или библиотеки кДНК и скрининга на последовательности ДНК для этих частей (обычно НР) посредством гибридизации с применением синтетических олигонуклеотидных зондов в соответствии со стандартными способами (срав. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Jork, 1989). В этом случае последовательность геномной ДНК или кДНК, кодирующая сигнальный пептид, может быть соединена с геномной или кДНК последовательностью, кодирующей гетерологичный белок, после чего эта последовательность ДНК может быть модифицирована инсерцией синтетических олигонуклеотидов, кодирующих последовательность 5'-P-SP(LP)n-PS-HP-3' в соответствии с хорошо известными способами. Наконец, последовательность ДНК 5'-PSP(LP) n-PS-HP-3' может быть смешанной синтетической и геномной, смешанной синтетической и кДНК или смешанной геномной и кДНК, полученной отжигом (гибридизацией) синтетических, геномных или кДНК фрагментов (как удобно), соответствующих различным частям целой последовательности ДНК, в соответствии со стандартными способами. Таким образом, можно предусмотреть, чтобы последовательность ДНК, кодирующая сигнальный пептид или гетерологичный полипептид, была геномного происхождения или происходила из кДНК, тогда как последовательность 5'-P-SP-(LP) n-PS может быть получена синтетически. Рекомбинантным экспрессирующим вектором, несущим последовательность 5'-P-SP(LP)nPS-HP-3', может быть любой вектор, который спо собен реплицироваться в дрожжевых организмах. В этом векторе промоторной последовательностью (Р) может быть любая последовательность ДНК, которая обнаруживает транскрипционную активность в дрожжах и может быть получена из генов, кодирующих белки, гомологичные или гетерологичные для дрожжей. Предпочтительно промотор получают из гена, кодирующего белок, гомологичный для дрожжей. Примерами подходящих промоторов являются промоторы MF a1, TP1, ADH1, ADH11 или PGK Saccharomyces cerevisial или соответствующие промоторы из других видов дрожжей, например, Schizosaccharomyces pombe. Примеры подходящих промоторов описаны, например, Russel and Hall, J. Biol. Chem. 258, 1983, pp. 143–149; Russel Nature 301, 1983, pp. 167–169; Ammerer, Meth. Entymol 101, 1983, pp. 192–201; Russel et al., J. Biol. Chem. 258, 1983, pp. 2674– 2682; Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 225, 1980, pp. 12073–12080; Kawasaki and Fraenket, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108, 1982, and T. Alber and G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, pp. 419–434. Последовательности, указанные выше, должны быть также оперативно соединены с подходящим терминатором, например ТР1 терминатором (срав. T. Alber and G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet 1, 1982, pp. 419–434) или дрожжевым CYCl терминатором. Рекомбинантный экспрессирующий вектор изобретения содержит также последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в дрожжах. Примерами таких последовательностей являются гены репликации REP 1–3 и начало репликации дрожжевой плазмиды 2m. Вектор может также содержать селектируемый маркер, например, TP1 ген Schitosaccharomyces pomle, описанный P.R. Russel Gene 40, 1985, pp. 125–130, или ген дрожжей URA3. Процедуры, применяемые для встраивания последовательности 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' в подходящий дрожжевой вектор, содержащий информацию, необходимую для репликации в дрожжах, хорошо известны лицам с квалификацией в данной области (срав., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, цитир. выше). Должно быть понятно, что вектор может быть сконструирован либо путем первоначального приготовления конструкции ДНК, содержащей полную последовательность, и последующего встраивания этого фрагмента в подходящий экспрессирующий вектор, либо путем последовательного встраивания фрагментов ДНК, содержащих генетическую информацию для отдельных элементов (таких как промоторная последовательность, сигнальная последовательность, лидерная последовательность или ДНК, кодирующая гетерологичный полипептид) с последующим лигированием. Дрожжевым организмом, трансформированным вектором изобретения, может быть любой подходящий дрожжевой организм, который при культивировании продуцирует большие количества гетерологичного полипептида, представляющего интерес. Примерами подходящих дрожжевых организмов могут быть штаммы Saccharomyces, такие как Saccharomyces сerevisial, Saccharomyces kluyveri или Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces, та 4 40625 кие как Schizosaccharomyces pomle, Kluyveromyces такие как Kluyveromyces lactis, Garrowia, такие как Garrowia lipolytica, или Hansenula, такие как Hansenula polymorpha. Трансформация дрожжевых клеток может, например, выполняться путем образования протопластов с последующей трансформацией известными per se способами. Средой для культивирования клеток может быть любая общепринятая среда, подходящая для выращивания дрожжевых организмов. Секретируемый гетерологичный белок, значительная часть которого будет присутствовать в среде в правильно процессированной форме, может быть извлечен из среды обычными способами, включающими отделение дрожжевых клеток от среды центрифугированием или фильтрованием, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с применением соли, например, сульфата аммония, с последующей очисткой различными хроматографическими процедурами, например, ионообменной хроматографией, аффинной хроматографией или т.п.п. Краткое описание рисунков Изобретение описывается далее в следующих ниже примерах со ссылками на прилагаемые рисунки, в которых фиг. 1А и 1В схематически изображают конструкцию плазмиды pL aC257; фиг. 2 изображает последовательность ДНК и произведенную из нее аминокислотную последовательность инсерции EcoR1-Xba1 в pL aC257 (SEQ 1D № 2); фиг. 3А и 3В схематически изображают конструкцию плазмиды pL aC242Apr; фиг. 4 показывает последовательность ДНК и произведенную из нее аминокислотную последовательность фрагмента EcoR1-Xba1, причем последовательность белка, показанная курсивом, получена из фрагмента ДНК, клонированного произвольной экспрессией (SEQ 1D № 4); фиг. 5 показывает схематически конструкцию плазмиды pLa C263; фиг. 6 показывает последовательность ДНК и произведенную аминокислотную последовательность фрагмента EcoR1–Xba1 pL aC263 (SEQ 1D № 6); фиг. 7А и 7В показывают последовательность ДНК и произведенную аминокислотную последовательность ингибитора пути тканевого фактора человека (TFP1), в том числе нативного сигнального пептида (SEQ 1D № 8); фиг. 8А показывает последовательность ДНК и произведенную аминокислотную последовательность сигнального пептида Spx3 и лидерного пептида 212 (показанных в WO 89/02463), соединенных на N-конце с последовательностью TFP1 в плазмиде pVES-212 TFP1161–117Q (SEQ 1D N:10); фиг. 8В показывает последовательность ДНК и произведенную аминокислотную последовательность сигнального пептида YAP3 и лидерного пептида 212, соединенного на N-конце с последовательностью TFPI в плазмиде pYES-ук TFP1161–117Q (SEQ 1D N: 12); и фиг. 9 показывает рестрикционные карты плазмид pYES21, pP-212 TFP1161–117Q; pYES212 TFP1161–117Q и pYES-ук TFP1161–117Q. Изобретение далее иллюстрируется примерами, которые не предназначены для какого бы то ни было ограничения сферы действия изобретения, описанной в формуле изобретения. Примеры Плазмиды и ДНК материалы Все экспрессирующие плазмиды содержат последовательности ДНК 2m для репликации в дрожжах и используют либо ген URA3 S. cerevisial, либо ген триозофосфатизомеразы SchizoSaccharomyces pomle (РОТ) в качестве селектируемых маркеров в дрожжах. РОТ плазмиды описаны в ЕР Patent application № 171 142. Плазмида, содержащая РОТ ген, доступна из депонированного штамма. E. coli (АТСС 39685). РОТ плазмиды, кроме того, содержат промотор и терминатор (PTP1 и TTP1) триозофосфатизомеразы S. cerevisial. Они идентичны рМТ742 (М. Egel-Mitani et al., Gene 73, 1988, pp. 113–120) (см. фиг. 1), за исключением района, определяемого сайтами рестриктаз SphXba1, охватывая PTP1 и район, кодирующий сигнальный пептид/лидерный пептид/продукт. PTP1 был модифицирован относительно последовательности, обнаруженной в pMT742, только для облегчения конструирования плазмиды. Внутренний сайт расщепления SPh1 был исключен расщеплением при помощи SPh1, удалением одноцепочечных хвостов и повторным лигированием. Кроме того, последовательности ДНК слева от промотора, не влияющие на него удаляли обработкой экзонуклеазой Ba131 с последующим добавлением линкера сайта рестрикции Sph1. Эту промоторную конструкцию, присутствующую на фрагменте из 373 п.н. Sph1-EcoR1 обозначали PTP1d и при использовании в уже описанных плазмидах эта модификация промотора указывалась добавлением d к названию плазмиды. Наконец, использовали ряд синтетических фрагментов ДНК, которые синтезировали на автоматизированном синтезаторе ДНК (Applied Biosystems model 380A) с применением фосфорамидитного способа и коммерчески доступных реагентов (S.L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859–1869). Олигонуклеотиды очищали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле при денатурирующих условиях. Перед отжигом комплементарных пар таких одноцепочечных цепей ДНК их обрабатывали Т4 полинуклеотидкиназой и АТФ. Все другие примененные способы и материалы известны и обычны для данной области знаний (J. Gambrook et al., Molecular Cloning, A. Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) Cold Spring Harbor N.Y. (1989). Пример 1. Модифицированный сигнальный пептид амилазы слюны мышей (MSA3SP) (описанный в WO 89/02463) экспрессионной кассеты плазмиды pLS C6315D3 (описанной в Примере 3 WO 92/11378), которая содержит последовательность ДНК, кодирующую предшественник инсулина М13 (В(1–29)-Ala-AlaLys-A(1-21)), был заменен сигнальным пептидом УАЗ3 при помощи следующих стадий: Была приготовлена конструкция для легкой замены сигнальных пептидов. При помощи сайтнаправленного мутагенеза сайт Asp718 вводили непосредственно перед кодоном сигнала инициации (инициирующим кодоном) в pL aC196d (срав. WO 89/02463, фиг.5) при помощи способа двойных 5 40625 праймеров, применяющего мутагенный праймер NOR494: Полученную плазмиду назвали pL aC196d ASp718 (см. фиг. 1). Нуклеотидную последовательность района, охватывающего соединение между сигнальным пептидом и лидерным пептидом экспрессионной кассеты в pLS C6315D3, модифицировали заменой фрагмента рестрикции Apa1-HgiA1 синтетическим отрезком ДНК, NOR 2521/2522: 3'-ATTT CT CCATGGTACTTTCAGAA (SEQ 1D N:14), где жирные буквы указывают мутации, а подчеркнутая последовательность указывает инициирующий кодон. NOR2521: 5'-CAA CCA ATA GAC ACG CGT AAA GAA GGC CTA CAG CAT GAT TAC GAT ACA GAG ATC TTG GAG (SEQ 1D N:15) NOR2522: 5'-C CAA GAT CTC TGT ATC GTA ATC ATG CTG TAG GCC TTC TTT ACG CGT GTC TAT TGG TTG GGC C (SEQ 1D N:16) Полученную плазмиду назвали pLS C6315D3P (см. фиг.1). Фрагмент Sph1-A p718 pL aC196 -Asp718 лигировали с разрезанной Sph1-Mlu1 и плазмидой pLS C6315D3R и синтетическим отрезком ДНК, кодирующей сигнальный пептид УАР3: YAP-Sp1: 5'-GT ACC AAA ATA ATC AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CCA ATA GAC A (SEQ 1D N:17) YAP-Sp2: 5'-CG CGT GTC TAT TGG TTG GCC AAG GAC CTG AGA TGC AAA GAG TGA CGA AAG GAC CGC AGA TCT TAC AGT TTT CAG TTT CTA TAT TTT G (SEQ 1D N:18) Полученная плазмида pL aC257 по существу состоит из pLSC6315D3, в которой сигнальный пептид MSA3 был изменен сигнальным пептидом УАР3 (см. фиг. 2). Трансформация дрожжей: Штамм МТ663. S. cerevisial (Е2-7В ХЕ11–36 a/aDtpi/Dtpi pep 4-3/pep 4-3) (этот штамм дрожжей МТ663 был депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур в связи с подачей WO 92/11378 и получил номер депозита DS M 6278) выращивали на УРGal (1% Бактодрожжевой экстракт, 2% бактопептон, 1% галактоза, 1% лактат) до О.D. при 600 нм 0,6. 100 мл культуры собирали центрифугированием, промывали 10 мл воды, повторно центрифугировали и ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 1,2 М сорбит, 25 мМ Na2 ЭДТА, рН = 8,0, и 6,7 мг/мл дитиотреитола. Суспензию инкубировали при 30оС в течение 15 минут, центрифугировали и клетки ресуспендировали в 10 мл раствора, содержащего 1,2 М сорбит, 10 мМ Na2 ЭДТА, 0,1 М цитрат натрия, рН 5,8, и 2 мг Novozym â 234. Суспензию инкубировали при 30оС в течение 30 минут, клетки собирали центрифугированием, промывали в 10 мл раствора, содержащего 1,2 С сорбит, и 10 мл CAS (1,2 М сорбит, 10 мМ CaCl2, 10 мМ Трис-HCl (трис-трис(гидроксиметил)аминометан) рН = 7,5) и ресуспендировали в 2 мл CAS. Для трансформации 1 мл суспендированных в СА клеток смешивали с приблизительно 0,1 мкг плазмиды pL aC257 и оставляли при комнатной температуре в течение 15 минут. 1 мл (20% полиэтиленгликоля 4000, 20 мМ CaCl2, 10 мМ CaCl2, 10мМ Трис-HCl, рН 7,5) добавляли и смесь оставляли еще на 30 минут при комнатной температуре. Смесь центрифугировали и осадок ресуспендировали в 0,1 мл SOS (1,2 M сорбит, 33% об./об. YPD, 6,7 мМ CaCl2, 14 мкг/мл лейцина) и инкубировали при 30оС в течение 2 часов. Затем суспензию центрифугировали и осадок ресуспендировали в 0,5 мл 1,2 С сорбита. Затем 6 мл верхнего агара (SC среда Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)), содержащего 1,2 М сорбит плюс 2,5% агар) при 52оС добавляли и суспензию выливали на верхнюю часть чашек, содержащих ту же самую среду с отвержденным агаром, содержащую сорбит. Колонии трансформанта выковыривали спустя 3 дня выдерживания при 30оС, повторно изолировали и использовали для засева жидких культур. Один трансформант отбирали для дальнейшей характеристики. Ферментация: Дрожжевой штамм МТ663, трансформированный плазмидой pL aC257, выращивали на среде YPD (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон (из Difco Laboratories) и 3% глюкоза). 1 литр культуры этого штамма качали при 30оС до оптической плотности (OD) при 650 нм 24. После центрифугирования выделяли супернатант. Клетки МТ663, трансформированные плазмидой pLSC6315D3 и культивированные, как описано выше, использовали для сравнения выходов предшественника инсулина М13. Выходы М13 определяли непосредственно на культуральных супернатантах по способу Shel, Damgaard and Mollerup, Chromatographia 24, 1987, pp. 329–332. Результаты показаны ниже. Плазмида Выход М13 pSL C63.15D3 (MSA3SP) 100% pL aC257 (УАР3) 120% Пример 2. Плазмиду pLS C6315D3 модифицировали в двух стадиях. Сначала сигнальный пептид MSA3 заменяли сигнальным пептидом Spx3 посредством замены фрагмента Sph1-Apal аналогичным фрагментом из PL aC212 Spx3 (cрав. WO 89/02463). Из полученной плазмиды pSL C63.15 Spx3 выделяли фрагмент EcoR1-D 302 п.н. и сливали с фрагментом Nco1-Xba1 204 п.н. pKFN1003 (WO 90/10075), содержащим последовательность ДНК, кодирующую апротинин, через синтетический ДНК-линкер, NOR2101/2100 (см. фиг. 3). 6 40625 NOR 2101: 5'-T AAC GTC GC (SEQ 1D N: 19) NOR 2100: 5'-CAT GGC GAC G (SEQ 1D N:20) Полученную плазмиду, pL aC242-Apr (см. фиг.3), расщепляли при помощи Clal, дефосфорилировали и применяли в клонировании произвольных фрагментов ДНК с 5'-CG- cвешивающихся хвостами, выделенных из штамма МТ663 S. cerevisial, согласно описанию в WO 92/11278. Трансформацию и ферментацию дрожжевого штамма МТ663 проводили, как описано в примере 1. Из полученной библиотеки дрожжей трансформанты, несущие плазмиду pAPR-Scl (полученную по способу, описанному в WO 92/11378), содержащую лидер, последовательность которого дана на фиг. 4, выбирали посредством скрининга. Сигнальный пептид рх3SpAPR-Scl заменяли сигнальным пептидом УАР3 путем слияния фрагмента Sph1-Sty1 из pL aC257 с фрагментом из 300 п.н. Nhe1-Xba1 pAPR-Sc1 через синтетический ДНКлинкер МН1338/1339 (см. фиг.5): MH 1338: 5'-CTT GGC CAA TCG AAA TTG AAA CCA G MH 1339: 5'-CT AGC TGG TTT CAA TTT CGA TGG TTG GC Полученную плазмиду назвали pL aC263 (cм. фиг. 5). Последовательность ДНК и произведенная аминокислотная последовательность фрагмента EcoR1-Xba1 плазмиды pL aC263 даны на фиг. 6. Плазмида Выход апротинина pAPR-Sc1 (Spx3SP) 100% pL aC263 136% Пример 3. Синтетический ген, кодирующий человеческий TFP1, последовательность ДНК которого была получена из опубликованной последовательности кДНК, кодирующей ингибитор пути тканевого фактора человека (TFP1) (Wunet al, J. Biol Chem 263 (1988), 6001–6004) получали ступенчатым клонированием синтетических фрагментов рестрикции в плазмиду рВS(+). Полученный ген находился в рестрикционном фрагменте из 928 п.н. Sal 1. Этот ген имел 26 молчащих нуклеотидных замен в вырожденных кодонах по сравнению с этой кДНК, что приводит к 14 уникальным сайтам рестриктаз. Последовательность ДНК фрагмента Sal 1 из 928 п.н. и соответствующая аминокислотная последовательность TFP1 человека (пре-форма) показаны в фиг. 7 (SEQ 1D N:8). Эту последовательность ДНК затем укорачивали для кодирования разновидности TFP1, состоящей из первых 161 аминокислот. Негликозилированную разновидность, TFP11-161-117 Gln, в которой ААТ-кодон для Asn 117 был заменен САА-кодоном, кодирующим Cln, конструировали сайт-специфичес (SEQ 1D N:21) (SEQ 1D N : 22) ким мутагенезом способом, известным per Se, с применением синтетических олигонуклеотидов. Перед последовательностью ДНК, кодирующей TFP11-161117 Gln, помещали синтетическую сигнальную-лидерную последовательность 212Spx3 (срав. WQ 89/02463), см. фиг. 8А. Эту конструкцию вставляли в плазмиду рР-212TFP1161-117Q (основанную на векторе РОТ-типа (G.Kawasaki and L. Bell, US patent 4931373), срав. Фиг. 8). Фрагмент Sph-Xba1 1,1 т.п., содержащий кодирующий район для 212spx3-TFP11-161-117C Gln, выделяли и клонировали в плазмиду pYЕS21, полученную из коммерчески доступного (stratagene) вектора рYЕS2.О (срав. фиг. 8). Эта плазмида содержит последовательность 2m для репликации в дрожжах, дрожжевой ген URA3 для отбора плазмиды в URA3 штаммах, ген bлактамазы для отбора в E.coli, ColE1 начало репликации для репликации в E.coli, 1 начало ("ориджин") для извлечения одноцепочечной ДНК-плазмиды из сверхинфицированных штаммов E. coli и дрожжевой CYCl терминатор транскрипции. Фрагмент Sph1-Xba1 клонировали в pYES 2.0 впереди CYCl терминатора. Полученную плазмиду pYES-212TFP1161–1170 (ср. фиг. 9) расщепляли при помощи Pfl M1 и EcoR1 для удаления кодирующего района для сигнального пептида амилазы слюны мышей, который заменяли двухцепочечной синтетической олигонуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид УАР3: MHJ 1131: 5' AAT TCA AAC TAA AAA ATG AAG CTT AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCG CAG GTC CTA GGT CAA CCA GTC A (SEQ 1D N : 23). MHJ: 1132 5' CTG GTT GAC CTA GGA CCT GCG ATG CAA AGA GTG ACG AAA GGA CCG CAG ATC TTA CAG TTT TAA GCT TCA TTT TTT AGT TTG (SEQ 1D N: 24) Таким образом получили плазмиду pYESукTFP1161–117Q (ср. фиг. 8В и фиг.9). Плазмиды pYES-212TFP1161-117Q и pYESукTFP1161-117Q трансформировали в гаплоидный штамм дрожжей YNG318 (MATa nr a3-52-Leu2-D2 pep4-D1 his 4-539 [cir+]. Отбор плазмид выполняли для Ura + клеток. Выделенные трансформанты выращивали в 50 мл синтетической полной среды без урацила (SC–URa) в течение 3 дней при 30оС. После измерения плотности клеток (OD6Oo) культуры центрифугировали и полученные супернатанты анализировали на уровень секретируемой FXa/TF/FV 11a-зависимой хромогенной TFP1-активности (P.M. Sandset et al. Thromb. Res. 47, 1987, pp. 389–400). Средняя активность, измеренная для супернатантов штаммов, содержащих плазмиду pYES-212TFP1161-117Q (т.е. плазмиду, содержащую сигнальную последовательность амилазы слюны мышей), была 0,65 Е/мл OD. Средняя активность, измеренная для супернатантов от штаммов, содержащих плазмиду yYE-укTFP1161-117Q, была 1,00 Е/ми OD. 7 40625 ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (В) ЭВМ: совместимая с ІВМ РС (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РСDOS/MS-DOS (D) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25 (ЕРО) Инфоpмация для SEQ ID № 1: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 63 к.п. (комплементаpные паpы) Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Типология: линейная Тип молекулы: кДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: S. cirivisiae Описание посл-ти: SEQ ID № 1: (1) ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ: (i) ЗАЯВИТЕЛЬ: (А) ИМЯ: (В) УЛИЦА (С) ГОРОД: (Е) СТРАНА: (F) ПОЧТОВЫЙ КОД: (G) ТЕЛЕФОН: (Н) ТЕЛЕФАКС: (ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Констpукция ДНК, кодиpующая сигнальный пептид YАPЗ (iii) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 24 (iv) МАШИНОЧИТАЕМОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ (А) ТИП НОСИТЕЛЯ: гибкий дискк ATGAAACTGA AAACTGTAAG ATCTGCGGTC CTTTCGTCAC TCTTTGCATC TCAGGTCCTT GGC Инфоpмация для SEQ ID № 2: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 476 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Типология: линейная Тип молекулы: кДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Пpизнак: Имя/ключ: CDS Местоположение:81...452 Пpизнак: Имя/ключ: sig.peptide Местоположение:81...293 Пpизнак: Имя/ключ: mat. peptide Местоположение: 294...452 Описание посл-ти: SEQ ID № 2: 8 63 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 3: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 124 аминокислоты Тип: аминокислота Топология: линейная Тип молекулы: белок Описание: посл-ти: SEQ ID № 3: Инфоpмация для SEQ ID № 4: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 450 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Пpизнак: Имя/ключ: CDS Местоположение: 76...441 Пpизнак: Имя/ключ: sig-peptide Местоположение: 76...267 Пpизнак: Имя/ключ: mat-peptide Местоположение: 268...441 Описание посл-ти: SEQ ID № 4: 9 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 5: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 122 аминокислоты Тип: аминокислота Топология: линейная Тип молекулы: белок Описание посл-ти: SEQ ID № 5: Инфоpмация для SEQ ID № 6: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 470 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Типология: линейная Тип молекулы: ДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Пpизнак: Имя/ключ: CDS Местоположение:81...461 Пpизнак: Имя/ключ: sig- peptide Местоположение: 81...287 Пpизнак: Имя/ключ: mat-peptide Местоположение: 288...461 Описание посл-ти: SEQ ID № 6: 10 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 7: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 127 аминокислот Тип: аминокислота Топология: линейная Тип молекулы: белок Описание: посл-ти: SEQ ID № 7: 11 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 8: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 923 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: кДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: Homo sapiens Пpизнак: Имя/ключ: CDS Местоположение: 8...919 Пpизнак: Имя/ключ: sig-peptide Местоположение: 8...91 Пpизнак: Имя/ключ: mat-peptide Местоположение: 92...919 Описание посл-ти: SEQ ID № 8: 12 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 9: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 304 аминокислоты Тип: аминокислота Топология: линейная Тип молекулы: белок Описание: посл-ти: SEQ ID № 9: 13 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 10: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 234 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Пpизнак: Имя/ключ: CDS Местоположение: 76...234 Пpизнак: Имя/ключ: sig-peptide Местоположение: 76...222 Пpизнак: Имя/ключ: mat-peptide Местоположение: 223...234 Описание посл-ти: SEQ ID № 10: Инфоpмация для SEQ ID № 11: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 53 аминокислоты Тип: аминокислота Топология: линейная Тип молекулы белок Описание: посл-ти: SEQ ID № 11: Agr Asp Ser Glu Glu 14 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 12: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 190 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Пpизнак: Имя/ключ: CDS Местоположение: 17...190 Пpизнак: Имя/ключ: sig-peptide Местоположение: 17...178 Пpизнак: Имя/ключ: mat-peptide Местоположение: 179...190 Описание посл-ти: SEQ ID № 12: Инфоpмация для SEQ ID № 13: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 58 аминокислот Тип: аминокислота Топология: линейная Тип молекулы: белок Описание посл-ти: SEQ ID № 13: Инфоpмация для SEQ ID № 14: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 27 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Гипотетическая: нет Антисмысловая: нет Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание: посл-ти: SEQ ID № 14: ATTTGCTGCC ATGGTACTTT CAGAAGG Инфоpмация для SEQ ID № 15: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 60 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 15: Инфоpмация для SEQ ID № 16: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 62 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание: посл-ти: SEQ ID № 16: 15 40625 Инфоpмация для SEQ ID № 17: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 87 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 17: Инфоpмация для SEQ ID № 18: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 87 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 18: Инфоpмация для SEQ ID № 19: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 9 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 19: Инфоpмация для SEQ ID № 20: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 10 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 20: Инфоpмация для SEQ ID № 21: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 28 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 21: Инфоpмация для SEQ ID № 22: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 28 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 22: Инфоpмация для SEQ ID № 23: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 88 к.п. Тип: нуклеиновая кислота 16 40625 Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 23: Инфоpмация для SEQ ID № 24: Хаpактеpистики последовательности: Длина: 81 к.п. Тип: нуклеиновая кислота Количество цепей: одна Топология: линейная Тип молекулы: ДНК Пеpвоначальный источник: Оpганизм: синтетический Описание посл-ти: SEQ ID № 24: Фиг. 1а 17 40625 Фиг. 1b Фиг. 1c 18 40625 Фиг. 2 Фиг. 3 19 40625 Фиг. 4 20 40625 Фиг. 5a 21 40625 Фиг. 5b 22 40625 Фиг. 6 23 40625 Фиг. 7 24 40625 Фиг. 8 25 40625 Фиг. 9 26 40625 Фиг. 10 27 40625 Фиг. 11 28 40625 Фиг. 12 29 40625 Фиг. 13 30