Cx3cr1-зв’язуючий поліпептид

Реферат: Винахід стосується поліпептиду, що містить анти-CX3CR1 (анти-CX3 хемокіновий рецептор 1) імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, де зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен складається по суті з чотирьох каркасних ділянок (FR1, FR2, FR3 і FR4) і трьох гіперваріабельних ділянок (CDR1, CDR2 і CDR3); нуклеїнових кислот, що кодують зазначений поліпептид; способу одержання зазначеного поліпептиду; клітини-хазяїна, яка експресує або має здатність експресувати зазначений поліпептид; композиції, що містить зазначений поліпептид; і застосування зазначеного поліпептиду або зазначеної композиції для профілактики, лікування та діагностики захворювання, порушення або стану, асоційованого з CX3CR1. UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься до винахід Даний винахід відноситься до CX3CR1-зв’язуючих поліпептидів, зокрема, поліпептидів, які містять специфічні імуноглобулінові домени. Винахід також відноситься до нуклеїнових кислот, які кодують зазначені поліпептиди; способів одержання зазначених поліпептидів; клітин-хазяїв, які експресують або мають здатність експресувати зазначені поліпептиди; композицій, які містять зазначені поліпептиди; і застосувань зазначених поліпептидів або зазначених композицій, зокрема, для профілактичних, терапевтичних і діагностичних цілей. Передумови створення винаходу CX3CR1 являє собою спряжений з G-білком інтегральний мембранний білок, який є хемокіновим рецептором. Він експресується головним чином на таких клітинних типах, як моноцити, дендритні клітини і Т-клітини, які асоційовані з ініціацією та розвитком атеросклеротичних бляшок. На моноцитах має місце його підвищувальна регуляція за допомогою окиснених ліпідів, і він опосередковує міграцію зазначених клітин в бляшки і їх виживання всередині бляшок. Його унікальний ліганд фракталкін (FKN) експресується на поверхні судинних ендотеліальних і гладком’язових клітин в ділянках пошкоджень, в яких він модулює адгезію лейкоцитів. В результаті протеолітичного розщеплення фракталкін вивільняється також в кровотік, де він функціонує як хемотаксичний агент. Встановлено, що у людей варіант CX3CR1 (V249I/T280M) зі зниженою активністю асоційований з більш низьким ризиком серцево-судинного захворювання (коронарна хвороба серця, цереброваскулярна хвороба або захворювання периферійних судин) (McDermott, Circ Res 89, 2001, с. 401), захворювання коронарної артерії (ангіографічний прояв стенозу) (McDermott, J. Clin. Invest. 111, 2003, с. 1241) і оклюзивного захворювання сонної артерії (Ghilardi, Stroke 35, 2004, с. 1276). CX3CR1 локалізується спільно з фракталкіном, що проявляється за посиленим імунозабарвленням поліклональними антитілами в атеросклеротичних бляшках (Wong, Cardiovasc. Path. 11, 2002, с.332). В ділянках артерій, в яких відсутні бляшки, не виявлено ніякого забарвлення фракталкіну. У декількох незалежних проведених на мишах генетичних дослідженнях продемонстрована сприятлива дія дефіциту CX3CR1 на атеросклероз. Більш низькі рівні пошкоджень дуги аорти і черевної аорти, а також зниження накопичення моницитів/макрофагів в бляшках виявлено в -/-/дослідах на двох незалежно виведених лініях мишей CX3CR1 apoE , що вирощені на кормі з високим вмістом жиру (Combadière, Circulation, 107, 2003, с. 1009; Lesnik, J. Clin. Invest. 111, 2003, с. 333). Встановлено, що CX3CR1 приймає участь у серцево-судинних захворюваннях, і модуляція його активності може являти собою перспективну терапію. Тому існує необхідність в молекулах, що є антагоністами CX3CR1, які мають сприятливі фармакологічні властивості, які можна застосовувати як терапевтичні агенти для лікування захворювань, зокрема, серцево-судинних захворювань, у людей. Таким чином, однією із задач, покладених в основу даного винаходу, було розробити молекули, які мають антагоністичну активність щодо CX3CR1 (анти-CX3CR1 антагоністичні молекули), зокрема, молекули, які мають антагоністичну активність щодо CX3CR1, для яких характерна висока афінність зв’язування з CX3CR1. Іншою задачею, покладеною в основу даного винаходу, було розробити молекули, які мають антагоністичну активність щодо CX3CR1, які є високо специфічними щодо CX3CR1. Ще однією задачею, покладеною в основу даного винаходу, було розробити антагоністи CX3CR1, які мають високу активність. Іншою задачею, покладеною в основу даного винаходу, було розробити антагоністи CX3CR1, які мають сприятливі біодоступність і час напівжиття. Ще однією задачею, покладеною в основу даного винаходу, було розробити антагоністи CX3CR1, які мають сприятливі біофізичні властивості. Як інші задачі даного винаходу розглядали комбінації, що включають будь-які з зазначених вище задач. Стислий виклад суті винаходу Даний винахід відноситься до поліпептидів, які зв’язуються з людським CX3CR1 і мають здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. В одному з об’єктів винаходу поліпептид являє собою імуноглобулін, який містить антигензв’язуючий домен, що містить три гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3, де зазначений імуноглобулін зв’язується з людським CX3CR1 і має здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. Відповідно до наступного об’єкта винаходу поліпептид містить один або декілька анти-CX3CR1 імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, де зазначений поліпептид має здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським 1 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CX3CR1. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, відрізняється однією або декількома наступними властивостями: • зв’язується з високою афінністю з людським CX3CR1; • блокує зв’язування розчинного фракталкіну з людським CX3CR1; • інгібує індукований фракталкіном хемотаксис; • інгібує індуковану фракталкіном інтерналізацію рецептора CX3CR1; • має перехресну реактивність з CX3CR1 мавп ціномолгус (cyno), при цьому величина E/IC50, що характеризує зв’язування і функціональне інгібування людського CX3CR1, в 10 разів перевищує відповідну величину для cynoCX3CR1. Відповідно до наступного об’єкта винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен і додатково містить фрагмент, що подовжує час напівжиття, наприклад, альбумінзв’язуючий фрагмент, молекулу поліетиленгліколю або Fc-домен. Відповідно до наступного об’єкта винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить два або більшу кількість анти-CX3CR1 імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів. В одному з об’єктів винаходу два антиCX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени зв’язані ковалентно через лінкерний пептид. В одному з об’єктів винаходу два анти-CX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени в поліпептиді, пропонованому в даному винаході, мають однакову амінокислотну послідовність. В іншому об’єкті винаходу два анти-CX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени в поліпептиді, пропонованому в даному винаході, мають різні амінокислотні послідовності. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить два анти-CX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени і додатково містить фрагмент, що подовжує час напівжиття, наприклад, альбумінзв’язуючий фрагмент, молекулу поліетиленгліколю або Fc-домен. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить перший анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, ковалентно зв’язаний з альбумінзв’язуючим фрагментом за допомогою першого лінкерного пептиду, де зазначений альбумінзв’язуючий фрагмент додатково ковалентно зв’язаний з іншим анти-CX3CR1 імуноглобуліновим одиничним варіабельним доменом за допомогою іншого лінкерного пептиду. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить антиCX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, ковалентно зв’язаний з Fcдоменом за допомогою лінкерного пептиду. В одному з об’єктів винаходу зазначений поліпептид, що містить анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, ковалентно зв’язаний з Fc-доменом за допомогою лінкерного пептиду, має форму димеру, наприклад, зв’язаного дисульфідними містками. Поліпептиди, пропоновані в даному винаході, застосовують для лікування, полегшення і/або діагностування асоційованих з CX3CR1 захворювань, порушень або станів, зокрема, серцевосудинних захворювань, таких як атеросклероз. Наступним об’єктом даного винаходу є: Варіант здійснення винаходу 1: Імуноглобулін, що містить антигензв’язуючий домен, який містить три гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3, де зазначений імуноглобулін зв’язується з людським CX3CR1 і має здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. Варіант здійснення винаходу 2: Поліпептид, що містить один або декілька анти-CX3CR1 імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, де зазначений поліпептид має здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. Варіант здійснення винаходу 3: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 2, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен практично складається з чотирьох каркасних ділянок (FR1, FR2, FR3 і FR4) і трьох гіперваріабельних ділянок (CDR1, CDR2 і CDR3). Варіант здійснення винаходу 4: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 3, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен має структуру FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Варіант здійснення винаходу 5: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-4, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою домен антитіла. Варіант здійснення винаходу 6: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 5, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VH, VL, VHH, камелізований VH, або VHH, який є оптимізованим щодо стабільності, ефективності, 2 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 технологічності і/або схожості з людськими каркасними ділянками. Варіант здійснення винаходу 7: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-6, де зазначений поліпептид має афінність до людського CX3CR1, що характеризується: а) величиною EC50, яка більш низька або дорівнює 10нM, більш низька або дорівнює 5нM, більш низька або дорівнює 2,5нM, або більш низька або дорівнює 1нM, за даними, отриманими шляхом аналізу клітинного зв’язування за допомогою FACS; або б) величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 10нM, більш низька або дорівнює 5нM, більш низька або дорівнює 2,5нM, або більш низька або дорівнює 1нM, за даними, отриманими за допомогою FACS в умовах конкуренції. Варіант здійснення винаходу 8: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-7, де зазначений поліпептид блокує зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1, що характеризується величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 300нM, або більш низька або дорівнює 100нM, або більш низька або дорівнює 20нM, або більш низька або дорівнює 10нM, або більш низька або дорівнює 5нM, або більш низька або дорівнює 2,5нM, або більш низька або дорівнює 1нM. Варіант здійснення винаходу 9: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-8, де зазначений поліпептид інгібує індукований фракталкіном хемотаксис, опосередкований людським CX3CR1, що характеризується величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 500нM, або більш низька або дорівнює 100нM, або більш низька або дорівнює 75нM, або більш низька або дорівнює 50нM, або більш низька або дорівнює 10нM, або більш низька або дорівнює 5нM. Варіант здійснення винаходу 10: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-9, де зазначений поліпептид інгібує інтерналізацію фракталкіну, опосередковану людським CX3CR1, що характеризується величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 10нМ, або більш низька або дорівнює 5нM, або більш низька або дорівнює 1нM. Варіант здійснення винаходу 11: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-10, в якому зазначений CDR3 має амінокислотну послідовність Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 197), в якій: - Xaa1 означає Pro, Ala або Gly; - Xaa2 означає Asp або Asn; - Xaa3 означає Thr або Ser; - Xaa4 означає Arg, Lys, Ala або Gly; і - Xaa5 означає Tyr або Phe. Варіант здійснення винаходу 12: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-11, в якому: a) - Xaa1 означає Pro, Ala або Gly; - Xaa2 означає Asp або Asn; - Xaa3 означає Thr; - Xaa4 означає Arg або Lys; і - Xaa5 означає Tyr, і/або б) в якому зазначений CDR3 вибраний з будь-якої з SEQ ID NО: 186-190. Варіант здійснення винаходу 13: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-12, в якому зазначений CDR3 має амінокислотну послідовність Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-ThrArg-Tyr (SEQ ID NO: 186). Варіант здійснення винаходу 14: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-10, в якому: I) зазначений CDR1: а) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 141; б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 80% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 141; в) має амінокислотну послідовність, яка має 2 або 1 амінокислотні(-ну) відмінності(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 141, в якій - в положенні 2 S замінений на T або G; - в положенні 6 S замінений на R; - положенні 7 N замінений на T; і/або - в положенні 9 M замінений на K; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 141-145 і 213; II) CDR2: 3 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 а) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 164; б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 70% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 164; в) має амінокислотну послідовність, яка має 4, 3, 2 або 1 амінокислотні(-ну) відмінності(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 164, в якій - в положенні 1 G замінений на A, L, V або S; - в положенні 3 N замінений на D, S, Q, G або T; - в положенні 4 S замінений на T, K, G або P; - в положенні 5 V замінений на A; - в положенні 6 G замінений D; - в положенні 7 I замінений на T або V; - вположенні 8 T замінений на A; і/або - в положенні 9 K замінений на R; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 162-175 і 214221; і III) зазначений CDR3: а) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 186; б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 70% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 186; в) має амінокислотну послідовність, яка має 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 186, в якій - в положенні 2 P замінений на A або G; - в положенні 7 D замінений на N; і/або - в положенні 9 R замінений на K; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 186-190. Варіант здійснення винаходу 15: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-10, в якому I) зазначений CDR1 має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 146; II) зазначений CDR2 має амінокислотну послідовність, яка а) принаймні на 90% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 176 або б) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 176 або 177; і III) зазначений CDR3 має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 191. Варіант здійснення винаходу 16: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-10, в якому I) зазначений CDR1: а) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 147; або б) має амінокислотну послідовність, яка має 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 147, в якій - в положенні 1 G замінений на K, R або A; - в положенні 2 T замінений на I, P, S або L; - в положенні 3 I замінений на V або T; - в положенні 4 F замінений на L; - в положенні 5 S замінений на R або D; - в положенні 6 N замінений на S, T або D; і/або - в положенні 7 N замінений на T або Y; або в) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 147-161; II) зазначений CDR2: а) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 179; або б) має амінокислотну послідовність, яка має 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 179, в якій - в положенні 3 S замінений на T або G; - в положенні 4 N замінений на S або I; - в положенні 5 S замінений на T; - в положенні 6 G замінений на Y; і/або - в положенні 8 T замінений на A; або в) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 178-185; і III) зазначений CDR3: а) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 192; або б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 80% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 192; або 4 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в) має амінокислотну послідовність, яка має 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 192, в якій - в положенні 2 A замінений на G; - в положенні 8 T замінений на S; - в положенні 9 A замінений на G; і/або - в положенні 10 Y замінений на F; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 192-196. Варіант здійснення винаходу 17: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 3, в якому амінокислотні послідовності зазначених CDR1, CDR2 і CDR3 представлені в: - SEQ ID NО: 141, 162 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 163 і 187 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 164 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 166 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 167 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 167 і 189 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 168 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 168 і 187 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 169 і 190 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 170 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 171 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 174 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 175 і 187 відповідно; або - SEQ ID NО: 142, 165 і 188 відповідно; або - SEQ ID NО: 142, 173 і 188 відповідно; або - SEQ ID NО: 143, 164 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 144, 172 і 187 відповідно; або - SEQ ID NО: 145, 172 і 187 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 214 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 215 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 216 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 217 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 218 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 219 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 220 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 213, 221 і 186 відповідно; або - SEQ ID NО: 213, 214 і 186 відповідно. Варіант здійснення винаходу 18: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 3, в якому амінокислотні послідовності зазначених CDR1, CDR2 і CDR3 представлені в: - SEQ ID NО: 146, 176 і 191, відповідно; або - SEQ ID NО: 146, 177 і 191, відповідно. Варіант здійснення винаходу 19: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 3, в якому амінокислотні послідовності зазначених CDR1, CDR2 і CDR3 представлені в: - SEQ ID NО: 147, 178 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 147, 179 і 192, відповідно; або - SEQ ID NО: 147, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 148, 179 і 193 відповідно; або - SEQ ID NО: 149, 179 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 149, 180 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 149, 181 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 149, 183 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 149, 185 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 150, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 150, 182 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 151, 179 і 193 відповідно; або - SEQ ID NО: 151, 182 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 151, 184 і196 відповідно; або - SEQ ID NО: 152, 179 і 195 відповідно; або - SEQ ID NО: 153, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 154, 182 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 155, 179 і 195 відповідно; або 5 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - SEQ ID NО: 156, 181 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 157, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 158, 179 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 159, 178 і 192 відповідно; або - SEQ ID NО: 160, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NО: 161, 179 і 194 відповідно. Варіант здійснення винаходу 20: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 3, в якому амінокислотні послідовності зазначених CDR1, CDR2 і CDR3 представлені в: SEQ ID NO: 141, 164 і 186 відповідно або SEQ ID NO: 141, 162 і 186 відповідно. Варіант здійснення винаходу 21: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 3, в якому амінокислотні послідовності зазначених CDR1, CDR2 і CDR3 представлені в: SEQ ID NO: 213, 214 і 186 відповідно або SEQ ID NO: 141, 162 і 186 відповідно. Варіант здійснення винаходу 22: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-10, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHH-домен, який містить такі послідовності, як: а) амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 3; б) амінокислотна послідовність, яка принаймні на 90% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 3; в) амінокислотна послідовність, яка має 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 3; або г) амінокислотна послідовність, представлена в будь-якій одній з SEQ ID NO: 1-48, 121-140 або 222-224. Варіант здійснення винаходу 23: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-10, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHH-домен, який містить такі послідовності, як: а) амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 49; б) амінокислотна послідовність, яка принаймні на 95% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 49; в) амінокислотна послідовність, яка має 5, 4, 3,2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 49; або г) амінокислотна послідовність, представлена в будь-якій одній з SEQ ID NO: 49-52. Варіант здійснення винаходу 24: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-10, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHH-домен, який містить такі послідовності, як: а) амінокислотна послідовність SEQ ID NO: 67; б) амінокислотна послідовність, яка принаймні на 90% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 67; в) амінокислотна послідовність, яка має 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 67; або г) амінокислотна послідовність, представлена в будь-якій одній з SEQ ID NO: 53-120. Варіант здійснення винаходу 25: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 2, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 3. Варіант здійснення винаходу 26: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 2, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить послідовність, представлену в будь-якій одній з SEQ ID NO: 121-140 або SEQ ID NO: 222-224. Варіант здійснення винаходу 27: Поліпептид за одним з попередніх варіантів здійснення винаходу, який гуманізований і/або оптимізований щодо стабільності, ефективності, технологічності і/або схожості з людськими каркасними ділянками. Варіант здійснення винаходу 28: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 27, який гуманізований і/або послідовність якого оптимізована в одному або декількох з наступних положень (нумерація за Кеботом): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108. Варіант здійснення винаходу 29: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 28, що містить одну або декілька з наступних мутацій: E1D, S11L, A14P, E16G, A74S, K83R, Q108L. Варіант здійснення винаходу 30: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-29, в якому: I) FR1 вибраний з SEQ ID NO: 198-204; II) FR2 вибраний з SEQ ID NO: 205-208; III) FR3 вибраний з SEQ ID NO: 209-210; і/або IV) FR4 вибраний з SEQ ID NO: 211-212. 6 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Варіант здійснення винаходу 31: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-30, який гуманізований і/або послідовність якого оптимізована в одному або більшій кількості з наступних положень (нумерація за Кеботом): 52, 53. Варіант здійснення винаходу 32: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 31, що містить одну або більшу кількість з наступних мутацій: N52S, S53T. Варіант здійснення винаходу 33: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 3-32, в якому CDR2 вибраний з SEQ ID NO: 214-221. Варіант здійснення винаходу 34: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-33, в якому зазначений анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить послідовність, представлену в будь-якій з SEQ ID NO: 138-140 або 222-224. Варіант здійснення винаходу 35: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2226, в якому VHH-домен складається з будь-якої однієї з зазначених амінокислотних послідовностей. Варіант здійснення винаходу 36: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-35, в якому зазначений імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен перехресно блокує зв’язування принаймні одного з імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, які мають SEQ ID NO: 1-120, 121-140 і 222-224, з CX3CR1. Варіант здійснення винаходу 37: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-35, в якому зв’язування зазначеного імуноглобулінового одиничного варіабельного домену з CX3CR1 перехресно блокується принаймні однією з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 1-120, 121-140 і 222-224. Варіант здійснення винаходу 38: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-37, де поліпептид містить також фрагмент, що подовжує час напівжиття. Варіант здійснення винаходу 39: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 38, в якому фрагмент, що подовжує час напівжиття, ковалентно зв’язаний із зазначеним поліпептидом і вибраний з групи, що включає альбумінзв’язуючий фрагмент, такий як антиальбуміновий імуноглобуліновий домен, трансферинзв’язуючий фрагмент, такий як антитрансфериновий імуноглобуліновий домен, молекулу поліетиленгліколю, рекомбінантну молекулу поліетиленгліколю, людський сироватковий альбумін, фрагмент людського сироваткового альбуміну, альбумінзв’язуючий пептид або Fc-домен. Варіант здійснення винаходу 40: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 38 або 39, в якому фрагмент, що подовжує час напівжиття, складається з антиальбумінового імуноглобулінового одиничного варіабельного домену. Варіант здійснення винаходу 41: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 40, в якому імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен вибраний з VHH-домену, гуманізованого VHH-домену, камелізованого VH-домену, доменного антитіла, однодоменного антитіла і/або «dAb». Варіант здійснення винаходу 42: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 41, в якому антиальбуміновий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен вибраний з SEQ ID NO: 230-232. Варіант здійснення винаходу 43: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-39, де зазначений поліпептид зчеплений з Fc-ділянкою (такою як людська Fc, наприклад, представлена в SEQ ID NO: 252) необов’язково через прийнятний лінкер або шарнірну ділянку. Варіант здійснення винаходу 44: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-39, де зазначений поліпептид додатково зчеплений з одним або декількома константними доменами (наприклад, 2 або 3 константними доменами, які можна застосовувати як частину і/або для формування Fc-ділянки), з Fc-ділянкою і/або з однією або декількома ділянками антитіл, фрагментами або доменами, які надають одну або декілька ефекторних функцій поліпептиду, пропонованому у винаході, і/або можуть надавати здатності до зв’язування з одним або декількома Fc-рецепторами, необов’язково через прийнятний лінкер або шарнірну ділянку. Варіант здійснення винаходу 45: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 2-37, де зазначений поліпептид додатково містить другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, переважно другий анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен. Варіант здійснення винаходу 46: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 45, в якому зазначений перший і зазначений другий імуноглобулінові одиничні варіабельні домени ковалентно зв’язані за допомогою лінкерного пептиду. Варіант здійснення винаходу 47: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 45 або 46, в якому зазначений другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен практично складається з чотирьох каркасних ділянок (FR1-FR4) і трьох гіперваріабельних ділянок (CDR1 7 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR3). Варіант здійснення винаходу 48: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4547, в якому зазначений перший і зазначений другий імуноглобулінові одиничні варіабельні домени являють собою домени антитіла. Варіант здійснення винаходу 49: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4548, в якому зазначені перший і другий імуноглобулінові одиничні варіабельні домени являють собою VH, VL, VHH, камелізований VH або VHH, оптимізований щодо стабільності, ефективності, технологічності і/або схожості з людськими каркасними ділянками. Варіант здійснення винаходу 50: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4549, в якому зазначені CDR1-CDR3 зазначеного другого імуноглобулінового одиничного варіабельного домену представлені в одному із варіантів здійснення винаходу 11-21. Варіант здійснення винаходу 51: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4550, в якому зазначений перший і зазначений другий імуноглобулінові одиничні варіабельні домени містять однаковий CDR3. Варіант здійснення винаходу 52: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 51, в якому CDR3 представлений в одному із варіантів здійснення винаходу 11-13. Варіант здійснення винаходу 53: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4553, в якому зазначений перший і зазначений другий імуноглобулінові одиничні варіабельні домени містять однакові CDR1, CDR2 і CDR3. Варіант здійснення винаходу 54: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 53, в якому зазначені CDR1-CDR3 представлені в одному із варіантів здійснення винаходу 11-21. Варіант здійснення винаходу 55: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4554, в якому зазначений перший і зазначений другий імуноглобулінові одиничні варіабельні домени містять однаковий VHH-домен. Варіант здійснення винаходу 56: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4555, в якому зазначений VHH-домен представлений в одному із варіантів здійснення винаходу 22-37. Варіант здійснення винаходу 57: Поліпептид, що містить перший і імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, який містить CDR1, CDR2 і CDR3, представлені в SEQ ID NO: 141, 164 і 186 або SEQ ID NO: 141, 162 і 186, і другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, представлений в одному з варіантів здійснення винаходу 2-37. Зазначений поліпептид може являти собою, зокрема, поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 45-56. Варіант здійснення винаходу 58: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 57, в якому зазначений перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить CDR1, CDR2 і CDR3, представлені в SEQ ID NO: 213, 214 і 186, SEQ ID NO: 213, 221 і 186 або SEQ ID NO: 141, 162 і 186. Варіант здійснення винаходу 59: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 57 або 58, в якому зазначений другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить CDR1, CDR2 і CDR3, представлені в SEQ ID NO: 141, 164 і 186 або SEQ ID NO: 141, 162 і 186. Варіант здійснення винаходу 60: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 57 або 58, в якому зазначений другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен містить CDR1, CDR2 і CDR3, представлені в: SEQ ID NO: 213, 214 і 186, SEQ ID NO: 213, 221 і 186 або SEQ ID NO: 141, 162 і 186. Варіант здійснення винаходу 61: Поліпептид, що містить перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, в якому зазначений перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHH-домен, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 3, і другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен за одним з варіантів здійснення винаходу 2-37. Зазначений поліпептид може являти собою, зокрема, поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 45-60. Варіант здійснення винаходу 62: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 61, в якому зазначений перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHHдомен, що містить послідовність, представлену в будь-якій одній з SEQ ID NO: 121-140 або 222224. Варіант здійснення винаходу 63: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 61 або 62, в якому зазначений другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHHдомен, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 3. Варіант здійснення винаходу 64: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 63, в якому зазначений другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою VHH-домен, 8 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що містить послідовність, представлену в будь-якій одній з SEQ ID NO: 121-140 або 222-224. Варіант здійснення винаходу 65: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4564, де поліпептид містить додатково фрагмент, що подовжує час напівжиття. Варіант здійснення винаходу 66: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 65, в якому фрагмент, що подовжує час напівжиття, ковалентно зв’язаний із зазначеним поліпептидом і вибраний з групи, що включає альбумінзв’язуючий фрагмент, такий як антиальбуміновий імуноглобуліновий домен, трансферинзв’язуючий фрагмент, такий як антитрансфериновий імуноглобуліновий домен, молекулу поліетиленгліколю, рекомбінантну молекулу поліетиленгліколю, людський сироватковий альбумін, фрагмент людського сироваткового альбуміну, альбумінзв’язуючий пептид або Fc-домен. Варіант здійснення винаходу 67: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 66, в якому зазначенийфрагмент, що подовжує час напівжиття, складається з антиальбумінового імуноглобулінового одиничного варіабельного домену. Варіант здійснення винаходу 68: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 67, в якому імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен вибраний з VHH-домену, гуманізованого VHH-домену, камелізованого VH-домену, доменного антитіла, однодоменного антитіла і/або «dAb». Варіант здійснення винаходу 69: Поліпептид за варіантом здійснення винаходу 68, в якому антиальбуміновий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен вибраний з SEQ ID NO: 230-232. Варіант здійснення винаходу 70: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4564, де зазначений поліпептид зчеплений з Fc-ділянкою (такою як людська Fc, наприклад, представлена в SEQ ID NO: 252) необов’язково через прийнятний лінкер або шарнірну ділянку. Варіант здійснення винаходу 71: Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 4566, де зазначений поліпептид додатково зчеплений з одним або декількома константними доменами (наприклад, 2 або 3 константними доменами, які можна застосовувати як частину і/або для формування Fc-ділянки), з Fc-ділянкою і/або з однією або декількома ділянками антитіл, фрагментами або доменами, які надають одну або декілька ефекторних функцій поліпептиду, пропонованому у винаході, і/або можуть надавати здатності до зв’язування з одним або декількома Fc-рецепторами, необов’язково через прийнятний лінкер або шарнірну ділянку. Варіант здійснення винаходу 72: Поліпептид, що містить будь-яку одну з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 225-227. Варіант здійснення винаходу 73: Поліпептид, що містить будь-яку одну з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 249 або 277-281. Варіант здійснення винаходу 74: Поліпептид, що містить будь-яку одну з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 257-262. Варіант здійснення винаходу 75: Поліпептид, що містить будь-яку одну з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 253 або 254. Варіант здійснення винаходу 76: Поліпептид, що містить будь-яку одну з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 263 або 266. Варіант здійснення винаходу 77: Поліпептид, що містить будь-яку одну з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 267-276 і 282. Варіант здійснення винаходу 78: Молекула нуклеїнової кислоти, що містить ділянку, яка кодує поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77. Варіант здійснення винаходу 79: Експресійний вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за варіантом здійснення винаходу 78. Варіант здійснення винаходу 80: Клітина-хазяїн, що несе експресійний вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, де зазначена молекула нуклеїнової кислоти містить ділянку, яка кодує поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, де зазначена клітина-хазяїн має здатність експресувати поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, і де зазначена клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну або еукаріотичну клітину. Варіант здійснення винаходу 81: Фармацевтична композиція, що містить (I) як діючу речовину один або декілька із поліпептидів за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77 і (II) фармацевтично прийнятний носій, і необов’язково (III) розріджувач, ексципієнт, ад’ювант і/або стабілізатор. Варіант здійснення винаходу 82: Спосіб одержання поліпептиду за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, який полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких - культивують клітину-хазяїна в умовах, що забезпечують експресію поліпептиду за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, 9 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де зазначена клітина-хазяїн несе експресійний вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, де зазначена молекула нуклеїнової кислоти містить ділянку, яка кодує поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, і де зазначена клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну або еукаріотичну клітину; - виділяють зазначений поліпептид; і - очищають зазначений поліпептид. Варіант здійснення винаходу 83: Спосіб застосування поліпептиду за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77 для лікування, попередження або полегшення захворювання, порушення або стану, зокрема у людини. Варіант здійснення винаходу 84: Спосіб за варіантом здійснення винаходу 83, в якому зазначене захворювання, порушення або стан являє собою асоційоване з CX3CR1 захворювання, порушення або стан. Варіант здійснення винаходу 85: Спосіб за варіантом здійснення винаходу 83, в якому зазначене захворювання, порушення або стан являє собою атеросклероз. Варіант здійснення винаходу 86: Фармацевтична композиція для ін'єкції, що містить поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, де зазначену композицію можна застосовувати для внутрішньовенної або підшкірної ін’єкції людині. Варіант здійснення винаходу 87: Спосіб попередження і/або лікування захворювання або порушення, яке асоційоване з CX3CR1, який полягає в тому, що вводять індивідууму, який потребує цього, в фармацевтично активній кількості принаймні один поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1- 77. Варіант здійснення винаходу 88: Спосіб за варіантом здійснення винаходу 85, який полягає також в тому, що вводять додатковий терапевтичний засіб, вибраний з групи, що включає статин, антитромбоцитарний засіб, антикоагулянт, протидіабетичний засіб і гіпотензивний засіб. Варіант здійснення винаходу 89: Спосіб інгібування зв’язування CX3CR1 з фракталкіном в клітині ссавця, який полягає в тому, що вводять в клітину поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, інгібуючи тим самим передачу сигналів, опосередковану фракталкіном. Варіант здійснення винаходу 90: Спосіб детекції і/або кількісної оцінки рівнів CX3CR1 в біологічному зразку, який полягає в тому, що приводять у контакт зразок з поліпептидом за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77 і визначають зв’язування поліпептиду з CX3CR1. Варіант здійснення винаходу 91:Спосіб діагностування асоційованого з CX3CR1 порушення або вирішення питання про те, чи має пацієнт ризик розвитку асоційованого з CX3CR1 порушення, який полягає в тому, що приводять у контакт біологічний зразок з організму пацієнта з поліпептидом за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77 і визначають зв’язування поліпептиду з CX3CR1 для оцінювання рівня експресії або концентрації CX3CR1. Варіант здійснення винаходу 92. Поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, призначений для застосування для лікування, попередження або полегшення захворювання, порушення або стану, зокрема у людини. Варіант здійснення винаходу 93. Поліпептид, призначений для застосування відповідно до варіанту здійснення винаходу 92, де захворювання, порушення або стан являє собою асоційоване з CX3CR1 захворювання, порушення або стан. Варіант здійснення винаходу 94. Поліпептид, призначений для застосування відповідно до варіанту здійснення винаходу 92, де захворювання, порушення або стан вибирають з кардіо- і цереброваскулярних атеросклеротичних порушень, захворювання периферійних артерій, рестенозу, діабетичної нефропатії, гломерулонефриту, людського серпоподібного гломерулонефриту, IgA-нефропатії, мембранозної нефропатії, вовчакового нефриту, васкуліту, включаючи пурпуру Геноха-Шенлейна і гранулематоз Вегенера, ревматоїдного артриту, остеоартриту, відторгнення трансплантату, системного склерозу, нейродегенеративних порушень і демієлінізуючого захворювання, розсіяного склерозу (РС), хвороби Альцгеймера, легеневих захворювань, таких як ХОЗЛ, астма, нейропатичного болю, пов’язаного із запаленням болю або раку. Варіант здійснення винаходу 95. Поліпептид, призначений для застосування відповідно до варіанту здійснення винаходу 92, де захворювання, порушення або стан являє собою атеросклероз. Варіант здійснення винаходу 96. Застосування поліпептиду за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77 для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування, попередження або полегшення захворювання, порушення або стану у людини. Варіант здійснення винаходу 97. Спосіб за варіантом здійснення винаходу 87, в якому захворювання або порушення вибирають з кардіо- і цереброваскулярних атеросклеротичних 10 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порушень, захворювання периферійних артерій, рестенозу, діабетичної нефропатії, гломерулонефриту, людського серпоподібного гломерулонефриту, IgA-нефропатії, мембранозної нефропатії, вовчакового нефриту, васкуліту, включаючи пурпуру ГенохаШенлейна і гранулематоз Вегенера, ревматоїдного артриту, остеоартриту, відторгнення трансплантату, системного склерозу, нейродегенеративних порушень і демієлінізуючого захворювання, розсіяного склерозу (РС), хвороби Альцгеймера, легеневих захворювань, таких як ХОЗЛ, астма, нейропатичного болю, пов’язаного із запаленням болю або раку. Варіант здійснення винаходу 98. Спосіб за варіантом здійснення винаходу 87, в якому захворювання, порушення або стан являє собою атеросклероз. Варіант здійснення винаходу 99. Діагностичний набір або діагностичний спосіб, що включає поліпептид за одним з варіантів здійснення винаходу 1-77, або його застосування. Варіант здійснення винаходу 100. Діагностичний набір або діагностичний спосіб за варіантом здійснення винаходу 99, призначений для діагностування принаймні одного з кардіо- і цереброваскулярних атеросклеротичних порушень, захворювання периферійних артерій, рестенозу, діабетичної нефропатії, гломерулонефриту, людського серпоподібного гломерулонефриту, IgA-нефропатії, мембранозної нефропатії, вовчакового нефриту, васкуліту, включаючи пурпуру Геноха-Шенлейна і гранулематоз Вегенера, ревматоїдного артриту, остеоартриту, відторгнення трансплантату, системного склерозу, нейродегенеративних порушень і демієлінізуючого захворювання, розсіяного склерозу (РС), хвороби Альцгеймера, легеневих захворювань, таких як ХОЗЛ, астма, нейропатичного болю, пов’язаного із запаленням болю або раку. Докладний опис винаходу Визначення Зазначені вище і інші об’єкти і варіанти здійснення винаходу повинні стати очевидними після ознайомлення з додатковим описом, в якому: a) Якщо не зазначено або не визначено інше, то всі застосовувані поняття вживаються в їх звичайному значенні, прийнятому в даній галузі, яке очевидно спеціалістам в даній галузі. Як посилання можна зазначити, наприклад, стандартні керівництва, такі як Sambrook і ін., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 2-е вид., т. 1-3, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Lewin, «Genes IV», вид-во Oxford University Press, New York, 1990, і Roitt і ін., «Immunology» (2-е вид.), вид-во Gower Medical Publishing, London, New York, 1989, а також документи, що стосуються загального рівня техніки, процитовані в даному описі; крім того, якщо не вказано інше, то всі методи, стадії, процеси і маніпуляції, які не описані конкретно в деталях, можна здійснювати (і їх здійснювали) добре відомими методами, що має бути очевидно спеціалісту в даній галузі. І в цьому випадку також як посилання можна, наприклад, зазначити відомі керівництва, відомості, що стосуються загального рівня техніки, зазначені вище, і додаткові процитовані в них посилання. б) Якщо не вказано інше, то поняття «імуноглобулін» і «послідовність імуноглобуліну», якщо їх використовують в контексті даного опису стосовно антитіла, що складається тільки з важких ланцюгів, або канонічного антитіла, що складається з 4 ланцюгів, застосовують як загальні поняття, які включають повнорозмірне антитіло, його індивідуальні ланцюги, а також всі його ділянки, домени або фрагменти (включаючи (але, не обмежуючись лише ними) антигензв’язуючі домени або фрагменти, такі як VHH-домени або VH/VL-домени відповідно). Крім того, поняття «послідовність» в контексті даного опису (наприклад, в поняттях типу «послідовність імуноглобуліну», «послідовність антитіла» «послідовність (одиничного) варіабельного домену, «послідовність VHH» або «послідовність білка»), як це звичайно прийнято, відноситься як до відповідних амінокислотних послідовностей, так і до послідовностей нуклеїнових кислот або нуклеотидних послідовностей, які їх кодують, якщо з контексту не випливає більш обмежена інтерпретація. в) Поняття «домен (ділянка)» (поліпептиду або білка) в контексті даного опису відноситься до складчастої білкової структури, яка має здатність зберігати свою третинну структуру, незалежно від решти білка. Як правило, домени відповідають за окремі функціональні властивості білків і у багатьох випадках їх можна додавати, видаляти або переносити в інші білки без втрати функції частини білка і/або домену, що залишилася. г) Поняття «імуноглобуліновий домен» в контексті даного опису відноситься до глобулярної ділянки ланцюга антитіла (такої, наприклад, як ланцюг канонічного антитіла, що складається з 4 ланцюгів, або що складається з важких ланцюгів антитіла) або до поліпептиду, який складається практично з зазначеної глобулярної ділянки. Імуноглобулінові домени відрізняються тим, що вони зберігають притаманну імуноглобуліну складчасту структуру молекул антитіла, яка являє собою 2-шаровий «сендвіч», що складається приблизно з 7 11 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антипаралельних бета-ланцюгів, що утворюють дві бета-складки, необов’язково стабілізовані за допомогою консервативного дисульфідного містка. д) Поняття «імуноглобуліновий варіабельний домен» в контексті даного опису відноситься до імуноглобулінового домену, що складається практично з чотирьох «каркасних ділянок», як вони визначені в даній галузі, і позначені нижче як «каркасна ділянка 1» або «FR1»; «каркасна ділянка 2» або «FR2»; «каркасна ділянка 3» або «FR3» і «каркасна ділянка 4» або «FR4» відповідно; зазначені каркасні ділянки перемежовуються трьома «гіперваріабельними ділянками», або «CDR», як вони визначені в даній галузі, і позначені нижче як «гіперваріабельна ділянка 1» або «CDR1»; «гіперваріабельна ділянка 2» або «CDR2» і «гіперваріабельна ділянка 3» або «CDR3» відповідно. Таким чином, загальну структуру або послідовність варіабельного домену імуноглобуліну можна позначати як: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Саме варіабельний(і) домен(и) імуноглобуліну надає(ють) специфічність антитілу щодо антигену, оскільки він(вони) несуть антигензв’язуючий центр. е) Поняття «імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен» і «одиничний варіабельний домен» в контексті даного опису відноситься до імуноглобулінового варіабельного домену, який має здатність специфічно зв’язуватися з епітопом антигену без спарювання із додатковим імуноглобуліновим варіабельним доменом. Одним із прикладів імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів відповідно до даного винаходу є «доменні антитіла», такі як одиничні варіабельні домени VH і VL (VH-домени і VL-домени). Іншим прикладом імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів є «VHH-домени» (або просто «VHH») з представників верблюдових, як зазначено нижче в даному описі. У світлі вищезазначених визначень антигензв’язуючий домен канонічного антитіла, що складається з 4 ланцюгів (такого як молекула IgG, IgM, IgA, IgD або IgE; відома в даній галузі) або Fab-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента, такого як зв’язаний дисульфідним містком Fv або scFv-фрагмент, або димерного антитіла (діабоді) (які всі відомі в даній галузі), виведений з зазначеного канонічного антитіла, що складається з 4 ланцюгів, не слід розглядати як імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, оскільки в цих випадках зв’язування з відповідним епітопом антигену в нормі не може здійснюватися за допомогою одного (одиничного) імуноглобулінового домену, а має відбуватися за допомогою спарювання (асоціації) імуноглобулінових доменів, таких як варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів, тобто за допомогою пари VH-VL імуноглобулінових доменів, які спільно зв’язуються з епітопом відповідного антигену. е1) «VHH-домени», які позначають також як VHH, VHH-домени, фрагменти VHH-антитіла і VHH-антитіла, вперше були описані як антигензв’язуючі імуноглобулінові (варіабельні) домени «антитіл, що складаються з важких ланцюгів» (тобто «антитіл, в яких відсутні легкі ланцюги», Hamers-Casterman C., Atarhouch T, Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. в: «Naturally occurring antibodies devoid of light chains»; Nature 363, 1993, сс. 446-448). Поняття «VHH-домен» було вибрано для того, щоби можна було відрізняти ці варіабельні домени від варіабельних доменів важких ланцюгів, які присутні в канонічних антитілах, що складаються з 4 ланцюгів (вони позначені далі як «V H-домени (ділянки)» або «VHдомени (ділянки)») та від варіабельних доменів легких ланцюгів, які присутні в канонічних антитілах, що складаються з 4 ланцюгів (вони позначені далі як «VL-домени (ділянки)» або «VLдомени (ділянки)»). VHH-домени можуть специфічно зв’язуватися з епітопом без додаткового антигензв’язуючого домену (на відміну від VH- або VL-доменів в канонічному антитілі, що складається з 4 ланцюгів, в якому для розпізнавання епітопу потрібна присутність VL-домену в поєднанні з VH-доменом). VHH-домени являють собою невеликі, сильні та ефективні структури (одиниці), що розпізнають антиген, утворені одиничним імуноглобуліновим доменом. В контексті даного винаходу поняття VHH-домен, VHH, VHH-домен, фрагмент VHH-антитіла, VHH-антитіло, а також «Nanobody®» і «домен Nanobody®» («Nanobody» (нанободі) є товарним знаком компанії Ablynx N.V.; Гент, Бельгія) застосовують взаємозамінно, і вони відносяться до імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів (які мають наступну будову: FR1-CDR1FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, і які специфічно зв’язуються з епітопом, не вимагаючи присутності іншого імуноглобулінового варіабельного домену), і вони відрізняються від VH-доменів наявністю так називаних «відмітних залишків, залишків-маркерів», як вони визначені, наприклад, в WO 2009/109635, фіг. 1. Амінокислотні залишки VHH-домену нумерують згідно з загальною номенклатурою Кебота для VH-доменів («Sequence of proteins of immunological interest», вид-во US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, публікація № 91), в тому вигляді, в якому її застосовують для VHHдоменів верблюдових, наприклад, як продемонстровано на фіг. 2 у Riechmann і Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 1999, сс. 25-38. Відповідно до цієї нумерації: 12 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 FR1 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 1-30, CDR1 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 31-35, FR2 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 36-49, CDR2 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 50-65, FR3 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 66-94, CDR3 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 95-102 і FR4 містить амінокислотні залишки, які присутні в положеннях 103-113. Однак слід зазначити, що, як добре відомо для VH-доменів і для VHH-доменів, загальна кількість амінокислотних залишків в кожному CDR може варіюватися і може не відповідати загальній кількості амінокислотних залишків, зазначених в номенклатурі Кебота (тобто одне або декілька положень згідно з номенклатурою Кебота можуть бути незайнятими у фактичній послідовності, або фактична послідовність може містити більшу кількість амінокислотних залишків, ніж кількість залишків, яка повинна бути присутньою згідно з номенклатурою Кебота). Це означає, що, в цілому, нумерація за Кеботом може як відповідати, так і не відповідати фактичній нумерації амінокислотних залишків в фактичній послідовності. В даній галузі відомі альтернативні методи нумерації амінокислотних залишків VH-доменів, зазначені методи також можна застосовувати аналогічним чином до VHH-доменів. Однак, в даному описі, формулі винаходу і на кресленнях нумерація відповідає номенклатурі Кебота, і її застосовують до описаних вище VHH-доменів, якщо спеціально не вказано інше. Загальна кількість амінокислотних залишків в VHH-домені, як правило, становить від 110 до 120, частіше від 112 до 115. Однак слід зазначити, що для цілей даного винаходу можна застосовувати також як більш короткі, так і більш довгі послідовності. Інші структурні характеристики і функціональні властивості VHH-доменів і поліпептидів, що їх містять, можна узагальнити наступним чином: VHH-домени (які «створені» природою таким чином, що вони можуть функціонально зв’язуватися з антигеном без присутності або без якої-небудь взаємодії з варіабельним доменом легкого ланцюга) можуть функціонувати як одинична відносно невелика функціональна антигензв’язуюча структурна одиниця, домен або поліпептид. Це відрізняє VHHдомени від VH- і VL-доменів канонічних антитіл, що складаються з 4-ланцюгів, які самі по собі, як правило, не придатні для практичного застосування у вигляді одиничних антигензв’язуючих білків або імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, а потребують об’єднання в тій чи іншій формі для створення функціональної антигензв’язуючої одиниці (як, наприклад, фрагменти канонічних антитіл, такі як Fab-фрагменти в scFv, який складається з VH-домену, ковалентно зв’язаного з VL-доменом). Завдяки їх унікальним властивостям, застосування VHH-доменів – або індивідуально, або як частину більш великого поліпептиду – має низку важливих переваг в порівнянні з застосуванням канонічних VH- і VL-доменів, scFv або фрагментів канонічних антитіл (таких як Fab- або F(ab')2фрагменти): - тільки один домен необхідний для зв’язування антигену з високою афінністю і високою селективністю, тому відсутня як необхідність в наявності двох окремих доменів, так і необхідність у вимозі, щоби ці два домени знаходилися в правильній просторовій конформації та конфігурації (тобто необхідність у застосуванні спеціально створених лінкерів, як у випадку scFv); - VHH-домени можна експресувати з одного гена й при цьому відсутня необхідність в посттрансляційному фолдинзі або модифікації; - VHH-домени легко можна конструювати в багатовалентних і мультиспецифічних форматах (що детально обговорено нижче в даному описі); - VHH мають високу розчинність і не мають тенденції до агрегації (що має місце у випадку одержаних з антитіл мишей антигензв’язуючих доменів, описаних в Ward і ін., Nature 341, 1989, сс. 544-546)); - VHH-домени мають високу стійкість до нагрівання, рН, протеаз та інших денатуруючих агентів або умов і тому їх можна одержувати, зберігати або транспортувати без застосування охолоджуючого устаткування, що дозволяє економити витрати, час і зберігати навколишнє середовище; - VHH-домени можна легко і відносно дешево одержувати, у тому числі навіть в необхідному масштабі . Наприклад, VHH-домени і поліпептиди, що їх містять, можна одержувати з використанням ферментації мікроорганізмів (що більш докладно описано нижче) і для цієї мети не потрібне застосування експресійних систем ссавців, що має місце у випадку фрагментів канонічних антитіл; - VHH-домени є відносно невеликими (приблизно 15 кДа або в 10 разів менше, ніж 13 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 канонічний IgG) у порівнянні з канонічними антитілами, що складаються з 4 ланцюгів, і їх антигензв’язуючими фрагментами, і тому для них - характерна висока (більш висока) здатність проникати в тканини, - та їх можна вводити в більш високих дозах, ніж дози канонічних антитіл, що складаються з 4 ланцюгів, і їх антигензв’язуючих фрагментів; - VHH-домени можуть мати так називану «здатність зв’язуватися з сайтом, розташованому в ущелині (бороздці)» (у тому числі завдяки їх подовженій CDR3-петлі, на відміну від канонічних VH-доменів), і тому для них є доступними також мішені та епітопи, які не доступні для канонічних антитіл, що складаються з 4 ланцюгів, і їх антигензв’язуючих фрагментів. Методи одержання VHH-доменів, що зв’язуються з специфічним антигеном або епітопом, описані раніше, наприклад, в WO 2006/040153 і WO 2006/122786. Як детально описано в зазначених документах, VHH-домени, виведені з представників верблюдових, можна «гуманізувати» шляхом заміни одного або декількох амінокислотних залишків в амінокислотній послідовності вихідної послідовності VHH на один або декілька амінокислотних залишків, які присутні у відповідному(их) положенні(ях) в VH-домені канонічного людського антитіла, що складається з 4 ланцюгів. Гуманізований VHH-домен може містити одну або декілька повністю людських послідовностей каркасних ділянок і в ще більш конкретному варіанті здійснення винаходу може містити послідовності людських каркасних ділянок, виведені з DP-29, DP-47, DP51 або їх фрагментів необов’язково в поєднанні з JH-послідовностями, такими як JH5. е2) «Доменні антитіла», які позначають також як «Dab» або «dAb» (поняття «доменні» антитіла» і «dAb» є товарним знаком групи компаній GlaxoSmithKline), описані, наприклад, в Ward E.S. і ін. в: «Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli», Nature 341, 1989, сс. 544-546; у Holt L.J. і ін. в: «Domain antibodies: proteins for therapy», TRENDS in Biotechnology 21(11), 2003, сс. 484-490 і в WO 2003/002609. Доменні антитіла в основному відповідають VH- або VL-доменам антитіл з представників ссавців, що не відносяться до верблюдових, зокрема людських, антитіл, що складаються з 4 ланцюгів. Для надання здатності зв’язуватися з епітопом у вигляді одиничного антигензв’язуючого домену, тобто без спарювання із VL- або VH-доменом відповідно, потрібно здійснювати специфічну селекцію щодо зазначених антигензв’язуючих властивостей, наприклад, з використанням бібліотек людських послідовностей одиничних VH- або VL-доменів. Доменні антитіла подібно VHH мають молекулярну масу, що становить від приблизно 13 до приблизно 16 кДа, якщо їх виводять з повністю людських послідовностей, і вони не потребують гуманізації, наприклад, для терапевтичного застосування на людях. Також як і у випадку VHHдоменів, їх можна з успіхом експресувати також в прокаріотичних системах експресії, що призводить до істотного зниження загальної вартості виробництва. Доменні антитіла, а також VHH-домени, можна піддавати процесу дозрівання афінності шляхом інтродукції однієї або декількох змін в амінокислотну послідовність одного або декількох CDR, зазначені зміни призводять до підвищеної афінності імуноглобулінового одиничного варіабельного домену, що утворився, до відповідного антигену у порівнянні з відповідною батьківською молекулою. Молекули імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів з дозрілою афінністю, пропоновані у винаході, можна одержувати методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в Marks і ін., Biotechnology 10, 1992, сс. 779-783 або у Barbas і ін., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994, сс. 3809-3813.; Shier і ін., Gene 169, 1995, сс. 147-155; Yelton і ін., Immunol. 155, 1995, сс. 1994-2004; Jackson і ін., J. Immunol. 154(7), 1995, сс. 3310-3319 і у Hawkins і ін., J. MoI. Biol. 226(3), 1992, сс. 889-896; у K.S. Johnson і R.E. Hawkins в: «Affinity maturation of antibodies using phage display», вид-во Oxford University Press, 1996. е3) Крім того, що також має бути очевидно спеціалісту в даній галузі, можна «трансплантувати» один або декілька зазначених вище CDR в інші «каркаси», включаючи (але, не обмежуючись лише ними) людські каркаси або неімуноглобулінові каркаси. Прийнятні каркаси і методики такої трансплантації CDR відомі в даній галузі. є) Поняття «епітоп» і «антигенна детермінанта», які можна застосовувати взаємозамінно, відносяться до ділянки макромолекули, такої як поліпептид, яка розпізнається антигензв’язуючими молекулами, такими як канонічні антитіла або поліпептиди, пропоновані у винаході, і більш конкретно антигензв’язуючими центрами зазначених молекул. Епітопи являють собою мінімальний сайт зв’язування для імуноглобуліну і тому являють собою специфічну мішень для імуноглобуліну. Частину антигензв’язуючої молекули (такої як канонічне антитіло або поліпептид, пропонований у винаході), яка розпізнає епітоп, називають паратопом. ж) Поняття «біпараптопну» (антиген)зв’язуюча молекула або «біпараптопний поліпептид» в 14 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контексті даного опису означає поліпептид, який містить перший імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен і другий імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, як вони визначені в даному описі, при цьому два зазначених варіабельних домени мають здатність зв’язуватися з двома різними епітопами одного антигену, при цьому, зазначені епітопи в нормі не зв’язуються одночасно одним моноспецифічним імуноглобуліном, таким, наприклад, як канонічне антитіло або один імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен. Біпараптопні поліпептиди можуть складатися з варіабельних доменів, які мають різні енпітопні специфічності, і не містять загальні пари комплементарних варіабельних доменів, які зв’язуються з одним і тим же епітопом. Отже, два варіабельні домени не конкурують один з одним за зв’язування з мішенню. з) Вважається, що поліпептид (такий як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, поліпептид, пропонований у винаході, або в цілому антигензв’язуюча молекула або її фрагмент), який може «зв’язуватися з» або «специфічно зв’язуватися з», має «афінність до» і/або «специфічність до» визначеного епітопу, антигену або білка (або принаймні однієї його ділянки, фрагменту або епітопу), «діє проти» або є «спрямованим проти» зазначеного спрямованим епітопу, антигену або білка, або є «зв’язуючою» молекулой щодо зазначеного епітопу, антигену або білка або, як говорять, є «анти»-епітопним, «анти»-антигенним або «анти»-білковим (наприклад, анти-CX3CR1). и) Як правило, поняття «специфічність» відноситься до ряду антигенів або епітопів різних типів, з якими конкретна антигензв’язуюча молекула або антигензв’язуючий білок (такий як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен або поліпептид, пропонований у винаході) може зв’язуватися. Специфічність антигензв’язуючого білка можна визначати на основі його афінності і/або авідності. Афінність, яка характеризується константою рівноваги реакції дисоціації комплексу антиген: антигензв’язуючий білок (KD), є мірою сили зв’язування між епітопом і антигензв’язуючим центром антигензв’язуючого білка: чим менше величина KD, тим вище сила зв’язування між епітопом і антигензв’язуючою молекулою (альтернативно цьому, афінність можна виражати у вигляді константи афінності (KA), яка являє собою 1/KD). Як має бути очевидно спеціалісту в даній галузі (наприклад, після ознайомлення з представленим нижче описом), афінність можна визначати добре відомим методом залежно від специфічності антигену, що становить інтерес. Авідність являє собою міру сили зв’язування між антигензв’язуючою молекулою (такою як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен або поліпептид, пропонований у винаході) і відповідним антигеном. Авідність пов’язана як з афінністю між епітопом і його антигензв’язуючим центром антигензв’язуючої молекули, так і з кількістю відповідних сайтів зв’язування, які присутні в антигензв’язуючій молекулі. і) Амінокислотні залишки позначають відповідно до стандартного трибуквеного або однобуквеного коду амінокислот, що добре відомо і є загальновизнаним в даній галузі. При порівнянні двох амінокислотних послідовностей поняття «амінокислотна відмінність (відмінність в амінокислотах)» відноситься до інсерцій, делецій або замін зазначеної кількості амінокислотних залишків у визначеному положенні референс-послідовності в порівнянні з другою послідовністю. У випадку замін(и) зазначені(а) заміни(а) переважно повинні(а) являти собою консервативні(у) амінокислотні(у) заміни(у), це означає, що амінокислотний залишок замінюють на інший амінокислотний залишок подібної хімічної будови, який має незначний вплив або практично не впливає на функцію, активність або інші біологічні властивості поліпептиду. Зазначені консервативні амінокислотні заміни добре відомі в даній галузі, наприклад, вони описані в WO 98/49185, при цьому консервативні амінокислотні заміни переважно являють собою заміни, при яких одну з амінокислот з наступних груп (I) - (V) замінюють на інший амінокислотний залишок, що входить до цієї ж групи: (I) невеликі аліфатичні неполярні залишки або залишки, що мають невисоку полярність: Ala, Ser, Thr, Pro і Gly; (II) полярні негативно заряджені залишки та їх (не заряджені) аміди: Asp, Asn, Glu і Gln; (III) полярні позитивно заряджені залишки: His, Arg і Lys; (IV) великі аліфатичні неполярні залишки: Met, Leu, Ile, Val і Cys; і (V) ароматичні залишки: Phe, Tyr і Trp. Найбільш кращими є наступні амінокислотні заміни: Ala на Gly або на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln або на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; 15 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 4045 50 55 60 Gly на Ala або на Pro; His на Asn або на Gln; Ile на Leu або на Val; Leu на Ile або на Val; Lys на Arg, на Gln або на Glu; Met на Leu, на Tyr або на Ile; Phe на Met, на Leu або на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp або на Phe; Val на Ile або на Leu. к) Молекула нуклеїнової кислоти або пептиду розглядається як «практично виділена» (знаходиться в «практично виділеній» формі), наприклад, з її нативного біологічного джерела і/або реакційного середовища або середовища для культивування, з якого її одержують, коли вона відокремлена принаймні від одного компоненту, з яким вона звичайно асоційована у зазначеному джерелі або вказаному середовищі, такого як інша нуклеїнова кислота, інший білок/поліпептид, інший біологічний компонент або макромолекула або принаймні один забруднювач, домішка або мінорний компонент. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду розглядається як «практично виділена», коли ступінь її чистоти підвищена принаймні в 2 рази, зокрема принаймні в 10 разів, більш переважно принаймні в 100 разів і аж до 1000 разів або більше. Молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду, яка знаходиться в «практично виділеній формі», переважно є практично гомогенною, що визначають за допомогою прийнятного методу, такого як прийнятний хроматографічний аналіз, електрофорез в поліакриламідному гелі. л) «Ідентичність послідовностей», наприклад, двох послідовностей імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, означає відсоток амінокислот, ідентичних для двох зазначених послідовностей. Його можна розраховувати або визначати згідно з методом, що викладений в розділі f) на с. 49 і с. 50 WO 2008/020079. «Подібність послідовностей» означає відсоток амінокислот, які або ідентичні, або являють собою консервативні амінокислотні заміни. Специфічність щодо мішені Поліпептиди, пропоновані у винаході, мають специфічність щодо людського CX3CR1. Так, поліпептиди, пропоновані у винаході, переважно зв’язуються з людським CX3CR1 (SEQ ID NO: 255). В одному з об’єктів винаходу поліпептиди, пропоновані в даному винаході, зв’язуються також з CX3CR1 мавп ціномолгус (SEQ ID NO: 256). Поліпептиди, пропоновані у винаході Винахід відноситься до нових фармацевтично активних агентів, що призначені для попередження, лікування, полегшення і/або діагностування асоційованих з CX3CR1 захворювань, порушень або станів, таких як серцево-судинні захворювання. Зокрема, винахід відноситься до поліпептидів, які зв’язуються з людським CX3CR1 і мають здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. В одному з об’єктів винаходу поліпептид являє собою імуноглобулін, що містить антигензв’язуючий домен, який містить три гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3, де зазначений імуноглобулін зв’язується з людським CX3CR1 і має здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. В кращому об’єкті винаходу поліпептид містить один або декілька анти-CX3CR1 імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів, де зазначений поліпептид має здатність блокувати зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, відрізняється однією або декількома з наступних властивостей: • зв’язується з високою афінністю з людським CX3CR1, що характеризується, наприклад, величиною EC50, яка більш низька або дорівнює 10нМ, більш низька або дорівнює 5нM, більш низька або дорівнює 2,5нM або більш низька або дорівнює 1нM, за даними, отриманими шляхом аналізу клітинного зв’язування за допомогою FACS; • блокує зв’язування людського фракталкіну з людським CX3CR1, що характеризується, наприклад, величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 300нмM, або більш низька або дорівнює 100нM, або більш низька або дорівнює 20нM, або більш низька або дорівнює 10нM, або більш низька або дорівнює 5нM, або більш низька або дорівнює 2,5нM або більш низька або дорівнює 1нM; • інгібує індукований фракталкіном хемотаксис, опосередкований людським CX3CR1, що характеризується, наприклад, величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 500нM, або більш 16 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низька або дорівнює 100нM, або більш низька або дорівнює 75нM, або більш низька або дорівнює 50нM, або більш низька або дорівнює 10нM, або більш низька або дорівнює 5нM; виявлена ефективність інгібування перевищує або дорівнює 15% або перевищує або дорівнює 50%, або перевищує або дорівнює 80%, або перевищує або дорівнює 95%; • інгібує індуковану фракталкіном інтерналізацію, опосередковану людським CX3CR1, що характеризується, наприклад, величиною IC50, яка більш низька або дорівнює 10нМ або більш низька або дорівнює 5нM; • має перехресну реактивність з CX3CR1 мавп ціномолгус (cyno), при цьому величина E/IC 50, що характеризує зв’язування і функціональне інгібування людського CX3CR1, в 10 разів перевищує відповідну величину для cynoCX3CR1. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, додатково містить фрагмент, що подовжує час напівжиття, наприклад, альбумінзв’язуючий фрагмент, молекулу поліетиленгліколю або Fc-домен. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить два або більшу кількість анти-CX3CR1 імуноглобулінових одиничних варіабельних доменів. В одному з об’єктів винаходу два анти-CX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени ковалентно зв’язані за допомогою лінкерного пептиду. В одному з об’єктів винаходу два анти-CX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени в поліпептиді, пропонованому в даному винаході, мають однакову амінокислотну послідовність. В іншому об’єкті винаходу два анти-CX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени в поліпептиді, пропонованому в даному винаході, мають різні амінокислотні послідовності. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить два антиCX3CR1 імуноглобулінові одиничні варіабельні домени і додатково містить фрагмент, що подовжує час напівжиття, наприклад, альбумінзв’язуючий фрагмент, молекулу поліетиленгліколю або Fc-домен. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить перший анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, ковалентно зв’язаний з альбумінзв’язуючим фрагментом за допомогою першого лікерного пептиду, в якому зазначений альбумінзв’язуючий фрагмент додатково ковалентно зв’язаний з іншим анти-CX3CR1 імуноглобуліновим одиничним варіабельним доменом за допомогою іншого лінкерного пептиду. В одному з об’єктів винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, містить антиCX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, ковалентно зв’язаний з Fcдоменом за допомогою лінкерного пептиду. В одному з об’єктів винаходу зазначений поліпептид, що містить анти-CX3CR1 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, ковалентно зв’язаний з Fc-доменом за допомогою лінкерного пептиду, утворює димер, наприклад, за допомогою зв’язування дисульфідними містками . Поліпептиди, пропоновані в даному винаході, одержують відповідно до викладеного нижче методу. В цілому, одиничні варіабельні домени, пропоновані в даному винаході, ідентифікували в бібліотеці, що експресує одиничні варіабельні домени (VHH), виведені з лами, імунізованої ДНК, яка кодує людський CX3CR1. Здійснювали пенінг фагової бібліотеки на вірусних ліпідних частинках, що містять hCX3CR1, і здійснювали скринінг зв’язування фагу щодо його здатності конкурувати за зв’язування з рецептором з міченим за допомогою барвника Alexa-fluor фракталкіном (AF-FKN). Репрезентативні одиничні варіабельні домени, пропоновані в даному винаході, описані більш детально нижче. В одному з об’єктів винаходу імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, практично складається з чотирьох каркасних ділянок (FR1, FR2, FR3 і FR4) і трьох гіперваріабельних ділянок (CDR1, CDR2 і CDR3). Зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен має структуру FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 FR3 - CDR3 - FR4. В одному з об’єктів винаходу імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен являє собою домен антитіла. В одному з об’єктів винаходу CDR3 поліпептиду, пропонованого в даному винаході, зокрема, імуноглобулінового одиничного варіабельного домену, пропонованого в даному винаході, має амінокислотну послідовність Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5, представлену в SEQ ID NO: 197, в якій: - Xaa1 означає Pro, Ala або Gly; - Xaa2 означає Asp або Asn; - Xaa3 означає Thr або Ser; - Xaa4 означає Arg, Lys, Ala або Gly; і - Xaa5 означає Tyr або Phe. В одному з об’єктів винаходу CDR3 поліпептиду, пропонованого в даному винаході, зокрема, імуноглобулінового одиничного варіабельного домену, пропонованого в даному винаході, має 17 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність Asp-Xaa1-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5, представлену в SEQ ID NO: 197, в якій: - Xaa1 означає Pro, Ala або Gly; - Xaa2 означає Asp або Asn; - Xaa3 означає Thr; - Xaa4 означає Arg або Lys; і - Xaa5 означає Tyr. В одному з об’єктів винаходу CDR3 поліпептиду, пропонованого в даному винаході, зокрема, імуноглобулінового одиничного варіабельного домену, пропонованого в даному винаході, має амінокислотну послідовність Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr, представлену в SEQ ID NO: 186. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має наступні CDR1, CDR2 і CDR3: CDR1: а) має амінокислотну послідовність GSIFSSNAMA (SEQ ID NO: 141); або б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 80% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 141; або в) має амінокислотну послідовність, яка має 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 141, в якій - в положенні 2 S замінений на T або G; - в положенні 6 S замінений на R; - в положенні 7 N замінений на T; і/або - в положенні 9 M замінений на K; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 141-145 і 213; CDR2: а) має амінокислотну послідовність GINSVGITK (SEQ ID NO: 164); або б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 70% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 164; або в) має амінокислотну послідовність, яка має 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 164, в якій - в положенні 1 G замінений на A, L, V або S; - в положенні 3 N замінений на D, S, Q, G або T; - в положенні 4 S замінений на T, K, G або P; - в положенні 5 V замінений на A; - в положенні 6 G замінений на D; - в положенні 7 I замінений на T або V; - в положенні 8 T замінений на A; і/або - в положенні 9 K замінений на R; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 162-175 і 214221; і CDR3: а) має амінокислотну послідовність DPRRGWDTRY (SEQ ID NO: 186); або б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 70% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 186; або в) має амінокислотну послідовність, яка має 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 186, в якій - в положенні 2 P замінений на A або G; - в положенні 7 D замінений на N; і/або - в положенні 9 R замінений на K; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 186-190. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має наступні CDR1, CDR2 і CDR3, в яких: зазначений CDR1 має амінокислотну послідовність GRTFSSYAMG (SEQ ID NO: 146); зазначений CDR2 має амінокислотну послідовність, яка a) принаймні на 90% ідентична амінокислотній послідовності GISGSASRKY (SEQ ID NO: 176), або б) має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 176 або 177; і зазначений CDR3 має амінокислотну послідовність SNSYPKVQFDY (SEQ ID NO: 191). В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, 18 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має наступні CDR1, CDR2 і CDR3: зазначений CDR1: а) має амінокислотну послідовність GTIFSNNAMG (SEQ ID NO: 147); або б) має амінокислотну послідовність, яка має 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 147, в якій - в положенні 1 G замінений на K, R або A; - в положенні 2 T замінений на I, P, S або L; - в положенні 3 I замінений на V або T; - в положенні 4 F замінений на L; - в положенні 5 S замінений на R або D; - в положенні 6 N замінений на S, T або D; і/або - в положенні 7 N замінений на T ил Y; або в) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 147-161; зазначений CDR2: а) має амінокислотну послідовність SISNSGSTN (SEQ ID NO: 179); або б) має амінокислотну послідовність, яка має 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 179, в якій - в положенні 3 S замінений на T або G; - в положенні 4 N замінений на S або I; - в положенні 5 S замінений на T; - в положенні 6 G замінений на Y; і/або - в положенні 8 T замінений на A; або в) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 178-185; і зазначений CDR3: а) має амінокислотну послідовність DARRGWNTAY (SEQ ID NO: 192); або б) має амінокислотну послідовність, яка принаймні на 80% ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 192; або в) має амінокислотну послідовність, яка має 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 192, в якій - в положенні 2 A замінений на G; - в положенні 8 T замінений на S; - в положенні 9 A замінений на G; і/або - в положенні 10 Y замінений на F; або г) має амінокислотну послідовність, вибрану з будь-якої однієї з SEQ ID NO: 192-196. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має наступні CDR1, CDR2 і CDR3: - SEQ ID NO: 141, 162 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 163 і 187 відповідно; або - SEQ ID NО: 141, 164 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 166 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 167 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 167 і 189 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 168 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 168 і 187 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 169 і 190 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 170 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 171 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 174 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 175 і 187 відповідно; або - SEQ ID NO: 142, 165 і 188 відповідно; або - SEQ ID NO: 142, 173 і 188 відповідно; або - SEQ ID NO: 143, 164 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 144, 172 і 187 відповідно; або - SEQ ID NO: 145, 172 і 187 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 214 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 215 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 216 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 217 і 186 відповідно; або 19 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 - SEQ ID NO: 141, 218 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 219 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 141, 220 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 213, 221 і 186 відповідно; або - SEQ ID NO: 213, 214 і 186 відповідно. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має наступні CDR1, CDR2 і CDR3: - SEQ ID NO: 146, 176 і 191 відповідно; або - SEQ ID NO: 146, 177 і 191 відповідно. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має наступні CDR1, CDR2 і CDR3: - SEQ ID NO: 147, 178 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 147, 179 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 147, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 148, 179 і 193 відповідно; або - SEQ ID NO: 149, 179 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 149, 180 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 149, 181 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 149, 183 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 149, 185 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 150, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 150, 182 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 151, 179 і 193 відповідно; або - SEQ ID NO: 151, 182 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 151, 184 і 196 відповідно; або - SEQ ID NO: 152, 179 і 195 відповідно; або - SEQ ID NO: 153, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 154, 182 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 155, 179 і 195 відповідно; або - SEQ ID NO: 156, 181 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 157, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 158, 179 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 159, 178 і 192 відповідно; або - SEQ ID NO: 160, 179 і 194 відповідно; або - SEQ ID NO: 161, 179 і 194 відповідно. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має CDR1, CDR2 і CDR3, представлені в: - SEQ ID NO: 141, 164 і 186; або - SEQ ID NO: 141, 162 і 186. В іншому об’єкті винаходу поліпептид, пропонований в даному винаході, зокрема, імуноглобуліновий одиничний варіабельний домен, пропонований в даному винаході, має CDR1, CDR2 і CDR3, представлені в: - SEQ ID NO: 213, 214 і 186; або - SEQ ID NO: 213, 221 і 186; або - SEQ ID NO: 141, 162 і 186. Репрезентативні поліпептиди, пропоновані в даному винаході, які мають CDR, зазначені вище, представлені в таблицях 1, 2, 3 (репрезентативні поліпептиди з сімейств 101, 9 і 13 відповідно) і в таблиці 4 (репрезентативні поліпептиди оптимізованих варіантів із сімейства 101). 20 UA 115781 C2 Таблиця 1 Сімейство 101 Нанотіло CX3CR1BII PMP66B02 CX3CR1BII PMP54A12 CX3CR1BII PMP54A3 CX3CR1BII PMP54A4 CX3CR1BII PMP54A5 CX3CR1BII PMP54A7 CX3CR1BII PMP54B1 CX3CR1BII PMP54B2 CX3CR1BII PMP54B3 CX3CR1BII PMP54B5 CX3CR1BII PMP54D5 CX3CR1BII PMP54D8 CX3CR1BII PMP54F6 CX3CR1BII PMP54G3 CX3CR1BII PMP54H1 CX3CR1BII PMP54H4 CX3CR1BII PMP61F10 CX3CR1BII PMP61D1 CX3CR1BII PMP61D5 CX3CR1BII PMP61E2 CX3CR1BII PMP61F11 CX3CR1BII PMP61G2 CX3CR1BII PMP61G3 CX3CR1BII PMP61G4 CX3CR1BII PMP61F4 CX3CR1BII PMP61A11 SEQ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 CDR1* GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GTIFSSNA MA GSIFSSNA MA GTIFSSNA MA GSIFSSNAMA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GTIFSSNA MA GSIFSSNA MA GTIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA SEQ CDR1 141 141 141 141 141 142 141 142 141 141 141 141 141 141 142 141 142 141 141 141 141 141 141 141 141 141 21 CDR2* AINSVGVT K VINSVGIT K GINSVGIT K GINSVGIT K GINSVGIT K GINSVDIT K GINSVGIT K GINSVDIT K AINSVGIT K GINSVGIT K LINSVGIT K GINSVGIT K AINSVGIT K LINSVGIT K GINSVDIT K VINSVGIT K GINSVDIT K LINSVGIT K LINSVGIT K GINSVGIT K AINSVGIT K LINSVGIT K AINSVGIT K AINSVGIT K VINTVGIT K VINSVGIT K SEQ CDR2 162 163 164 164 164 165 164 165 166 164 167 164 166 167 165 163 165 167 167 164 166 167 166 166 168 163 CDR3* DPRRGWD TRY DARRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWN TRY DPRRGWD TRY DPRRGWN TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DGRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWN TRY DARRGWD TRY DPRRGWN TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DARRGWD TRY DARRGWD TRY SEQ CDR3 186 187 186 186 186 188 186 188 186 186 189 186 186 186 188 187 188 186 186 186 186 186 186 186 187 187 UA 115781 C2 Нанотіло CX3CR1BII PMP61B2 CX3CR1BII PMP61C9 CX3CR1BII PMP65H02 CX3CR1BII PMP65E11 CX3CR1BII PMP65E10 CX3CR1BII PMP65E05 CX3CR1BII PMP65B11 CX3CR1BII PMP65B07 CX3CR1BII PMP65B09 CX3CR1BII PMP65H01 CX3CR1BII PMP65G07 CX3CR1BII PMP66H08 CX3CR1BII PMP66H04 CX3CR1BII PMP66F02 CX3CR1BII PMP66E11 CX3CR1BII PMP66D10 CX3CR1BII PMP66D08 CX3CR1BII PMP66A04 CX3CR1BII PMP66D04 CX3CR1BII PMP66D02 CX3CR1BII PMP66D06 CX3CR1BII PMP66G01 5 SEQ 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 CDR1* GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA KA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSRNA MA GGIFSRNA MA GTIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GTIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA SEQ CDR1 141 141 141 141 143 141 141 141 144 145 142 141 141 141 141 141 141 141 142 141 141 141 CDR2* VINTVGIT K LIDSAGIT K AINSVGIT K GINSVGIA K GINSVGIT K GINSVGIT K VINKVGIT K AINSVGIT K SINSVGIT K SINSVGIT K GINSVDIT R LINSVGIT K AINSVGIT K LINSVGIT K AINSVGTT K LINSVGIT K GINSVGIT K LINSVGIT K GINSVDIT K VINSVGIT K SIDSVGIT K LINSVGIT K SEQ CDR2 168 169 166 170 164 164 171 166 172 172 173 167 166 167 174 167 164 167 165 163 175 167 CDR3* DARRGWD TRY DARRGWN TKY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DARRGWD TRY DARRGWD TRY DPRRGWN TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWN TRY DARRGWD TRY DARRGWD TRY DGRRGWD TRY SEQ CDR3 187 190 186 186 186 186 186 186 187 187 188 186 186 186 186 186 186 186 188 187 187 189 *CDR-послідовності визначали відповідно до «Antibody Engineering», т. 2 під ред. Konetermann і Dübel, вид-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номери послідовностей в таблиці (SEQ) відповідають номерам послідовностей в переліку послідовностей, що додається до даної заявки. 22 UA 115781 C2 Таблиця 2 Сімейство 9 Нанотіло CX3CR1BII PMP11H11 CX3CR1BII PMP12B6 CX3CR1BII PMP12G9 CX3CR1BII PMP15G11 5 SEQ 49 50 51 52 CDR1* GRTFSSYA MG GRTFSSYA MG GRTFSSYA MG GRTFSSYA MG SEQ CDR1 146 146 146 146 CDR2* GISGSASR KY GISGSASR KY GISGSGSR KY GISGSGSR KY SEQ CDR2 176 176 177 177 CDR3* SNSYPKVQ FDY SNSYPKVQ FDY SNSYPKVQ FDY SNSYPKVQ FDY SEQ CDR3 191 191 191 191 *CDR-послідовності визначали відповідно до «Antibody Engineering», т. 2, під ред. Konetermann і Dübel, вид-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номери послідовностей в таблиці (SEQ) відповідають номерам послідовностей в переліку послідовностей, що додається до даної заявки. Таблиця 3 Сімейство 13 Нанотіло CX3CR1BII PMP18E6 CX3CR1BII PMP12C2 CX3CR1BII PMP18A10 CX3CR1BII PMP18A2 CX3CR1BII PMP18A8 CX3CR1BII PMP18A9 CX3CR1BII PMP18B7 CX3CR1BII PMP18B9 CX3CR1BII PMP18C6 CX3CR1BII PMP18C9 CX3CR1BII PMP18D1 CX3CR1BII PMP18D10 CX3CR1BII PMP18D12 CX3CR1BII PMP18F1 CX3CR1BII PMP18F5 CX3CR1BII PMP18F6 SEQ 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 CDR1* GTIFSNNA MG GTIFSNTA MG GIIFSNNA MG GIIFSNNA MG RTIFRSNA MG GIIFSNNA MG GTIFRSNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG GIIFSNNA MG GIIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG SEQ CDR1 147 148 149 149 150 149 151 147 147 149 149 147 147 147 147 147 CDR2* SISSSGSTN SISNSGST N SISNSGST N SIGSTYST N SISNSGST N SISSTYSTN SISNSGST N SISSSGSTN SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N 23 SEQ CDR2 178 179 179 180 179 181 179 178 179 179 179 179 179 179 179 179 CDR3* DARRGWN TAY DARRGWN SGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN SGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY SEQ CDR3 192 193 192 192 194 192 193 192 192 192 192 192 192 192 192 192 UA 115781 C2 Нанотіло CX3CR1BII PMP18F9 CX3CR1BII PMP18G5 CX3CR1BII PMP18H1 CX3CR1BII PMP18H10 CX3CR1BII PMP18H7 CX3CR1BII PMP18H9 CX3CR1BII PMP20B3 CX3CR1BII PMP20C12 CX3CR1BII PMP20C3 CX3CR1BII PMP20C6 CX3CR1BII PMP20D8 CX3CR1BII PMP20E11 CX3CR1BII PMP20E5 CX3CR1BII PMP20F3 CX3CR1BII PMP20F4 CX3CR1BII PMP20F5 CX3CR1BII PMP21B6 CX3CR1BII PMP24A12 CX3CR1BII PMP24A6 CX3CR1BII PMP24B9 CX3CR1BII PMP24D3 CX3CR1BII PMP24F7 CX3CR1BII PMP28B4 CX3CR1BII PMP28F1 CX3CR1BII PMP28F6 CX3CR1BII PMP28F9 CX3CR1BII PMP29A5 CX3CR1BII PMP29D5 SEQ 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 CDR1* GTIFRTNA MG RTIFRSNA MG GTIFSNNA MG KTIFRSNA MG GIIFSNNA MG GTIFSNNA MG GIIFSNNA MG GTIFRSNA MG GIIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTTFRSNA MG RTIFRSNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG ATIFRSNA MG ATIFRSNA MG GTIFSNNA MG GIIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFRSNA MG GIIFSNNA MG GLIFSNNA MG ATIFRSNA MG GIIFSNNA MG GIIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG GTIFRSNA MG SEQ CDR1 152 150 147 153 149 147 149 151 149 147 154 150 147 147 155 155 147 149 147 151 149 156 155 149 149 147 147 151 CDR2* SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SIGSTYST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SITNSGST N SITNSGST N SISNSGST N SISSSGSTN SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGSA N SISNSGST N SISISGSTN SISSTYSTN SISSTYSTN SISNSGST N SIGSTYST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N 24 SEQ CDR2 179 179 179 179 179 179 180 179 179 179 182 182 179 178 179 179 179 183 179 184 181 181 179 180 179 179 179 179 CDR3* DGRRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN SGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DGRRGWN TGY DGRRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGF DARRGWN TAY DARRGWN TAY DGRRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN SGY SEQ CDR3 195 194 192 194 192 192 192 193 192 192 194 194 194 192 195 195 192 192 192 196 192 192 195 192 192 194 192 193 UA 115781 C2 Нанотіло CX3CR1BII PMP29E3 CX3CR1BII PMP29E7 CX3CR1BII PMP29G10 CX3CR1BII PMP29G7 CX3CR1BII PMP29H1 CX3CR1BII PMP37A8 CX3CR1BII PMP37B9 CX3CR1BII PMP37C12 CX3CR1BII PMP37C7 CX3CR1BII PMP37D9 CX3CR1BII PMP37E12 CX3CR1BII PMP41B10 CX3CR1BII PMP41B11 CX3CR1BII PMP41B8 CX3CR1BII PMP41C10 CX3CR1BII PMP41F9 CX3CR1BII PMP41H10 CX3CR1BII PMP46B5 CX3CR1BII PMP46D3 CX3CR1BII PMP46H5 CX3CR1BII PMP48B8 CX3CR1BII PMP48D11 CX3CR1BII PMP48G8 CX3CR1BII PMP48H9 5 SEQ 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 CDR1* KTIFRSNA MG KTIFRSNA MG GTIFRSNA MG GIIFSNNA MG GTIFSNNA MG RTIFRSNA MG GTIFSNNA MG GSIFRSNA MG RTIFSNNA MG GTVFSNN AMG KPIFRSNA MG GTIFSNNA MG GTIFSNNA MG GIIFSNNA MG RTIFRSNA MG GIIFSNNA MG GLTLDDY AMG RTIFRSNA MG GTIFSNNA MG GIIFSNNA MG KTIFRSNA MG RTIFRSNA MG RTIFRSNA MG GTIFSNNA MG SEQ CDR1 153 153 151 149 147 150 147 157 158 159 160 147 147 149 150 149 161 150 147 149 153 150 150 147 CDR2* SISNSGST N SISNSGST N SITNSGST N SITNTGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISSSGSTN SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SIGSTYST N SISNSGST N SIGSTYST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISSTYSTN SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SISNSGST N SEQ CDR2 179 179 182 185 179 179 179 179 179 178 179 179 179 180 179 180 179 179 179 181 179 179 179 179 CDR3* DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TAY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TGY DARRGWN TAY SEQ CDR3 194 194 194 192 192 194 192 194 192 192 194 192 192 192 194 192 194 194 194 192 194 194 194 192 *CDR-послідовності визначали відповідно до «Antibody Engineering», т. 2, під ред. Konetermann і Dübel, вид-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номери послідовностей в таблиці (SEQ) відповідають номерам послідовностей в переліку послідовностей, що додається до даної заявки. 25 UA 115781 C2 Таблиця 4 Оптимізовані варіанти Нанотіло CX3CR1BII PMP66B02 CX3CR1BII 043 CX3CR1BII 045 CX3CR1BII 047 CX3CR1BII 048 CX3CR1BII 049 CX3CR1BII 050 CX3CR1BII 061 CX3CR1BII 056 CX3CR1BII 057 CX3CR1BII 060 CX3CR1BII 065 CX3CR1BII 067 CX3CR1BII 068 CX3CR1BII 074 CX3CR1BII 118 CX3CR1BII 129 CX3CR1BII 158 CX3CR1BII 306 CX3CR1BII 307 CX3CR1BII 308 5 10 SEQ 1 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 CDR1 GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSNA MA GSIFSSTA MA GSIFSSTA MA GSIFSSNA MA SEQ CDR1 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 141 213 213 141 CDR2 AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AINSVGVT K AISSVGVT K AIQSVGVT K AIGSVGVT K AITSVGVT K AINTVGVT K AINGVGVT K AINPVGVT K AISSVGVT K AISTVGVT K AINSVGVT K SEQ CDR2 162 162 162 162 162 162 162 162 162 162 162 214 215 216 217 218 219 220 214 221 162 CDR3 DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY DPRRGWD TRY SEQ CDR3 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 186 *CDR-послідовності визначали відповідно до «Antibody Engineering», т. 2, під ред. Konetermann і Dübel, вид-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номери послідовностей в таблиці (SEQ) відповідають номерам послідовностей в переліку послідовностей, що додається до даної заявки. Наступним об’єктом даного винаходу є поліпептиди, які мають один або декілька VHHдоменів. В одному з об’єктів винаходу VHH-домен, пропонований в даному винаході, містить або практично складається з послідовності, що представлена в: а) амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 3; або 26 UA 115781 C2 5 10 15 20 25 30 б) амінокислотних послідовностях, які принаймні на 90% ідентичні амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 3; або в) амінокислотних послідовностях, які мають 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 3, або г) будь-якій одній з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 1-48 або SEQ ID NO: 121140, або SEQ ID NO: 222-224. В іншому об’єкті винаходу VHH-домен, пропонований в даному винаході, містить або практично складається з послідовності, що представлена в: а) амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 49; або б) амінокислотних послідовностях, які принаймні на 95% ідентичні амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 49; або в) амінокислотних послідовностях, які мають 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 49, або г) будь-якій одній з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 49-52. В іншому об’єкті винаходу VHH-домен, пропонований в даному винаході, містить або практично складається з послідовності, що представлена в: а) амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 67; або б) амінокислотних послідовностях, які принаймні на 90% ідентичні амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 67; або в) амінокислотних послідовностях, які мають 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотних(-ну) відмінностей(-сть) з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 67, або г) будь-якій одній з амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 53-102. В іншому об’єкті винаходу VHH-домен, пропонований в даному винаході, містить або практично складається з амінокислотної послідовності, що представлена в будь-якій одній з SEQ ID NO: 121-140 або SEQ ID NO: 222-224. В іншому об’єкті винаходу VHH-домен, пропонований в даному винаході, містить або практично складається з амінокислотної послідовності, що представлена в будь-якій одній з SEQ ID NO: 138-140. В іншому об’єкті винаходу VHH-домен, пропонований в даному винаході, містить або практично складається з амінокислотної послідовності, що представлена в будь-якій одній з SEQ ID NO: 222-224. Репрезентативні VHH-домени, пропоновані в даному винаході, представлені нижче в таблиці 5, а репрезентативні оптимізовані VHH-домени, пропоновані в даному винаході, представлені нижче в таблиці 6: 35 Таблиця 5 VHH-домени SEQ ID NO: 1-48 являють собою VHH-домени сімейства 101 SEQ ID NO: 49-52 являють собою VHH-домени сімейства 9 SEQ ID NO: 53-120 являють собою VHH-домени сімейства 13 CX3CR1BII PMP66B02 CX3CR1BII PMP54A12 CX3CR1BII PMP54A3 CX3CR1BII PMP54A4 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS EVQLVESGRGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS 27 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 UA 115781 C2 CX3CR1BII PMP54A5 CX3CR1BII PMP54A7 CX3CR1BII PMP54B1 CX3CR1BII PMP54B2 CX3CR1BII PMP54B3 CX3CR1BII PMP54B5 CX3CR1BII PMP54D5 CX3CR1BII PMP54D8 CX3CR1BII PMP54F6 CX3CR1BII PMP54G3 CX3CR1BII PMP54H1 CX3CR1BII PMP54H4 CX3CR1BII PMP61F10 CX3CR1BII PMP61D1 CX3CR1BII PMP61D5 EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTLVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISSD NAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRY WGQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTVSRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRY WGQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTLVTVSS KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTQVTVSS EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAFGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAFGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS 28 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID 10 NO: SEQ ID 11 NO: SEQ ID 12 NO: SEQ ID 13 NO: SEQ ID 14 NO: SEQ ID 15 NO: SEQ ID 16 NO: SEQ ID 17 NO: SEQ ID 18 NO: SEQ ID 19 NO: