Спосіб підвищення стійкості до засухи у рослин шляхом порушення експресії функціонального білка пектинестерази

Реферат: Винахід стосується способу покращення стійкості рослини до засухи порівняно з контрольною рослиною, де вказаний спосіб включає порушення експресії функціонального білка пектинестерази в рослині шляхом мутації послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний функціональний білок пектинестерази. Винахід також стосується способу скринінгу стійкості рослин до засухи та рослин і рослинних продуктів із порушеною експресією функціонального білка пектинестерази. UA 115780 C2 (12) UA 115780 C2 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Даний винахід стосується способу збільшення засухостійкості рослини. Спосіб включає в себе порушення експресії гена або генів у вказаній рослині. Порівняно з рослиною, не підданою маніпуляціям для порушення експресії вказаного гена(ів), рослина має поліпшену засухостійкість. Представлені також рослини і продукти рослинного походження, які можна отримувати способом за винаходом. Передумови винаходу Абіотичні стреси, такі, як засуха, засолення, екстремальні температури, хімічна токсичність і окислювальний стрес, становлять загрозу для сільського господарства і є першочерговою причиною втрати урожаю в усьому світі (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14). У даній галузі доступно декілька повідомлень, що стосуються біохімічної, молекулярної і генетичної основи абіотичного стресу (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14 або Kilian et al (2007) Plant J 50(2) 347-363). Модифікація рослини для боротьби з абіотичним стресом часто основана на маніпуляції з генами, які захищають і підтримують функцію і структуру клітинних компонентів. Однак, через генетично складні відповіді на умови абіотичного стресу, такі рослини, мабуть, більш складно контролювати і конструювати. Wang (Wang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14), серед іншого, згадує, що один зі способів конструювання оснований на використанні одного або декількох генів, які або залучені до шляхів передачі сигналу і регуляторних шляхів, або кодують ферменти, присутні в шляхах, що приводять до синтезу функціональних і структурних захисних речовин, таких, як осмоліти і антиоксиданти, або кодують білки, які надають стресостійкість. Хоч опубліковані поліпшення в наданні стійких до абіотичного стресу рослин, природа генетично складних механізмів, які лежать в їх основі, забезпечує постійну необхідність у подальшому поліпшенні в цій галузі. Наприклад, опубліковано, що генетично трансформовані засухостійкі рослини, як правило, можуть мати більш повільний ріст і знижену біомасу (Serrano et al (1999) J Exp Bot 50:1023-1036) через дисбаланс в розвитку і фізіології, таким чином, маючи значну вартість пристосовуваності порівняно з рослинами, які не є трансформованими (Kasuga et al. (1999) Nature Biot. Vol. 17; Danby and Gehring (2005) Trends in Biot. Vol.23 No.11). Декілька біотехнологічних способів запропоновані для отримання рослин, які ростуть в умовах стресу. Рослини зі збільшеною стійкістю до сольового стресу описані, наприклад, в W003/020015. У цьому документі описані трансгенні рослини, стійкі до сольового стресу за допомогою використання нуклеїнових кислот і поліпептидів 9-цис-епоксикаротеноїддіоксигенази. Рослини зі збільшеною засухостійкістю описані, наприклад, в US 2009/0144850, US 2007/0266453 і WO 2002/083911. У US2009/0144850 описана рослина, яка має фенотип засухостійкості через змінену експресію нуклеїнової кислоти DR02. У US 2007/0266453 описана рослина, що має фенотип засухостійкості через змінену експресію нуклеїнової кислоти DR03, і в WO 2002/083911 описана рослина, що має збільшену стійкість до стресу через засуху завдяки зниженій активності транспортера ABC, експресованого в замикальних клітинах. Іншим прикладом є робота Kasuga і співавторів (1999), які описують, що надекспресія кДНК, що кодує DREB1A, у трансгенних рослинах активувала експресію множини генів стресостійкості в нормальних умовах росту і приводила до поліпшеної стійкості до засухи, сольового навантаження і заморожування. Однак, експресія DREB1A також приводила до серйозного сповільнення росту в нормальних умовах росту (Kasuga (1999) Nat Biotechnol 17(3) 287-291). Залишається необхідність в нових, альтернативних і/або додаткових способах збільшення стійкості до абіотичного стресу, зокрема, такого абіотичного стресу, як засуха. Метою даного винаходу є надання нових способів збільшення засухостійкості у рослини. За допомогою такої рослини є, наприклад, можливим отримувати більше біомаси і/або більше урожаю і отриманого з них продукту рослинного походження при вирощуванні в умовах низької доступності води/засухи порівняно з рослинами, не підданими впливу способом за винаходом. Короткий виклад суті винаходу У першому аспекті, даний винахід стосується способу отримання рослини, яка має поліпшену засухостійкість порівняно з контрольною рослиною, що включає в себе стадію порушення експресії функціонального білка пектинестерази в рослині, протопласті рослини або клітині рослини, де вказаний функціональний білок пектинестераза містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 55 % ідентичності з амінокислотною послідовністю з SEQ ID NO:2, і необов'язково, регенерації вказаної рослини. Функціональний білок пектинестераза може являти собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, що має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до рослини з порушеною засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії 1 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якому вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується. В іншому аспекті даний винахід стосується способу отримання рослини, яка має поліпшену засухостійкість порівняно з контрольною рослиною, що включає в себе стадію порушення експресії функціонального білка пектинестерази в рослині, протопласті рослини або клітині рослини, де вказаний функціональний білок пектинестераза кодований послідовністю нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що має щонайменше 60 % ідентичності з послідовністю нуклеїнової кислоти з SEQ ID NO:1, і, необов'язково, регенерації вказаної рослини. Функціональний білок пектинестераза може являти собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до порушеної засухостійкості порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якому вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується. Вказана стадія порушення експресії може включати в себе введення мутації в послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує вказаний функціональний білок пектинестеразу. Вказана стадія введення мутації у вказану послідовність нуклеїнової кислоти може включати в себе вставку, делецію і/або заміну щонайменше одного нуклеотиду. Вказана стадія порушення експресії може включати в себе вимкнення гена. Спосіб може включати в себе порушення експресії двох або більше функціональних білків пектинестераз. Він може далі включати в себе стадію отримання рослини або продукту рослинного походження з рослини, що має поліпшену засухостійкість. У іншому аспекті даний винахід стосується використання амінокислотної послідовності, що має щонайменше 55 % ідентичності з амінокислотною послідовністю з SEQ ID NO:2, або послідовності нуклеїнової кислоти, що має щонайменше 60 % ідентичності з послідовністю нуклеїнової кислоти з SEQ ID NO:1, для скринінгу рослин із засухостійкості. Крім того, в цьому документі пояснене використання амінокислотної послідовності пектинестерази з SEQ ID NO:2 або послідовності нуклеїнової кислоти пектинестерази з SEQ ID NO:1 для скринінгу рослин Arabidopsis thaliana із засухостійкості. Винахід стосується також використання щонайменше частини послідовності нуклеїнової кислоти пектинестерази, що має SEQ ID NO:1, або щонайменше частини амінокислотної послідовності пектинестерази з SEQ ID NO:2 як маркера для селекції засухостійких рослин Arabidopsis thaliana. Винахід, крім того, стосується використання функціонального білка пектинестерази, як визначено в цьому документі, для модуляції, переважно, збільшення, засухостійкості рослини. Крім того, винахід стосується використання рослини, клітини рослини або продукту рослинного походження, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена, де функціональний білок пектинестераза являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до рослини з порушеною засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якому вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується, для росту в стресових умовах засухи, де вказані стресові умови засухи примушують контрольну рослину, клітину рослини або продукт рослинного походження, в яких експресія вказаного функціонального білка пектинестерази не порушена, демонструвати ознаки стресу через засуху, такі, як ознаки в'янення, раніше, ніж рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена. Нарешті, винахід стосується рослини, клітини рослини або продукту рослинного походження з Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, видів Triticum, Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale або Brassica napus, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена, де функціональний білок пектинестераза являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до рослини з порушеною засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якій вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується. У одному з варіантів здійснення вказана рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження містить пошкоджений ендогенний ген пектинестерази. Короткий опис креслень На фігурі 1 показані результати типового експерименту, описаного в прикладах 1 і 2. 2 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фігурі 2 показаний засухостійкий фенотип при нокауті пектинестерази (інсерційний мутант Arabidopsis At5g19730) порівняно із засухочутливим фенотипом контрольної (дикого типу) рослини. На фігурі 3 показана виживаність при засусі інсерційного мутанта Arabidopsis At5g19730 (нокаут пектинестерази). Інсерційний мутант Arabidopsis At5g19730 виживав при засусі значно краще (р0,05), ніж рослини дикого типу або інсерційні мутанти At5g19730 після комплементації з допомогою гомологів Brassica rapa, Solanum lycopersicum або Oryza sativa. На цій фігурі показано не тільки те, що інсерційна мутація в цьому гені забезпечує засухостійкий фенотип, а також що гомологи цього гена з еволюційно віддалених однодольних і дводольних видів діють для відновлення нормального засухочутливого фенотипу. Сірі стовпчики мають значуще більш низькі значення (р0,05), ніж чорні стовпчики. Визначення У нижченаведеному описі і прикладах використовують ряд термінів. Для забезпечення зрозумілого і правильного розуміння опису і формули винаходу, включаючи об'єм, привласнений таким термінам, представлені наступні визначення. Якщо в цьому документі не визначено інше, всі використані технічні і наукові терміни мають таке ж значення, яке є загальноприйнятим для фахівця в галузі, до якої належить цей винахід. Повні описи всіх публікацій, патентних заявок, патентів і інших посилань наведені в цьому документі як посилання. Способи здійснення загальноприйнятих технологій, що використовуються в способах за винаходом, очевидні фахівцеві в даній галузі. Практичне здійснення загальноприйнятих способів молекулярної біології, біохімії, обчислювальної хімії, культури клітин, рекомбінантної ДНК, біоінформатики, геноміки, секвенування і споріднених галузей добре відомі фахівцям в даній галузі і їх обговорюють, наприклад, в наступних літературних посиланнях: Sambrook et al., Molecular Cloning. А Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 і періодичні оновлення; і серії Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego. У цьому документі і в формулі винаходу дієслово "містити" і його відмінювання використовують в його необмежувальному значенні для позначення того, що предмети після слова включені, але предмети, не згадані конкретно, не виключені. Він включає в себе дієслова "в основному складатися з", так само як "складатися з". Як застосовують в цьому документі, форми однини включають в себе посилання на множину, якщо контекст явно не вимагає іншого. Наприклад, спосіб виділення "молекули" ДНК, як використовують вище, включає в себе виділення множини молекул (наприклад, 10-ків, 100ен, 1000-ч, 10-ків тисяч, 100-ен тисяч, мільйонів або більше молекул). Вирівнювати і вирівнювання: Під терміном "вирівнювати" і "вирівнювання" розуміють порівняння двох або більше нуклеотидних послідовностей, основане на присутності коротких або довгих відрізків ідентичних або схожих нуклеотидів. Декілька способів вирівнювання нуклеотидних послідовностей відомо в даній галузі, як додатково пояснено нижче. "Експресія гена" означає процес, в якому область ДНК, функціонально зв'язана з придатними регуляторними областями, зокрема, промотором, транскрибується в РНК, яка є біологічно активною, тобто яка здатна до трансляції в біологічно активний білок або пептид (або фрагмент активного пептиду) або яка є активною сама по собі (наприклад, для посттранскрипційного вимкнення гена або РНК). Активний білок в конкретних варіантах здійснення означає білок, що є конститутивно активним. Кодуюча послідовність переважно знаходиться в смисловій орієнтації і кодує бажаний, біологічно активний білок або пептид, або фрагмент активного пептиду. "Ектопічна експресія" стосується експресії в тканині, в якій ген в нормі не експресується. "Функціональний", відносно білків пектинестераз (або варіантів, таких, як ортогоги або мутанти, і фрагменти), стосується здатності гена і/або кодованого білка модифікувати (кількісно і/або якісно) засухостійкість, наприклад, за допомогою модифікації рівня експресії гена (наприклад, за допомогою надекспресії або вимкнення) в рослині. Наприклад, функціональність білка пектинестерази, отриманого з виду рослин X, можна тестувати різними способами. Переважно, якщо білок є функціональним, вимкнення або нокаут гена, що кодує білок пектинестеразу у виді рослин X, з використанням, наприклад, векторів для вимкнення гена, приводить до поліпшеної засухостійкості, як можна тестувати, як детально пояснено в цьому документі. А також, комплементація лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ген пектинестерази, за допомогою послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує вказаний функціональний білок пектинестеразу, приводить до рослини, в якій відновлена 3 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нормальна засухостійкість, тобто рослина, піддана комплементації, має засухостійкість, схожу з контрольною рослиною. Фахівець в даній області здатний тестувати функціональність білка пектинестерази з використанням загальноприйнятих способів, як проілюстровано в цьому документі. Термін "ген" означає послідовність ДНК, яка містить область (транскрибовану область), яка транскрибується в молекулу РНК (наприклад, мРНК) в клітині, функціонально зв'язану з придатними регуляторними областями (наприклад, промотором). Ген може, таким чином, містити декілька функціонально зв'язаних послідовностей, таких, як промотор, лідерна послідовність, яка містить, наприклад, послідовності залучені в ініціацію трансляції, кодуючу (білок) область (кДНК або геномної ДНК), і 3' нетрансльовану послідовність (відому також як 3' нетрансльовану послідовність або 3'UTR), що містить, наприклад, ділянки послідовності термінації транскрипції. Термін "кДНК" означає комплементарну ДНК. Комплементарну ДНК отримують за допомогою зворотної транскрипції РНК в комплементарну послідовність ДНК. Послідовності кДНК таким чином, відповідають послідовностям РНК, експресованим з генів. Оскільки послідовності мРНК при експресії з геному можуть зазнавати сплайсингу, тобто інтрони в результаті сплайсингу вирізаються з мРНК, і екзони з'єднуються разом, перед трансляцією в цитоплазмі в білки, зрозуміло, що експресія кДНК означає експресію мРНК, що кодує кДНК. Послідовність кДНК, таким чином, може не бути ідентичною до послідовності геномної ДНК, якій вона відповідає, оскільки кДНК може кодувати тільки повну відкриту рамку зчитування, що складається зі з'єднаних екзонів, для білка, в той час як геномна ДНК кодує екзони, перервані послідовностями інтронів, фланковані послідовностями 5' і 3' UTR. "Ідентичність" являє собою ступінь ідентичності нуклеотидних послідовностей або амінокислотних послідовностей. Як правило, послідовності вирівнюють так, щоб отримати збіг найвищого порядку. "Ідентичність" як така має прийняте в даній галузі значення, і її можна розраховувати з використанням опублікованих способів. Див., наприклад: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. М., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. М., і Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; і SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. і Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). У той час, як існує ряд способів для вимірювання ідентичності між двома полінуклеотидними або поліпептидними послідовностями, термін "ідентичність" добре відомий фахівцям в даній галузі (Carillo, Н., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073). Способи, загальноприйняті для визначення ідентичності або схожості між двома послідовностями, включають в себе, але без обмеження, способи, описані в GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, і Carillo, Н., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073. Способи для визначення ідентичності і схожості кодовані в комп'ютерних програмах. Переважні способи комп'ютерних програм для визначення ідентичності і схожості між двома послідовностями включають в себе, але без обмеження, пакет програмного забезпечення GCS (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403). Як ілюстрацію, під полінуклеотидом, який має нуклеотидну послідовність, яка має щонайменше, наприклад, 95 % "ідентичності" з контрольною нуклеотидною послідовністю, яка кодує поліпептид певної послідовності, мають на увазі, що нуклеотидна послідовність полінуклеотиду є ідентичною до контрольної послідовності, за винятком того, що полінуклеотидна послідовність може включати аж до п'яти точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів контрольної поліпептидної послідовності. Таким чином, процент ідентичності нуклеотидної послідовності з контрольною нуклеотидною послідовністю потрібно розраховувати протягом повної довжини контрольної нуклеотидної послідовності. Іншими словами, для отримання полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, щонайменше на 95 % ідентичну до контрольної нуклеотидної послідовності, аж до 5 % нуклеотидів у контрольній послідовності можна делетувати і/або замінювати іншим нуклеотидом, і/або ряд нуклеотидів, аж до 5 % від всіх нуклеотидів у контрольній послідовності, можна вставляти в контрольну послідовність. Ці мутації контрольної послідовності можуть зустрічатися в 5'- або 3'-кінцевих положеннях контрольної нуклеотидної послідовності, або в будь-якому місці між цими кінцевими положеннями, поширеними або окремо серед нуклеотидів у контрольній послідовності, або в одній, або в декількох безперервних групах всередині контрольної послідовності. Подібним чином, під поліпептидом, який має амінокислотну послідовність, що має щонайменше, наприклад, 95 % "ідентичності" з контрольною амінокислотною послідовністю з 4 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID NO:2, мають на увазі, що амінокислотна послідовність поліпептиду є ідентичною до контрольної послідовності, за винятком того, що поліпептидна послідовність може включати аж до п'яти замін амінокислоти на кожні 100 амінокислот із контрольних амінокислот з SEQ ID NO:2. Таким чином, процент ідентичності амінокислотної послідовності з контрольною амінокислотною послідовністю потрібно розраховувати протягом повної довжини контрольної амінокислотної послідовності. Іншими словами, для отримання поліпептиду, який має амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 % ідентичну до контрольної амінокислотної послідовності, аж до 5 % амінокислотних залишків у контрольній послідовності можна делетувати або замінювати іншою амінокислотою, або ряд амінокислот аж до 5 % від усіх амінокислотних залишків у контрольній послідовності можна вставляти в контрольну послідовність. Ці зміни контрольної послідовності можуть зустрічатися в аміно- або карбоксикінцевих положеннях контрольної амінокислотної послідовності або в будь-якому місці між цими кінцевими положеннями, поширеними або окремо серед залишків у контрольній послідовності чи або в одній, або в декількох безперервних групах всередині контрольної послідовності. Нуклеїнова кислота відповідно до даного винаходу може включати в себе будь-який полімер або олігомер піримідинових і пуринових основ, переважно, цитозину, тиміну і урацилу, і аденіну і гуаніну відповідно (див. Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982), повний зміст якої наведений в цьому документі як посилання для всіх цілей). Даний винахід стосується будь-якого дезоксирибонуклеотидного, рибонуклеотидного або пептидного компоненту нуклеїнової кислоти, і будь-яких їх хімічних варіантів, таких, як метилування, гідроксиметилування або глікозилування форми цих основ, і т. п. Полімери або олігомери можуть бути гетерогенними або гомогенними за складом, і можуть бути виділеними з природних джерел або можуть бути штучно або синтетично отриманими. Крім того, нуклеїнові кислоти можуть являти собою ДНК або РНК, або їх суміш, і можуть існувати постійно або тимчасово в одноланцюжковій або дволанцюжковій формі, включаючи гомодуплекс, гетеродуплекс і гібридні стани. Як застосовують в цьому документі, термін "функціонально зв'язаний" стосується зв'язку полінуклеотидних елементів у функціональному взаємозв'язку. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли вона вміщена в функціональний взаємозв'язок з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, промотор, або, швидше, послідовність для регуляції транскрипції, є функціонально зв'язаними з кодуючою послідовністю, якщо вони впливають на транскрипцію кодуючої послідовності. Функціонально зв'язаний означає, що зв'язані послідовності ДНК, як правило, безперервні і, при необхідності, з'єднують дві або більше областей, які кодують білки, безперервно і в рамці зчитування. "Рослина" стосується або цілої рослини, або частин рослини, таких, як клітини, тканини або органи (наприклад, пилок, насіння, гамети, коріння, листя, квіти, квіткові бутони, пиляки, плоди і т. д.), які можна отримувати з рослини, так само як похідних будь-чого з цього і потомства, отриманого з такої рослини за допомогою самоопилення або схрещування. "Клітина(и) рослини" включає в себе протопласти, гамети, суспензійні культури, мікроспори, пилкові зерна і т. д., або виділені, або всередині тканини, органа або організму. Як застосовують в цьому документі, термін "промотор" стосується послідовності нуклеїнової кислоти, яка функціонує для контролю транскрипції одного або декількох генів, локалізованого вище відносно напряму транскрипції від ділянки ініціації транскрипції гена, і його структурно ідентифікують за присутністю ділянки зв'язування ДНК-залежної РНК-полімерази, ділянок ініціації транскрипції і будь-яких інших послідовностей ДНК, включаючи, але без обмеження, ділянки зв'язування факторів транскрипції, ділянки зв'язування репресорних і активаторних білків, і будь-які інші послідовності нуклеотидів, відомі фахівцеві в даній галузі як такі, що діють напряму або опосередковано для регуляції рівня транскрипції з промотору. Необов'язково, термін "промотор" включає в себе в цьому документі також 5'-UTR область (5'-нетрансльовану область) (наприклад, промотор в цьому документі може включати в себе одну або декілька частин вище (5'-) від кодону ініціації транскрипції гена, оскільки ця область може грати роль у регуляції транскрипції і/або трансляції. "Конститутивний" промотор являє собою промотор, який є активним в більшості тканин у більшості фізіологічних умов і умов розвитку. "Індуцибельний" промотор являє собою промотор, регульований фізіологічно (наприклад, за допомогою введення ззовні конкретних сполук) або в ході розвитку. "Тканиноспецифічний" промотор є активним тільки в специфічних типах тканин або клітин. "Промотор, активний в рослинах або клітинах рослин" стосується загальної здатності промотору управляти транскрипцією в рослині або клітині рослини. Це не має на увазі висновків відносно просторово-часової активності промотору. 5 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терміни "білок" або "поліпептид" використовують взаємозаміно, і вони означають молекули, які складаються з ланцюга амінокислот, без відношення до специфічного способу дії, розміру, тривимірної структури або походження. "Фрагмент" або "частину" білка можна, таким чином, все ще позначати як "білок". "Виділений білок" використовують для позначення білка, який більше не знаходиться в його природному оточенні, наприклад, in vitro або в рекомбінантній клітиніхазяїні бактерії або рослини. "Трансгенна рослина" або "трансформована рослина" в цьому документі означає рослину або клітину рослини, трансформовану, наприклад, за допомогою введення немовчазної мутації в ендогенний ген або його частину. Така рослина генетично модифікована для введення, наприклад, однієї або декількох мутацій, вставок і/або делецій в ген і/або вставок конструкції для вимкнення гена в геном. Трансгенна клітина рослини може стосуватися клітини рослини, виділеної або в культурі клітин, або клітини рослини, що міститься в рослині або в диференційованому органі або тканині, і обидві можливості конкретно включені в цей документ. Таким чином, посилання на клітину рослини в описі або формулі винаходу не призначене для позначення тільки виділеної клітини або протопластів у культурі, але стосується будь-якої клітини рослини, в якому б місці вона не могла бути локалізована або в якому б типі тканини або органа рослини вона не могла бути присутньою. Направлена заміна нуклеотидів (TNE) являє собою спосіб, за допомогою якого синтетичний олігонуклеотид, частково комплементарний до ділянки в хромосомальному або епісомальному гені, куреє заміною окремого нуклеотиду в конкретній ділянці. Описана TNE з використанням широкої множини олігонуклеотидів і мішеней. Деякі з опублікованих олігонуклеотидів являють собою химери РНК/ДНК, містять модифікації кінців для надання стійкості до нуклеази. Як застосовують в цьому документі, термін "стрес через засуху" або "засуха" стосується субоптимальних умов зовнішнього середовища, пов'язаних з обмеженою доступністю води для рослини. Обмежена доступність води може виникати, наприклад, при відсутності або більш низькій кількості дощу і/або при менш частому поливі рослин, ніж необхідно. Обмежена доступність води для рослини може виникати також, наприклад, коли вода присутня в ґрунті, але рослина не може її ефективно витягувати. Наприклад, коли ґрунти сильно зв'язують воду або коли вода має високий вміст солі, для рослини може бути більш складно витягувати воду з ґрунту. Таким чином, множина чинників може робити внесок, що приводить в результаті до обмеженої доступності води, тобто до засухи, для рослини. Ефект піддавання рослин "засусі" або "стресу через засуху" може бути таким, що рослини не мають оптимального росту і/або розвитку. Рослини, піддані засусі, можуть мати ознаки в'янення. Наприклад, рослини можна піддавати на період щонайменше 15 діб впливу специфічних умов, що контролюються, без забезпечення водою, наприклад, за відсутності дощу і/або поливу рослин. Термін "поліпшена засухостійкість" стосується рослин, для яких, при наданні поліпшеної засухостійкості, при піддаванні засусі або стресу через засуху не показують ефектів або показують ослаблені ефекти, які спостерігають в контрольних рослинах без надання поліпшеної засухостійкості. Нормальна рослина має деякий рівень засухостійкості. Можна легко визначити, чи має рослина поліпшену засухостійкість за допомогою порівняння контрольної рослини з рослиною з наданою поліпшеною засухостійкістю в умовах, що контролюються, вибраних таким чином, що в контрольній рослині ознаки засухи можна спостерігати після конкретного періоду, тобто коли рослини піддавали засусі або стресу через засуху. Для рослин із поліпшеною засухостійкістю спостерігають менші і/або знижені ознаки піддавання засусі, такі, як в'янення, порівняно з контрольними рослинами. Фахівцеві в даній галузі відомо, як вибирати придатні умови, наприклад, такі, як умови, що контролюються, в прикладах. Коли рослина має "поліпшену засухостійкість", вона є здатною підтримувати нормальний ріст і/або нормальний розвиток при піддаванні засусі або стресу через засуху, які в іншому випадку можуть приводити до зниженого росту і/або зниженого розвитку нормальних рослин. Таким чином, "поліпшена засухостійкість" являє собою відносний термін, який визначається порівнянням рослин, на основі чого рослина, найбільш здатна до підтримки (нормального) росту при стресі через засуху, являє собою рослину з "поліпшеною засухостійкістю". Фахівцеві в даній галузі добре відомо, як вибирати придатні умови для визначення засухостійкості рослини і як вимірювати ознаки засухи, такі, як описано, наприклад, в керівництві, представленому в IRRI, Breeding rice for drought prone environments, Fischer et al., 2003, і в CIMMYT, Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize: from theory to practice, Banzinger et al, 2000. Приклади способів визначення поліпшеної засухостійкості у рослин представлені в Snow and Tingey, 1985, Plant Physiol, 77, 602-7 і Harb et al., Analysis of drought stress in Arabidopsis, AOP 2010, Plant Physiology Review, і описані в розділі "Приклади" нижче. Докладний опис винаходу 6 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується способу модуляції, наприклад, поліпшення, засухостійкості рослини за допомогою модифікації рослини, наприклад, порушення експресії функціонального білка пектинестерази у вказаній рослині, наприклад, із використанням генетичної модифікації або направленої заміни нуклеотидів. Модуляція, така, як поліпшення, відбувається відносно контрольної рослини, в якій експресія функціонального білка пектинестерази не модифікована, наприклад, не порушена. Іншими словами, модифікована рослина за винаходом є, порівняно з немодифікованою рослиною, краще здатною рости і виживати в умовах зниженої доступності води, (тимчасового) обмеження кількості води або в умовах засухи. Зрозуміло, що за винаходом модифікація, наприклад, порушення, експресії функціонального білка пектинестерази, може включати в себе генетичну модифікацію, наприклад, експресії гена пектинестерази, або направлену заміну нуклеотидів. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способу поліпшення засухостійкості рослини за допомогою порушення експресії функціонального білка пектинестерази у вказаній рослині, наприклад, з використанням генетичної модифікації або направленої заміни нуклеотидів. Генетична модифікація включає в себе введення мутацій, вставок, делецій у послідовність нуклеїнової кислоти і/або вставку конструкцій для вимкнення гена в геном рослини або клітини рослини, націлені на послідовність нуклеїнової кислоти. Генетична модифікація послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, гена, який кодує мРНК, може стосуватися не тільки модифікації екзонних послідовностей, відповідних послідовності мРНК, але може включати в себе також внесення мутацій в інтронні послідовності геномної ДНК і/або (інші) регуляторні послідовності гена цієї послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, гена. В одному з варіантів здійснення функціональний білок пектинестераза може являти собою білок, який, при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, такою, як лінія з нокаутом At5g19730, наприклад, SALK_136556C (http://www.arabidopsis.org/servlets/SeedSearcher?action=detail&stock_number=SALK_136556C), згадана в цьому документі, приводить до рослини з порушеною засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, наприклад, лінії з нокаутом At5g19730, наприклад, SALK_136556C, в якій вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується. Термін "пошкоджений ендогенний ген пектинестерази", як застосовують в цьому документі, стосується гена пектинестерази, природним чином присутнього в геномі рослини, який є пошкодженим, наприклад, перерваним, наприклад, за допомогою вставки Т-ДНК у вказаний ген пектинестерази. Пошкодження вказаного ендогенного гена пектинестерази може приводити до відсутності експресії вказаного ендогенного гена пектинестерази. Термін "контрольна рослина", як застосовують в цьому документі, стосується рослини такого ж виду, переважно, такого ж сорту, переважно, з таким же генетичним фоном. Однак, модифікація, введена у вказану контрольну рослину, переважно, не присутня або не введена у вказаній контрольній рослині. Даний винахід стосується також модуляції засухостійкості рослини за допомогою модифікації експресії функціонального білка пектинестерази у вказаній рослині. Модуляція відбувається відносно контрольної рослини (переважно, рослини з таким же генетичним фоном), в якій така модифікація не введена або не присутня. "Порушена експресія функціонального білка пектинестерази", як застосовують в цьому документі, може означати, що експресія гена пектинестерази порушена, і/або що експресія гена пектинестерази є нормальною, але трансляція отриманої мРНК інгібована або відвернена (наприклад, за допомогою РНК-інтерференції), і/або що амінокислотна послідовність білка пектинестерази змінена, так що його специфічна активність пектинестерази знижена порівняно зі специфічною активністю пектинестерази білка, який містить амінокислотну послідовність, як показано на SEQ ID NO:2, переважно, в фізіологічних умовах, зокрема, ідентичних до фізіологічних умов. Альтернативно, білок пектинестераза може ставати менш функціональним або нефункціональним через видалення білка з використанням, наприклад, антитіла, або інгібітора пектинестерази. Наприклад, антитіло, що специфічно зв'язується з вказаним білком пектинестеразою, може експресуватися одночасно, таким чином, знижуючи специфічну активність білка пектинестерази. Фраза "порушення експресії функціонального білка пектинестерази", як застосовують в цьому документі, крім того, стосується видалення функціонального білка пектинестерази за допомогою збільшеної експресії інгібіторів пектинестерази, наприклад, білків, що припиняють, що запобігають або що знижують активність білка пектинестерази. Необмежувальним прикладом такого інгібітора пектинестерази є ген 7 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 At1g48020. Альтернативно, можна використовувати хімічний інгібітор пектинестерази, такий, як іони або метали, або кофактори пектинестерази можна видаляти, таким чином, знижуючи їх доступність для активності пектинестерази. Таким чином, фраза включає в себе ситуацію, при якій білок пектинестераза експресується на нормальному рівні, але при якій вказаний білок пектинестераза не має активності або має знижену активність порівняно з білком пектинестеразою, що містить амінокислотну послідовність, як указано в SEQ ID NO:2, або через мутацію амінокислотної послідовності, або через видалення (необов'язково функціонального) білка пектинестерази. Пектинестераза каталізує деестерифікацію пектину до пектату і метанолу. Пектин є одним з основних компонентів стінки клітин рослини. Специфічну активність білка пектинестерази можна вважати "зниженою", якщо специфічна активність відносно деестерификації пектину такою пектинестеразою є статистично значно меншою, ніж специфічна активність пектинестерази, як показано в SEQ ID NO:2. Специфічна активність білка пектинестерази може, наприклад, бути зниженою щонайменше на 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % або більше. Знижена експресія ендогенного гена пектинестерази рослини може, наприклад, супроводжуватися зміною промоторної послідовності, наприклад, із використанням направленої заміни нуклеотидів. Фахівець у даній галузі є здатним визначати специфічну активність пектинестерази. Наприклад, PE активність ферменту можна визначати титруванням, як описано в Tucker et al. (Tucker GA, et al. (1982). J Sci Food Agric 33 396-400). Автори даного винаходу вважають, що порушення експресії функціонального білка пектинестерази (наприклад, за допомогою зниження, репресії або видалення експресії і/або активності) приводить до відсутності або зниження рівня функціонального білка пектинестерази, або внаслідок низької експресії, наприклад, за допомогою РНК-інтерференції, або внаслідок зниженої активності/функціональності білка пектинестерази, або одного або декількох з вищезгаданого, і що вказана відсутність або знижений рівень функціонального білка пектинестерази приводить до зниженої потреби у воді або поліпшеній засухостійкості вказаної рослини. Білок пектинестераза Arabidopsis thaliana складається з 383 амінокислот (амінокислотна послідовність показана на SEQ ID NO:2). кДНК, отримана з гена пектинестерази Arabidopsis thaliana, містить 1149 нуклеотидів, і її послідовність нуклеїнової кислоти показана на SEQ ID NO:1. Термін "білок пектинестераза", як застосовують в цьому документі, стосується білка, що містить амінокислотну послідовність як показано на SEQ ID NO:2, так само як його фрагментів і варіантів. Варіанти білка пектинестерази включають в себе, наприклад, білки, які мають щонайменше 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, або більше, наприклад, 100 %, ідентичності амінокислотної послідовності, переважно протягом повної довжини, з амінокислотною послідовністю з SEQ ID NO:2. Ідентичність амінокислотної послідовності можна визначати за допомогою попарного порівняння з використанням алгоритму Нідлмана і Вунша і параметрів GAP за замовчуванням, як визначено вище. Інший аспект даного винаходу стосується способу збільшення засухостійкості рослини, де спосіб включає в себе стадію порушення експресії у вказаній рослині гена, який кодує білок пектинестеразу. "Порушена експресія гена" відповідно до даного винаходу означає відсутність або знижену присутність функціонального білка пектинестерази. Фахівцеві в даній галузі добре відомі багато механізмів, доступних в даній галузі для порушення експресії гена, наприклад, на рівні транскрипції або на рівні трансляції. Порушення на рівні транскрипції може бути результатом введення однієї або декількох мутацій в послідовності для регуляції транскрипції, включаючи послідовності промоторів, енхансерів, ініціації, термінації або сплайсингу інтронів. Ці послідовності, як правило, локалізовані на 5'-, 3' -, або всередині кодуючої послідовності гена пектинестерази за винаходом. Незалежно, або спільно, порушення експресії можна здійснювати також за допомогою делеції, заміни, перестановки або вставки нуклеотидів у кодуючій області генів. Наприклад, у кодуючій області нуклеотиди можна замінювати, вставляти або делетувати, приводячи до введення одного, двох або більше передчасних стоп-кодонів. Також, вставка, делеція, перестановка або заміна може приводити до модифікацій в кодованій амінокислотній послідовності, і таким чином, приводити до порушеної експресії функціонального білка пектинестерази. Навіть більше: великі ділянки генів можна видаляти, наприклад, щонайменше 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або навіть 100 % (кодуючої області) гена 8 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 видаляють із ДНК, присутньої в рослині, таким чином, порушуючи експресію функціонального білка пектинестерази. Альтернативно, один, два, три або більше нуклеотидів можна вводити в ген або гени, які кодують білок пектинестеразу, або приводячи, наприклад, до зсуву рамки зчитування, або приводячи до введення послідовності, яка кодує додаткові амінокислоти, або до введення послідовності, яка не кодує амінокислоти, або до введення великих вставок, таким чином, порушуючи отримання/експресію функціонального білка пектинестерази. Іншими словами, делеція, заміна або вставка нуклеотиду(ів) в нуклеотидній послідовності, яка кодує білок пектинестеразу, як описано вище, може приводити, наприклад, до зсуву рамки зчитування, введення стоп-кодону, або введення безглуздого кодону. Зокрема, введення стопкодону і введення мутації зсуву рамки зчитування, є загальноприйнятими як ефективні способи отримання рослини з нокаутом, тобто, рослини зі зниженою, репресованою або видаленою експресією і/або активністю специфічного білка. Мутація зсуву рамки (яка також називається помилкою рамки або зсувом рамки зчитування) являє собою генетичну мутацію, викликану вставками-делеціями (вставками або делеціями) кількості нуклеотидів, яка не ділиться на три без залишку, в нуклеотидну послідовність. Через триплетну природу експресії гена за допомогою кодонів, вставка або делеція може змінювати рамку зчитування (угрупування кодонів), що приводить до трансляції, повністю відмінної від оригіналу. Що раніше в послідовності зустрічається делеція або вставка, то більш зміненим є продукований білок. Мутація зсуву рамки, як правило, викликає зчитування кодонів після мутації з кодуванням інших амінокислот, але тут можуть існувати винятки внаслідок виродженості генетичного коду. Більш того: стоп-кодон ("UAA", "UGA" або "UAG") у вихідній послідовності не зчитується, і альтернативний стоп-кодон може приводити до більш ранньої або більш пізньої ділянки зупинки. Отриманий білок може бути аномально коротким або аномальний довгим. Введення стоп-кодону в нуклеотидну послідовність, яка кодує білок пектинестеразу, як визначено в цьому документі, може приводити до передчасної зупинки транскрипції, яка, як правило, приводить до усіченого, неповного і нефункціонального білка пектинестерази. Переважно, стоп-кодон вводять рано у напрямку транскрипції. Що раніше в нуклеотидній послідовності введений стоп-кодон, то більш коротким і більш зміненим є білок, який продукується. Введення нонсенс-кодону в нуклеотидну послідовність, яка кодує білок пектинестеразу, може приводити до транскрипту мРНК, де, наприклад, один кодон більше не кодує амінокислоту, яка зустрічається в природі в пектинестеразі, наприклад, кодон, який в нормі кодує амінокислоту, яка є необхідною для білка пектинестерази, щоб бути функціональним. Таким чином, такий білок пектинестераза може не бути функціональним. Іншими словами, порушення може включати в себе введення мутацій одного або декількох нуклеотидів у генах або послідовностях нуклеїнової кислоти, описаних в цьому документі, що приводить або до присутності меншої кількості, або навіть до повної відсутності білкового продукту експресії (тобто до відсутності білка, який можна отримувати, коли гени за винаходом не модифіковані, як описано вище), або до присутності нефункціонального білка. Таким чином, в одному з варіантів здійснення способу, описаного в цьому документі, порушення є наслідком однієї або декількох мутацій у вказаному гені пектинестерази, що приводять до присутності меншої кількості білкового продукту експресії або до відсутності білкового продукту експресії порівняно з контрольною рослиною. Термін інгібування/присутність меншої кількості білкового продукту експресії, як застосовують в цьому документі, стосується зниження експресії білка щонайменше на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або навіть 99 % порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія не порушена. Термін "відсутність експресії білка" стосується фактичної відсутності будь-якого продукту експресії, наприклад, менше 5 %, 4 %, 3 %, 2 % або навіть менше 1 % порівняно з контролем. Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі, мутацію можна також вводити в нуклеотидну послідовність, яка кодує пектинестеразу, як визначено в цьому документі за допомогою введення мутагенних сполук, таких, як етилметансульфонат (EMS) або інші сполуки, здатні до (випадкового) введення мутацій в нуклеотидні послідовності. Такі мутагенні сполуки або вказану іншу сполуку можна використовувати як засоби для отримання рослин, які несуть мутацію в нуклеотидній послідовності, яка кодує білок пектинестеразу. Альтернативно, введення мутації в нуклеотидну послідовність, яка кодує білок пектинестеразу за винаходом, можна здійснювати за допомогою введення транспортної ДНК (ТДНК) в нуклеотидну послідовність, яка кодує такий білок, наприклад, Т-ДНК індукуючої пухлини (Ti) плазміди з деяких видів бактерій, таких, як Agrobacterium tumefaciens. Елемент Т-ДНК можна вводити у вказану нуклеотидну послідовність, що приводить або до нефункціонального 9 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білка, або до відсутності експресії білка, отже, до зменшення потреби у воді рослини, отриманої способом за винаходом (див., наприклад, Krysan et al. 1999 The Plant Cell, Vol 11. 2283-2290). Подібним чином, можна отримувати перевагу від використання вставки мобільного елемента (Див., наприклад, Kunze et al (1997) Advances in Botanical Research 27 341-370 або Chandlee (1990) Physiologia Planta 79(1) 105-115). В одному з варіантів здійснення введення мутації в нуклеотидну послідовність, яка кодує білок за винаходом, можна провести за допомогою TNE, наприклад, як описано в WO2007073170. З використанням TNE, специфічні нуклеотиди можна змінювати в нуклеотидній послідовності, яка кодує пектинестеразу, таким чином, наприклад, можна вводити стоп-кодон, який може, наприклад, приводити до нуклеотидної послідовності, яка кодує усічений білок зі зниженою або втраченою активністю пектинестерази. Інший варіант здійснення стосується способу, як описаний вище, в якому порушення експресії функціонального білка пектинестерази викликане експресією нефункціонального білка або білка зі зниженою функціональністю. Як пояснено вище, у фахівця в даній галузі не виникає проблем у визначенні функціональності генів за винаходом. Наприклад, фахівець в даній галузі може провести дослідження комплементації за допомогою введення контрольного гена, без яких-небудь модифікацій, в рослину, в якій експресія білка за винаходом порушена, і дослідження засухостійкості. Альтернативно, фахівець в даній галузі може провести експерименти, аналогічні до експериментів, описаних у прикладах нижче, і визначати засухостійкість у рослині, в якій одна або декілька мутацій введені в гени за винаходом, за допомогою порівняння з придатною контрольною рослиною/рослиною дикого типу. Порушення можна забезпечувати також на рівні трансляції, наприклад, за допомогою введення передчасного стоп-кодону або за допомогою посттрансляційних модифікацій, що впливають, наприклад, на згортання білка. Незалежно від механізму, на порушення відповідно до даного винаходу вказує відсутність або знижена присутність функціонального білка пектинестерази, включаючи присутність нормальних рівнів дисфункціонального білка пектинестерази. Як пояснено вище, термін інгібування експресії або знижена присутність, як використовують в цьому документі, стосується зниження експресії білка щонайменше на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або навіть 99 % порівняно з контрольною рослиною, в якій експресія не порушена. Термін "відсутність експресії білка" стосується фактичної відсутності якого-небудь продукту експресії, наприклад, менше 5 %, 4 %, 3 %, 2 % або навіть менше 1 % порівняно з контролем. Відповідно до іншого варіанта здійснення, вказане порушення викликане вимкненням гена, наприклад, РНК-інтерференцією або РНК-вимкненням. За допомогою способів молекулярної біології, легко доступних для фахівця в даній галузі, пошкодження генів можна здійснювати також за допомогою вимкнення гена, наприклад, із використанням способів РНК-інтерференції, длРНК або інших способів вимкнення експресії (див. наприклад, Kusaba et. al (2004) Current Opinion in Biotechnology 15:139-143, або Preuss and Pikaard (2003) in RNA Interference (RNAi)-Nuts & Bolts of siRNA Technology (pp.23-36), ©2003 by DNA Press, LLC Edited by: David Engelke, Ph.D.) або, як вже обговорювалося вище, нокауту. У іншому переважному варіанті здійснення, і як вже обговорювалося вище, представлений спосіб за винаходом, де пошкодження викликане вставкою, делецією і/або заміною щонайменше одного нуклеотиду. Наприклад, 1, 2, 3, … 10, 40, 50, 100, 200, 300, 1000 або навіть більше нуклеотидів можна вставляти, делетувати або замінювати в генах за винаходом. Передбачені також комбінації вставки, делеції і/або заміни, або в кодуючій, або в некодуючій областях гена. В іншому варіанті здійснення способу, описаного в цьому документі, спосіб включає в себе стадію порушення експресії у вказаній рослині більше 1, наприклад, 2, 3, 4, 5 або всіх генів, що кодують білок пектинестеразу. У цьому варіанті здійснення експресія більше одного гена, як описано вище, присутнього в конкретній рослині, порушена. Наприклад, експресія одного, двох, трьох, чотирьох або всіх генів, що кодують білок пектинестеразу, які присутні в рослині, порушена. За допомогою порушення експресії більшої кількості генів, як описано вище, в один і той же час (коли вона присутня в рослині), можна досягати навіть більш поліпшеної засухостійкості. В іншому варіанті здійснення, рослину, отримана способом за винаходом, можна використовувати для отримання додаткових рослин і або отриманих з них продуктів рослинного походження. Термін "продукти рослинного походження" стосується того матеріалу, який можна отримувати з вирощених рослин, і включає в себе плоди, листя, органи рослин, рослинні жири, 10 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рослинні олії, рослинний крохмаль, фракції рослинного білка, подрібнені, розмелені або все ще інтактні, змішані з іншими матеріалами, висушені, заморожені, і т. д. Як правило, такі продукти рослинного походження можна, наприклад, розпізнати за присутністю гена, як описано в цьому документі, модифікованого таким чином, що експресія функціонального білка порушена, як детально описано вище. Переважно, експресія і/або активність білка пектинестерази за винаходом порушена (наприклад, знижена, репресована або делетована) в рослині, що належить до сімейства Brassicaceae, включаючи Brassica napus (рапс посівний), сімейства Solanaceae, включаючи томат, або сімейства Curcurbitaceae, включаючи диню і огірок, або сімейства Poaceae, включаючи Oryza, включаючи рис, або кукурудзу звичайну, включаючи маїс (кукурудзу), або Fabaceae, включаючи боби, горох або квасолю. Переважно, спосіб за винаходом використовують для томата, рису, маїсу, дині або огірка, таким чином отримуючи рослини зі зниженою потребою у воді або поліпшеною засухостійкістю порівняно з відповідною контрольною рослиною. Представлені також клітина рослини, рослина або продукт рослинного походження, який походить з них, які можна отримувати способом за винаходом, і де для вказаної клітини рослини, рослини або продукту рослинного походження показана знижена експресія функціонального білка пектинестерази, порівняно з контрольною рослиною, не підданою впливу способом за винаходом. Представлені також клітина рослини, рослина або отриманий з них продукт рослинного походження, які відрізняються тим, що у вказаній клітині рослини, рослині або отриманому з них продукті рослинного походження експресія щонайменше одного, переважно, всіх генів, які кодують білок пектинестеразу, таких, як ті, де послідовність кДНК, відповідна послідовності мРНК, транскрибованої з вказаного щонайменше одного гена, містить послідовність, показану на SEQ ID NO:1, і послідовності кДНК з більш, ніж 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ідентичністю з нуклеотидною послідовністю з SEQ ID NO:1, і/або де амінокислотна послідовність, кодована вказаним щонайменше одним геном, містить послідовність, показану на SEQ ID NO:2 або її варіант, порушена. Переважно, рослина не являє собою мутант Arabidopsis thaliana, як описано в прикладах нижче, або мутант Brachypodium зі вставкою Т-ДНК. В іншому аспекті винахід стосується використання гена, де послідовність кДНК, відповідна послідовності мРНК, транскрибованої зі вказаного гена, містить послідовність, показану на SEQ ID NO:1, і послідовності кДНК з більш, ніж 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ідентичністю з нею, і/або де амінокислотна послідовність кодована вказаним щонайменше одним геном, містить послідовність, показану на SEQ ID NO:2, і амінокислотні послідовності з більш ніж 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ідентичністю з нею, для надання збільшеної засухостійкості рослині. У цьому варіанті здійснення описаний ген можна використовувати як мішень для поліпшення засухостійкості рослини, відповідно до опису в цьому документі, або ген можна використовувати для ідентифікації нових білків, залучених до чутливості і стійкості до засухи. Інший варіант здійснення стосується застосування послідовності пектинестерази, що має SEQ ID NO:1 або 2, з виду Arabidopsis thaliana в скринінгу рослин Arabidopsis thaliana із засухостійкості. Крім того, представлене застосування, де послідовність пектинестерази є аналогічною послідовності SEQ ID NO:1 або 2 з інших видів рослин, і де скринінг проводять для рослин з інших видів рослин. Більш того: представлений спосіб скринінгу рослин або клітин рослин з поліпшеною засухостійкістю, який включає в себе стадії: - отримання гетерогенної популяції клітин рослин або рослин виду Arabidopsis thaliana; - отримання послідовності пектинестерази, що має SEQ ID NO:1 або 2; - визначення послідовності щонайменше частини гена пектинестерази клітин рослин або рослин; - порівняння певних послідовностей пектинестерази з клітин рослин або рослин з отриманою послідовністю пектинестерази; - ідентифікації клітин рослин або рослин, де послідовність пектинестерази містить мутацію. Альтернативно за способом, клітини рослин або рослини, які отримані, належать до інших видів, і послідовність гена пектинестерази, яка отримана, являє собою аналогічну послідовність з інших видів. Таким чином, з використанням послідовності пектинестерази SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2 з виду Arabidopsis thaliana, або аналогічної їй послідовності з інших видів, у видах рослин можна ідентифікувати мутантні послідовності пектинестерази, які можуть забезпечувати поліпшену засухостійкість. Послідовність в інших видах, аналогічну послідовності пектинестерази SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2 з виду Arabidopsis thaliana, визначають як послідовність, що має 11 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щонайменше 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або щонайменше 99 % ідентичності послідовності з нею. Аналогічний білок пектинестераза може мати по суті таку ж функцію, як SEQ ID NO:2. Аналогічні послідовності показані як SEQ ID NO:3-10 в списку послідовностей і отримані з Brassica rapa, Solanum lycopersicum і Oryza sativa відповідно. Ідентичність їх послідовності порівняно з SEQ ID NO:2 вказана в таблиці 2 нижче. За способом, представлена гетерогенна популяція клітин рослин або рослин з виду. Гетерогенну популяцію можна отримувати, наприклад, піддаванням клітин рослин впливу мутагену, який вносить випадкові мутації, таким чином, отримуючи гетерогенну популяцію клітин рослини. Таким чином, гетерогенну популяцію можна отримувати з одного сорту рослини, яку піддають випадковому мутагенезу для отримання множини мутацій в потомстві, таким чином, отримуючи гетерогенну популяцію. У даній галузі відома множина мутагенів, наприклад, іонне випромінювання, УФ-випромінювання і мутагенні хімічні речовини, такі, як азиди, бромід етидію або етилметансульфонат (EMS). Таким чином, фахівцеві в даній галузі відомо, як отримувати гетерогенну популяцію рослин або клітин рослин. А також, фахівець в даній галузі може також отримувати множину рослин в формі гетерогенної популяції, тобто не єдиного сорту, з виду. Для сорту рослин показана генетична різноманітність, вони не є генетично ідентичними, але оскільки рослини належать до одного і того ж виду, вони є по суті ідентичними. У будь-якому випадку, гетерогенна популяція клітин рослин або рослин може мати щонайменше 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98 %, 99 %, 99,5 % або щонайменше 99,9 % ідентичності послідовності. За допомогою визначення щонайменше частини послідовності гена пектинестерази з послідовністю з рослин або клітин рослин з гетерогенної популяції, і подальшого порівняння цих послідовностей з наданою послідовністю гена пектинестерази (контрольною), можна ідентифікувати клітини рослин або рослини, які містять мутацію в послідовності гена пектинестерази. Зрозуміло, що таке порівняння можна здійснювати за допомогою вирівнювання послідовностей, і що мутація являє собою відмінність відносно щонайменше одного положення нуклеїнової кислоти або амінокислоти в аналогічній (контрольній) послідовності пектинестерази з виду рослин. Таким чином, ідентифікують рослини або клітини рослин, які мають мутації в гені пектинестерази (наприклад, вставки, делеції, заміни), які можуть забезпечувати поліпшену засухостійкість. Переважно, відбирають рослини, які мають мутації, які можуть приводити до порушення експресії функціонального білка пектинестерази, так, як вже описано вище. Мутації, які можуть приводити до порушення експресії функціонального білка пектинестерази, можуть являти собою мутації, які можуть порушувати відкриту рамку зчитування (введення зсуву рамки або стоп-кодону) або порушувати або іншим чином змінювати функцію кодованого білка за допомогою зміни нуклеотидів у кодонах, які кодують амінокислоти, що є необхідними для правильного функціонування білка, таким чином, приводячи до модифікованої (наприклад, збільшеної) засухостійкості порівняно з не зміненим білком. Спосіб можна використовувати також, наприклад, для скринінгу і селекції рослин, підданих генетичній модифікації, націленій на послідовність гена пектинестерази, як описано вище. А також, послідовність пектинестерази можна використовувати також в аналізі скринінгу, в якому (гетерогенну) популяцію рослин піддають засусі. Інший варіант здійснення стосується використання щонайменше частини послідовності пектинестерази, яка має SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:2 з виду Arabidopsis thaliana, як маркера для виведення засухостійких рослин Arabidopsis thaliana. А також, послідовність пектинестерази може являти собою аналогічну послідовність з іншого виду, де маркер призначений для виведення засухостійких рослин з іншого виду рослин. Винахід, крім того, стосується використання рослини, клітини рослини або продукту рослинного походження, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена, де функціональний білок пектинестераза являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до рослини з порушеною засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якому вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується, для росту в стресових умовах засухи, де вказані стресові умови засухи примушують контрольну рослину, клітину рослини або продукт рослинного походження, в яких експресія вказаного функціонального білка пектинестерази не порушена, демонструвати ознаки стресу через засуху, такі, як ознаки в'янення, раніше, ніж рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена. 12 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Один з аспектів даного винаходу стосується рослини, клітини рослини або продукту рослинного походження, які можна отримати або які отримані способом, поясненим в цьому документі. Крім того, винахід стосується насіння, отриманого з такої рослини. Винахід також стосується рослини, клітини рослини або продукту рослинного походження, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена, де функціональний білок пектинестераза являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою ТДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до рослини з порушеною засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якій вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується. Рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження можуть являти собою будьяку рослину або клітину рослини, або можуть походити з будь-якої рослини, такої, як однодольні рослини або дводольні рослини, але найбільш переважно, рослина належить до сімейства Solanaceae. Наприклад, рослина може належати до роду Solanum (включаючи lycopersicum), Nicotiana, Capsicum, Petunia і інших родів. Наступні види-хазяїни можна використовувати придатним чином: тютюн (види Nicotiana, наприклад N. benthamiana, N. plumbaginifolia, N. tabacum і т. д.), види овочів, такі, як томат (Solanum lycopersicum), наприклад, вишневидний томат, var. cerasiforme або смородиновидний томат, var. pimpinellifolium) або цифомандра томатне дерево (S. betaceum, синонім Cyphomandra betaceae), картопля (Solanum tuberosum), баклажан (Solanum melongena), пепіно (Solanum muricatum), кокона (Solanum sessiliflorum) і наранхіла (Solanum quitoense), перці (Capsicum annuum, Capsicum frutescens, Capsicum baccatum), види декоративних рослин (наприклад, Petunia hybrida, Petunia axillaries, Р. integrifolia). Альтернативно, рослина може належати до будь-якого іншого сімейства, такого, як Cucurbitaceae або Gramineae. Придатні рослина-хазяїни включають в себе, наприклад, маїс/кукурудзу (вид Zea), пшеницю (вид Triticum), ячмінь (наприклад, Hordeum vulgare), овес (наприклад, Avena sativa), сорго (Sorghum bicolor), жито (Secale cereale), сою (види Glycine, наприклад, G. max), бавовник (види Gossypium, наприклад, G. hirsutum, G. barbadense), види Brassica (наприклад, В. napus, В. juncea, В. oleracea, В. rapa і т. д.), соняшник (Helianthus annus), сафлор, батат, маніоку, люцерну (Medicago sativa), рис (види Oryza, наприклад, O. Sativa культивар-група indica або культивар-група japonica), кормові трави, просо (види Pennisetum, наприклад, Р. glaucum), види дерев (Pinus, тополя, ялиця, плантайн і т. д.), рослини чаю, кави, олійну пальму, кокосову пальму, види овочевих рослин, такі, як горох, цукіні, квасоля (наприклад, види Phaseolus), огірок, артишок, спаржа, броколі, часник, цибуля-порей, латук, цибуля, редиска, турнепс, брюсельська капуста, морква, цвітна капуста, цикорій, селера, шпинат, ендивій, фенхель, буряк, рослини з м'ясистими плодами (виноград, персики, сливи, полуниці, манго, яблуня, слива, вишня, абрикос, банан, ожина, чорниця, цитрусові рослини, ківі, інжир, лимон, лайм, нектарин, малина, кавун, апельсин, грейпфрут і т. д.), види декоративних рослин (наприклад, види троянди, петунії, хризантеми, лілії, гербери), трави (м'ята, петрушка, базилік, чебрець і т. д.), деревні рослини (наприклад, види Populus, Salix, Quercus, Eucalyptus), види волокнистих рослин, наприклад, льон (Linum usitatissimum) і коноплі (Cannabis sativa), або модельні організми, такі, як Arabidopsis thaliana. Переважними хазяїнами є "сільськогосподарські рослини", тобто види рослин, які культивуються і які виводяться людиною. Сільськогосподарську рослину можна культивувати для харчових цілей (наприклад, польові культури) або для декоративних цілей (наприклад, отримання квітів для зрізання, трав для газонів і т. д.). Сільськогосподарська рослина, як визначено в цьому документі, включає в себе також рослини, з яких отримують нехарчові продукти, такі, як масло для палива, пластичні полімери, фармацевтичні продукти, пробку і т. п. Переважно, рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження за винаходом не являє собою рослину, клітину рослини або продукт рослинного походження з Arabidopsis thaliana або Brachypodium. Рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження за винаходом може, наприклад, являти собою рослину, клітину рослини або продукт рослинного походження з Solanum lycopersicum або Brassica rapa. Наприклад, даний винахід стосується рослини, клітини рослини або продукту рослинного походження з Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, видів Triticum, Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale або Brassica napus, в яких експресія функціонального білка пектинестерази порушена, де функціональний білок пектинестераза являє собою білок, який при експресії в лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, приводить до рослини з порушеною 13 UA 115780 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 засухостійкістю порівняно із засухостійкістю вказаної лінії Arabidopsis thaliana зі вставкою Т-ДНК, яка має пошкоджений ендогенний ген пектинестерази, в якому вказаний функціональний білок пектинестераза не експресується. Вказані рослина, клітина рослини або продукт рослинного походження з Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, видів Triticum, Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale або Brassica napus можуть містити пошкоджений ендогенний ген пектинестерази. Повний зміст усіх посилань, процитованих в цьому документі, наведений в цьому документі як посилання. Приклади Приклад 1 Тест при засусі Насіння Arabidopsis thaliana (At), трансформованої Agrobacterium tumefaciens з вектором pROK2, що приводить до відсутності функціонального білка пектинестерази (NASC ID: N664100, код AGI At5g19730 і SALK_136556C; що надалі в цьому документі позначаються як мутантне насіння або мутантні рослини), отримане з Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC; School Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD United Kingdom). Як контроль використали At Col-0 (Columbia, N60000); що надалі в цьому документі позначається як контрольне насіння або рослина). Середовище для росту: Використали ґрунтову суміш, яка містить одну частину піску і вермікуліту і дві частини компосту (пісок:вермікуліт:компост = 1:1:2). Ця суміш збільшує просочення води, таким чином, полегшує однорідне поглинання води в кожному горщику і поліпшує відведення води. Перед посівом насіння зберігали при 4C протягом 3 діб в умовах темряви і вологості для стратифікації. Як мутантне, так і контрольне насіння висівали в прямокутний піддон, що містить 85=40 горщиків діаметром ~4 см зі щільністю 5 рослин на горщик. Поживний розчин (EC=1.5) доставляли до всіх рослин з дна горщиків у піддоні через 10 діб після проростання (DAG), і на 15 DAG рослини піддавали засусі (протягом 15, 16, 17 або 18 діб) за допомогою перенесення горщиків у сухі піддони. Потім рослини регідратували і обстежували за відновленням через 1 тиждень. Три повтори горщиків для кожного генотипу включали в попередній скринінг при засусі. Загальний час, необхідний для повного тесту, становив приблизно 36-39 діб. Оцінка аналізу при засусі: Після досягнення рослинами стадії 2 істинного листя їх проріджували для підтримання точно 5 рослин на горщик. На 10 DAG рослини отримували підгодівлю (EC=1.5) і на 15 DAG кожний горщик переносили в сухий піднос. З цієї доби і надалі рослини не отримували води. Кожну добу у рослин, особливо контрольних (або дикого типу) (Col-0), спостерігали ознаки в'янення. На 15-у добу засухи (DOD), Col-0 в'янули повністю і не відновлювалися після регідратації. Автори даного винаходу визначили цю добу як їх точку стійкого в'янення (PWP). З цієї доби і надалі по одному повтору з мутантів регідратували і спостерігали ознаки відновлення, і отримували фотографії. Для мутантів показали виживання щонайменше на 2 доби більше при засусі порівняно з контролем, і їх піддавали подальшому ретельному скринінгу. Приклад 2 Тест при засусі Середовище для росту: Такі ж мутантні і контрольні рослини, як в прикладі 1, вирощували в подібному піддоні, організованому, як описано вище в тесті попереднього скринінгу. Рослини піддавали стресу за допомогою відсутності води від 15 DAG до досягнення контролем PWP. Протягом цього періоду кожну другу добу горщики міняли місцями всередині піддонів, щоб зменшити ефекти положення і дозволити рівномірне випаровування. На добу 15 DOD контрольні рослини досягли PWP і не відновлювалися при регідратації. Повтор одного горщика мутанта регідратували щодобово від 15 DOD і далі, і перевіряли за відновленням після стресу через засуху. Отримували фотографії і відновлення оцінювали в балах. Для мутанта показане відновлення після стресу через засуху протягом щонайменше 3 діб більше після того, як контроль досягав PWP. На фігурі 1 показана фотографія, яка порівнює мутант і контроль, що показує чудовий ефект для мутанта щодо стресу через засуху порівняно з контролем. Приклад 3 Тест при засусі Матеріали і методи Рослинний матеріал. Лінію зі вставкою Т-ДНК з порушеним геном AT5G19730 (пектинестерази) (SALK_136556C) отримували з Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC). Лінії з комплементацією отримували за допомогою стабільної трансформації рослин Arabidopsis thaliana з використанням трансформації зануренням квітів (Bent et al., 2006. Methods Mol. Biol. 14 UA 115780 C2 Vol. 343:87-103). Ідентифікували гомологи гена пектинестерази з Arabidopsis thaliana (AT5G19730) з декількох видів сільськогосподарських культур, включаючи Brassica rapa (капуста), Solanum lycopersicum (томат) і Oryza sativa (рис), і модельного виду Arabidopsis thaliana.5 Анотація Пектинестераза 10 Arahidopsis thaliana Brassica rapa Solatium lycopersicum Oryza sativa AT5G19730 (SEQ ID N0:1 і 2) Br81413.g42 (SEQ ID N0:3 і 4) Slg24530 (SEQ ID N0:5 і 6) Os01g53990_1 (SEQ ID N0:7 і 8] Os01g53990_2 (SEQ ID N0:9 і 10] Процент ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти між послідовністю кДНК пектинестерази з Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:1) і послідовностями гомологів кДНК в Brassica rapa (Br81413; SEQ ID NO:3), Solanum lycopersicum (Slg24530; SEQ ID NO:5) і Oryza sativa (Qs01g53990_1 і Qs01g53990_2; SEQ ID NO:7 і 9 відповідно)(перша колонка); і процент ідентичності амінокислотної послідовності між білковою послідовністю пектинестерази з Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:2) і білковими послідовностями гомологів у Brassica rapa (Br81413; SEQ ID NO:4), Solanum lycopersicum (Slg24530; SEQ ID NO:6) і Oryza sativa (Os01g53990_1 і Os01g53990_2; SEQ ID NO:8 і 10 відповідно)(друга колонка) 15 Br81413 Slg24530 Os01g53990_1 Os01g53990_2 20 25 30 35 40 45 % ідентичності послідовності кДНК 89 65 65 64 % ідентичності амінокислотної послідовності 91 57 63 61 Аналіз при засусі. Лінії дикого типу, з нокаутом Т-ДНК і після комплементації висівали в дизайні блоків повторів у піддони для сіянців з 50 комірками, що містять суміш 2:1:1 ґрунтозамінного середовища Metro-Mix 852, дрібного піску і вермікуліт. Піддони з рослинами вміщували при 4C на три доби для виведення зі стану спокою і потім переносили в камеру для вирощування (16 год., 22/20C, 50 % rH) для проростання і приживання. Лінії після комплементації обприскували складом із глуфосинатом (20 мг глуфосинату, 20 мкл поверхневоактивної речовини Silwet, 200 мл води) як тільки у них повністю розкривалися сім'ядолі, щоб переконатися в селекції тільки трансформованих ліній. Після цієї обробки сіянці в кожній комірці проріджували до окремої рослини. Після досягнення рослинами стадії 4-6 істинного листя їх акліматизували до умов більшої нестачі тиску водяних парів для стимуляції рівномірного стресу через засуху (28/26C, 25 % rH), і ідентифікували незвичайно малі рослини для видалення перед впливом засухи. Піддони з рослинами змочували водою і потім дозволяли висохнути, залишаючи всі комірки при місткості горщиків. Цілі піддони поливали, як тільки половина рослин дикого типу в будь-якому даному піддоні, вочевидь, досягала їх точки стійкого в'янення (1,5-2 тижні впливу засухи). Рослинам дозволяли відновлюватися протягом декількох діб, і реєстрували виживаність, з виключенням заздалегідь ідентифікованих незвичайно малих рослин із подальших аналізів. Статистичний аналіз. Статистичну значущість відмінностей імовірностей виживаності протягом цього впливу засухи оцінювали за допомогою застосування тесту однакових або даних співвідношень у статистичному програмному забезпеченні R (http://www.r-project.org/). Функцію prop.test використовували для тестування нульової гіпотези, що співвідношення рослин, які вижили, між мутантною лінією і лінією дикого типу (односторонній), або альтернативно, між лініями інсерційних мутантів, які містять або не містять комплементуючі трансгени (двосторонній), були однаковими. Результати На фігурі 2 показаний засухостійкий фенотип (At5g19730 КО) порівняно із засухочутливим фенотипом (диким типом). На фігурі 3 показана виживаність при засусі інсерційного мутанта Arabidopsis At5g19730 (нокаут пектинестерази). Інсерційний мутант Arabidopsis At5g19730 виживав при засусі значно краще (р0,05), ніж рослини дикого типу або інсерційні мутанти At5g19730 після комплементації гомологами з Brassica rapa ("трансген Br81413"), Solanum lycopersicum ("трансген Slg24530"), або Oryza sativa ("трансген Os01g53990_1" і "трансген 15 UA 115780 C2 5 Os01g53990_2"). На цій фігурі показано, не тільки те, що інсерційна мутація в цьому гені забезпечує засухостійкий фенотип, а також що гомологи цього гена з еволюційно віддалених однодольних (Oryza sativa) і дводольних видів (Arabidopsis thaliana, Brassica rapa, Solanum lycopersicum) діють для відновлення нормального засухочутливого фенотипу. Сірі стовпчики мають значно більш низькі значення (р