Фармацевтична композиція уреази для інгібування росту ракових клітин і її застосування

1. Фармацевтична композиція для застосування в інгібуванні росту ракових клітин у ссавців, яка містить ензим уреази; націлювальний компонент, безпосередньо кон'югований з вказаним ензимом уреази та вибраний з групи, яка складається з протипухлинного антигенного антитіла, анти-hCG антитіла і ліганду, здатного до зв'язування специфічно з поверхневими рецепторами ракових клітин, де вказаний націлювальний компонент є ефективним для поліпшення доставки ензиму до ракових клітин при введенні композиції суб'єкту; і необов'язково, протиракову сполуку з властивостями слабкої основи, ефективність якої C2 2 81634 1 3 конкретного типу раку, залежатиме від таких факторів, як вік пацієнта, ступінь локалізації раку, і тип і стадія раку. Часто терапія включає поєднання двох або більше модальностей, таких як рентгенотерапія в поєднанні з хіміотерапією, або з імунотерапією в поєднанні з хіміотерапією. Була залучена велика кількість хіміотерапевтичних сполук і композицій і стратегій у лікування раків. Багато які антинеопластичні сполуки розроблені з тим, щоб зруйнувати реплікацію у клітинах, що швидко діляться, або з тим, щоб інгібувати ключовий метаболічний зв'язок в клітинах, що активно проліферуються. Хоча застосування таких підходів було успішним для конкретних типів раків, або раків на конкретних стадіях, хіміотерапія взагалі пов'язана з неприємними до ослаблення побічними ефектами, такими як, наприклад, нездужання, нудота, втрата апетиту, облисіння і анемія. Надалі, сполуки, які діють на рівні реплікації клітин, або за допомогою внесення нуклеотидних аналогів в клітини, які діляться, або за допомогою руйнування нормальної реплікації, мають потенціал внесення широко поширених генетичних мутацій в нормальних клітинах у об'єкта. Крім того, ракові клітини можуть розвинути стійкість до багатьох типів протиракових агентів, або за допомогою обмеження поглинання агента в клітини, або за допомогою зміни метаболізму агента всередині клітин. Як відповідь до цих обмежень, були зроблені спроби модифікувати хіміотерапевтичні агенти, щоб зменшити їх побічні ефекти, подолати проблеми стійкості або вдосконалити їх націлювання на вибрані локалізації пухлин. У той час, як ці зусилля дали вдосконалені терапевтичні результати у деяких випадках, все ж залишається потреба у забезпеченні поліпшеного хіміотерапевтичного агента і способу. Зокрема, такий агент повинен бути ефективним у знищенні або інгібуванні росту ракових клітин, повинен бути відносно нетоксичним як у відношенні побічних ефектів, так і у відношенні тривалих ефектів на генетичну цілісність суб'єкта, що піддається лікуванню, і переважно поставлятись у формі, яка забезпечує пряме попадання в пухлину або селективне націлювання на пухлини. Винахід забезпечує фармацевтичну композицію для застосування в інгібуванні росту ракових клітин у ссавця. Композиція включає ензим уреази, такий як, наприклад, бактеріальну або рослинну уреазу, і хімічний об'єкт, асоційований з уреазою для поліпшення доставки ензиму до ракових клітин, при введенні композиції суб'єкту. В одному втіленні, хімічний об'єкт включає гідрофільний полімер, який кон'югується з уреазою в кількості, ефективній для розширення часу кровообігу або зменшення антигенності згаданої композиції по відношенню до природної уреази. Полімер може бути, наприклад, поліетиленгліколем, полівінілпіролідоном, полівінілметилефіром, полігідроксипропіл метакриламідом, полігідроксипропіл метакрилатом, полігідроксіетил акрилатом, 81634 4 поліметакриламідом, полідиметилакриламідом, поліметилоксазоліном, поліетилоксазоліном, полШдроксіетилоксазоліоном, полігідроксипропіок£азоліном, поліаспартамід, або гідрофільними целюлозними похідними. Полімер є, переважно, полімером з лінійним ланцюгом, таким як поліетиленглікольний лінійний ланцюг, що має молекулярну вагу між близько 1,000 і 10,000 дальтон. Хімічний об'єкт може бути націлювальною частиною, приєднаною до уреази, такою як протиракове антигенне антитіло, анти-hCG антитіло або ліганд, здатний до зв'язування специфічно до поверхневих рецепторів ракових клітин. Там, де націлювальна частина являє собою поліпептид, композиція може бути злитим протеїном націлювальної частини і ензиму уреази. Альтернативно, там, де уреаза може включати, на її С- або N-кінці, перший кільцеутворювальний пептид, який характеризується селективним зарядом і кільцеутворювальним пептидом, з тим щоб сформувати стійкий α-спіральний біспіральний гетеродимер; і хімічний об'єкт може включати націлювальну частину, яка включає другий кільцеутворювальний пептид. Хімічний об'єкт може включати везикули, які мають ензим уреази у захопленій формі. Зразкові везикули включають ліпосоми, які є довгоциркулюючими завдяки зовнішньому покриттю ланцюгів поліетиленгліколю і є такого розміру, щоб витікати в пухлинні клітини, коли композицію вводять внутрішньовенно, і ліпосоми, що мають поверхнево зв'язані націлювальні частини. Везикули можуть включати додаткові агенти, такі як сечовина, терапевтично активний протипухлинний агент або радіофармацевтичний агент. Хімічний об'єкт може включати інгібітор уреази, асоційований з ним, в кількості, достатній, щоб інгібувати активність згаданого ензиму. В іншому аспекті, винахід включає спосіб інгібування росту ракових клітин у ссавців. Спосіб включає піддавання клітин дії уреази в кількості, ефективній, щоб інгібувати ріст ракових клітин. Там, де ракові клітини включають солідну пухлину, уреаза може бути ін'єктована безпосередньо в пухлину суб'єкта або введена парентерально, наприклад, ін'єкцією, або іншим безпосереднім введенням. В доповнення до уреази у фармацевтично прийнятному носії, також придатні для застосування в даному винаході різні композиції, які містять уреазу, зазначену вище. Спосіб може включати модулювання активності уреази на ракових клітинах за допомогою введення суб'єкту кількості інгібітора уреази, ефективної для зменшення активності уреази на згаданих ракових клітинах. Активність уреази може модулюватись у протилежному напрямку за допомогою введення суб'єкту сечовини до, під час, або після введення уреази. Уреаза може бути введена у дві стадії: перша стадія, яка включає кон'югат націлювальної частини пухлини і першої зв'язувальної частини, що має здатність взаємодіяти з другою зв'язувальною частиною; і друга стадія, яка 5 включає другий кон'югат, що містить другу зв'язувальну частину, кон'юговану з уреазою. Ще в іншому втіленні, спосіб може включати введення суб'єкту композиції генної терапії, що складається з націлювального вектора, ефективного при введенні суб'єкту, щодо селективного трансфікування ракових клітин, і переношуваної в згаданому векторі рекомбінантної послідовності нуклеїнової кислоти, ефективної для продукування уреази мРНК у трансфікованих ракових клітинах. Зразковий вектор являє собою аденовірус. Зразкова послідовність нуклеїнової кислоти кодує уреазу і секреторну лідерну послідовність, ефективну для підвищення секреції уреази з трансфікованих ракових клітин. У пов'язаному аспекті, винахід забезпечує спосіб збільшення терапевтичної ефективності слабо основної протипухлинної сполуки, ефективність якої зменшується вищим внутрішньоклітинним/нижчим позаклітинним рН градієнтом у солідній пухлині, у суб'єкта, що отримує агент для лікування пухлини. Цей спосіб включає введення суб'єкту кількості уреази, ефективної для зменшення або повної зміни вищого внутрішньоклітинного/нижчого позаклітинного рН градієнту у солідній пухлині. Переважно, кількість уреази, яка вводиться, є ефективною для підвищення рівня позаклітинної рідини пухлини до щонайменше рН7,2. Уреаза може бути ін'єктована безпосередньо в пухлину, або введена парентерально, що відрізняється від безпосереднього введення, як вказано вище. Протипухлинна сполука може являти собою, наприклад, доксорубіцин, даунорубіцин, мітоксантрон, епірубіцин, мітоміцин, блеоміцин, алкалоїди вінка, такі як вінбластин і вінкристин, алкілуючі агенти, такі як циклофосфамід і гідрохлорид мехлоретаміну, і похідні антринеопластичного пурину або піримідину. Ще в іншому аспекті, винахід корисний в оцінці присутності, розміру або стану солідної пухлини у суб'єкта. Тут, уреазу вводять суб'єкту, що має або вважається таким, що має солідну пухлину, в умовах, ефективних для локалізації уреази в солідній пухлині у суб'єкта. Потім суб'єкта детально досліджують за допомогою діагностичних інструментальних засобів, таких як рентгеноскопія, ЯМР, або позитронна емісійна томографія, здатних до виявлення змін в позаклітинному рівні рН всередині тканини суб'єкта, або у присутності або за відсутності рНчутливого репортера, для визначення ділянки тканини суб'єкта, що показує зростання позаклітинного рівня рН. Цей спосіб може бути використаний в поєднанні з вищезазначеним способом лікування, з тим щоб оцінити тривалість і/або ефективність дозування уреази або лікування. Так, наприклад, при введенні уреази суб'єкту, можна слідувати поширенню і ступеню зміни рівня рН в пухлинній ділянці для того, щоб спрямовувати введення уреази або щоб оцінити зміни в розмірі або поширенні пухлини протягом лікування. 81634 6 Також розкритий набір для застосування в інгібуванні росту ракових клітин у ссавців. Набір включає фармацевтичну композицію, що містить ензим уреази, та інструкції, які пояснюють введення композиції суб'єкту для лікування раку суб'єкта. Інструкція може роз'яснити введення композиції уреази суб'єкту в кількості, яка залежить від розміру пухлини і складає від 0,1 до 100 міжнародних одиниць, переважно від 0,5 до 10, активності уреази на мм3 пухлини, коли композицію вводять безпосередньою ін'єкцією в пухлину, і в кількості між 100-100,000 міжнародних одиниць/кг, переважно 500-10,000 міжнародних одиниць/кг міжнародних одиниць активності уреази/кг ваги тіла суб'єкта, коли композицію вводять суб'єкту парентерально, що відрізняється від безпосередньої ін'єкції в пухлину. Інструкція може роз'яснити введення суб'єкту уреази, який також отримує слабо основну протипухлинну сполуку, ефективність якої зменшується вищим внутрішньоклітинним/нижчим позаклітинним рН градієнтом в солідній пухлині, в кількості уреази, ефективній для зменшення або повної зміни вищого внутрішньоклітинного/нижчого позаклітинного рН градієнту у солідній пухлині. Інструкція може роз'яснити введення суб'єкту уреази, який має або вважається таким, що має солідну пухлину, в умовах, ефективних для локалізації уреази в солідній пухлині у суб'єкта, детально досліджуючи суб'єкта за допомогою діагностичних інструментальних засобів, здатних до виявлення змін в позаклітинному рівні рН всередині тканини суб'єкта та ідентифікації пухлинної ділянки у суб'єкта, що показує зростання позаклітинного рівня рН після вказаного введення. Також розкрита композиція генної терапії для застосування в інгібуванні росту ракових клітин у ссавців. Ця композиція включає, як зазначено вище, націлювальний вектор, ефективний при введенні суб'єкту, щодо селективного трансфікування ракових клітин, і переношувану у вказаному векторі рекомбінантну послідовність нуклеїнової кислоти, ефективну для продукування уреази мРНК у трансфікованих ракових клітинах. Ці та інші об'єкти та характеристики винаходу стануть більш повністю очевидними з наступного докладного опису винаходу разом із супровідними кресленнями. Короткий опис креслень Фіг.1A-1D демонструють стадії реакції уреази. Сечовина розщеплюється уреазою для продукування однієї молекули аміаку і одного карбам ату (А). Карбамат мимовільно розкладається на аміак і карбонову кислоту (В). Карбонова кислота урівноважується у воді (С), як роблять дві молекули аміаку, що стають протонованими для одержання амонію та іонів гідроксиду (D). Реакція закінчується підвищенням рівня рН середовища реакції; Фіг.2 показує мас-спектрометричний профіль сирого продукту, який містить уреазу, яку готують відповідно до одного з втілень винаходу; 7 Фіг.3 ілюструє профілі афінності очищення уреази на різних стадіях процесу очищення, відповідно до іншого втілення винаходу; Фіг.4 ілюструє очищення кон'югату Е-кільцеahEGFR IgG колонкою протеїн-G, одержаного відповідно до одного з втілень винаходу; і Фіг.5 показує титр антитіла очищеного кон'югату Е-кільце-ahEGFR IgG, приготованого відповідно до одного з втілень винаходу, як визначено імобілізованим К-кільцем ELISA. І. Визначення Якщо інакше не вказано, всі технічні і наукові терміни, які використовуються тут, мають такі ж значення, які відомі кваліфікованому фахівцю в даній галузі техніки. Практикуючий спеціаліст особливо керується [Sambrook et al. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, 3rd Ed.; and Ausubel, P.M., et al. (1993) in Current Protocols in Molecular Biology], щодо визначень і термінів галузі. Повинно бути зрозумілим, що даний винахід не обмежуються конкретною методологією, протоколами і реактивами, які описані вище, оскільки вони можуть змінюватись. Термін "уреаза" відноситься до ензиму, що має ензиматичну активність сечовини амідогідролази (Е.С. 3.5.1.5), природного походження або одержаної за допомогою, наприклад, техніки рекомбінантної нуклеїнової кислоти і/або хімічного синтезу. Уреаза також включає злиті протеїни, які включають повну уреазу, підодиниці або її фрагменти, і/або уреазу із амінокислотними замісниками, делеціями або домішками, які зберігають активність сечовини амідогідролази поліпептиду. Урізана послідовність уреази, як використано тут, являє собою фрагмент уреази, вільний від частини непошкодженої послідовності уреази, що починається або в аміно або карбокси кінці уреази. Способи для ізолювання природної уреази, для синтезування уреази рекомбінантно і для ідентифікування активних фрагментів і модифікованих поліпептидв уреази визначені нижче. Термін "рак" використаний для посилання на анормальні клітину або клітини, або велику частину тканини. Ріст цих клітин або тканин перевищує і не узгоджується із ростом нормальних тканин або клітин, і продовжується ріст надмірно після припинення дії сигналів, які викликали зміну. Ці неопластичні тканини або клітини показують відсутність структурної організації і координації по відношенню до нормальних тканин або клітин, які можуть привести до утворення великої частини тканин або клітин, що можуть бути або доброякісними або злоякісними. Як використано тут, рак включає будь-яке новоутворення. Він включає, але не обмежується цим, меланому, аденокарциному, злоякісну гліому, карциному простати, ниркову карциному, карциному міхура, карциному підшлункової залози, карциному щитовидної залози, карциному легені, карциному ободової кишки, карциному прямої кишки, карциному мозку, карциному печінки, карциному молочної залози, карциному яєчника і тому подібне. 81634 8 "Пухлина" або "солідна пухлина" відноситься до маси ракових клітин, які утворюють єдине ціле, включаючи, але не обмежуючись цим, напівсолідні і солідні пухлини, солідні пухлини метастазів, ангіофіброми, ретролентальну фіброплазію, гемангіоми і саркоми Капоші. Як використано тут, термін "націлювальна частина" відноситься до молекули, яка зв'язується з визначеною популяцією клітин або вибраним типом клітин. Націлювальна частина може зв'язувати рецептор, олігонуклеотид, ензиматичний субстрат, антигенний детермінант або іншу ділянку зв'язування, присутню на або в клітині-мішені або популяції клітин. Зразкова націлювальна частина являє собою антитіло. Фрагменти антитіла і невеликі пептидні послідовності, здатні до розпізнавання виражених антигенів, також вважаються націлювальними частинами. Як використано тут, термін "інгібує ріст ракових клітин" або "інгібування росту ракових клітин" відноситься до будь-якого уповільнення швидкості проліферації ракових клітин і/або міграції, затримання проліферації ракових клітин і/або міграції, або знищення ракових клітин, таке, що швидкість росту ракових клітин зменшується у порівнянні зі швидкістю росту нелікованих контрольних ракових клітин, що спостерігається або передбачається. Термін "інгібує ріст" може також відноситись до зменшення в розмірі або зникнення ракової клітини або пухлини, а також до зниження в метастатичному потенціалі. Переважно, таке інгібування на клітинному рівні може зменшити розмір, перешкодити росту, зменшити агресивність, або запобігти або інгібувати метастаз раку у пацієнта. Кваліфіковані в даній галузі фахівці можуть легко визначити, за будь-якою з різноманіття відповідних ознак, чи інгібується ріст ракових клітин. Інгібування росту ракових клітин може стати очевидним, наприклад, за допомогою затримання ракових клітин в конкретній фазі циклу клітини, наприклад, затримують у фазі G2/M клітинного циклу. Інгібування росту ракових клітин може також стати очевидним прямим або посереднім вимірюванням розміру ракових клітин або пухлини. У пацієнтів з людським раком, такі вимірювання загалом здійснюють за допомогою добре відомих способів візуалізації, таких як ядерний магнітний резонанс, комп'ютерна томографія та рентгенівське випромінювання. Ріст ракових клітин може також бути визначений опосередковано, наприклад за допомогою визначення рівнів циркулюючого онкофетального антигену, специфічного антигену простати або інших ракспецифічних антигенів, які корелюють із ростом ракових клітин. Інгібування росту раку також в цілому корелює з пролонгованим виживанням і/або збільшеним здоров'ям і добрим самопочуттям суб'єкта. Як використано тут, термін "індукує апоптоз" відноситься до активізації форми запрограмованої смерті клітин, яка характеризується фрагментацією ДНК. Апоптоз може бути визначений способами, відомими в даній галузі. 9 Наприклад, набори є комерційно доступним, і вони виявляють наявність ДНК фрагмента за допомогою in situ імуногістохімії (наприклад, Apoptag, доступний від Intergen, Purchase, N.Y.). Додатково, апоптоз може також бути визначений аналізом FACS, в якому апоптичні клітини показують вміст sub-Gl ДНК, вказуючи на фрагментацію ДНК. Як використано тут, "антитіло" відноситься до пептиду, поліпептиду або протеїну, який містить один або більше пептидів або поліпептидів, повністю або частково кодованих щонайменше однією імуноглобуліновою молекулою нуклеїнової кислоти або геном імуноглобуліну або фрагментом щонайменше однієї імуноглобулінової молекули або гену імуноглобуліну. Розпізнані імуноглобулінові гени включають каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, іпсилон і мю гени константної ділянки, також як і незліченні імуноглобулінові гени змінної ділянки. Легкі ланцюги класифікуються як або каппа або лямбда. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсилон, які по черзі визначають класи імуноглобуліну, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, відповідно. Типова імуноглобулінова структурна одиниця (наприклад, антитіло) включає тетрамер. Кожний тетрамер складається з двох однакових пар поліпептидних ланцюгів, кожний з яких має один "легкий" ланцюг (близько 25 kD) і один "важкий" ланцюг (близько 50-70 kD). N-кінець кожного ланцюга визначає змінну ділянку від близько 100 до 110 або більше амінокислот, перш за все відповідальних за антигенне розпізнавання. Терміни "змінний легкий ланцюг" (VL) і "змінний важкий ланцюг" (VH) відносяться до цих легкого і важкого ланцюгів, відповідно. Антитіла існують як непошкоджені імуноглобуліни або як ряд добре характеризованих фрагментів, продукованих ферментативним гідролізом з різними пептидазами. Так, наприклад, пепсин розкладає антитіло нижче дйсульфідних зв'язків в шарнірній ділянці для продукування F(ab)'2, димеру Fab, який являє собою легкий ланцюг, що з'єднується з VH-CH1 дисульфідним зв'язком. F(ab)'2 може бути зменшений у м'яких умовах, з тим щоб розбити дисульфідний зв'язок в шарнірній ділянці, таким чином перетворюючи (Fab)'2 димер на Fab' мономер. Fab' мономер є по суті Fab з частиною шарнірної ділянки [див. Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)], для більш докладного опису інших фрагментів антитіл). У той час, як різні фрагменти антитіла визначають на основі ферментативного гідролізу непошкодженого антитіла, будь-який кваліфікований в даній галузі фахівець зрозуміє, що такі Fab' фрагменти можуть бути синтезовані de novo або хімічно або за допомогою застосування рекомбінантної ДНК методології. Таким чином, термін "антитіло", як використано тут, також включає фрагменти антитіла, які або продукуються модифікуванням всіх антитіл або синтезуються de novo, використовуючи рекомбінантну ДІЖ методологію. Антитіла включають одноланцюгові антитіла, включаючи одноланцюгові антитіла Fv (sFv), в яких VH і VL 81634 10 об'єднуються (безпосередньо або через пептидний лінкер), щоб утворити безперервний поліпептид. "Антиген-зв'язувальний фрагмент" антитіла являє собою пептидний або поліпептидний фрагмент антитіла, який зв'язує антиген. Антигензв'язувальна ділянка утворюється тими амінокислотами антитіла, які сприяють, залучені до або впливають на зв'язування антигену. [Див. Scott, Т. A. and Mercer, Ε. I., CONCISE ENCYCLOPEDIA: BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY (de Gruyter, 3d ed. 1997) та Watson, J. D. et al, RECOMBINANT DNA (2d ed. 1992)], кожний з яких включений в даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті для будь-яких цілей. Термін "фрагмент антитіла" також включає будь-який синтетичний або генетично конструйований протеїн, який діє як антитіло за допомогою зв'язування зі специфічним антигеном, з тим щоб утворити комплекс. Терміни "активний агент", "ліки" і "фармакологічно активний агент" використовуються тут, замінюючи один одне, з посиланням на хімічний матеріал або сполуку, що при введенні суб'єкту індукує бажаний фармакологічний ефект, і мається на увазі, що включає діагностичний або терапевтичний агент, включаючи радіонукліди, ліки, протиракові агенти, токсини і т.п. Переважно, термін "активний агент" включає протеїни, глікпротеїни, природні і синтетичні пептиди, алкалоїди, полісахариди, молекули нуклеїнової кислоти, невеликі молекули і т.п. Більш переважно, термін "активний агент" відноситься до протеїнів. Зразковий активний агент являє собою уреазу. "РН-чутливий" активний агент відноситься до активного агента, здатність якого індукувати бажаний фармакологічний ефект залежить, щонайменше частково, від рівня рН навколишнього позаклітинного середовища. Термін "очищувальний агент", як використано тут, відноситься до агента, здатного до зв'язування, який утворює комплекс або по-іншому зв'язується з частиною, що вводиться, наприклад, націлювальна частина-ліганд, націлювальна частина-антиліганд або тільки антиліганд, присутніми в кровообігу одержувача, таким чином полегшуючи очищення циркулюючої частини з тіла одержувача, видалення з кровообігу або інактивації з кровообігу. Очищувальний агент переважно характеризується фізичними властивостями, такими як розмір, заряд, конфігурація або їх поєднанням, що обмежує доступ очищувального агента до популяції клітинмішеней, які розпізнаються націлювальною частиною, що використовується в тому ж лікувальному протоколі, що і очищувальний агент. Термін "радіофармацевтичний засіб" призначений для посилання на сполуки, які можуть бути виявлені. Термін "ад'ювант" відноситься до речовини або агента, який додається до складу або композиції, щоб сприяти дії головного інгредієнта. 11 Терміни "внутрішньоклітинна" і "позаклітинна" рідина відносяться до рідини, що знаходиться між або навколо клітин ссавців. Терміни "суб'єкт", "особа" і "пацієнт" використовуються тут, замінюючи один одне, з посиланням на будь-яку ціль лікування. Даний винахід також забезпечує спосіб лікування пухлинних клітин in situ, або в їх нормальному положенні або місцезнаходженні, наприклад, неопластичних клітин молочної залози або пухлин простати. Ці in situ пухлини можуть бути розміщені свередині або на широкій різноманітності хазяїнів; наприклад, людські хазяїни, собачі хазяїни, котячі хазяїни, кінські хазяїни, бичачі хазяїни, свинячі хазяїни, і тому подібне. Будь-який хазяїн, в якому знайдені пухлина або пухлинні клітини, можуть бути піддані лікуванню і відповідно до даного винаходу. Таким чином, суб'єкт включає хребетну тварину, переважно ссавця, більш переважно людину. Під "часом витримування клітини-мішені" мається на увазі кількість часу, коли молекула уреази або іншого активного агента залишається на поверхні клітини-мішені або всередині клітинимішені. Як використано тут, термін "з'єднуються" охоплює хімічні кон'югати (ковалентний або нековалентний зв'язок), злиті протеїни і тому подібне. Терміни "протеїн", "поліпептид" або "пептид", як використано тут, відносяться, замінюючи один одне, до біополімеру, який складається з субодиниць амінокислоти або аміокислотного аналогу, звичайно деяких або всіх з 20 загальних L-амінокислот, які знаходяться в біологічних протеїнах, що з'єднуються пептидними міжсубодиничними зв'язками або іншими міжсубодиничними зв'язками. Протеїн має первинну структуру, представлену його субодиничною послідовністю, і може мати вторинні спіральні або складчасті структури, також як і повну трьохмірну структуру. Хоча "протеїн" звичайно відноситься до відносно великого поліпептиду, наприклад, який містить 100 або більше амінокислот, і "пептид" - до менших поліпептидів, дані терміни використовуються тут взаємозамінно. Тобто, термін "протеїн" може відноситись до більшого поліпептиду, а також до меншого пептиду, і навпаки. "Модулятор уреази" являє собою або інгібітор уреази або енхансер уреази. "Інгібітор уреази" включає молекулу або групу молекул, яка втручається в: (1) експресію, модифікацію, регулювання, активацію або деградацію уреази; або (2) одну або більше з нормальних функцій уреази. Нормальні функції уреази включають гідроліз сечовини, ведучи до продукування карбамату і аміаку. Інгібітор "діє безпосередньо на уреазу", коли інгібітор зв'язується з уреазою через електростатичні або хімічні взаємодії. Такі взаємодії можуть бути або можуть не бути опосередкованими іншими молекулами. Інгібітор діє "опосередковано на уреазу", коли його найбільш безпосередній вплив здійснюється на молекулу, іншу ніж уреаза, що 81634 12 впливає на експресію, активацію або функціонування уреази. "Енхансер уреази" включає молекулу або групу молекул, яка підсилює: (1) експресію, модифікацію, регулювання або активацію уреази; або (2) одну або більше з нормальних функцій уреази. Енхансер діє "опосередковано на уреазу", коли його найбільш безпосередній вплив здійснюється на молекулу, іншу ніж уреаза, що впливає на експресію, активацію або функціонування уреази. ''Конструйована мутація" в гені уреази включає зміну в нуклеотидній послідовності гену уреази, що приводить до продукування (1) збільшених або зменшених кількостей протеїну уреази відносно кількостей, продукованих за відсутності такої зміни; або (2) протешу уреази, який підсилив або знизив нормальні функції відносно таких функцій за відсутності таких змін. Термін "фармацевтична композиція" означає композицію, придатну для фармацевтичного використання для суб'єкта, включаючи тварину або людину. Фармацевтична композиція звичайно включає ефективну кількість активного агента і носія, включаючи, наприклад фармацевтично прийнятний носій. "Фармацевтично прийнятний склад" включає склад, придатний для введення активноного агента (наприклад, уреази або модулятора уреази) до певної міри, яка дає бажані результати і також не спричиняє побічні ефекти, достатні для того, щоб переконати терапевта, що потенційне ушкодження для пацієнта більше, ніж потенційна користь для цього пацієнта. Основний інгредієнт для ін'єктованого складу звичайно являє собою водний розріджувач. Водні розріджувачі, які є корисними, включають розчин хлориду натрію (NaCl), розчин Рінгера, розчин NaCl/глюкози, і тому подібне. Розріджувачі, змішувані з водою, також корисні для здійснення повного розчинення активного агента. Протимікробні агенти, буфери і антиоксиданти можуть бути корисні, залежно від потреби. Так само, "фармацевтично прийнятна" сіль або "фармацевтично прийнятне" похідне сполуки, як тут мається на увазі, являють собою сіль або інше похідне, яке не є біологічно або інакше небажаним. Мається на увазі, що термін "контрольоване вивільнення" відноситься до будь-якого складу, навантаженого лікарськими засобами, в якому спосіб і профіль вивільнення лікарського засобу зі складу є контрольованим. Термін "контрольоване вивільнення" відноситься як до складів безпосереднього вивільнення, так і до складів не безпосереднього вивільнення, де склади безпосереднього вивільнення включають, але не обмежуються цим, склади тривалого вивільнення і уповільненого вивільнення. Термін "тривале вивільнення" (також "продовжене вивільнення") використовується у звичайному сенсі з посиланням на лікарський склад, який передбачає поступове вивільнення лікарського засобу протягом продовженого періоду часу, і, що більш переважно, хоча не обов'язково, приводить до суттєвих постійних рівнів лікарського 13 засобу в крові за продовжений період часу. Термін "уповільнене вивільнення" використовується у звичайному сенсі з посиланням на лікарський склад, в якому є затримка часу між введенням складу і вивільненням лікарського засобу. "Уповільнене вивільнення" може включати або не включати поступове вивільнення лікарського засобу за продовжений період часу, і, таким чином, може бути або може не бути "уповільненим вивільненням." "Терапевтичне лікування" являє собою лікування, яке призначається суб'єкту, що виявляє симптоми або ознаки патології, хвороби або розладу, в якому лікування призначається суб'єкту з метою зменшення або усунення таких ознак або симптомів патології, хвороби або розладу. "Терапевтична активність" являє собою активність агента, такого як нуклеїнова кислота, вектор, ген, поліпептид, протеїн, речовина або композиція, що усуває або зменшує ознаки або симптоми патології, хвороби або розладу, при введенні суб'єкту, що страждає від таких ознак або симптомів. "Терапевтично корисний" агент або сполука (наприклад, нуклеїнова кислота або поліпептид) вказує, що агент або сполука корисні у зменшенні, лікуванні або усуненні таких ознак або симптомів патології, хвороби або розладу. Термін "невелика молекула" включає сполуку або молекулярний комплекс, синтетичний або природно отриманий, або частково синтетичний, і який переважно має молекулярну вагу менше ніж 5,000 Дальтон. Більш переважно, невелика молекула має молекулярну вагу між 100 і 1,500 Дальтон. Терміни "молекула нуклеїнової кислоти" або "олігонуклеотид" або їх граматичний еквівалент, відносяться до щонайменше двох нуклеотидів, які ковалентно зв'язані, і звичайно відноситься до РНК, ДНК і молекул сДНК. Нуклеїнова кислота за даним винаходом переважно являє собою однониткову або двониткову, і взагалі буде містити фосфодіефірні зв'язки, хоча в деяких випадках включені аналоги нуклеїнової кислоти, що можуть мати змінний вміст основ, наприклад, фосфорамід, фосфортіоат, фосфордитіоат і/або О-метилфосфорамідитні зв'язки. Буде зрозумілим, що в результаті дегенеративності генетичного коду може бути продукована множина нуклеотидних послідовностей, які кодують дані пептиди, такі як уреаза. "Гетерологічний" структурний компонент або послідовність нуклеїнової кислоти має частину послідовності, яка не споріднена до клітини, в якій вона експресована. Гетерологічний, у відношенні до контрольної послідовності, відноситься до контрольної послідовності (тобто, промотор або енхансер), яка не функціонує по характеру для регулювання того ж гену, експресію якого вона в даний момент регулює. Взагалі, гетерологічні послідовності нуклеїнової кислоти не є ендогенними до клітини або частини геному, в якому вони присутні, і були додані до клітини інфекуванням, трансфікуванням, мікроін'єктуванням, електропорацією або подібним чином. Гетерологічний структурний компонент 81634 14 нуклеїнової кислоти може містити комбінацію контрольної послідовності/ДНК кодуючої послідовності, що є такою же або може відрізнятись від комбінації контрольної послідовності/ДНК кодуючої послідовності, знайдених у природних клітинах. Як використано тут, термін "вектор" відноситься до структурного компонента нуклеїнової кислоти, сконструйованого для передачі між різними клітинами хазяїна. "Експресійний вектор" відноситься до вектора, який має здатність включити та експресувати спеціальні гетерологічні ДНК фрагменти у чужорідній клітині. Багато прокаріотичних і еукаріотичних експресійних векторів є комерційно доступними. Вибір відповідних експресійних векторів лежить в основі знань кваліфікованих в даній галузі фахівців. Як використано тут, "касета експресії" або "експресійний вектор" являє собою структурний компонент нуклеїнової кислоти, який генерується рекомбінантно або синтетично, з рядом описаних елементів нуклеїнової кислоти, які дозволяють транскрипцію конкретної нуклеїнової кислоти в клітині-мішені або in vitro. Касета рекомбінантної експресії може бути включена до плазміди, хромосоми, мітохондріальної ДНК, пластидної ДНК, вірусу або фрагмента нуклеїнової кислоти. Звичайно, частина касети рекомбінантної експресії експресійного вектора включає, серед інших послідовностей, послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибується, і промотор. Як використано тут, термін "плазміда" відноситься до структурного елемента кільцевої двониткової ДНК, який використовується як клонуючий вектор і який утворює екстрахромосомний генетичний елемент, що самореплікується, у багатьох бактеріях та деяких еукаріотах. Як використана тут, термін "селектована маркер-кодуюча нуклеотидна послідовність" відноситься до нуклеотидної послідовності, яка здатна до експресії в клітинах хазяїна і де експресія селектованого маркера надає клітинам, які містять експресований ген, здатність вирости у присутності відповідного селективного агента. Як використано тут, терміни "промотор" і "ініціатор транскрипції" відносяться до послідовності нуклеїнової кислоти, яка функціонує, з тим щоб спрямувати транскрипцію низхідного гену. Промотор взагалі буде придатним для клітини хазяїна, в якій експресований ген-мішень. Промотор, разом з іншою транскрипційною і трансляційною регуляторними послідовностями нуклеїнової кислоти (також названі "контрольні послідовності"), необхідні для експресування даного гену. Взагалі, транскрипційні та трансляційні регуляторні послідовності включають, але не обмежуються цим, послідовності промотору, рибосомні зв'язувальні ділянки, транскрипційні початкові та зупиняючі послідовності, трансляційні початкові та зупиняючі послідовності, та енхансерні або активаторні послідовності. 15 "Химерний ген" або "гетерологічний структурний елемент нуклеїнової кислоти", як визначено тут, відноситься до неприродного гену (тобто, до того, який був введений в хазяїна), що може складатись з частин різних генів, включаючи регуляторні елементи. Структурний елемент химерного гену для трансформування клітини хазяїна звичайно складається з транскрипційної регуляторної ділянки (промотору), дієво прикріпленого до гетерологічної протеїн-кодуючої послідовності, або, в селектованому маркерному химерному гені, до селектованого маркерного гену, кодуючого протеїн, який надає стійкість антибіотика до трансформованих клітин хазяїна. Типовий химерний ген даного винаходу, для трансформування в клітину хазяїна, включає транскрипційну регуляторну ділянку, невід'ємну або індуковану, протеїн-кодуючу послідовність і термінаторну послідовність. Структурний елемент химерного гену може також включати другу послідовність ДНК, яка кодує сигнальний пептид, якщо секреція цільового протеїну є бажаною. Нуклеїнова кислота є "дієво зчепленою", коли вона залучена у функціональний взаємозв'язок з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК, яка кодує секреторний лідер, дієво зчіплюється з ДНК для поліпептиду, якщо він експресований як препротеїн, що бере участь в секреції поліпептиду; промотор або енхансер дієво зчіплюється з кодуючою послідовністю, якщо це впливає на тарнскрипцію послідовності; або рибосомна зв'язувальна ділянка дієво зчіплюється з кодуючою послідовністю, якщо вона розміщена так, щоб полегшити транслювання. Взагалі, "дієво зчеплений" означає, що послідовності ДНК, які зчіплюються, є суміжними, і, у випадку секреторного лідера, суміжними і у фазі зчитування. Однак, енхансери не повинні бути суміжними. Зчеплення завершується лігуванням у придатних обмежувальних ділянках. Якщо такі ділянки не існують, використовуються синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери відповідно до звичайної практики. Як використано тут, термін "ген" означає сегмент ДНК, який залучений до продукування поліпептидного ланцюга, що може включати або не включати ділянки, попередні і слідуючі за кодуючою ділянкою, наприклад, 5' нетрансльовані (5' UTR) або "лідерні" послідовності і 3' UTR або "трейлерні" послідовності, також як і проміжні послідовності (інтрони) між індивідуальними кодуючими сегментами (екзони). Як використано тут, "рекомбінантний" включає посилання на клітину або вектор, який був модифікований введенням гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти або, що клітина походить від клітини, таким чином модифікованої. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, які не знаходяться в однаковій формі всередині природної (нерекомбінантної) форми клітини або експресують природні гени, які інакше ненормально експресовані, недостатньо експресовані або не експресовані взагалі як результат навмисного людського втручання. 81634 16 Термін "введений", в контексті вміщення послідовності нуклеїнової кислоти в клітину, означає "трансфікування", "трансформування" або "трансдукування" і включає посилання на об'єднання послідовності нуклеїнової кислоти в еукаріотичну або прокаріотичну клітину, де послідовність нуклеїнової кислоти може бути об'єднана в геном клітини (наприклад, хромосом, плазміду, пластиду або мітохондріальну ДНК), перетворений на автономний реплікон або випадково експресований (наприклад, трансфікована мРНК). Як використано тут, термін "експресія" відноситься до процесу, яким продукується поліпептид, оснований на послідовності нуклеїнової кислоти гену. Процес включає як транскрипцію, так і трансляцію. Термін "сигнальна послідовність" відноситься до послідовності амінокислот в N-кінцевій частині протеїну, який полегшує секрецію зрілої форми протеїну зовні клітини. Зріла форма позаклітинного протеїну відчуває нестачу сигнальної послідовності, яка розщеплюється протягом процесу секреції. Терміном "клітина хазяїна" позначена клітина, яка містить вектор і підтримує реплікацію, або транскрипцію і трансляцію (експресію) експресійного структурного елемента. Клітини хазяїна для використання в даному винаході можуть бути прокаріотичними клітинами, такі як Е. соlі, або еукаріотичними клітинами, такими як дріжджі, рослина, комаха, амфібія або клітини ссавців. Як використано тут, "ефективна кількість" або "фармацевтично ефективна кількість" активного агента відноситься до кількості, достатньої для одержання вимірюваної зміни у фізіологічному параметрі клітини-мішені або суб'єкта і/або для забезпечення або модулювання експресії або активності активного агента через введення однієї або більше з фармацевтичних одиниць дозування. Така ефективна кількість може змінюватись від особи до особи залежно від їх стану, росту, ваги, віку, і/або здоров'я, шляху введення активного агента (наприклад, уреази або модулятора уреази), конкретного активного агента, що вводиться, та інших факторів. В результаті, це може бути корисне для емпіричного визначення ефективної кількості для конкретного пацієнта у конкретних умовах. Всі публікації і патенти, які цитуються тут, включені в даний опис виключно як посилання з метою опису і розкриття композицій і методологій, які могли б використовуватись у зв'язку з даним винаходом. II. Композиція за даним винаходом Даний винахід включає, в одному аспекті, композицію, яка містить уреазу як активний агент для застосування в інгібуванні росту ракових клітин. Хімічний об'єкт може бути асоційований з активним агентом, як описано нижче, для поліпшення доставки активного агента до ракових клітин. Було знайдено, що піддавання ракових клітин пацієнта дії уреази, як описано тут, забезпечує ефективне лікування раку у пацієнта. 17 Ракові клітини можуть знаходитись всередині пухлини, наприклад, солідної або напівсолідної пухлини. Альтернативно, ракові клітини можуть циркулювати в кровообігу суб'єкта. Раки, пухлини і/або новоутворення включають новий ріст клітин або тканини, в яких розмноження клітин є неконтрольованим і прогресуючим. Деякий такий ріст доброякісний, але інші називаються "злоякісними", які ведуть до смерті організму. Злоякісні новоутворення відрізняються від доброякісних зростань тим, що в доповнення до виявлення агресивного клітинного розмноження, раки поражають оточуючі тканини і метастазують. Крім того, злоякісні новоутворення характеризуються тим, що вони виявляють велике зниження диференціювання і їх організації відносно один одного і їх оточуючих тканин. Нижче розглянуті компоненти, включені в композиції за даним винаходом. А. Уреаза Як визначено вище, активним агентом в композиції є уреаза. Уреаза може бути будь-якого походження, включаючи, наприклад, бактерії, рослини, грибки і віруси. Ряд досліджень забезпечив докладну інформацію про генетику уреаз з різноманітності еволюційно відмінних бактерій, рослин, грибків і вірусів [Mobley, H.L.T. et al. (1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480; Eur. J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990) Міжнародна публікація №WO 90/04030; Clayton, С L. et al. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 362; і Патенти США №№6,248,330 і 5,298,399], кожний з яких включений в даний опис за допомогою посилання. Особливий інтерес представляє уреаза, що знаходиться в рослинах [Sirko, A. and Brodzik, R. (2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95]. Одна зразкова рослинна уреаза являє собою уреазу канавалії мечеподібної, розкриту в Прикладах 2-3. Послідовність зразкової амінокислоти уреази канавалії мечеподібної представлена SEQ ID NO: 7. Корисні послідовності уреази можуть бути ідентифіковані в публічних базах даних, [наприклад, Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)]. Додатково, праймери, які корисні для ампліфікування уреаз з широкої різноманітності організмів, можуть бути використані, як описано [Baker, Κ.Μ. and Collier, J.L. (htxp://www.science.smith.edu/departments/Biology/lk atz/NEMEB_webpage/abstracts.ht ml)] або використовуючи [CODEHOP (COnsensusDEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer), як описано в Rose, et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26:1628]. Уреаза може контактувати з пухлинними клітинами, бути розміщеною в позаклітинному середовищі тканинної рідині, що оточує пухлинні клітини, або бути експресованою всередині ракових клітин або клітин навколо ракових клітин. Доки не буде бажаним бути зв'язаною будь-якими специфічними молекулярними механізмами, що лежать в основі успішного інгібування росту ракових клітин уреазою, сполука уреази може піднімати рівень рН тканинної рідини, в якій 81634 18 знаходяться ракові клітини, шляхом додавання уреази до тканинної рідини суб'єкта. Уреаза може перетворити сечовину субстрату в аміак і карбамат. Ця ензиматична активність може збільшити рівень рН, що робить середовище більш основним (Фіг.1A-1D). Середовище навколо ракової клітини є звичайно кислотним [Webb, S.D., et al. (2001) Novartis Found Symp 240: 169-81]. Таким чином, за допомогою підвищення рівня рН позаклітинного середовища цим способом, інгібується ріст ракових клітини. Відповідно, додавання активного агента в конкретних втіленнях винаходу спричиняє підвищення рівня рН тканинної рідини до близько 0,1рН одиниць, наприклад, 0,1-0,5рН одиниць або більше. Так, активні агенти винаходу включають форми уреази природного походження, а також їх функціонально активні варіанти. Розглянуті два загальні типи варіантів амінокислотної послідовності. Варіанти амінокислотної послідовності є такими, що мають один або більше замісників в конкретних амінокислотах, які не знищують активність уреази. Ці варіанти включають сховані варіанти і консервативно модифіковані варіанти, які суттєво гомологічні і функціонально еквівалентні природному протеїну. Варіант природного протеїну є "суттєво гомологічним" природному протеїну, коли щонайменше близько 80%, більш переважно щонайменше близько 90%, навіть більш переважно щонайменше близько 95%, ще навіть більш переважно 98%, і найбільш переважно щонайменше близько 99% амінокислотної послідовності ідентичні амінокислотній послідовності природного протеїну. Варіант може відрізнитись за, як незначною кількістю, 1 або до 10 або більше амінокислотами. Другий тип варіантів включає розмірні варіанти уреази, які являють собою окремі фрагменти уреази. Розмірні варіанти можуть бути утворені за допомогою, наприклад, фрагментування уреази, хімічної модифікації, протеолітичного ферментативного гідролізу, або їх комбінацій. Додатково, генетичні технології конструювання, також як і способи синтезування поліпептидів безпосередньо із залишків амінокислот, можуть служити для продукування розмірних варіантів. Під "функціонально еквівалентним" мається на увазі, що послідовність варіанту визначає ланцюг, який продукує протеїн, що має по суті ту ж біологічну активність, що і природна уреаза. Такі функціонально еквівалентні варіанти, які охоплюють суттєві варіації послідовності, також входять в об'єм винаходу. Так, функціонально еквівалентний варіант протеїну природної уреази матиме достатню біологічну активність для того, щоб бути терапевтично корисним. Способи є доступними в галузі техніки для визначення функціональної еквівалентності. Біологічна активність може бути виміряна з використанням досліджень, які конкретно призначені для вимірювання активності протеїну природної уреази, як у Прикладі 3. Додатково, антитіла, отримані проти біологічно активного природного протеїну, можуть бути випробувані на їх здатність 19 81634 зв'язуватись з функціонально еквівалентним варіантом, де ефективне зв'язування є ознакою протешу, який має структуру, подібну до структури природного протеїну. Для кваліфікованого в даній галузі фахівця зрозуміло, що завдяки дегенеративності генетичного коду, множина послідовностей нуклеїнової кислоти, кодуючих поліпептиди уреази з даним винаходом, може бути продукована, деякі з яких можуть носити мінімальну гомологію послідовності до відомих послідовностей нуклеїнової кислоти уреази. Такі "сховані варіації" являють собою один вид "консервативно модифікованих варіацій", що обговорюється нижче. Винахід забезпечує кожну можливу варіацію послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид з даним винаходом, що може бути зроблене шляхом вибору комбінацій, які основуються на можливих виборах кодону. Ці комбінації зроблені відповідно до стандартного триплетного генетичного коду, як застосовано до послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид протеїну уреази за даним винаходом. Поліпептиди уреази за даним винаходом включають одну або більше консервативно модифікованих варіацій (або просто "консервативних варіацій") послідовностей відомих послідовностей поліпептиду уреази. Такі консервативні варіації включають замісники, домішки або делеції, які змінюють, додають або вилучають одинарну амінокислоту або невеликий процент амінокислот. Звичайний фахівець в даній галузі техніки розпізнає, що індивідуальна заміна, делеція або доповнення, що замінює, вилучає або додає одинарну амінокислоту або невеликий процент амінокислот (звичайно менше ніж 5%, більш звичайно менше ніж 4%, 2%, 1%, або менше) послідовно звичайно складає консервативні варіації, де такі зміни приводять до делеції амінокислоти, додавання амінокислоти або заміни амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таблиці консервативної заміни, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, добре відомі для звичайних фахівців в даній галузі техніки. Таблиця 1 визначає шість груп, що містять амінокислоти, які є консервативними замінами або консервативними варіаціями одна для одної. Таблиця 1 Консервативні замісні групи 1 2 3 4 5 6 Аланін (А) Аспаргінова кислота(D) Аспарагін (N) Аргінін (R) Ізолейцін (І) Фенілаланін (F) Серин(и) Треонін (Т) Глутамінова кислота(Е) Глутамін (Q) Лізин (К) Лейцин (L) Метіонін (М) Валін (V) Тирозин (Y) Триптофан(W) Додаткові групи амінокислот можуть також бути утворені. Наприклад, амінокислоти можуть бути згруповані за подібною функціональною або 20 хімічною структурою або складом (наприклад, кислотні, основні, аліфатичні, ароматичні, сірковмісні). Наприклад, аліфатичне групування може включати: гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин. Інші групи, які містять амінокислоти, які є консервативними замісниками одна для одної, включають наступне: (і) ароматичні: фенілаланін, тирозин, триптофан; (іі) сірковмісні: метіонін, цистеїн; (ііі) основні: аргінін, лізин, гістидин; і (iv) кислотні: аспаргінова кислота, глутамінова кислота, аспарагін, глутамін. [Див. Creighton (1984) Proteins, W. Η. Freeman and Company], для додаткового групування амінокислот. Послідовності протеїну уреази за даним винаходом, включаючи консервативно замінені послідовності, можуть бути представлені як частина більших послідовностей поліпептиду, як такі, що походять при доповненні одного або більше доменів для очищення протеїну (наприклад, його полісегменти, FLAG мічені сегменти і т.д.), наприклад, де додаткові функціональні домени мають невеликий вплив або зовсім не мають впливу на активність частини протеїну уреази протеїну, або де додаткові домени можуть бути видалені шляхом етапів після синтезу, такі як лікування протеазою. Додавання однієї або більше нуклеїнових кислот або послідовностей, які не змінюють кодовану активність молекули нуклеїнової кислоти за винаходом, таке як додавання нефункціональної послідовності, є консервативною варіацією основної молекули нуклеїнової кислоти, і додавання одного або більше залишків амінокислоти, які не змінюють активність поліпептиду за винаходом, є консервативною варіацією основного поліпептиду. Обидва такі типи додавань є ознаками даного винаходу. Звичайний фахівець в даній галузі техніки розуміє, що багато консервативних варіацій структурних елементів нуклеїнової кислоти, які розкриті, дають функціонально ідентичний структурний елемент. Різноманітність способів визначення взаємозв'язків послідовностей може використовуватись, включаючи ручне вирівнювання і комп'ютеризоване вирівнювання послідовності і аналіз. Останній підхід є найкращим підходом за даним винаходом, завдяки збільшеній продуктивності, яка надається комп'ютеризованими способами. Доступна велика кількість комп'ютерних програм для виконання вирівнювання послідовності, або вони можуть бути вироблені фахівцем. Як визначено вище, послідовності нуклеїнових кислот і поліпептиди (і їх фрагменти), включені в предмет даного винаходу, не повинні бути ідентичними, але можуть по суті бути ідентичними (або суттєво подібними) до відповідної послідовності поліпептиду уреази або молекули нуклеїнової кислоти (або їх фрагменту) за винаходом або пов'язаної молекули. Наприклад, поліпептиди можуть служити предметом для різних змін, таких як введення, делеції і зміни, консервативні або неконсервативні, однієї або більше амінокислот або нуклеїнових кислот, 21 включаючи, де, наприклад, такі зміни могли б передбачити конкретні переваги у їх використанні, наприклад, у їх терапевтичному або профілактичному використанні або введенні або діагностичному застосуванні. Вирівнювання і порівняння відносно коротких амінокислотних послідовностей (менше ніж близько 30 залишків) звичайно пряме. Порівняння довших послідовностей може вимагати використання більш удосконалених способів для досягнення оптимального вирівнювання двох послідовностей. Оптимальне вирівнювання послідовностей для вирівнювання порівняльного вікна може бути проведене алгоритмом локальної гомології [Сміта і Вотермана (1981) Adv Appl Math 2: 482], алгоритмом гомологічного вирівнювання [Нідлмана і Вюнша (1970) J Моl Віоl 48: 443], способом пошуку на схожість [Пірсона і Ліпмана (1988) Ргос Nat'l Acad Sci USA 85: 2444], комп'ютеризованими втіленнями цих алгоритмів [GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.; and BLAST, див., наприклад, Altschul et al. (1977) Nuc Acids Res 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J Моl Biol 215: 403-410], або інспекцією, на найкраще вирівнювання (тобто, що приводить до найбільшого проценту подібності послідовності або ідентичності послідовності по відношенню до порівнювального вікна), що генерується різними способами, які вибираються. Зразковий алгоритм, придатний для визначення процентної ідентичності послідовності (процентна ідентичність) і подібності послідовності, є алгоритм FASTA, [який описується в Pearson, W, R. & Lipman, D. J. (1988) Proc Nat'l Acad Sci USA 85: 2444. Див. також W. R. Pearson (1996) Methods Enzymology 266: 227-258]. Найкращі параметри, які використовуються у FASTA вирівнюванні послідовностей ДНК, щоб підрахувати процентну ідентичність, оптимізуються, BL50 Матриця 15: -5, k-кортеж=2; приєднуваний штраф=40, оптимізація=28; проміжок штрафу=-12, довжина проміжку штрафу=-2; і ширина=16. Для звичайного фахівця в даній галузі техніки буде зрозумілим, що вищезазначене обговорення алгоритмів пошуку і вирівнювання також відноситься до ідентифікації та оцінки полінуклеотидних послідовностей, із заміною запитуваних послідовностей, які містять нуклеотидні послідовності, і, де прийнятно, вибір баз даних нуклеїнових кислот. В. Асоційований хімічний об'єкт Композиція за даним винаходом може містити хімічний об'єкт, який асоційований з активним агентом для поліпшення доставки активного агента до ракових клітин. Розглядається широка різноманітність асоційованих хімічних об'єктів для застосування, як описано нижче. В1. Полімери Хімічний об'єкт може містити полімер, що включає, наприклад, гідрофільні полімери і гідрофобні полімери, де переважними є гідрофільні полімери. Термін "гідрофільний", як 81634 22 використано тут, відноситься до композиції, речовини або матеріалу, наприклад, полімеру, який може взагалі швидко асоціюватись з водою. Таким чином, хоча гідрофільні полімери, які можуть бути залучені до даного винаходу, можуть мати домени різного типу, наприклад, домени, які є більш гідрофільними, і домени, які є більш гідрофобними, загальна природа гідрофільних полімерів є переважно гідрофільною, розуміючи, звичайно, що ця гідрофільність може змінюватись через континуум від відносно більш гідрофільної до відносно менш гідрофільної. Широка різноманітність полімерів може бути включена в дані композиції і склади. Взагалі, полімер є тим, який має бажану гідрофільність і/або гідрофобність, і який може утворювати матриці, також як і ковалентні прикріплення з націлювальними лігандами, як описано тут. Полімер може бути поперечно зшитим або непоперечно зшитим. Терміни "поперечно зшити", "поперечно зшитий" і "поперечне зшивання", як використано тут, взагалі відносяться до зшивання двох або більше сполук або матеріалів, наприклад, полімерів, одним або більшими мостами. Мости, які можуть бути складені з одного або більше елементів, груп або сполук, взагалі служать для приєднання атома від першої сполуки або матеріальної молекули до атома другої сполуки або матеріальної молекули. Мости поперечного зшивання можуть включати ковалентні і/або нековалентні асоціації. Будь-який з різноманітності елементів, груп і/або сполук може утворювати мости в поперечних зшиваннях, і сполуки або матеріали можуть бути поперечно зшиті природно або через синтетичні засоби. Відповідно до конкретних втілень, полімер, лінійний, зірчастий або розгалужений, може бути вибраний з групи, яка складається з оксиду поліалкілену, поліалкіленіміну, аміну поліалкілену, сульфіду поліалкену, сульфонату поліалкілену, сульфону поліалкілену, полі(алкіленсульфонілалкіленімін) і їх співполімерів. Як визначено вище, залежно від конкретного полімеру, який включається, полімери можуть бути відносно більш гідрофільними або відносно більш гідрофобними. Приклади* придатних, відносно більш гідрофільних полімерів включають, але не обмежуються цим, поліетиленгліколь, поліпропілейгліколь, розгалужений поліетиленімін, полівініл піролідон, полілактид, полі(лактид-когліколід), полісорбат, оксид поліетилену, полі(етилен оксид-ко-пропілен оксид), полі(оксіетильований) гліцерин, полі(оксіетильований) сорбіт, полі(оксіетильована глюкоза), поліметилоксазолін, поліетилоксазолін, полігідроксіетилоксазолін, полігідроксипропілоксазолін, полівініловий спирт, полі(гідроксіалкілкарбоциклічна кислота), полігідроксіетил акрилова кислота, полігідроксипропіл метакрилова кислота, полігідроксивалерат, полігідроксибутират, поліоксазолідин, поліаспартамід, полісіалова кислота і їх похідні, суміші і співполімери. 23 Відповідно, полімер, переважно гідрофільний, може бути кон'югований з активним агентом або іншими асоційованими хімічними об'єктами, розкритими тут, для поліпшення доставки активного агента до ракових клітин. Кон'югат полімер-активний агент переважно вводять в кількості, ефективній для розширення часу кровообігу і/або зменшення антигенності і/або імуногенності вказаної композиції відносно природного, або недериватизованого, активного агента. Особливо переважні гідрофільні полімери включають, але не обмежуються цим, полівінілпіролідон, полівінілметилефір, полігідроксипропіл метакриламід, полігідроксипропіл метакрилат, полігідроксіетил акрилат, поліметакриламід, полідиметилакриламід, поліметилоксазолін, поліетилоксазолін, полігідроксіетилоксазоліон, полігідроксипропіоксазолін, поліаспартамід, і/або гідрофільні целюлозні похідні. Переважний гідрофільний полімер являє собою поліетиленгліколь, який має, наприклад, молекулярну вагу між близько 1,000 і 10,000 дальтон. В одному втіленні, поліетиленгліколь має молекулярну вагу між 1,000 і 5,000 дальтон. Додаткові полімери, які розглядаються для використання у винаході, обговорюються більш детально в [in U.S. Pre-Grant Published No.20020041898, опублікованій 11 квітня 2002], яка включена в даний опис за допомогою посилання. В2. Націлювальні частини Націлювальні частини розглядаються як хімічні об'єкти даного винаходу і прив'язуються до визначеного, вибраного типу клітини або популяції клітин-мішеней, таких як ракові клітини. Націлювальні частини, корисні в цьому відношенні, включають антитіла і фрагменти антитіла, пептиди і гормони. Протеїни, які відповідають відомим рецепторам клітинної поверхні (включаючи ліпопротеїни низької щільності, трансферин та інсулін), фібринолітичним ензимам, анти-НЕR2, тромбоцит-зв'язувальним протеїнам, таким як анексини і біологічним модифікаторам (включаючи інтерлейкін, інтерферон, еритропоетин і колнієстимулюючий фактор), також розглядаються як націлювальні частини. Олігонуклеотиди, наприклад, антисенсибілізовані олігонуклеотиди, які є додатковими до частини нуклеїнової кислоти клітини-мішені, можуть бути використані як націлювальні частини в даному винаході. Націлювальні частини можуть також бути олігонуклеотидами, які зв'язуються з поверхнею клітини-мішені. Аналоги перелічених вище націлювальних частин, які зберігають здатність зв'язуватись з визначеною популяцією клітинимішені, можуть також бути використані як націлювальні частини. Функціональні еквіваленти зазначених вище націлювальних частин також корисні як націлювальні частини даного винаходу. Зразковий функціональний еквівалент націлювальної частини являє собою органічний хімічний елемент, сконструйований, з тим щоб імітувати відповідну конфігурацію і/або орієнтацію для зв'язування клітини-мішені націлювальної частини. Інший 81634 24 функціональний еквівалент націлювальної частини являє собою короткий поліпептид, що виявляє зв'язувальну афінність націлювальної частини. Переважні націлювальні частини даного винаходу являють собою антитіла, пептиди, олігонуклеотиди або подібні, які реагують з антигеном на поверхні клітини-мішені. Можуть бути залучені як поліклональні, так і моноклональні антитіла, які або доступні комерційно або описані в літературі. Антитіла можуть бути цілими антитілами або їх фрагментами. Моноклональні антитіла і фрагменти можуть бути продуковані відповідно до звичайної техніки, такої як синтез гібридоми, техніка рекомбінантної ДНК і синтез протеїну. Корисні моноклональні антитіла і фрагменти можуть бути одержані з будь-яких видів (включаючи людини) або можуть біти утворені як химерні протеши, які залучають послідовності від більше ніж одного виду. В одному втіленні винаходу, людські моноклональні антитіла або гуманізовані мишачі антитіла використовуються як націлювальні частини. Гуманізовані націлювальні частини здатні до зменшення імунореактивності антитіла або поліпептиду в хазяїні-реципієнті, дозволяючи зростання періоду півжиття і зниження несприятливих імунних реакцій. Мишачі моноклональні антитіла можуть бути гуманізовані за допомогою, наприклад, генетичного рекомбінування нуклеотидної послідовності, яка кодує мишачу Fv ділянку або комплементарність, що визначає її ділянки з нуклеотидною послідовністю, яка кодує людську константну доменну ділянку і Fc ділянку. Мишачі залишки також можуть бути збережені всередині каркасних доменів людських варіабельних ділянок, щоб гарантувати відповідні характеристики зв'язування цільових ділянок. Необмежувальним прикладом націлювальної частини є анти-α-2-GP антитіло до мозкових нейроглічних клітин (альфа-2глікопротеїн), описане [Slepnev et al., Bioconjugate Chem. 3: 273-274 (1992)]. Генетично сконструйовані антитіла для доставки різних активних агентів до ракових клітин розглянуті в [Bodey, В. (2001) Expert Opin Biol. Ther. 1 (4):60317]. В іншому втіленні винаходу, націлювальна частина є лігандом, який реагує з рецептором на поверхні клітини-мішені. Так, націлювальна частина може включати без обмеження гормони з афінністю для компонента клітинного зв'язування, будь-якої молекули, яка містить частину вуглеводу, яка розпізнається компонентом клітинного зв'язування і лікарськими препаратами або невеликими молекулами, які зв'язуються з компонентом клітинного зв'язування. Фраза "зв'язувальний компонент" включає як рецептор, так і молекули-акцептори. Переважно, зв'язувальний компонент є зв'язувальним компонентом поверхні клітини. В одному втіленні, націлювальна частина є протеїном природного походження, таким як наприклад інсулін, що зв'язується до цільової ділянки. Цитокіни, включаючи інтерлейкіни і фактори, такі як 25 гранулоцит/макрофаг колонієстимулюючий фактор (GM-CSF) і фактор некрозу пухлини (TNF), являють собою також конкретні націлювальні частини, відомі за зв'язуванням з конкретними клітинами, експресуючими високі рівні їх рецепторів [Terlikowski, SJ (2002) Toxicology 174(3): 143-152]. Для того, щоб зменшити вплив уреази або іншого активного агента на нецільові клітини або тканини, націлювальні частини можуть бути скриновані для ідентифікування тих, що виявляють мінімальну нецільову реактивність, зберігаючи Цільову специфічність і реактивність. За допомогою зменшення нецільового впливу (і несприятливої локалізації і/або токсичності), можуть бути введені збільшені дози уреази або іншого активного агента. Це дозволяє введення найвищої можливої концентрації уреази або іншого терапевтичного агента для того, щоб збільшити вплив клітин-мішеней, залишаючись нижче порога неприйнятної токсичності нецільових клітини. У конкретних втіленнях винаходу, залучені два або більше кон'югатів націлювальної частини активного агента, де кожний кон'югат включає різні націлювальні частини, наприклад, різні види антитіла. Кожна з використаних націлювальних частин зв'язується з різними цільовими ділянками, які можуть бути асоційовані з тією ж або іншою цільовою ділянкою. Компонент активного агента кожного введеного кон'югата може бути таким же або відрізнятись. Дивіться, [наприклад, Патенти США №№4,867,962 і 5,976,535], кожний з яких включений в даний опис за допомогою посилання. На практиці цього втілення винаходу, збільшення цільової ділянки кон'югату активного агента до цільової ділянки вдосконалюється, тому що кожна націлювальна частина, наприклад, різновид антитіла, розпізнає різні цільові ділянки, наприклад, цільову ділянку епітопу. Цей підхід альтернативної цільової ділянки надає більш потенційні переваги цільового зв'язування для активного агента. Отже, фактичного або ефективного насичення цільової ділянки, наприклад, через насичення епітопом і/або стеричних перешкод, можна уникнути. Так, адитивне накопичення активного агента, наприклад, уреази, може бути вдосконалене. Альтернативно, або у поєднанні, додаткові продукти конкретного гену уреази можуть служити як активні агенти, наприклад, для продукування каталітично активного повного ферменту в цільовій ділянці. Зразковий апоезим уреази включає гамма, бета і альфа підодиниці, які кодуються за допомогою бактеріальних ureABC генів [Bume, R.A. and Chen, Y.M. (20UU) Microoes ana Infection 2: 533-542]. Зразки перехресної реактивності для моноклональних антитіл, спрямованим проти конкретної цільової ділянки, можуть бути аналізовані для ідентифікування ряду двох або більше мішень-специфічних моноклональних антитіл з неперекриваючою перехресною реактивністю для використання у діагностичному або терапевтичному застосуванні. Фраза 81634 26 "неперекриваючі зразки перехресної реактивності" вказує на те, що нецільові тканини, зв'язані одним різновидом антитіла, суттєво відрізняються від нецільових тканин, зв'язаних іншим різновидом антитіла. Зразки перехресної реактивності відрізняються в межах, необхідних для пропорційного зменшення впливу активного агента для терапевтичних застосувань. Переважним є менше перекриття пари антитіла (або більший набір антитіл). Антитіла можуть бути скриновані різноманітністю способів. Може бути залучений амуногастохімічний аналіз для визначення реактивності з цільовою тканиною і перехресної реактивності з нецільовою тканиною. Тканини, з якими різновиди антитіла зв'язуються, можуть бути ідентифіковані за допомогою піддавання тканини впливу антитіла; промивання тканини, для видалення будь-якого незв'язаного антитіла; і виявлення наявності зв'язаного антитіла. In vitro гістохімічні процедури відомі в даній галузі техніки. Дивіться, [наприклад, Sanchez-Islas, E. and LeonOlea, Μ. (2001) Nitric Oxide 5(4): 302-16]. Композиція даного винаходу може також бути корисна у лікуванні hCG-секретуючих пухлин. Через те, що плацентарний трофобласт є нормальною ділянкою синтезу hCG, зрозуміло, що як гестаційні, так і негестаційні трофобластичні пухлини синтезують і секретують hCG. Дійсно, вимірювання hCG цілком були корисні для діагностики цих пухлин, демонструючи пухлини, і для моніторингу впливів терапії. Крім того, деякі нетрофобластичні пухлини можуть продукувати hCG ектопічно. hCG може служити фактором росту для деяких пухлин [Melmed S. and Braunstein GD: Human chorionic gonadotropin stimulates proliferation of Nb 2 rat lymphoma cells. J. Clin. Endocrinol. Metab 56: 1068-1070, (1983)]. Дивіться, [наприклад, Патент США №6,448,022], який включений в даний опис за допомогою посилання. Таким чином, відповідно до одного втілення винаходу, застосування анти-hCG антитіла для доставки активного агента до hCG-секретуючої пухлини придушує ріст hCG-секретуючої пухлини. Так, в конкретних втіленнях, хімічний об'єкт винаходу являє собою націлювальну частину, зв'язану з активним агентом, і являє собою протипухлинне антигенне антитіло, анти-hCG антитіло або ліганд, здатний до зв'язування специфічно до рецепторів поверхні ракових клітин. Націлювальна частина являє собою, переважно, поліпептид, який з'єднується з ензимом уреази для утворення злитого протеїну. Як визначено вище, відповідно до одного втілення винаходу, активний агент безпосередньо кон'югований з націлювальною частиною. Альтернативно, відповідно до іншого втілення винаходу, використовують двох- або трьохетапний підхід для доставки активного агента до ракових клітин. Таким чином, активний агент може включати перший зв'язувальний партнер, який може взаємодіяти з другим зв'язувальним партнером, і хімічний об'єкт може включати націлювальну частину, яка включає другий 27 зв'язувальний партнер. Ці втілення описані більш конкретно в Розділі III, нижче. Звичайний фахівець в даній галузі розуміє, що націлювальні частини цього винаходу і активні агенти можуть бути об'єднані в будь-якому порядку. Таким чином, де націлювальна частина являє собою поліпептид, активний агент може бути з'єднаний з або аміном або карбокси кінцями націлювальної молекули. Націлювальна частина може також бути з'єднана з внутрішньою ділянкою активного агента, або навпаки, активний агент може бути з'єднаний з внутрішньою ділянкою націлювальної частини, поки зв'язування не перешкоджає відповідним видам діяльності молекул. Націлювальна частина і активний агент можуть бути з'єднані будь-якими засобами, добре відомими фахівцям в даній галузі техніки. Звичайно, активний агент кон'югований, або безпосередньо або через лінкер (спейсер), з націлювальною частиною. Однак, коли націлювальна частина і активний агент обидва є поліпептидами, переважним може бути рекомбінантно експресувати химерну молекулу, як одноланцюговий злитий протеїн. В одному втіленні, націлювальна частина (наприклад, αhEGFR IgG Ab) хімічно з'єднується з активним агентом або хімічним об'єктом (наприклад, лікарським засобом, уреазою або ліпосомою). Засоби хімічного кон'югування молекул добре відомі фахівцям в даній галузі техніки. Процедура з'єднання агента з антитілом або іншою націлювальною молекулою поліпептиду буде змінюватись відповідно до хімічної структури агента. Поліпептиди звичайно містять множину функціональних груп; наприклад, карбоциклічну кислоту (СООН) або вільні (-NH2) аміногрупи, які доступні для реакції з придатною функціональною групою на активному агенті для зв'язування його націлювальної частини. Альтернативно, націлювальна частина і/або активний агент можуть бути дериватизовані для виявлення або прикріплення додаткових реагуючих функціональних груп. Дериватизація може включати прикріплення будь-якої кількості лінкерних молекул таких як, ті, що доступні від Pierce Chemical Company, Rockford III. "Лінкер", як використано тут, являє собою молекулу, використану для приєднання націлювальної частини до активного агента. Лінкер здатний до утворення ковалентних зв'язків як до націлювальної частини, так і до активного агента. Придатні лінкери добре відомі фахівцям в даній галузі техніки і включають, але не обмежуються цим, прямі або розгалужені ланцюгові вуглецеві лінкери, гетероциклічні вуглецеві лінкери або пептидні лінкери. Там, де націлювальна частина і молекула активного агента обидва є поліпептидами, лінкери можуть бути приєднані до складових амінокислот через їх бічні групи (наприклад, через сполучення дисульфіду до цистеїну). Однак, у переважному втіленні, лінкери будуть приєднані до альфа вуглець аміно і карбоксильних груп кінцевих амінокислот. 81634 28 Біфункціональний лінкер, який має одну функціональну групу, реагуючу з групою на конкретному агенті, та іншу групу, реагуючу з антитілом, може бути використаний для утворення бажаного імунокон'югату. Альтернативно, дериватизація може включати хімічне лікування націлювальної частини, наприклад, глікольне розщеплення цукрової частини глікопротеїнового антитіла періодатом, щоб генерувати вільні групи альдегіду. Вільні групи альдегіду на антитілі можуть піддані реакції з вільним аміном або групами гідразину на агенті для зв'язування з ними агента [див. Патент США №4,671,958]. Процедури генерування вільних груп сульфгідрилу на поліпептиді, таких як антитіла або фрагменти антитіла, також відомі [див. Патент США №4, 659,839]. Багато процедур і лінкерних молекул для прикріплення різних сполук, включаючи хелати радіонуклідних металів, токсини і лікарські засоби, до протеїнів, таких як антитіла, відомі [див., наприклад, Європейську Патентну Заявку №188, 256; Патенти США №№4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; і 4,589,071; і Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075]. Зокрема, продукування різних імунотоксинів відоме в даній галузі техніки і може бути знайдене, [наприклад, в "Monoclonal AntibodyToxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet," Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp.168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1657, Патенти США №№4,545,985 і 4,894,443]. У деяких випадках, бажаним є звільнити молекулу активного агента від націлювальної частини, коли химерна молекула досягла цільової ділянки. Таким чином, химерні кон'югати, які містять зв'язки, що розколюються навколо цільової ділянки, можуть бути використані тоді, коли діючий початок повинен бути вивільнений в цільовій ділянці. Розколення зв'язку для вивільнення агента з націлювальної частини може спонукатись ензиматичною активністю або умовами, дії яких піддається кон'югат або всередині клітини-мішені або навколо цільової ділянки. Повинно бути взятим до уваги, що, коли цільова ділянка являє собою пухлину, може бути використаний лінкер, який розколюється в умовах, присутніх в ділянці пухлини (наприклад, коли піддається дії пухлинноасоційованих ензимів або кислотного рН). Ряд різних лїнкерів, що розколюються, є відомим фахівцям в даній галузі техніки [див. Патенти США №№4,618,492; 4,542,225, і 4,625,014]. Механізми для вивільнення активного агента з цих груп лінкерів включають, наприклад, опромінення фотолабільного зв'язку і кислотнокаталізований гідроліз. [Патент США №4,671,958], наприклад, включає опис імунокон'югатів, що містять лінкери, які розколюються в цільовій ділянці in vivo протеолітичними ензимами системи комплементу пацієнта. Беручи до уваги великий ряд способів, які були повідомлені для прикріплення різноманітності радіодіагностичних сполук, радіотерапевтичних сполук, лікарських засобів, токсинів та інших агентів до 29 націлювальних частин, фахівець, кваліфікований в даній галузі, зможе визначити придатний спосіб для прикріплення даного агента до вибраної націлювальної частини. Там, де націлювальна частина і/або активний агент є відносно короткими, вони можуть бути синтезовані стандартною технікою хімічного синтезу пептидів. Там, де обидві молекули є відносно короткими, химерна молекула може бути синтезована як єдиний неперервний поліпептид. Альтернативно, націлювальна частина і активний агент можуть бути синтезовані окремо і потім злиті конденсацією аміно кінця однієї молекули карбоксильним кінцем іншої молекули, таким чином утворюючи пептидний зв'язок. Альтернативно, націлювальна частина і молекули активного агента можуть бути кожна конденсована одним кінцем молекули пептидного спейсера, таким чином утворюючи неперервний злитий протеїн. Твердофазний синтез, в якому С-кінець амінокислоти послідовності є прикріпленим до нерозчинної плівки-підкладки, з наступними послідовними додаваннями залишкових амінокислот один за одним, розглядається як одне втілення для способу хімічного синтезу поліпептидів за даним винаходом. Пристрої для твердофазного синтезу [описані Вагапу і Merrifield, Solid -Phase Peptide Synthesis; pp.3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part Α., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc, 85: 2149-2156 (1963), and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nded. Pierce Chem. Co, Rockford, III. (1984)]. У переважному втіленні, химерні злиті протеїни даного винаходу синтезовані з використанням методології рекомбінантної ДНК. Взагалі, це включає створення послідовності ДНК, яка кодує злитий протеїн, розміщуючи ДНК в експресійній касеті під управлінням конкретного промотору, що експресує протеїн в хазяїні, виділяючи експресований протеїн і, якщо вимагається, ренатуруючи протеїн. ДНК, яка кодує злиті протеїни цього винаходу, може бути одержана будь-яким придатним способом, включаючи, наприклад, клонування і обмеження відповідних послідовностей або прямий хімічний синтез способами, такими як фосфотриефірний спосіб Наранга та інші. [(1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99]; фосфодіефірний спосіб Брауна та інші. [(1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151]; діетилфосфорамідитний спосіб Бюкожа та інші. [(1981) Tetra. Lett, 22: 1859-1862]; і спосіб твердої плівки-підкладки за [Патентом США №4,458,066]. Хімічний синтез продукує однонитковий олігонуклеотид. Він може бути перетворене на двониткову ДНК шляхом гібридизації з комплементарною послідовністю або шляхом полімеризації з ДНК полімеразою, використовуючи єдину нитку як зразок. Фахівець в даній галузі техніки повинен розпізнати, що, в той час, як хімічний синтез ДНК обмежується до послідовностей близько 100 основ, довші послідовності можуть бути одержані лігуванням більш коротких послідовностей. 81634 30 Альтернативно, послідовності можуть бути клоновані, а відповідні послідовності розколоті, використовуючи відповідні обмежувальні ензими. Фрагменти можуть бути потім ліговані, щоб продукувати бажану послідовність ДНК. У той час, як дві молекули переважно по суті безпосередньо об'єднуються, фахівець в даній галузі повинен взяти до уваги, що молекули можуть бути відокремлені пептидним спейсером, що складається з однієї або більше амінокислот. Взагалі спейсер не матиме специфічної біологічної активності, іншої, ніж для з'єднання протеїнів або збереження деякої мінімальної відстані або інших просторових відношень між ними. Однак, складові амінокислоти спейсера можуть бути селектовані, щоб вплинути на деякі властивості молекули, такі як згортання, результуючий заряд або гідрофобність. Послідовності нуклеїнової кислоти, які кодують злиті протеши, можуть бути експресовані в різноманітності клітин хазяїна, включаючи Е. соlі, інші бактеріальні хазяїни, дріжджі та різні вищі еукаріотичні клітини, такі як COS, клітинні лінії СНО і HeLa і клітинні лінії мієломи. Рекомбінантний ген протеїну буде дієво з'єднаний з відповідними експресуючими контрольними послідовностями для кожного хазяїна. Для Е. соlі вони включають промотор, такий як Т7, trp або лямбда промотори, рибосомозв'язувальну ділянку і переважно сигнал припинення транскрипції. Для еукаріотичних клітин, контрольні послідовності включатимуть промотор і переважно енхансер, який походить від імуноглобулінових генів, SV40, цитомегаловірусу, т.д., і поліаденілаційну послідовність, і можуть включати донора з'єднання і акцепторні послідовності. Плазміди винаходу можуть бути перенесені у вибрану клітину хазяїна відомими способами, такими як перетворення хлориду кальцію для Е. соlі і обробка фосфатом кальцію або електропоріція для клітин ссавців. Клітини, перетворені плазмідами, можуть бути селектовані стійкістю до антибіотиків, що надаються генами, які містяться на плазмідах, такі як amp, gpt, neo і hyg гени. Одного разу експресовані, рекомбінантні злиті протеїни можуть бути очищені відповідно до стандартних процедур галузі техніки, включаючи осадження сульфату амонію, афінні колонки, хроматографічні колонки, гель-електрофорез і тому подібне [див. R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y.]. Переважними для фармацевтичних застосувань є суттєво чисті композиції щонайменше близько 90 до 95% гомогенності, і найбільш переважними є 98 до 99% або більше гомогенності. Одного разу очищені, частково або до гомогенності, як бажано, поліпептиди можуть потім бути використані терапевтично. Фахівець в даній галузі техніки повинен розуміти, що після хімічного синтезу, біологічної експресії або очищення, злитий протеїн-мішень може отримати конформацію, що по суті 31 відрізняється від природних конформацій складових поліпептидів. У цьому випадку, може бути необхідним денатурувати і зменшити поліпептид і потім привести поліпептид до згортання у переважну конформацію. Способи зменшення і денатурування протеїнів та індукування повторного згортання добре відомі фахівцям в даній галузі техніки [див. Debinski et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; and Buchner, et al. (1992) Anal. Biochem., 205: 263270]. Фахівець в даній галузі техніки повинен розпізнати, що модифікації можуть бути зроблені до злитих протеїнів-мішеней без зменшення їх біологічної активності. Деякі модифікації можуть бути зроблені, з тим щоб полегшити клонування, експресію або об'єднання націлювальної молекули в злитий протеїн. Такі модифікації добре відомі фахівцям в даній галузі техніки і включають, наприклад, метіонін, який додається до аміно кінця, щоб забезпечити ділянку ініціації, або додаткові амінокислоти, розміщені або на кінці, щоб створити зручно розміщені обмежувальні ділянки, або на кінцевих кодонах. В3. Захоплені активні агенти У конкретних втіленнях, винахід розглядає використання везикул, таких як ліпосоми і/або нанокапсули як хімічні об'єкти для доставки активного агента або активних агентів, наприклад, уреази до ракових клітин. Такі склади можуть бути переважними для введення фармацевтичноприйнятних складів поліпептидів, фармацевтичних препаратів і/або антитіл, розкритих тут. Утворення і застосування ліпосом взагалі відоме фахівцям в даній галузі техніки. [Див., наприклад, Backer, M.V., et al. (2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7]. У переважному втіленні, розкрита композиція може бути захоплена в ліпосому. Нанокапсули можуть взагалі захоплювати сполуку стійким і відтворюваним шляхом [Whelan, J. (2001) Drug Discov Today 6(23): 1183-84]. Щоб уникнути побічних ефектів завдяки внутрішньоклітинному полімерному перевантажуванню, такі понадтонкі частинки (за розміром близько 0,1 (μm) можуть бути сконструйовані, використовуючи полімери, спроможні бути деградовані in vivo. Біодеградовані поліізобутилціаноакрилатні нанокапсули, що відповідають цим вимогам, розглядаються для застосування в даному винаході, і такі частинки можуть бути легко одержані, як описано, [наприклад, у Lambert, G., et al. (2001) Int J Pharm 214(1-2): 13-6]. Способи одержання поліалкілціано-акрилатних наночастинок, які містять біологічно активні речовини, і їх застосування описане [в Патентах США №№4,329,332, 4,489,055 і 4,913,908]. Нанокапсули доступні комерційно від джерел, таких як Capsulution, Inc. (www.capsulution.com). Фармацевтичні композиції, які містять нанокапсули для доставки активних агентів,[описані у Патентах США №№5,500,224, 5,620,708 і 6,514,481]. [Патент США 5,500,224] описує фармацевтичну композицію у формі 81634 32 колоїдної суспензії нанокапсул, яка містить маслянисту фазу, що по суті складається з олії, розчиненої у поверхнево-активній речовині і суспендованій у множині нанокапсул, які мають діаметр менше ніж 500 нанометрів. [Патент США 5,620,708] описує композиції і способи введення лікарських засобів та інших активних агентів. Композиції містять активну частинку носія агента, прикріплену до зв'язувальної частини, яка зв'язується конкретно з націлювальною молекулою, присутньою на поверхні ентероциту ссавця. Зв'язувальна частина зв'язується з націлювальною молекулою зі зв'язувальною афінністю або авідністю, достатньою, щоб ініціювати ендоцитоз або фагоцитоз частинки носія активного агента так, щоб носій абсорбувався ентероцитом. Активний агент потім буде вивільнений з носія кругообігу великого кола хазяїна. Таким чином, можна уникнути деградації чутливих до деградації лікарських засобів, таких як поліпептиди, в кишечнику, в той час, як абсорбція протеїнів і поліпептидів з кишкового тракту збільшується. Альтернативно, винахід розглядає вивільнення активного в середовищі навколо клітини-мішені. Наприклад, в одному втіленні, уреаза вивільняється з нанокапсули, з наступним зв'язуванням націлювальної частини з клітиноюмішенню, таким, що уреаза вивільняється в мікросередовище навкадо клітини-мішені, наприклад, пухлинної клітини. [Патенти США 6,379,683 і 6,303,150] описують способи створення нанокапсул і їх застосування, і включені в даний опис за допомогою посилання. Так, в одному втіленні винаходу, контактування включає додавання до клітин кон'югату, що містить націлювальну частину і перший кільцеутворювальний пептид, який характеризується селектованим зарядом і здатністю взаємодіяти з другим, протилежно зарядженим кільцеутворювальним пептидом, для утворення стійкого α-спірального біспірального гетеродимеру. Згодом, до клітин додають ліпосому. Ліпосома містить зовнішню поверхню і внутрішню частину; активний агент, наприклад, уреазу, розміщену всередині внутрішньої частини ліпосоми; і множину других пептидів, де кожний другий пептид приєднується до зовнішньої поверхні ліпосоми. В іншому втіленні, яке детально описане нижче, контактування включає додавання ліпосом до клітин, де ліпосоми мають активний агент, наприклад, уреазу, у захопленій формі, і зовнішні поверхні ліпосоми включають націлювальну частину клітини, ефективну для зв'язування конкретно з поверхнею-мішенню, і гідрофільне покриття полімеру, ефективне для захисту націлювальної частини від взаємодії з поверхнеюмішенню. Гідрофільне покриття полімеру може бути зроблене з полімерних ланцюгів, які ковалентно з'єднуються із поверхневими ліпідними компонентами в ліпосомах через зв'язки, що вивільняються. У цьому втіленні, агент, що вивільняється, додається до пухлинних клітин в кількості, достатній, щоб викликати вивільнення суттєвої порції зв'язків в доданих ліпосомах, таким 33 чином піддаючи націлювальну частину дії поверхні-мішені. Зв'язки, що вивільняються, можуть бути зменшені хімічними зв'язками, такими як дисульфідний, ефірний і пептидний зв'язки. Переважно, афінна частина ефективна для зв'язування конкретно з рак-специфічним антигеном. Відповідно до цього втілення винаходу, розглядається спосіб лікування ссавців, оснований на ліпосомах. Спосіб включає систематичне введення суб'єкту, наприклад, внутрішньовенне введення, ліпосом, які мрють поверхневозв'язувальну націлювальну частину і гідрофільне покриття полімеру. Гідрофільне покриття полімеру, що складається з полімерних ланцюгів, прикріплених з можливістю вивільнення, ефективне для захисту націлювальної частини від взаємодії з мішенню. Переважні гідрофільні полімери обговорюються вище. Введені ліпосоми можуть системно циркулювати, поки не буде досягнуто бажаного біорозподілу ліпосом. Агент вивільнення, як описано нижче, вводиться суб'єкту в кількості, ефективній, щоб викликати розколення суттєвої частини, наприклад, більше ніж близько 50%, переважно більше ніж близько 70%, і більш переважно більше ніж близько 90% зв'язків, що вивільняються, у введених ліпосомах. Націлювальна частина виявляється при вивільненні гідрофільного полімерного ланцюга для взаємодії з його мішенню. У переважному втіленні, ліпосоми використовуються для лікування солідної пухлини. Ліпосоми включають уреазу, і необов'язково, додатковий активний агент, наприклад, протипухлинний лікарський засіб, у захопленій формі, і націлюються на ділянку пухлини націлювальною частиною, ефективною для зв'язування спеифічно з пухлино-специфічним антигеном. У зразковому способі, ліпосоми націлені на судинні ендотеліальні пухлинні клітини шляхом включення VEGF ліганду в ліпосоми, для селективного прикріплення до Flk-1,2 рецепторів, експресованих на проліферуючих пухлинних ендотеліальних клітинах [Niederman, Т.М., et al. (2002) Proc Natl Acad Sci 99(10): 7009-14]. Переважно, ліпосоми мають розмір між близько 30-400нм. Ліпосоми в цьому інтервалі розміру виявили здатність входження в пухлини через "розриви", присутні в обшивці ендотеліальних клітин васкулятури пухлини [Maruyama, K, et al. (1999) Adv Drug Deliv Rev 40(12): 89-102]. Після введення ліпосом, наприклад, внутрішньовенного введення, і після того, як достатній час минув, щоб дозволити ліпосомам розподілитись в суб'єкті і зв'язатись з пухлиною, суб'єкту вводять агент вивільнення, щоб вивільнити гідрофільне поверхневе покриття з ліпосоми. Вивільнення поверхневого покриття ефективне для надання націлювальної частини, щоб дозволити зв'язування ліпосом з клітинамимішенями. В одному втіленні, гідрофільне поверхневе покриття прикріплюється до ліпосом рН чутливими зв'язками. Зв'язки вивільняються після того, як ліпосоми зв'язались з пухлиною. 81634 34 Ліпосоми в будь-яких втіленнях, які описуються вище, можуть, необов'язково, включати один або більше захоплених протипухлинних лікарських засобів або радіофармацевтичних агентів або те і інше. Ліпосоми можуть бути додані і їм може бути дозволено розподілятись, після чого агент вивільнення може бути введений, щоб вивільнити гідрофільне поверхневе покриття, щоб надати прикріплену націлювальну частину та ініціювати зв'язування. Таким чином, захоплений протипухлинний лікарський засіб або радіофармацевтичний агент або обидва специфічно і місцево вводяться до мішені. Зразкові протиракові лікарські засоби описані в Розділі III.А. нижче. Зразкові радіофармацевтичні агенти для використання в способі винаходу описані в Розділі III.В. нижче. Ліпосоми можуть бути одержані і введені, як описано [у Патенті США №6,043,094], який включений в даний опис за допомогою посилання. Додаткові агенти доставки, такі як невеликі одношарові везикули (SUV's), як описано [в Патенті США №6,180,114], який включений в даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті, можуть бути залучені до даного винаходу. В4. Модулятори активного агента Даним винаходом також розглядаються модулятори активного агента як асоційовані хімічні об'єкти. Переважним модулятором активного агента є модулятор уреази. "Модулятор уреази" являє собою або інгібітор уреази або енхансер уреази. Модулятор в композиціях (наприклад, фармацевтичних композиціях) відповідно може бути вибраний з всіх або частин послідовностей полінуклеотиду уреази, антисенсибілізованих молекул уреази, поліпептидів уреази, протешу, пептиду або органічних модуляторів біоактивності уреази, таких як інгібітори, антагоністи (включаючи антитіла) або агоністи. Переважно, модулятор є активним у лікуванні медичного стану, який опосередковується за допомогою або покращується за допомогою експресії уреази або активності уреази. "Інгібітор уреази" включає молекулу або групу молекул, яка втручається в: (1) експресію, модифікацію, регуляцію, активацію або деградацію уреази; або (2) одну або більше з нормальних функцій уреази, включаючи гідроліз сечовини, що веде до продукування карбамату і аміаку. Інгібітор "діє безпосередньо на уреазу", коли інгібітор зв'язується з уреазою через електростатичні або хімічні взаємодії. Такі взаємодії можуть бути або можуть не бути опосередковані іншими молекулами. Інгібітор діє "опосередковано на уреазу", коли найбільш безпосередній вплив здійснюється на молекулу, іншу, ніж уреаза, що впливає на експресію, активацію або функціонування уреази. Інгібітори уреази служать для уповільнення перетворення сечовини в іони амонію. Інгібітори уреази включають, але не обмежуються ними, похідні гідроксамової кислоти (наприклад, ацетогідроксамової кислоти), похідні фосфораміду (наприклад, фтораміду), фосфати, тіоли 35 (наприклад, 2-меркаптоетанол і т.д.), борну кислоту, галогенові сполуки (наприклад, фториди і т.д.), і екстракт кори китайської кориці. Додаткові інгібітори уреази відомі фахівцям в даній галузі техніки і описані [в Патенті США №4,824,783 (Apr. 25, 1989)], який включений в даний опис за допомогою посилання. "Енхансер уреази" включає молекулу або групу молекул, які підсилюють: (1) експресію, модифікацію, регуляцію або активацію уреази: або (2) одну або більше з нормальних функцій уреази. Енхансер "діє безпосередньо на уреазу", коли енхансер зв'язується з уреазою через електростатичні або хімічні взаємодії. Такі взаємодії можуть бути або можуть не бути опосередковані іншими молекулами. Енхансер діє "опосередковано на уреазу", коли найбільш безпосередній вплив здійснюється на молекулу, іншу, ніж уреаза, що впливає на експресію, активацію або функціонування уреази. С Додаткові Активні Агенти Додаткові активні агенти можуть також включатись в композицію винаходу. Додаткові активні агенти, наприклад, протипухлинний агент (агент, активний проти проліферуючих клітин), може бути використаний в композиції перед, паралельно з або після контактування клітин з першим активним агентом. Наприклад, після того, як уреаза була націлена на пухлинні клітини, вона може мати здатність модулювати або регулювати зовнішнє середовище пухлини, наприклад, через зміни рівня рН. Активні агенти, наприклад, протипухлинні агенти, які підтримують основне середовище, потім будуть більш ефективні. У конкретних втіленнях, субстрати, що здатні бути ензиматично оброблені уреазою, розглядаються для застосування як активних агентів. Переважно, активний агент являє собою субстрат, який уреаза може використовувати для утворення іонів амонію, наприклад, сечовини. Зразкові протипухлинні агенти включають цитокіни та інші частини, такі як інтерлейкіни (наприклад, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 і тому подібне), трансформуючи ріст бета-фактора, лімфотоксину, фактора пухлинного некрозу, інтерферонів (наприклад, гамма-інтерферону), колонієстимулюючих факторів (наприклад, GMCSF, M-CSF і тому подібне), фактора судинної проникності, промоторів (селектинів) лецитинзбудливої відповіді, таких як L-селектин, Еселектин, Р-селектин, і протеїнових частин, таких як Clq і NK рецепторний протеїн. Додаткові придатні протипухлинні агенти включають сполуки, які інгібують ангіогенез і таким чином інгібують метастаз. Приклади таких агентів включають протамін медроксипрогестерон, пентозан полісульфат, сурамін, таксол, талідомід, ангіостатин, альфа-інтерферон, інгібітори металопротеїнази, фактор тромбоциту 4, соматостатин, тромобоспондин. Інші характерні і необмежувальні приклади активних агентів, корисних відповідно до даного винаходу, включають вінкристин, вінбластин, віндезин, бусульфан, хлорамбуцил, спіроплатин, цисплатин, карбоплатин, метотрексат, адріаміцин, мітоміцин, 81634 36 блеоміцин, цитозин арабінозид, аденіь арабінозил, меркаптопурн, мітотан, прокарбазин, дактиноміцин (антиноміцин D), даунорубіцин, доксорубіцин гідрохлорид, таксол, плікаміцин, аміноглулетимід, естрамустин, флутамід, лейпролід, мегестрол ацетат, тамоксифен, тестолактон, трилостан, амсакрин (m-AMSA), аспаргіназа (L-аспаргіназа), етопозид, продукти крові, такі як гематопорфірини або похідні вищезгаданого. Інші приклади активних агентів включають генетичний матеріал, такий як нуклеїнові кислоти, РНК і ДНК природного або синтетичного походження, включаючи рекомбінантну РНК і ДНК. ДНК, що кодує конкретні протеїни, може використовуватись у лікуванні багатьох типів різних хвороб. Наприклад, гени фактора некрозу пухлини або інтерлейкіну-2 можуть бути забезпечені для лікування сучасних типів раку; гени тимідин кінази можуть бути забезпечені для лікування раком яєчників або мозкових пухлин; і гени інтерлейкіну-2 можуть бути забезпечені для лікування нейробластоми, злоякісної меланоми або ниркоподібного раку. Додаткові активні агенти, які розглядаються для застосування в даному винаході, описані [в Патенті США №6,261,537], який включений в даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті. Протипухлинні агенти і скрини для виявлення таких агентів описані [в Monga, M. і Sausville, Ε.Α. (2002) Leukemia 16(4): 520-6]. У конкретних втіленнях, активний агент є слабо основною протипухлинною сполукою, ефективність якої зменшується вищим внутрішньоклітинним/нижчим позаклітинним рН градієнтом в солідній пухлині. Зразкові слабо основні протипухлинні сполуки включають доксорубіцин, даунорубіцин, мітоксантрон, епірубіцин, мітоміцин, блеоміцин, алкалоїди вінка, такі як вінбластин і вінкристин, алкілуючі агенти, такі як циклофосфамід і мехлоретамін гідрохлорид, і антринеопластичний пурин і похідні піримідину. В одному втіленні винаходу, композиція включає уреазу і відчуває нестачу суттєво в будьяких цитокінах, наприклад факторі некрозу пухлини і/або інтерферонах. У цьому втіленні, уреаза одна або з активними агентами, іншими, ніж цитокіни, переважно в поєднанні з протипухлинними агентами невеликих молекул, ефективна для інгібування росту ракових клітин. Таким чином, в цьому втіленні, композиція може діяти або може не діяти разом з ендогенними або природними цитокінами, присутніми у суб'єкта, якого лікують, але композиція, що вводиться, не містить додаткових, екзогенних цитокінів. D. Радіофармацевтичні агенти Таким же чином, радіофармацевтичні агенти можуть бути включені в композицію або в додаткові композиції. Придатні радіофармацевтичні агенти включають комерційно доступні агенти, які використовуються в позитронній емісійній томографії (ПЕТ), комп'ютеризованій томографії (КТ), гаматомографії, опроміненні рентгенівськими променями, рентгеноскопії і ядерному магнітному резонансі (ЯМР). 37 Радіофармацевтичні агенти включають метали, радіоактивні ізотопи і рентгеноконтрастні агенти (наприклад, галій, технецій, індій, стронцій, йод, барій, бром і фосфоровмісні сполуки), рентгенопрозорі агенти, контрастні агенти, барвники (наприклад, флуоресцентні барвники і хромофори) і ензими, які каталізують колориметричну або флуоресцентну реакцію. Взагалі, такі агенти можуть бути прикріплені або захоплені з використанням різноманітності технік, як описано вище, і можуть бути присутні в будьякій орієнтації. Дивіться, [наприклад, Патенти США №№6,159,443 і 6,391,280], які обидва включені в даний опис за допомогою посилання. Контрастні агенти відповідно до даного винаходу корисні в модальностях відображення, таких як контрастні агенти рентгенівських променів, зонди світлового зображення, мітки спіну або радіоактивні одиниці. Приклади придатних матеріалів для використання як контрастних агентів в ЯМР включають в даний момент доступні хелати гадолінію, такі як діетилен триамін пентаоцтова кислота (ДТПК) і гадопентаноат димеглумін, також як і залізо, магній, марганець, мідь і хром. Приклади матеріалів, корисних для КТ та опромінення рентгенівськими променями, включають йод-основані матеріали, такі як іонні мономери, які є типовим представником діатризоату та іоталмату, неіонними мономерами, такими як іопамідол, ізогексол та іоверзол, неіонні димери, такі як іотрол та іодиксанол, та іонні димери, наприклад, іоксагалат. Повітря та інші гази можуть бути включені для використання у ехозображенні. Ці агенти можуть бути виявлені з використанням стандартних технік, доступних в даній галузі техніки, і комерційно доступного обладнання. Відповідно до одного з втілень винаходу, ракові клітини контактують з радіофармацевтичним агентом до або після, або як до, так і після контактування з активним агентом. Наприклад, після того, як уреаза була націлена на пухлинні клітини, вона може мати здатність модулювати або регулювати зовнішнє середовище пухлини, наприклад, через зміни рівня рН. Радіофармацевтичні агенти, які підтримують основне середовище, потім будуть більш ефективними. Як люмінесцентні циклен-основані лантанідні хелати так і ті, що початково отримують магнітний резонанс, сигнатури виявились чутливими до змін в рівні рН. Люмінесцентні зонди, використані для зчитування змін рівня рН, звичайно виявляють зміни в тривалості флуоресценції іона лантаніду, як функції рН. Подібно, контрастні агенти магнітного резонансу, які модулюють воднопротонну релаксацію через зміни в рівні рН, корисні в даному винаході. В обох випадках, за допомогою зміни рівня рН в даній системі, будьхто може уявити агенти з підсиленим контрастом. Відповідно, рН чутливий контрастний агент використовується на або навколо ракової клітини. Ракова клітина або клітина також піддаються дії композиції уреази, яка містить ензим уреази, щоб 81634 38 привести до зміни в рівні рН на або навколо ракової клітини. Таким чином, зміна в рівні рН викликає релаксаційні властивості ядерного магнітного резонансу водних протонів або інших ядер у водному середовищі, яке"" повинно бути змінене способом, що відображає рівень рН. Приклади рН чутливих контрастних агентів, які можуть бути використані, включають ті агенти, які містять метал лантаніду, такий як Се, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, і тому подібне, або інший парамагнетичний елемент, такий як Fe, Μn, 170, або подібне. Конкретні контрастні агенти, які можуть бути використані, включають Η (2)(17)О, GdDOTA-4AmP(5-), які описані [в Magn Reson Med. 2003 Feb; 49(2): 249-57], і Fе(III)мезо-тетра(4сульфонатофеніл)порфін (Fe-TPPS4), як описано [у Helpern etal. (1987) Magnetic Resonance in Medicine 5: 302-305 і Патенті США №6,307,372], які включені в даний опис за допомогою посилання. В доповнення, Gd, зв'язаний з полііоном, як описано [у Mikawa et al. Acad. Radiol (2002) 9(suppl 1):S109S1111, можуть бути використані у даному винаході. Як інша альтернатива, реактив зсуву може бути забезпечений у водному середовищі, яке оточує ракову клітину. Реактив зсуву розміщується так, що зміна в рівні рН впливає на хімічні властивості зсуву водних протонів або інших ядер, способом, що відображає рівень рН. Зміна у властивостях хімічного зсуву може потім бути виміряна за допомогою ядерного магнітного резонансу, щоб визначити, чи є активний агент біологічно активним. Зразкові реактиви зсуву, які можуть бути використані, включають ті, які містять метал лантаніду, такий як Се, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Db, Dy, Ho, Er, Tm, або Yb, або інший парамагнетичний елемент. Приклади конкретних реактивів зсуву, які можуть бути використані, включають Tm(DOTP) (5-), тулій (III) комплекс 1,4,7,10-тетраазацилододекан-N,N',N",N'"тетра(метиленфосфату), Dy(PPP) (2)(7)-диспрозій триполіфосфат і тому подібне. В одному втіленні винаходу, стратегія подвійно контрастного агента, використовуючи два агенти гадолінію, такі як рН-нечутливий GdDOTP(5-) і рН-чутливий GdDOTA-4AmP(5-), може бути використана для генерування рН карт ЯМР, як описано [в Magn Reson Med (2003) Feb; 49(2): 249-57]. Переважні агенти для використання з ПЕТ скануванням включають 13N і фтордеоксиглюкозу (ФДГ). Е. Склад композиції Як визначено вище, композиції винаходу містять активний агент і, необов'язково, асоційований хімічний об'єкт. Наприклад, поліпептид уреази або полінуклеотид уреази, і/або містять хімічну або біологічну сполуку, що є активною як модулятор експресії уреази або активності уреази. Крім того, біо сумісний фармацевтичний носій, ад'ювант або наповнювач може також бути включений у склад. Композиція може також містити інші нуклеотидні послідовності, поліпептиди, лікарські засоби або гормони, змішані з ексципієнтом(ами) 39 або іншими фармацевтично прийнятними носіями. Композиції, інші, ніж фармацевтичні композиції, необов'язково включають рідину, тобто, воду або рідину, основану на воді. Фармацевтично прийнятні ексципієнти, які повинні бути додані до фармацевтичних композицій, також відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям, і є легко доступними. Вибір ексципієнта буде визначатись частково конкретним способом введення продукту, який використовується, відповідно до даного винаходу. Відповідно, існує широка різноманітність придатних складів для використання в контексті даного винаходу. Техніки для складів і введення фармацевтичних композицій можуть бути знайдені у Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., 19th Ed., Williams & Wilkins, 1995, і є добре відомими кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям. Вибір ексципієнта буде визначатись частково конкретним способом введення продукту, який використовується, відповідно до даного винаходу. Відповідно, існує широка різноманітність придатних складів для використання в контексті даного винаходу. Наступні способи і ексципієнти є тільки зразковими і не призначені для обмеження. Фармацевтичні композиції даного винаходу можуть бути виготовлені з використанням будьякого звичайного способу, наприклад, змішування, розчинення, гранулювання, розтирання в порошок, емульгування, інкапсулювання, захоплення, формування волокна з розплаву, сушіння розпилюванням або способів ліофілізування. Однак, оптимальний фармацевтичний склад буде визначений фахівцем в даній галузі техніки залежно від шляху введення і бажаного дозування. Таї·: склади можуть вплинути на фізичний стан, стабільність, швидкість вивільнення in vivo і швидкість очищення in vivo агента, що вводиться. Залежно від стану, який лікують, ці фармацевтичні композиції можуть бути складені і введені, як описано в Розділі III нижче. Фармацевтичні композиції утворюються так, щоб містити придатні фармацевтично прийнятні носії, і можуть необов'язково включати ексципієнти і ад'юванти, які полегшують переробку активних сполук у препарати, які можуть бути використані фармацевтично. Модальність введення взагалі визначає природу носія. Наприклад, склади для парентерального введення можуть включати водні розчини активних сполук в розчинній у воді формі. Носії, придатні для парентерального введення, можуть бути вибрані з сольового розчину, буферного сольового розчину, глюкози, води та інших фізіологічно сумісних розчинів. Переважні носії для парентерального введення являють собою фізіологічно сумісні буфери, такі як розчин Хенка, розчин Рінгера, або фізіологічно забуферений сольовий розчин. Для тканинного або клітинного введення, пенетранти, відповідні для проникнення через конкретний бар'єр, використовуються у складі. Такі пенетранти взагалі відомі в даній галузі техніки. Для препаратів, які містять протеши, склад може включати стабілізуючі матеріали, такі як поліолі 81634 40 (наприклад, сахарозу) і/або поверхнево-активні речовини (наприклад, неіонні поверхнево-активні речовини) і тому подібне. Альтернативно, склади для парентерального використання можуть включати суспензії активних сполук, приготовані як відповідні маслянисті суспензії для ін'єкції. Придатні ліофільні розчинники або наповнювачі включають жирні олії, такі як кунжутна олія, і синтетичні жирно кислотні ефіри, такі як етил олеат або тригіцериди, або ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкції можуть містити речовини, які збільшують в'язкість суспензії, такі як натрій карбоксиметил целюлоза, сорбіт або декстран. Необов'язково, суспензія може також містити придатні стабілізатори або агенти, які збільшують розчинність сполук, щоб дозволити приготування сильно концентрований розчинів. Емульсії, наприклад, дисперсії олія-уводі і вода-в-олії, можуть також бути використані, необов'язково стабілізовані емульгатором або диспрегатром (поверхнево-активні матеріали; поверхнево-активні речовини). Ліпосоми, як описано вище, які містять активний агент, можуть також бути залучені до парентерального введення Альтернативно, фармацевтичні композиції, які містять агент в дозуванні, прийнятному для орального введення, можуть складатись з використанням фармацевтично прийнятних носіїв, добре відомі в даній галузі техніки. Препарати, які складаються для орального введення, можуть бути у формі таблеток, пілюль, капсул, облаток, коржиків, рідин, гелів, сиропів, рідких сумішей, суспензій, або порошків. Для прикладу, фармацевтичні препарати для орального введення можуть бути одержані за допомогою об'єднання активних сполук з твердим ексципієнтом, необов'язково подрібнюючи одержану суміш і обробляючи суміш гранул, після додавання відповідних допоміжних речовин, якщо бажано, для одержання таблеток. Оральні склади можуть включати рідкі носії, подібних до тих, які описані для парентерльного використання, наприклад, буферні водні розчини, суспензії і тому подібне. Ці препарати можуть містити один або більший ексципієнтів, які включають, без обмеження: а) розріджувачі, такі як цукор, включаючи лактозу, глюкозу, сахарозу, маніт або сорбіт; b) зв'язувачі, такі як магній алюмінієвий силікат, кукурудзяний крохмаль, пшениці, рису, картоплі, т.д.; с) целюлозні матеріали, такі як метил целюлоза, гідроксипропінетил целюлоза, і натрій карбоксиметил целюлоза, полівініл піролідон, камеді, такі як гуміарабік і трагакантова камедь, і протеїни, такі як желатин і колаген; d) дезинтегруючі або солюбілізуючі агенти, такі як зшитий полівініл піролідон, крохмаль, агар, альгінова кислота або їх сіль, така як натрій альгінат, або шипучі композиції; e) змащувачі, такі як кремнезем, тальк, стеаринова кислота або сіль магнію або кальцію, і поліетиленгліколь; f) агенти, що надають смаку та запаху, та підсолоджувачі; g) барвники або пігменти, наприклад, для визначення продукту або кількості (дозування) активного агента; і h) інші інгредієнти, такі як консерванти, 41 стабілізатори, агенти набухання, емульгатори, промотори розчину, солі для регулювання осмотичного тиску і буфери. Фармацевтична композиція може бути забезпечена як сіль активного агента, яка може бути утворена з багатьма кислотами, включаючи, але не обмежуючись цим, хлористоводневу, сірчану, оцтову, молочну, винну, яблучну, янтарну і т.д. Солі мають схильність бути більш розчинними у водних або інших протонних розчинниках, які, є відповідними вільно основними формами. Як визначено вище, властивості самого агента і складу агента можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість у вивільненні in vivo і швидкість в очищенні in vivo введеного агента. Такі фармакокінетичні та фармакодинамічні дані можуть бути зібрані за допомогою доклінічних in vitro і in vivo досліджень і пізніше підтверджені у людини протягом курсу клінічних досліджень. Керівництво для виконання людських клінічних досліджень, які основуються на in vivo даних тварин, може бути одержане з ряду джерел, включаючи, наприклад, http://www.clinicaltrials.gov. Так, для будь-якої сполуки, використаної в способі винаходу, терапевтично ефективна доза для ссавців, особливо людини, може бути підрахована початково на основі біохімічного і/або клітинного аналізів. Потім, дозування може складене в тваринних моделях, щоб досягнути бажаного діапазону циркулюючої концентрації, яка модулює експресію або активність активного агента. Оскільки людські дослідження проведені, подальші дані з'являться відносно відповідних рівнів дозування і тривалості лікування для різних хвороб і станів. Токсичність і терапевтична ефективність таких сполук може бути визначена стандартними фармацевтичними методиками в культурах клітини або експериментальних тваринах, наприклад, для визначення LD50 (смертельна доза для 50% популяції) і ED50 (терапевтично ефективна доза для 50% популяції). III. Спосіб винаходу Інший аспект даного винаходу включає спосіб інгібування росту ракових клітин. Спосіб включає один або більше компонентів композиції, описаної в Розділі II, вище, і/або в Розділах IV-VII, нижче. Спосіб включає піддавання клітин дії уреази як активному агенту в кількості, ефективній для інгібування росту ракових клітин. А. Піддавання ракових клітин дії активного агенту Композиція уреази, наприклад, уреаза сама по собі або уреаза в поєднанні з хімічним об'єктом, ефективним, щоб поліпшити доставку ензиму до ракових клітин, може бути доставлена до ракових клітин рядом способів, відомих в даній галузі техніки. В терапевтичних застосуваннях, композицію вводять до ракових клітин пацієнта, в кількості, достатній для інгібування росту ракової(их) клітин(и). Фармацевтичні композиції винаходу можуть бути введені в ракові клітини рядом шляхів введення, включаючи, без обмеження, парентеральне, ентеральне, 81634 42 трансепітеліальне, черезслизове, трансдермальне і/або хірургічне введення. Модальності парентерального введення включають ті, в яких композиція вводиться за допомогою, наприклад, внутрішньовенної, внутріпіньоартеріальної, внутрішньочеревинної, внутрішньомозкової, внутрішньом'язової, внутрішньосуглобної, інтратекальної та інтравентикулярної ін'єкції, підшкірної, інтрагонадної або внутрішньопухлинної голчастих болюсних ін'єкцій, або пролонгованої безперервної, пульсуючої або запланованої перфузій або мікроінфузій, використовуючи відповідну технологію насосом. Модальності ентерального введення включають, наприклад, оральне (включення букальне і під'язикове) і ректальне введення. Модальності трансепітеліального введення включають, наприклад, черезслизове введення і трансдермальне введення. Черезслизове введення включає, наприклад, ентеральне введення, також як і назальне, інгаляційне і глибоке легеневе введення, вагінальне введення і ректальне введення. Трансдермальне введення включає пасивну або активну трансдермальну або черезшкірну модальності, включаючи, наприклад, бляшки і прилади для іонтофорезу, також як і місцеве застосування паст, заспокійливих засобів або мазей. Хірургічні методи включають імплантацію запасних (резервних) композицій, осмотичних насосів і тому подібне. Єдині або багаторазові введення активного агента можуть вводитись в залежності від дозування і частоти, як вимагається і переноситься суб'єктом. Так чи інакше, композиція повинна забезпечити достатню кількість активного агента за даним винаходом для ефективного лікування суб'єкта. Фахівець в даній галузі техніки повинен взяти до уваги, що є деякі ділянки, які не є тяжко васкуляризованими або є захищеними клітинами, які з'єднуються щільними з'єднаннями і/або активними транспортними механізмами, які зменшують або запобігають входженню макромолекул, присутніх в кровотоці. Так, наприклад, систематичне введення лікарських засобів для лікування гліом або інших мозкових раків, може бути стримане гематоенцефалічним бар'єром, який перешкоджає входженню макромолекул в субарахноїдальний простір. У цих типах пухлин терапевтична композиція може переважно бути введена безпосередньо в пухлинну ділянку. Так, наприклад, мозкові пухлини можуть лікуватись за допомогою введення терапевтичної композиції безпосередньо до пухлинної ділянки, наприклад, через болюсну ін'єкцію, мікроінфузію або хірургічно імплантований катетер. Виділення може включати візуалізацію ракової клітини або пухлини з інструментарієм виявлення зображення, наприклад, як описано [в Enhanced Magnetic Resonance Imaging, V. M. Runge, ed., С V. Mosby Co. (1989) for MRI; наприклад, у ЕР 188,256; Kozak et al., TIBTEC October 1986, 262; Radiotracers for Medical Applications, CRC Press, 43 Boca Raton, Fla., для радіодіагностики і/або для радіотерапії; у Positron Emission Tomography of the Brain, Springer Verlag 1983, для ПЕТ; і у J. W. Nowicky et al., "Macroscopic UV-Marking through Affinity," J. Tumor Marker Oncology 31, 463-465 (1988)]. Так, будь-який з множини діагностичних агентів може бути введений в композиції, які можуть місцево або системно доставляти введені агенти через введення пацієнту. Радіофармацевтичні агенти, як описано вище, можуть біти використані для того, щоб дозволити контролювати лікування пухлини через введення композицій пацієнтові. Наприклад, їх звичайно вводять перед виконанням процедури відтворення зображення. Також введення може бути одночасним з відтворенням зображення там, де бажано, наприклад, у фармакокінетичних дослідженнях. Оптимальний період часу, який вимагається для локалізації в цільовій ділянці і оптимальне збільшення зображення, також змінюється з активним агентом і/або кон'югатом і/або тканиною і/або модальністю відтворення зображення, і також звичайно визначається. Звичайно, відтворення зображення відбувається перед значним очищенням активного агента з ділянки, період часу якого може також бути звичайно визначеним в даній галузі техніки. У конкретних втіленнях, активні агенти або кон'югати вводять за 15хв. - до 4 годин перед виконанням процедури відтворення зображення, оскільки активні агенти можуть бути локалізовані швидко до їх цільових ділянок і потім, необов'язково, швидко з них очищені, як обговорюється нижче. В одному втіленні винаходу, виділення включає дослідження суб'єкта діагностичним інструментальним засобом, здатним до виявлення змін в позаклітинному рівні рН в тканині суб'єкта, і розпізнавання ділянки тканини у суб'єкта, яка показує селективне підняття в позаклітинному рівні рН після введення. Основане на ідентифікації, виділення може повторюватись, доки не буде досягнуто селективної зміни в позаклітинному рівні рН всередині всієї солідної пухлини. В одному втіленні винаходу, виділення включає парентеральне введення композиції активного агента суб'єкту інакше, ніж прямою ін'єкцією. Активний агент може бути дериватизований, як зазначено в Розділі II, вище. Як вказано вище, уреаза каталізує гідроліз сечовини, ведучи до продукування карбамату і аміаку. У водному середовищі, карбамат швидко і мимовільно розкладається для одержання другої молекули аміаку і одного з діоксидів вуглецю (Фіг.1). Уреаза має широку різноманітність функцій. її первинна роль для середовища дозволити організму використовувати зовнішньо і внутрішньо генеровану сечовину як джерело азоту. В рослинах уреаза може брати участь в системних шляхах доставки азоту і може служити токсичним захисним протеїном. Субстратом для уреази є сечовина, що продукується в печінці, яка переноситься в кровотоці до нирок і виділяється в сечу. Сироваткові концентрації сечовини у здорових 81634 44 людей складають звичайно між 1 і 10mМ, але рівні сечовини в сечі можуть перевищити 0,5Μ [Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck and Co., Inc., Rahway, NJ, 1999]. Сечовина також присутня в секреціях великих і малих екзокринних залоз в концентраціях, приблизно еквівалентних до сироватки, так що велика частина циркулюючої сечовини зміщається на поверхні клітини секреторними системами, або в тканинні ексудати [Burne, R. Α., and Chen, Y. Μ., Microbes and Infection, 2, 2000; 533-542]. Наприклад, доросла людина виділяє майже 1 літр слини за день, яка містить 1-10мМ сечовини, і приблизно 20-25% всієї сечовини, яка продукується, входить в кишковий тракт скоріше, ніж виходить з тіла в сечі [Visek, W. J., Fed. Proc. 31 (1972) 1178-1193]. Немає очевидного механізму активного витікання для екзокринної секреції сечовини, так що вважається, що незаряджена молекула сечовини просто слідує за водою через клітини і щільні з'єднання епітелію. Як наслідок, поверхні клітин в людському тілі омиваються рідиною, яка містить сечовину [McLean R. J. С, et al. CRC, Crit. Rev. Microbiol. 16 (1988) 37-79]. В. Двох- і трьохстадійне виділення Як зазначено вище, відповідно до оцного втілення винаходу, активний агент безпосередньо кон'югує з націлювальною частиною. Альтернативно, відповідно до іншого втілення винаходу, двох-стадійний підхід використовують для того, щоб доставити активний агент до пухлинних клітин. Переважно, пухлинні клітини знаходяться всередині суб'єкта. Двох-стадійний підхід має перевагу розділення фармакокінетики активного агента від фармакокінетики націлювальної частини. Націлювальна частина може зрощуватись з цільовими ділянками, доки вона кон'югована з першим зв'язувальним партнером, наприклад, кільцеутворювальним пептидом. Після зрощування націлювальної частини, по суті всі з нецільових кон'югатів можуть бути очищені від кровообігу суб'єкта. Активний агент може потім бути введений як кон'югат до комплементарного члена зв'язувального партнера, наприклад, другого кільцеутворювального пептиду. Будь-яка двох-стадійна система, відома в даній галузі техніки, може бути використана, така як біотин, гаптени і т.д., що мають зв'язувальний партнер високої афінності, наприклад, авідин, специфічні антитіла, т.д. [Див., наприклад, Патенти США №№6,190,923, 6,187,285, і 6,183,721]. Переважна двох-стадійна система включає біспіральну систему. Таким чином, в конкретних втіленнях винаходу, які включають двох-стадійний підхід, як описано вище, перший кон'югат, який містить націлювальну частину і перший кільцеутворювальний пептид, який характеризується селективним зарядом і здатністю взаємодіяти з другим, протилежно зарядженим кільцеутворювальним пептидом, для утворення стійкого α-спірального біспірального гетеродимеру, додають до пухлинних клітин. Зразковий спосіб кон'югування націлювальної 45 частини антитіла до кільцеутворювального пептиду описаний у Прикладі 4. Потім другий кон'югат, який містить другий кільцеутворювальний пептид і активний агент, додають до клітин. Переважний активний агент являє собою уреазу. Зразковий спосіб кон'югування уреази канавалії мечеподібної з кільцеутворювальним пептидом описаний у Прикладі 2 Коли перший кільцеутворювальний пептид і другий кільцеутворювальний пептид змішані разом в умовах, які підтримують утворення α-спіральних біспіральних гетеродимерів, вони взаємодіють, щоб утворити двох-субодиничний α-спіральний біспіральний гетеродимерний комплекс. Пептиди всередині α-спіральної біспіральної конформації взаємодіють один з одним до певної характерної міри, яка визначається первинною послідовністю кожного пептиду. Третинна структура α-спіралі є такою, що сім залишків амінокислот у первинній послідовності один за одним відповідають приблизно двом поворотам α-спіралі. Відповідно, первинна амінокислотна послідовність, що утворює α-спіральну конформацію, може бути розбита на одиниці кожного з семи залишків, названих "гептадами". Гетеродимер-субодиничні пептиди складаються з ряду гептадів послідовно. Коли послідовність гептаду повторюється в конкретному гетеродимер-субодиничному пептиді, гептад може бути надалі названий "повторення гептаду", або просто "повторення". Перший кільцеутворювальний пептид і другий кільцеутворювальний пептид можуть збиратись в біспіральну спіраль (біспіральний геетродимер) в паралельні або антипаралельні конфігурації. У паралельній конфігурації, дві гетеродимерсубодиничні пептидні спіралі вирівнюються так, що вони мають однакову орієнтацію (аміно-кінець до карбоксил-кінця). В антипаралельній конфігурації, спіралі розташовуються так, що аміно-кінець однієї спіралі вирівнюється з карбоксил-кінцем іншої спіралі, і навпаки. Такі гетеродимерні субодиниці описані [в РСТ заявці на патент WO 95/31480 "Heterodimer Polypeptide Immunogen Carrier Composition and Method", дата публікації 23 листопада 1995], яка включена в даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті. Зразкові субодиниці згадуються тут як К-кільця, що відносяться до позитивно заряджених субодиниць, заряд яких забезпечується домінуюче залишками лізину, і Ε-кільця, що відносяться до негативно заряджених субодиниць, заряд яких забезпечується домінуюче залишками глутамінової кислоти. Переважні приклади з вищезазначеної заявки включають ID SEQ NOS: 12. Гетеродимер-субодиничні пептиди, сконструйовані згідно з керівництвом, яке представлене у вищезазначеній заявці, звичайно виявляють перевагу для збирання в паралельну орієнтацію проти антипаралельної орієнтації. Наприклад, зразкові пептиди, ідентифіковані ID SEQ NО:3 і ID SEQ NO: 4, утворюють гетеродимери паралельної конфігурації, як роблять інші пептидні послідовності [як 81634 46 обговорено у заявці WO 95/31480]. Додатковий зразковий пептид включає К-кільцевий пептид, складений з 7-амінокислот, наприклад, ID SEQ NO: 5 повторень. В одному втіленні, К-кільце складається з 35 амінокислот в довжині; є позитивно зарядженим, без конкретної структури у розчині. Ε-кільце може бути пептидом, що складається з 7-амінокислот, наприклад, ID SEQ NO: 6 повторень. В одному втіленні, Ε-кільце складається з 35 амінокислот в довжині; є негативно зарядженим, і не має конкретної структури у розчині. Як зазначено вище, один з двох субодиничних пептидів в гетеродимері містить націлювальну частину, а інший пептид містить активний агент. В обох випадках, пептид може бути синтезований або дериватизований після синтезу, щоб забезпечити потрібну функцію прикріплення. Зразковий спосіб пептидного синтезу описаний у Прикладі 1. Загалом, більшість кон'югуючих способів не знищують кільцеутворювальну активність кільцеутворювального пептиду, і такі кон'югування не розривають активність кон'югованого активного агента або націлювальної частини. Зважаючи на модифікацію першого кільцеутворювального пептиду, пептид може бути синтезований або на N- або на С-кінці з тим, щоб переносити додаткові кінцеві пептиди, які можуть функціонувати як спейсер між націлювальною частиною і спіраль-утворювальною частиною пептиду. Кільцеутворювальний пептид націлювальної частини і/або кільцеутворювальний пептид активного агента може бути синтезований, як зазначено вище, або твердотільним електролізом з періодичним реверсуванням струму, або рекомбінантним способами, in vivo або in vitro. У формуванні кон'югату через твердотільні способи, активний агент або націлювальна частина переважно ковалентно прикріплюється до N-кінця амінокислотного залишку, або до одного з залишків, розкриваючи виділену поверхню гетеродимеру. Переважні зв'язувальні групи являють собою тіольні групи залишків цистеїну, які легко змінюються стандартними способами. Інші корисні зв'язувальні групи включають тіоефір метіонін, імідазолільна група гістидину, гуанідильна група аргініну, фенольна група тирозину та індолільна група триптофану. Ці зв'язувальні групи можуть бути дериватизовані, використовуючи реакційні умови, відомі кваліфікованим в даній галузі фахівцям. Щоб зв'язати другий кільцеутворювальний пептид активного агента з кільцеутворювальним пептидом націлювальної частини, два пептиди контактують в умовах, що підтримують утворення гетеродимеру. Зразкове утворення середовище сприятливого біспірального гетеродимеру являє собою фізіологічносумісний водний розчин, який звичайно має рівень рН між близько 6 і близько 8 і концентрацію солі між близько 50мМ і близько 500мМ. Переважно, концентрація солі складає між близько 100мМ і близько 200мМ. Зразкове середовище має наступний склад: 56мМ фосфату 47 калію, 100мМ KСl; рН7. Однаково ефективні середовища можуть бути одержані за допомогою заміщення, наприклад, фосфат натрію на фосфат калію і/або NaCl на KСI. Гетеродимери можуть бути утворені в умовах поза вищезазначеними рівнем рН і діапазоном концентрацій солі, середовищем, але деякі молекулярні взаємодії і відносна стабільність гетеродимерів проти гомодимерів можуть відрізнятись від властивостей, детально розписаних вище. Наприклад, іонні взаємодії між іонними групами, які ведуть до стабілізації гетеродимерів, можуть зламатись при низьких або високих значеннях рН завдяки протонуванню, наприклад, Glu бічних ланцюгів в кислотному рН, або депротонуванню, наприклад, Lys бічних ланцюгів в основному рН. Такі впливи низьких і високих значень рН на утворення біспірального гетеродимеру можуть бути подолані, однак, за допомогою збільшення концентрації солі. Збільшення концентрації солі може нейтралізувати стабілізування притягнення іонів або стримувати дестабілізування відштовхування іонів. Певні солі мають більшу ефективність в нейтралізуванні іонних взаємодій. Наприклад, у випадку K-кільцевого пептиду, 1М або більша концентрація СlO4- аніонів необхідна для індукування максимальної α-спіральної структури, тоді як 3М або більша концентрація іонів Сlнеобхідна для того ж впливу. Впливи високої солі на біспіральне утворення при низькому і високому рівнях рН також показують, що внутрішньоспіральні притягнення іонів не є суттєвими для утворення спіралі, але скоріше, контролюють, чи біспіраль схиляється до утворення як гетеродимера проти гомодимера. Перший кільцеутворювальний пептид, наприклад, Е-кільцевий пептид, і другий кільцеутворювальний пептид, наприклад, K-кільцевий пептид, можуть також кон'югуватись з націлювальними частинами і активними агентами, як описано [у Прикладі 2 заявки США 09/654,191] (Справа повереного №:4800-0015.31), що знаходиться у співвласності, яка включена в даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті. Див., також, [Патент США 6,300,141], який включений в даний опис за допомогою посилання у всій своїй повноті. В одному втіленні винаходу, кільцеутворювальний пептид активного агента має коротке півжиття сироватки і виділяється нирковим шляхом. Таким чином, активний агент або зрощується з цільовою ділянкою або швидко видаляється з суб'єкта. Цей біорозподіл активного агента полегшує захист нормальних тканин одержувача від небажаного виділення. З тим, щоб підсилити ниркове виділення може бути залучене кон'югування до спрямовуючої біорозподіл молекули, що промотує ниркове виділення. Альтернативою до необов'язкової стадії очищення є те, щоб дозволити пройти достатній кількості часу, що дозволяє природним механізмам очищення суб'єкта у значній мірі видалити перший кон'югат. В іншому втіленні, антитіло-основані або неантитіло-основані націлювальні частини 81634 48 залучаються для доставки ліганду або антиліганду до цільової ділянки, що несе невпорядкований антиген. Переважно, з цією метою використовується природний зв'язувальний агент для такого невпорядкованого антигену. Наприклад, хвороби, такі як гепатома або мієлома взагалі характеризуються невпорядкованими IL-6 рецепторами, для яких IL-6 діє як аутокринна або паракринна частина щодо швидкості проліферації цих типів клітин-мішеней. Для лікування таких захворювань, IL-6, таким чином, може бути залучений як націлювальна частина. Дивіться, [наприклад, Mild, С. et al. (2002) Cancer 94(5): 1584-92]. Наприклад, IL-6 і перший кільцеутворювальний пептид можуть кон'югуватись через хімічні засоби або бути утворені як рекомбінантна молекула. Кон'югат IL-6перщий кільцеутворювальний пептид вводиться одержувачу, і IL-6 компонент кон'югату спрямовує локалізацію кон'югату до IL-6 рецепторів. Ця локалізація матиме місце, переважно, на ділянках, що несуть невпорядковані IL-6 рецептори. Після того, як відбувається локалізація цільової ділянки, очищувальний агент, як описано нижче, необов'язково вводиться, щоб суттєво очистити циркуляцію одержувача кон'югату IL-6-перший кільцеутворювальний пептид. Придатні очищувальні агенти з цією метою являють собою, наприклад, IL-6 рецептор-НSА-галактоза або антиІL-6-антитіло-НSА-галактоза. Після часу, достатнього для суттєвого, наприклад, 50%, 70% або переважно 90%, очищення IL-6 з кровообігу одержувача, активний агент-другий кільцеутворювальний пептид, наприклад, уреазадругий кільцеутворювальний пептид, вводиться і локалізує в цільові ділянки кон'югат IL-6-перший кільцеутворювальний пептид. Як описано більш детально в Розділі VII нижче, експресійні вектори, які походять від ретровірусів, аденовірусу, герпесу або вірусів вакцинії, або від різних бактеріальних плазмід, можуть бути використані для доставки рекомбінантних молекул уреази до популяції клітин-мішеней. Способи, які добре відомі кваліфікованим в даній галузі фахівцям, можуть бути використані для конструювання рекомбінантних векторів, які містять уреазу. Дивіться, наприклад, техніки, які описуються [в Sambrook et al., і Ausubel et al]. Альтернативно, активні агенти можуть бути доставлені до клітинмішеней, використовуючи ліпосоми або нанокапсули, як описано в Розділі II вище. В одному втіленні, спосіб винаходу включає додавання суб'єкту композиції, яка містить активний агент і націлювальну частину, ефективні для націлювання композиції до клітин-мішеней. С. Очищувальні агенти Як зазначено вище, очищувальний агент може вводитись суб'єкту. Очищувальний агент здатний до спрямування циркулюючого першого кон'югату до гепатоцитних рецепторів, таким чином зменшуючи кількість циркулюючого першого кон'югату до введення другого кон'югату. 49 Як вказано вище, очищувальні агенти композиції протешу або не-протеїну, які мають фізичні властивості щодо полегшення застосування для in vivo комплексоутворення і очищення крові від незв'язаних кон'югатів націлювальної частини, можуть бути корисними, коли суб'єкт має пухлинні клітини, наприклад, людина. Очищувальні агенти переважно виявляють одну або більше з наступних характеристик: швидке, ефективне комплексоутворення з націлювальною частиною in vivo; швидке очищення з крові кон'югатів націлювальної частини, здатних до зв'язування послідовно введеного активного агента; висока здібність до очищення або інактивування великих кількостей кон'югатів націлювальної частини; і низький рівень імуногенності. Корисні очищувальні агенти включають гексоза-основані і не-гексоза-основані частини. Гексоза-основані очищувальні агенти являють собою молекули, які були отримані, щоб ввести одну або більше гексоз (шість вуглець цукрових частин), що розпізнаються рецепторами Ashwell або іншими рецепторами, такими як маноза/Nацетилглюкозамін рецетор, асоційовані з ендотеліальними клітинами і/або клітинами Kupffer печінки або маноза 6-фосфат рецептором. Зразкові гексози включають галактозу, манозу, манозу 6-фосфат, N-ацетилглюкозамін і тому подібне. Інші частини, які розпізнаються рецепторами Ashwell, включаючи глюкозу, Nгалактозамін, N-ацетилгалактозамін, тіогліказиди галактози і, звичайно, D-галактозиди і глюкозиди також можуть бути використані. Кон'югування тоглюкозиду галактози з протеїном може бути удосконалене, наприклад, як описано [в Lee et al. (1976) Biochemistry, 15(18): 3956 or Drantz et al.(1976) Biochemistry, 15(18): 3963]. Галактоза-основані очищувальні агенти протеїнового типу включають протеїни, які мають ендогенно виділені залишки галактози або які були одержані, щоб виділити або ввести такі залишки галактози. Виділені залишки галактози спрямовують очищувальний агент до швидкого очищення ендоцитозом в печінку через конкретні рецептори (рецептори Ashwell). Ці рецептори зв'язують очищувальний агент та індукують ендоцитоз в гепатоциті, ведучи до злиття з ліпосомою і рециклом повернення рецептора назад до поверхні клітини. Цей механізм очищення характеризується високою ефективністю, високою продуктивністю і швидкою кінетикою. Зразковий очищувальний агент протеїноснованої/галактоза-несучої множини є похідне слово асіалоорозомукоїдним похідним людського альфа-1 кислотного глікопротеїну. Швидке очищення асіалоорозомукоїду з крові описане [в Galli, et al., J Sci of Nucl Med (1988) 32(2): 110-16]. Обробка орозомукоїду нейрамінідазою видаляє залишки егалової кислоти, таким чином виділяючи залишки галактози. Додаткові дериватизовані очищувальні агенти включають, наприклад, галактозильований альбумін, галактозильованийIgM, галактозильований-IgG, асіалогаптоглобін, асіалофетуїн і асіалоцеркулоплазмін. 81634 50 Додаткові очищувальні агенти описані [в Патенті США №6,358,490, виданому 19 березня, 2002; Патенті США №6,172,045, виданому 9 січня, 2001; і Патенті США №5,886,143, виданому 23 березня, 1999], кожний яких включений в даний опис за допомогою посилання. Подальший клас очищувальних агентів, корисних в даному винаході, включає невеликі молекули, наприклад, в діапазоні від близько 500 до близько 10,000 Дальтон. Невеликі молекули можуть бути дериватизовані з галактози. Очищувальні агенти невеликих молекул переважно здатні до (1) швидкого і ефективного комплексоутворення з відповідним кон'югатом, кільцеутворювальним пептидом, активним агентом і/або націлювальною частиною; і (2) oчищення таких комплексів з крові через рецептор галактози, систему специфічної деградації печінки, як протилежно агрегації в комплекси, які видаляються, наприклад, легенею і селезінкою. Додатково, швидка кінетика галактозаопосередкованого видалення печінкою, разом з афінністю ліганд-анти-ліганд взаємодії, дозволяють використання посередника або навіть носіїв низької молекулярної ваги. В одному втіленні винаходу, використовують не-галактоза-основані очищувальні агенти типу протеїну або полімеру. Ці очищувальні агенти можуть діяти через агрегація-опосередкований механізм. У цьому втіленні винаходу очищувальний агент, який використовується, може бути селектований, основуючись на цільовому органі, доступ очищувального агента до якого повинен бути виключеним. Наприклад, висока молекулярна вага, наприклад, в діапазоні від близько 200,000 до близько 1,000,000 Дальтон, може бути корисна, коли залучені пухлинні клітини-мішені. Інший клас очищувальних агентів включає агенти, які не видаляють кон'югати циркулюючий активний агент/націлювальна частина, але замість цього інактивують циркулюючі кон'югати за допомогою блокування відповідних цільових ділянок на активному агенті, націлювальній частині, ліпосомі, вірусному векторі і/або будь-якій іншій їх частині. Ці "ковпачкові" очищувальні агенти є переважно невеликими, наприклад, від 500 до 10,000 Дальтон, високо зарядженими молекулами, наприклад, дериватизована 6,6'[(3,3'-диметил[1,1'-біфеніл]-4,4'-діїл)біс(азо)біс[4аміно-5-гідрокси-1,3-нафтлін дисльфонова кислота]тетразолідію сіль. Е. Дозування/Введення Для способу за даним винаходом, може бути використаний будь-який ефективний режим введення, який регулює вибір часу і послідовність дозування. Зразкові рівні дозування для людини залежатимуть від способу введення, величини (розміру і поширення) пухлини, розміру пацієнта і реакції раку у відповідь на лікування уреазою. Там, де композицію уреази ін'єктують безпосередньо в пухлину, зразкове дозування складає від 0,1 до 1,000 міжнародних одиниць активності уреази на мм3 пухлини. Наприклад, і передбачаючи досягнення відносно однорідного 51 поширення уреази в пухлині, може бути придатним дозування між 0,5 і 5 міжнародними одиницями. Розміщення голки ін'єкції може бути здійснене відповідно до звичайної техніки наведення зображення, наприклад, рентгеноскопії, так, щоб терапевт міг бачити положення голки щодо цільової тканини. Такі засоби керівництва можуть включати ультразвук, рентгеноскопію, КТ або ЯМР. Згідно з одним аспектом винаходу, ефективність або поширення введеної дози уреази може контролюватись, протягом або після прямої ін'єкції уреази в пухлину, за допомогою моніторингу пухлинної тканини інструментальним засобом, здатним до виявлення змін в рівні рН всередині ділянки ракової тканини суб'єкта. Такі інструментальні засоби можуть включати рН зонд, який може бути вставлений безпосередньо в пухлину, або візуалізаційні інструментальні засоби, такі як ядерний магнітний резонанс (ЯМР), комп'ютерна томографія (КТ) або рентгеноскопія. Запит ЯМР може бути проведений за відсутності додаткових радіофармацевтичних агентів, основуючись лише на відмінностях в магнітних властивостях тканини як функції рН. КТ або рентгеноскопічне відтворення зображення може вимагати додаткового рН-чутливого радіофармацевтичного агента, непрозорість якого піддається впливу рН середовища тканини. Такі агенти добре відомі фахівцям в даній галузі техніки. Перед будь-якою ін'єкцією уреази, пухлинна тканина може бути візуалізована її нижчим рівнем рН по відношенню нормальної тканини, що оточує її. Так, нормальна тканина може мати нормальний рівень рН близько 7,2, тоді як пухлинна тканина може бути на 0,1 до 0,4 або більше рН одиниць нижче. Тобто, перед тим, як ін'єктують будь-яку уреазу, протяжність пухлинної тканини може буди визначена за її нижчим рівнем рН. Після введення уреази, рівень рН пухлинної ділянки, що містить уреазу, почне підійматись і може бути ідентифікований за допомогою порівняння результуючих зображень з більш ранніми зображеннями перед дозуванням. За допомогою запитів до тканини таким способом можна контролювати ступінь зміни ρ рівні рН і протяжності тканини, яка знаходиться піц впливом. Основуючись на цьому запиті, терапевт може вводити додаткову композицію до ділянки, і/або може вводити композицію в додаткові ділянки всередині пухлинної ділянки. Цю процедуру можна повторювати, доки не буде досягнуто бажаних змін рівня рН, наприклад, 0,2 до 0,4рН одиниць, по всій ділянці солідної пухлини. Дозування прямою ін'єкцією можна повторювати через відповідні інтервали, наприклад, кожний тиждень або двічі на тиждень, поки не будуть спостерігати бажаної кінцевої точки, переважно суттєву або повну регресію пухлинної маси. Ефективність лікування може спостерігатись, як вказано вище, за допомогою візуалізованих змін в рівні рН тканини, яку обробляють, протягом курсу лікування. Так, перед 81634 52 кожною додатковою ін'єкцією, рівень рН тканини може бути візуалізований, щоб визначити справжню існуючу протяжність пухлини, після чого можуть бути використані зміни в рівні рН тканини для моніторингу введення нової дози композиції уреази до тканини. Там, де уреазу вводять парентеральним способом, іншим, ніж пряма ін'єкція, зразкова доза уреази складає 100-100,000 міжнародних одиниць/кг активності уреази/кг ваги тіла суб'єкта. Як зазначено тут, композиція уреази в цьому способі переважно включає цільовий агент для націлювання уреази до ракових клітин, наприклад, ділянки солідної пухлини, або для секвестрування уреази, наприклад, в ліпосомальній формі, селективно в пухлинній ділянці. Як вказано вище, техніки відтворення зображення, які чутливі до змін в рівні рН тканини, можуть бути використані для моніторингу ефективності дози, яку вводять. Оскільки таке цільове призначення може зайняти декілька години або більше, спосіб може включати моніторинг рівню рН пухлини, як зазначено вище, перед ін'єктуванням уреази, і декілька годин, наприклад, 12-24 годин після дозування, щоб підтвердити, що пухлинна ділянка була відповідно дозована, що доведено підвищенням рівня рН в пухлинній ділянці. Залежно від результатів цього запиту, спосіб може вимагати додаткового дозування, доки не буде спостерігатись бажане підвищення рівня рН, наприклад, 0,2-0,4рН одиниць. Як тільки ця доза встановлена, пацієнта можуть лікувати подібною дозою композиції уреази на регулярній основі, наприклад, один раз або двічі на тиждень, доки не буде досягнута зміна в розмірі або стані пухлини. В обох типах введення, кінцевий режим дозування буде визначений присутнім терапевтом, беручи до уваги хорошу медичну практику, зважаючи на різні фактори, які змінюють дію лікарських засобів, наприклад, специфічна активність агента, тяжкість стану хвороби, реакція пацієнта у відповідь, вік, стан, ?ага тіла, стать і харчування пацієнта, тяжкість будь-якої інфекції, і тому подібне. Додаткові фактори, які можуть прийматись до уваги, включають час і частоту введення, комбінацію(ї) ліків, чутливості реакції і толерантність/відповідь на лікування. Подальше уточнення дозування, придатного для лікування, яке включає будь-які склади, згадані тут, робиться звичайно кваліфікованим практикуючим спеціалістом, особливо в світлі інформації про дозування і розкритих аналізів, також як і фармакокінетичних даних, які спостерігаються в клінічних випробуваннях. Відповідне дозування може бути визначене через використання встановлених випробувань для визначення концентрації агента в біологічній рідині або іншого зразка разом з даними відповіді на дозування. Частота дозування залежатиме від фармакокінетичних параметрів агента і шляху введення. Дозування і введення регулюються, щоб забезпечити достатні рівні активного агента або щоб підтримати бажаний ефект. Відповідно, фармацевтичні композиції можуть вводитись в 53 єдиній дозі, багаторазових окремих дозах, безперервній інфузії, складах тривалого вивільнення, або їх комбінаціях, як вимагається для підтримання бажаного мінімального рівня агента. Короткодіючі фармацевтичні композиції (тобто, короткий час півжиття) можуть бути введені однин раз на день або більше ніж однин раз на день (наприклад два, три, або чотири рази на день). Довгодіючі фармацевтичні композиції можуть бути введені кожні 3 до 4 днів, кожного тижня, або одного разу кожні два тижні. Насоси, такі як підшкірний, внутрішньочеревинний, або субдуральні насоси, можуть бути переважними для безперервно інфузії. Композиції, які включають активний агент винаходу, утворений як описано в Розділі II, вище, у фармацевтичному прийнятному носії, можуть бути одержані, розміщені у відповідному контейнері і помічені для лікування зазначеного стану. Стани, які вказуються на мітці, можуть включати, але не обмежуються цим, лікування і діагноз різних типів раку. Набори, як описано нижче, також розглядаються, де набір містить форму дозування фармацевтичної композиції і вкладиш з інструкціями для використання композиції у лікування медичного стану. Взагалі, активні агенти, які використовуються у винаході, вводять суб'єкту в ефективній кількості. В цілому, ефективна кількість являє собою кількість, ефективну для або (1) зменшення ознак хвороби, яку намагаються вилікувати; або (2) індукування фармакологічної зміни, що відноситься до лікування хвороби, яку намагаються вилікувати. Для раку, ефективна кількість може включати кількість, ефективну для: зменшення розміру пухлини; уповільнення росту пухлини; запобігання або інгібування метастазів; або збільшення очікуваної тривалості життя ураженого суб'єкта. Зразковий спосіб введення активного агента миші описаний у Прикладі 6, нижче. Активні агенти, очищувальні агенти, і/або радіофармацевтичні агенти даного винаходу можуть бути введені в єдиній або багаторазовій дозах. Альтернативно, агенти можуть інфузовані внутрішньовенно за розширений період часу. Наприклад, очищувальний агент може бути введений внутрішньовенно протягом періоду часу, достатнього, щоб очищувати націлювальну частину безперервно. У втіленнях винаходу щодо введення мультинацілювальних частин, який описаний вище, дози кожного компонента, що вводиться, можуть бути визначені присутнім терапевтом згідно з його або її досвідом; особливості стану одержувача, наприклад, природа і місцезнаходження цільової ділянки, включаючи антигени, асоційовані з ним, будуть впливати на вибір націлювальної частини і шляху введення; і поєднання націлювальної частини, яка буде залучена, наприклад, ефективність антитіл, може змінюватись відносно антигенної щільності і афінності антитіла до антигену. 81634 54 IV. Спосіб потенціювання протиракового лікарського засобу Як зазначено вище, одним з обмежень в сьогоднішній хіміотерапії є те, що пухлина-мішень стає надзвичайно стійкою до впливу протипухлинної сполуки. Ця стійкість може виникати завдяки зменшеному поглинанню сполуки пухлинними клітинами, зменшеній ефективності лікарського засобу на ділянці поглинання або збільшеному внутрішньоклітинному метаболізму. Для ряду слабо основних лікарських засобів, тобто, лікарських засобів, які мають один або більше протонізованих амінів, механізм поглинання лікарського засобу може включати пасивну дифузію через мембрану клітини в незарядженій формі. Відповідно, швидкість руху сполуки через мембрану клітини залежатиме від внутрішнього/зовнішнього рН градієнту. Якщо позаклітинний рівень рН дорівнює або більше, ніж внутрішньоклітинний рівень рН, наприклад, близько рН7.2, суміш буде прагнути пройти у клітини в незарядженій формі, щонайменше так часто, як вона виходить з клітини. Навпаки, оскільки позаклітинний рівень рН падає по відношенню до внутрішньоклітинного рівня рН, як це відбувається в солідних пухлинах, нижча межа рН підтримуватиме заряджену, протоновану форму сполуки, і це інгібуватиме поглинання лікарського засобу в клітини. Насправді, один з впливів нижчого позаклітинного рівня рН в пухлинах являє собою захист пухлини від слабо основних протипухлинних сполук. Слабо основні протипухлинні сполуки, активність яких може піддаватись несприятливому впливу нижчого позаклітинного рівня рН, включають доксорубіцин, даунорубіцин, мітоксантрон, епірубіцин, мітоміцин, блеоміцин, алкалоїди вінка, такі як вінбластин і вінкристин, алкілуючі агенти, такі як циклофосфамід і мехлоретамін гідрохлорид, і похідні антринеопластичного пурину і піримідину. В даному способі, уреаза або композиція, яка містить уреазу, можуть бути введені в солідну пухлину у кількості, ефективній для підняття позаклітинного рівня рН пухлинної рідини щонайменше на 0,1рН одиницю, наприклад, від 0,1 до 0,5рН одиниць або більше. У конкретних втіленнях, позаклітинний рівень рН рідини підіймається до щонайменше рН7,0, 7,2, або вище. Уреаза може бути введена, як описано у Розділі III вище, наприклад, безпосередньо в пухлину суб'єкта або парентерально, інакше, ніж прямою ін'єкцією. Також, як описано вище, зміна в рівні рН, продукована введенням уреази, може спостерігатись за допомогою визначення змін в рівні рН в пухлинній тканині і протяжності цих змін, використовуючи інструментальні засоби відтворення зображення для візуалізації пухлинного рівня рН, або прямими рН вимірюваннями пухлини. Доза, яку вводять в даному способі, може бути меншою, ніж необхідно, де уреаза є єдиним протипухлинним агентом, поки кількість, яку 55 ін'єктують, є достатньою для продукування бажаного підвищення в пухлинному рівні рН. Альтернативно, спосіб може включати введення терапевтичної кількості уреази і терапевтичної або субтерапевтичної кількості протиракової сполуки. Як може розумітись, спосіб може дозволити застосування нижчої, ніж нормальна доза протипухлинної сполуки, як через те, що уреаза збільшує терапевтичний ефект сполуки, так і через те, що уреаза сама по собі сприяє терапевтичному ефекту. В результаті отримується більша ефективність з меншою кількістю побічних ефектів. В одному втіленні, хімічний об'єкт, як описано вище, може також бути асоційований з активним агентом, щоб збільшити доставку активного агента. У цьому втіленні, активний агент може бути введений будь-яким способом, наприклад, парентерально, іншим, ніж пряма ін'єкція. V. Спосіб моніторингу протиракового лікування Винахід також забезпечує, у ще одному аспекті, спосіб моніторингу протиракового лікування за допомогою оцінки наявності, розміру або стану солідної пухлини у суб'єкта. Спосіб включає введення активного агента, як описано вище, наприклад, уреази, суб'єкту, яка має, або вважається що має, солідну пухлину. Активний агент вводять в умовах, ефективних для локалізації активного агента в солідній пухлині у суб'єкта. Суб'єкта досліджують діагностичним інструментальним засобом, здатним до виявлення змін в позаклітинному рівні рН в тканині суб'єкта, як описано вище. Діагностичний інструментальний засіб є переважно рН-чутливим діагностичним агентом, таким як рафіофармацевтичний агент, контрастний агент або реактив зсуву, як описано в Розділі II, вище, здатний до локалізації в пухлині, що може бути введеним до, після або паралельно з активним агентом. Ділянку тканини ідентифікують всередині суб'єкта, яка показує підняття позаклітинного рівня рН, після введення. Може бути використаний будь-який інструментальний засіб, здатний до розпізнання діагностичного агента, для виявлення агента, а саме ЯМР, ПЕТ сканування, і тому подібне, як описано вище. В одному втіленні, спосіб включає введення уреази суб'єкту, залученому до протипухлинного лікування, а ідентифікування використовують для виявлення локалізації уреази в солідній пухлині. Ідентифікування може бути використаним для моніторингу зміни в розмірі і формі пухлини у відповідь на введення уреази. В одному втіленні, яке залучає ПЕТ сканування, суб'єкту вводять 13N-мічений аміак. Потім пацієнту вводять уреазу в кількості, ефективній, щоб досягнути пухлинної ділянки. Уреаза гідролізує сечовину, щоб продукувати немічений аміак. З часом, мічений розріджують або витісняють, викликаючи поступове очищення на сканері. В іншому втіленні, яке залучає ПЕТ сканування, суб'єкту вводять 13N-мічену сечовину. Потім пацієнту вводять уреазу в кількості, 81634 56 ефективній, щоб досягнути пухлинної ділянки. Уреаза гідролізує мічену сечовину, щоб продукувати мічений аміак, який може бути виявлений на сканері. VI. Набори У додатковому аспекті, даний винахід забезпечує набори для інгібування росту пухлинних клітин, використовуючи способи, які описуються тут. Набори включають контейнер, який містить один або більше активних агентів. Набори можуть додатково включати будь-які інші компоненти, які описуються тут, для практики втілення способів цього винаходу. Такі компоненти включають, але не обмежуються цим, фармацевтичні компоненти, націлювальні частини, радіофармацевтичні агенти, очищувальні агенти, компоненти генної терапії і тому подібне. Набори можуть необов'язково включати інструкції, які містять керівництва (тобто, протоколи), які розкривають застосування активних агентів для інгібування росту пухлинних клітини. Так, в одному втіленні, набір включає фармацевтичну композицію, яка містить активний агент, переважно ензим уреази, та інструкції, які пояснюють введення композиції суб'єкту, для лікування раку у суб'єкта. В одному втіленні, інструкція пояснює введення композиції уреази суб'єкту в кількості, що залежить від розміру пухлини і складає між від 0,1 до 100 міжнародних одиниць активності уреази на мм3 пухлини, коли композицію вводять прямою ін'єкцією в пухлину, і в кількості між 100-100,000 міжнародних одиниць/кг міжнародних одиниць активності уреази/кг ваги тіла суб'єкта, коли композицію вводять парентерально суб'єкту інакше, ніж прямою ін'єкцією в пухлину. В іншому втіленні, інструкція пояснює введення композиції уреази суб'єкту, який також отримує слабо основну протипухлинну сполуку, ефективність якої зменшується вищим внутрішньоклітинним/нижчим позаклітинним рН градієнтом в солідній пухлині, в кількості уреази, ефективній для зменшення або зміни вищого внутрішньоклітинного/нижчого позаклітинного рН градієнту в солідній пухлині. Альтернативно, інструкція пояснює введення композиції уреази суб'єкту, що має або вважається таким, що має, солідну пухлину, в умовах, ефективних для локалізації уреази в солідній пухлині у суб'єкта, досліджуючи суб'єкта діагностичним інструментальним засобом, здатним до виявлення змін в позаклітинному рівні рН в тканині суб'єкта, і розпізнаючи ділянку тканини всередині суб'єкта, яка показує підвищення у позаклітинному рівні рН, після згаданого введення. У той час, як інструкції звичайно містять написані або надруковані матеріали, вони не обмежуються цим. Будь-який засіб, здатний до збереження таких інструкцій і повідомлення їх кінцевому користувачу, розглядається даним винаходом. Такі носії включають, але не обмежуються цим, електронні носії даних (наприклад, магнітні диски, плівки, касети, чіпи), оптичні носії (наприклад, CD ROM) і тому подібне. 57 Такі носії можуть включати адреси internet сайтів, які забезпечують такі інструкції. VII. Генна/клітинна терапія Композиція генної терапії також розглядається, в іншому аспекті винаходу, для застосування в інгібуванні росту ракових клітин у ссавців. Композиція генної терапії включає націлювальний вектор, ефективний, при введенні суб'єкту, щодо селективного трансфікування ракових клітин, і переношувану в згаданому векторі рекомбінантну послідовність нуклеїнової кислоти, ефективну для продукування молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, мРНК, яка кодує активний агент, переважно уреазу, у трансфікованих ракових клітинах. В одному втіленні, пухлинні клітини контактують з конструйованими непухлиногенними клітинами, які експресують гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує активний агент. Конструйовані непухлиногенні клітини можуть бути, без обмеження, фабробластами, епітеліальними клітинами, ендотеліальними клітинами, кістковими клітинами, кератиноцитами або опроміненими конструйованими не-пухлиногенними клітинами, одержаними з пухлин. В іншому втіленні, пухлинні клітини трансфікують генним елементом, кодуючим націлювальну частину клітини і гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, кодуючу протеїн уреази і секреторну лідерну послідовність. Генний елемент здатний до експресування націлювальної частини клітини і гетерологічного протеїну уреази і секреторної лідерної послідовності як кон'югата в пухлинних клітинах і за допомогою чого кон'югат направляється секреторною лідерною послідовністю, щоб після цього залишити клітину для селективної локалізації на антигені поверхні клітини, що розпізнається націлювальною частиною клітини. Переважно, націлювальна частина клітини селективно локалізується на антигені поверхні клітини, і на антиген поверхні клітини є специфічним щонайменше для однієї людської солідної пухлини. Генний елемент може містити транскрипційну регуляторну послідовність, що містить промотор і контрольний елемент, який включає генетичний перемикач для контролю експресії генного елемента. Відповідно до одного втілення винаходу, генний елемент об'єднується у вірусний вектор. Різноманітність вірусних векторів доступні для пухлинного націлювання. Парвівіруси є відомими для селективного інфекування пухлинних клітин. Альтернативно, вірус може бути сконструйований, щоб селективно реплікуватись в пухлинних клітинах, відповідно до опублікованих способів. Дивіться, [наприклад, Puhlmann Μ; et al., Hum Gene Ther, (1999) 10 (4): 649-57; Noguiez-Hellm P; et al. Proc Natl Acad Sci U S A, (1996) 93(9): 417580; and Cooper MJ, Semin Oncol (1996) 23(1) 17287]. Наприклад, вірус може бути змінений, щоб містити мутовану тимідин кіназу або ген полімерази, який робить можливим вірусну реплікацію тільки в клітинах, що швидко діляться, 81634 58 які містять ці ензими. Альтернативно, вірус може бути генетично сконструйований, щоб містити пухлино-специфічні контрольні елементи, наприклад, пухлино-специфічні промоторні ділянки, що чутливі і експресують бажаний протеїн або протеїн, необхідний для вірусної реплікації тільки в пухлинних клітинах. Переважно, генний елемент об'єднується в аденовірус. А. Вектори для клонування, генної передачі та експресії У конкретних втіленнях винаходу, експресійні вектори залучені для експресії продукту поліпептиду уреази, який потім може бути очищений. В інших втіленнях, експресійні вектори використовують в генній терапії. Експресійні вектори можуть включати відповідні сигнали, які забезпечуються у векторі, і різні регуляторні елементи, такі як енхансери/промотори від вірусних джерел і/або ссавців, які керують експресією генів, що представляють інтерес, в клітинах хазяїна. Елементи, сконструйовані для оптимізації стабільності месенджера РНК і переносимості в клітинах хазяїна, також визначаються. Також забезпечені умови для застосування кількості домінуючих маркерів вибору лікарських засобів для встановлення постійних, стійких клітинних клонів, експресуючих продукти, як елемент, що зв'язує експресію маркерів вибору лікарських засобів з експресією поліпептиду. В. Регуляторні елементи Термін "експресійний елемент" призначений для включення будь-якого типу генетичного елемента, який містить кодування нуклеїнової кислоти для генного продукту, в якому частина або вся кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти здатна до транскрибування. Транскрипт може бути трансльований на протеїн, але цього не повинно бути. У конкретних втіленнях, експресія включає як транскрибування гена, так і транслювання мРНК в генний продукт. В інших втіленнях, експресія включає тільки транскрибування нуклеїнової кислоти, яка кодує ген, що представляє інтерес. У переважних втіленнях, нуклеїнова кислота, яка кодує генний продукт, знаходиться під транскрипційним контролем промотору. "Промотор" відноситься до ДНК послідовності, яка розпізнається синтетичною структурою клітини, або представленої синтетичної структури, необхідної для ініціювання специфічної транскрипції гену. Фраза "під транскрипційним контролем" означає, що промотор знаходиться у правильному місці і орієнтації відносно нуклеїнової кислоти, щоб контролювати ініціацію РНК полімерази і експресію гену. Термін "промотор" буде використаний тут для посилання на групу транскрипційних контрольних модулів, які збираються навколо ділянки ініціювання для РНК полімерази II. Промотори можуть бути скомпоновані з дискретних функціональних модулів, кожний з яких містить приблизно 7-20 bр ДНК, і містять одну або більше ділянок розпізнавання для транскрипційного активатора або репресивних протеїнів. Щонайменше один модуль в кожному промоторі 59 функціонує, щоб визначити положення стартової ділянки для РНК синтезу. Зразковий модуль являє собою ТАТА бокс, але в деяких промоторах, які відчувають нестачу ТАТА бокс, такі як промотор для кінцевого гена деоксинуклеотидил трансферази ссавця і промотор для SV40 останніх генів, дискретний елемент, який накладається на стартову ділянку, сам безпосередньо допомагає фіксувати ділянку ініціювання. Не вважається, що конкретний промотор, залучений до контролю експресії послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, є важливим, доки він здатний спрямовувати експресію нуклеїнової кислоти в клітину-мішень. Так, де йде націлювання на людську клітину, переважним є визначити положення кодуючої ділянки нуклеїнової кислоти поряд з і під контролем промотору, який здатний бути експресованим в людській клітини. Взагалі, такий промотор може включати або людський або вірусний промотор. У різних втіленнях, людський цитомегаловірусний (CMV) безпосередній ранній генний промотор, ранній промотор SV40, довгокінцеве повторення вірусу саркоми Рауса, промотор інсуліну щура і гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназа можуть бути використані для одержання високо-рівневої експресії кодуючої послідовності, яка представляє інтерес. Застосування іншого вірусного або ссавцевого клітинного або бактеріофагального промоторів, які відомі в даній галузі техніки, для досягнення експресії кодуючої послідовності, яка представляє інтерес, також розглядається. Там, де залучена вставка сДНК, можна бажати включити сигнал поліаденілування, щоб виконати відповідне поліаденілування генного транскрипту. Не вважається, що природа сигналу поліаденілування є ключовою для успішної практики втілення винаходу, і будь-яка така послідовність може бути залучена, така як гормон росту людини і сигнали SV40 поліаденілування. Термінатор також розглядається як елемент експресійної касети. Ці елементи можуть служити для збільшення рівнів повідомлення і мінімізації зчитування з касети в інші послідовності. С. Селектовані маркери У конкретних втіленнях винаходу, клітини, які містять елементи нуклеїнової кислоти за даним винаходом, можуть бути ідентифіковані in vitro або in vivo за допомогою включення маркера в експресійний елемент. Такі маркери надають ідентифіковану зміну до клітини, дозволяючи легке ідентифікування клітин, які містять експресійний елемент. Звичайно, включення селективного маркера лікарського засобу допомагає у клонуванні і у виборі трансформантів, наприклад, гени, які надають стійкість до неоміцину, пуроміцину, гігроміцину, DHFR, GPT, зеоцину і гістидинолу, є корисними сіелектованими маркерами. Альтернативно, ензими, такі як герпесна симплексна вірусна тимідин кіназа (tk) або хлорамфенікол ацетилтрансфераза можуть бути залучені. Імунологічні маркери також можуть бути залучені. Подальші приклади селектованих 81634 60 маркерів добре відомі фахівцю в даній галузі техніки мистецтві. Дивіться, [наприклад, Baumann, R.P. et al. (2002) Biotechniques 32(5): 1030-34]. D. Доставка експресійних векторів Є ряд шляхів, якими експресійні вектори можуть бути доставлені в клітини. У конкретних втіленнях винаходу, експресійний елемент містить вірус або сконструйований елемент, одержаний з вірусного геному, який використовується для доставки композиції уреази до клітини-мішені. Здатність конкретних вірусів входити в клітини через рецептор-опосередкований ендоцитоз, щоб інтегрувати геном в клітини хазяїна, і експресувати стабільність і ефективність вірусних генів зробили їх привабливими кандидатами для передачі чужорідних генів в клітини ссавця. Один з переважних способів in vivo доставки включає застосування експресійного вектора аденовірусу. "Експресійний вектор аденовірусу" призначений, щоб включати ті елементи, які містять аденовірусні послідовності, достатні для (а) підтримання пакування елемента і (b) експресії полінуклеотиду, що був клонований. У цьому контексті, експресія не вимагає, щоб генний продукт був синтезований. Дивіться, [наприклад, Barnett, B.G., et al. (2002) "Targeted Adenovirus Vectors" Biochim Biophys Acta 1575(1-3): 1-14]. В одному втіленні винаходу, експресійний вектор може включати генетично сконструйовану форму аденовірусу. Знання генетичної організації аденовірусу, 36 kb, лінійний, вірус двониткової ДНК, робить можливим заміну великих частин аденовірусної ДНК чужорідними послідовностями до 7 kb. На відміну від ретровірусу, аденовірусне зараження клітин хазяїна не закінчується хромосомною інтеграцією, через те, що аденовірусна ДНК може реплікувати епісомально без потенційної генотоксичності. Також, аденовіруси є структурно стійкими, і не виявляється геномного перегрупування після поширеної ампліфікації. Аденовірус особливо придатний для застосування як вектора генної передачі, завдяки його середньо-розмірному геному, легкості маніпулювання, високому титру, широкому ряду клітин-мішеней і високій інфективності. Генерація і розповсюдження векторів аденовірусу може залежати від хелперної клітинної лінії. Хелперні клітинні лінії можуть бути отримані від людських клітин, таких як людські ембріональні ниркові клітини, мускульні клітини, гематопоетичні клітини або інші людські ембріональні мезенхімальні або епітеліальні клітини. Альтернативно, хелперні клітини можуть бути отримані від клітин інших видів ссавців, які є придатними для людського аденовірусу. Такі клітини включають, наприклад, Vero клітини або інші мавпячі ембріональні або мезенхімальні клітини. Зразкова хелперна клітинна лінія є 293 клітинна лінія, яка була перетворена з людської ембріональної ниркової клітини Ad5 ДНК фрагментами і конститутивно експресує Е1 протеїни. Способи культурування 293 клітин і розповсюдження аденовірусу були описані.