Мутантний неубластин

1. Поліпептид неубластин, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотам 8-113 SEQ ID NО:1 і який містить одну або декілька замін аргініну у положенні 48, аргініну у положенні 49 або аргініну у положенні 51 на залишок глутамінової кислоти. 2. Поліпептид за п. 1, в якому залишок аргініну у положенні 48 замінений глутаміновою кислотою. 3. Поліпептид за п. 1, в якому залишок аргініну у положенні 49 замінений глутаміновою кислотою. 4. Поліпептид за п. 1, в якому залишок аргініну у положенні 51 замінений глутаміновою кислотою. (19) (21) a200508412 (22) 02.02.2004 (24) 12.07.2010 (86) PCT/US2004/002763, 02.02.2004 (31) 10/356,264 (32) 31.01.2003 (33) US (46) 12.07.2010, Бюл.№ 13, 2010 р. (72) САХ ДІНАХ ВЕН-ЙІ, US, ПЕПІНСКІ Р. БЛЕЙК, US, БОРІАК-СЙОДІН ПАУЛА ЕНН, US, МІЛЛЕР СТЕФАН С., US, РОССОМАНДО ЕНТОНІ, US, СІЛЬВІАН ЛАУРА, US (73) БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ІНК., US 3 91178 4 ЕР02/02691, РСТ публікаціях U502/02319 і US02/06388), а також через його здатність зв'язуватися з RET рецептором і активувати його як частину комплексу GFR . Зокрема, неубластин високоселективний для зв'язування з GFR 3-RET рецепторним комплексом. У цьому відношенні неубластин містить унікальні підобласті у своїй амінокислотній послідовності у порівнянні з іншими членами сімейства лігандів, споріднених з GDNF. Сучасні дані свідчать, що неубластин може грати захисну і регенеративну роль у периферичній і центральній нервовій системі і, в результаті, може бути придатний як лікувальний засіб при нейродегенеративних захворюваннях. Наприклад, дані свідчать про те, що неубластин може сприяти виживанню сенсорних нейронів, що культивуються, зі спинномозкових гангліїв і гангліїв трійчастого нерва і дофамінергічних нейронів, що культивуються, чорної субстанції (Baloh et al., Neuron 21: 1291-1302 (1998)). Тому вважається, що неубластин може сприяти виживанню популяцій нейронів, включаючи сенсорні і дофамінергічні нейрони. Це важливо, тому що дегенерація і дисфункція нейронів зв'язані з хворобливими станами. Наприклад, патологія сенсорних і дофамінергічних нейронів лежить в основі периферичної нейропатії і хвороби Паркінсона, відповідно. Тому введення неубластину може бути корисним, наприклад, при лікуванні хвороб, пов'язаних з дегенерацією і дисфункцією нейронів. Однак неубластин швидко виводиться з організму, що може вплинути на парадигму дозування неубластину, яка необхідна для лікувального застосування. Таким чином, існує потреба у змінених поліпептидах неубластину зі збільшеною біодоступністю. Відповідно, об'єктом даного винаходу стала саме іден тифікація змінених форм неубластину, які виявляють підвищену біодоступність. Суть винаходу Винахід відноситься до полімер-кон'югованих димерів мутантного неубластину. Кожний димер містить перший поліпептид, що містить першу Nкінцеву амінокислоту, і другий поліпептид, що містить другу N-кінцеву амінокислоту. Кожний поліпептид окремо містить: (а) амінокислотну послідовність, що характеризується щонайменше 70%, 80%, 90% або 95%-ю ідентичністю з послідовністю 8-113 амінокислот з SEQ ID NO:1; (b) залишок цистеїну у кожному з положень 16, 43, 47, 80, 81, 109 і 111 (нумерація відповідно до SEQ ID NO:1); (с) залишки амінокислот, як наведено нижче: С у положенні 16, L у положенні 18, V у положенні 25, L у положенні 28, G у положенні 29, L у положенні 30, G у положенні 31, Ε у положенні 36, F у положенні 40, R у положенні 41, F у положенні 42, С у положенні 43, G у положенні 45, С у положенні 47, С у положенні 80, С у положенні 81, R у положенні 82, Ρ у положенні 83, F у положенні 91, D у положенні 93, S у положенні 105, А у положенні 106, С у положенні 109 і С у положенні 111; і (d) повтор LGLG, мотив FRFC, мотив QPCCRP і мотив SATACGC. Димер включає щонайменше одну амінокислотну заміну (відносно SEQ ID NO:1), яка надає внутрішню ділянку для кон'югації з полімером, до якої кон'югований полімер. Винахід також відноситься до полімеркон'югованого димеру мутантного неубластину, що містить перший поліпептид і другий поліпептид, де кожний поліпептид містить 90-140, наприклад, 95120 або 100-110 амінокислот SEQ ID NO:6, з 1-6 амінокислотними замінами, кожна заміна надає ділянку для кон'югації з полімером, до якої кон'югований полімер. Конкретні приклади поліпептидів за винаходом включають Переважно, щонайменше одна з двох Nкінцевих амінокислот у димері кон'югована з полімером. Переважні амінокислотні заміни включають заміну залишку аргініну на залишок лізину (Raa#K; де аа# являє собою номер амінокислоти, що базується на SEQ ID NO:1) і заміну залишку аспарагіну на залишок лізину (Naa#K) або залишок аспартату (Naa#D). Конкретними прикладами такої заміни є R14K, R39K, R68K, N95D і N95K (нумерація базується на SEQ ID NO:1). Особливо переважна заміна N95K. Переважно, загальна об'єднана молекулярна маса полімерів на димері становить 20000-40000 Да. Переважно, середня молекулярна маса кожно го полімеру становить 2000-100000 Да; більш переважно 5000-50000 Да; і найбільш переважно приблизно 10000-20000 Да. Полімер може бути лінійним або розгалуженим. Переважно, полімер є залишком поліалкіленгліколю, наприклад, залишком поліетиленгліколю (ПЕГ). У деяких варіантах здійснення щонайменше один поліпептид глікозильований. У деяких варіантах здійснення винаходу полімер-кон'югований димер містить перший поліпептид і другий поліпептид, де: (а) кожний поліпептид окремо містить 100-110 амінокислот з SEQ ID NO:1, (b) кожний поліпептид містить заміну аспарагіну на лізин у 95-му положенні у SEQ ID NO:1, 5 (с) і димер містить 3 або 4 залишки ПЕГ, де молекулярна маса кожного залишку ПЕГ становить приблизно 10000 Да, і кожний залишок ПЕГ кон'югований з N-кінцем або з лізином у положенні 95. Переважним варіантом здійснення є гомодимер, що містить пару мономерів, позначений 3 (,4) x 10 кДа ПЕГ ΝΒΝ106-Ν95Κ. Винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить димер відповідно до винаходу. У деяких варіантах здійснення композиція містить два або декілька різних димерів відповідно до винаходу. Винахід відноситься до нуклеїнової кислоти, наприклад, ДНК-вектора, що експресує, який кодує поліпептид для об'єднання у димер за винаходом. Винахід також відноситься до клітини хазяїна, трансформованої нуклеїновою кислотою. Винахід відноситься до способу лікування нейропатичного болю у ссавця. Спосіб передбачає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості димеру за винаходом. У деяких варіантах здійснення терапевтично ефективна кількість складає від 0,1 мкг/кг до 1000 мкг/кг, від 1 мкг/кг до 100 мкг/кг або від 1 мкг/кг до 30 мкг/кг. Введення димеру може здійснюватися різними шляхами, наприклад, внутрішньом'язовим, підшкірним або внутрішньовенним. У деяких способах відповідно до винаходу димер вводиться три рази на тиждень. Винахід також відноситься до способу активації рецептора RET у ссавця. Спосіб передбачає введення ссавцеві ефективної кількості димеру. Інші особливості і переваги винаходу стануть очевидними з наведеного нижче докладного опису і пунктів формули винаходу. Докладний опис винаходу Якщо не вказано інакше, будь-яке посилання на номер положення амінокислоти неубластину буде відноситися до нумерації, проілюстрованої у SEQ ID NO:1. Якщо не визначено інакше, всі технічні і наукові терміни, що використовуються тут, мають те ж саме значення, яке звичайно розуміється фахівцем зі звичайними навичками у тій галузі техніки, до якої даний винахід належить. Хоча методи і матеріали, подібні або еквівалентні описаним тут, можуть використовуватися у здійсненні на практиці або випробовуванні винаходу, придатні методи і матеріали описані нижче. Всі публікації, заявки на патент, патенти та інші посилання, згадані тут, включені сюди у всій їх повноті за допомогою посилання. У випадку конфлікту вирішальним буде даний опис, включаючи наведені у ньому визначення. Крім того, матеріали, методи і приклади виключно ілюстративні і не призначені для обмеження. Як використовується тут, «поліпептид неубластину дикого типу» означає послідовність, що зустрічається у природі поліпептиду неубластину. Поліпептид неубластину дикого типу може бути далі визначений за джерелом неубластину, наприклад, людський, мишачий або щурячий неубластин (див., наприклад, SEQ ID NO:2, 3 або 4). Консенсусна послідовність поліпептиду неубластину відповідає SEQ ID NO:1. 91178 6 Як використовується тут, «мутантний поліпептид неубластину» означає поліпептид, який містить щонайменше вказаний мінімальний рівень ідентичності послідовності відносно поліпептиду неубластину дикого типу, містить щонайменше одну амінокислотну заміну, вставку або злиття відносно поліпептиду неубластину дикого типу і виявляє активність неубластину (наприклад, як описано у міжнародній заявці № PCT/US02/02319 (W0 02/060929)). Як використовується тут, «внутрішня ділянка для кон'югації з полімером» означає некінцевий залишок амінокислоти у мутантному поліпептиді неубластину, причому залишок забезпечує бічний ланцюг, придатний для кон'югації з полімером. Як використовується тут, «модифікований поліпептид неубластину» означає поліпептид, який містить щонайменше один прикріплений полімер. Як використовується тут, «злиття» означає колінеарний ковалентний зв'язок двох або декількох поліпептидів через їх відповідні пептидні каркаси за допомогою генної експресії полінуклеотидної молекули, що кодує ці білки, у тій же самій рамці зчитування. Як використовується тут, «ідентичність» відноситься до подібності послідовності між двома поліпептидами, молекулами або між двома нуклеїновими кислотами. Коли положення в обох з двох порівняних послідовностей зайняте тією ж самою основою або субодиницею амінокислотного мономера (наприклад, якщо положення у кожній з двох молекул ДНК зайняте аденіном або положення у кожному з двох поліпептидів зайняте лізином), то відповідні молекули гомологічні по цьому положенню. «Процент ідентичності» між двома послідовностями є функцією числа відповідних положень, що розділяються двома послідовностями, поділеного на число порівняних положень, χ 100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень у двох послідовностях відповідають, то ці дві послідовності мають 60% ідентичність. Як приклад, послідовності ДНК CTGACT і CAGGTT розділяють 50% гомологію (відповідають 3 з усіх 6 положень). Як правило, порівняння проводиться, коли дві послідовності вирівняні, щоб дати максимальну відповідність. Таке вирівнювання може бути забезпечене з використанням, наприклад, способу Needleman et al., J. Моl Biol. 48: 443-453 (1970), що зручно забезпечити комп'ютерними програмами, такими як програма Align (DNAstar, Inc.). «Подібні» послідовності являють собою ті, які, будучи вирівняними, розділяють ідентичні і подібні амінокислотні залишки, де подібні залишки являють собою консервативні заміни, або «дозволені точкові мутації» відповідних амінокислотних залишків у вирівняній еталонній послідовності. У цьому відношенні «консервативна заміна» залишку в еталонній послідовності являє собою заміну залишком, який фізично або функціонально подібний до відповідного еталонного залишку, наприклад, має подібний розмір, форму, електричний заряд, хімічні властивості, включаючи здатність формувати ковалентні або водневі зв'язки, або тому подібне. Таким чином, «мутантна консервативна заміна» послідовності є такою, яка відрізняється від еталонної послідовно 7 91178 8 сті або послідовності дикого типу тим, що у ній присутні одна або декілька консервативних замін або дозволених точкових мутацій. «Процентний вміст позитивних» між двома послідовностями являє собою функцію числа положень, які містять відповідні залишки або консервативні заміни, що розділяються двома послідовностями, поділеного на число порівняних положень, x 100. Наприклад, якщо у двох послідовностях відповідають 6 з 10 положень, і 2 з 10 положень містять консервативні заміни, то ці дві послідовності мають 80% позитивну гомологію. Мутантні поліпептиди неубластину Мутантні поліпептиди неубластину за винаходом зберігають нейротрофічну активність і мають підвищену біодоступність у порівнянні з поліпептидом неубластину дикого типу. Наприклад, мутантні неубластини за даним винаходом активують продукт гена RET у випробуваннях, в яких неубластин дикого типу активує RET. У цілому, мутантний поліпептид неубластину збереже щонайменше одну з наступних особливостей, але буде додатково включати щонайменше одну модифікацію, таку як створена внутрішня ділянка для кон'югації з полімером: (і) сім консервативних залишків цистеїну у положеннях 16, 43,47, 80, 81, 109 і 111, якщо вони пронумеровані відповідно до SEQ ID NO:1-4; (іі) амінокислотні залишки наступним чином: С у положенні 16, L у положенні 18, V у положенні 25, L у положенні 28, G у положенні 29, L у положенні 30, G у положенні 31, Ε у положенні 36, F у положенні 40, R у положенні 41, F у положенні 42, С у положенні 43, G у положенні 45, С у положенні 47, С у положенні 80, С у положенні 81, R у положенні 82, Ρ у положенні 83, F у положенні 91, D у положенні 93, S у положенні 105, А у положенні 106, С у положенні 109 і С у положенні 111, кожне перераховується відповідно до SEQ ID NO:1-4; (ііі) повтори LGLG, мотив FRFC, мотив QPCCRP і мотив SATACGC. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до усіченого мутантного поліпептиду неубластину, в якому N-кінець усіченого поліпептиду неубластину не має однієї або декількох N-кінцевих амінокислот зрілого поліпептиду неубластину, але мутований, щоб володіти внутрішнім прикріпленням для полімеру. Переважно, усічений мутантний поліпептид неубластину, коли димеризований, активує поліпептид RET. У деяких варіантах здійснення мутантний поліпептид неубластину індукує димеризацію поліпептиду RET. Така індукція може потребувати додаткових поліпептидів або кофакторів, як було б зрозуміло фахівцеві у даній галузі техніки. Амінокислотні послідовності людського і мишачого поліпептидів неубластину розкриті у РСТ публікації WO00/01815. Приклади поліпептидів неубластину дикого типу відповідно до винаходу представлені у таблиці 1А. Консенсусна послідовність неубластину (консенсус відносно людини, миші та щура) викладена у таблиці 1В. У деяких варіантах здійснення щонайменше один із залишків аргініну (Arg або R) або аспарагіну (Asn або N), показаних напівжирним шрифтом у таблиці 1А, замінені відмінним амінокислотним залишком. У переважному варіанті здійснення мутантний поліпептид неубластину має лізиновий (Lys або К) залишок, що замістив аспарагін у положенні 95, позначеному зірочкою у таблиці 1А, і згадується як NBN-N95K. Загалом, заміна N95K приводить до поліпшеної розчинності. Це полегшує приготування композицій з високими концентраціями. 9 Винахід відноситься до полімер-кон'югованого мутантного поліпептиду неубластину, що містить амінокислотну послідовність, яка, наприклад, щонайменше на 70% ідентична амінокислотам 8-113 з SEQ ID NO:1 (також наведеної у таблиці 1). В одному варіанті здійснення один або декілька аргінінів у положенні 14, положенні 39, положенні 68 або аспарагін у положенні 95 замінений(і) іншою амінокислотою, відмінною від аргініну або аспарагіну. В одному варіанті здійснення амінокислота дикого типу замінена лізином або цистеїном. Замінені залишки у мутантному поліпептиді неубластину можуть бути вибрані, щоб полегшити зв'язування полімеру, наприклад, поліалкіленгліколевого полімеру, із заміненою амінокислотою. Сприятливими ділянками модифікації є ділянки в областях, доступних для розчинника у поліпептиді неубластину. Такі ділянки можуть бути вибрані, базуючись на огляді кристалічної структури спорідненого нейротрофічного фактора, такого як GDNF, кристалічна структура якого описана Eigenbrot et al., Nat. Struct. Biol. 4:435-38, 1997. Ділянки також можуть бути вибрані, базуючись на кристалічній структурі неубластину, кристалізація і визначення структури якого описані нижче. До того 91178 10 ж, ділянки можуть бути вибрані, базуючись на структурно-функціональній інформації, наданій для химерних білків персефіну/неубластину. Ці химери описані у Baloh et al., J. Biol. Chem. 275:3412-20, 2000. Ілюстративний перелік доступних для розчинників або виставлених на поверхню амінокислот неубластину, виявлених за допомогою цієї методики, викладений у таблиці 2. Таблиця 2 містить список і кількість залишків у людському неубластині, які, як очікується, будуть виставлені на поверхню. Перша колонка відноситься до виставлених на поверхню залишків, визначених шляхом дослідження структури щурячого димеру GDNF, утвореного ланцюгами А і В (PDB код 1AGQ), і визначення, чи знаходився залишок на поверхні структури. Ця структура була потім порівняна з вирівнюванням послідовності GDNF і неубластину у Baloh et al., Neuron 21:1291-1302, 1998, щоб визначити відповідні залишки у неубластині. Друга і третя колонки, відповідно, відносяться до залишків, що знаходяться на поверхні, визначених шляхом дослідження структури димеру людського неубластину, сформованого ланцюгами А і В. Схема нумерації у таблиці 2 та ж, що наведена у таблиці 1. 11 n вказує, що залишки не присутні у структурах GDNF або неубластину. Це відбувається або через будову конструкта, гнучких областей, або вставок у неубластині відносно GDNF (залишки 68-71). - вказує, що залишки занурені, а не знаходяться на поверхні, або є залишками цистеїну, залученими до дисульфідних зв'язків. Оскільки цей білок є цистеїновим клубком, переважна більшість залишків знаходиться на поверхні. + вказує, що цей залишок знаходиться у неприкритому вигляді на поверхні у структурі GDNF або у структурі неубластину, хоча петля, що містить залишки 66-75, помітна тільки у структурі мономерів GDNF (припустимо гнучкій). Ця петля також містить 4 залишки, вставлених у неубластин відносно GDNF. У деяких варіантах здійснення поліпептид неубластину зберігає сім консервативних залишків Cys, які характерні для підсімейства GDNF і для TGF-бета надсімейства. Послідовність повної довжини людського препро-поліпептиду NBN (SEQ ID NO:5) показана у таблиці 3. Три зрілі форми поліпептидів неубластину були ідентифіковані. Ці форми включають: 91178 12 (і) 140 АА поліпептид, позначений тут як NBN140, який містить амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID NO:6; (іі) 116 АА поліпептид, позначений тут як NBN116, який містить амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID NO:7; і (ііі) 113 АА поліпептид, позначений тут як NBN113, який містить амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID NO:2. Таблиця 3 ілюструє відношення між розкритими послідовностями поліпептиду препронеубластину за винаходом. Лінія 1 передбачає поліпептид SEQ ID NO:5, лінія 2 передбачає поліпептид SEQ ID NO:6, лінія 3 передбачає поліпептид SEQ ID NO:7, і лінія 4 передбачає поліпептид SEQ ID NO:2. Сім консервативних залишків цистеїну позначаються символами ("*", "#", "+" і "І"), щоб показати внутрішньомолекулярні (*з*,#з# і + з+)і міжмолекулярні ("|") дисульфідні містки, сформовані у зрілому димеризованому ліганді неубластину. Знак вставки (" ") вказує на залишок аспарагіну в амінокислотному положенні 95, який замінезамінений лізином у NBN106-N95K. 13 В альтернативних варіантах здійснення послідовності визначених вище поліпептидів неубластину були усічені в їх N-кінцевій амінокислотній послідовності. їх приклади включають: (iv) 112АА поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN112, яка містить 112 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 29-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:8) або амінокислоти 2-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (ν) 111АА поліпептидна послідовність, позначена тут як ΝΒΝ111, яка містить 111 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 30-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:9) або амінокислоти 3-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (vi) 110AA поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN110, яка містить 110 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 31-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:10) або амінокислоти 4-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (vii) 109AA поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN109, яка містить 109 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 32-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:11) або амінокислоти 5-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (viii) 108AA поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN108, яка містить 108 С-кінцевих 91178 14 амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 33-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:12) або амінокислоти 6-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (іх) 107АА поліпептидна послідовність, позначена тут як№іШ07, яка містить 107 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 34-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:13) або амінокислоти 7-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (x) 106ΑΑ поліпептидна послідовність, позначена тут альтернативно як NBN106 або N-7, яка містить 106 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 35-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:14) або амінокислоти 8113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (хі) 105АА поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN105, яка містить 105 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 36-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:15) або амінокислоти 9-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (хіі) 104АА поліпептидна послідовність, позначена тут альтернативно як NBN104 або N-9, яка містить 104 С-кінцевих амінокислоти поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 37-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:16) або амінокислоти 10113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. 15 (хііі) 103АА поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN103, яка містить 103 С-кінцевих амінокислоти поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 38-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:17) або амінокислоти 11-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (xiv) 102AA поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN102, яка містить 102 С-кінцевих амінокислоти поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 39-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:18) або амінокислоти 12-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (xv) 101АА поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN101, яка містить 101 С-кінцеву амінокислоту поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 40-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:19) або амінокислоти 13-113 з SEQIDNO:1, 3 або 4. 91178 16 (xvi) 100AA поліпептидна послідовність, позначена тут як NBN100, яка містить 100 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 41-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:20) або амінокислоти 14-113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. (xvii) 99AA поліпептидна послідовність, позначена тут альтернативно як NBN99 або N-14, яка містить 99 С-кінцевих амінокислот поліпептиду неубластину, наприклад, амінокислоти 42-140 з SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:21) або амінокислоти 15113 з SEQ ID NO:1, 3 або 4. Поліпептидні послідовності цих усічених поліпептидів неубластину з NBN113 по NBN99 показані у таблиці 4. Формування дисульфідних містків як описано у таблиці 3. 17 Мутантний поліпептид неубластину відповідно до винаходу може бути, наприклад, щонайменше на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% або 99% ідентичний амінокислотам 8-113 з SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення амінокислотна послідовність мутантного поліпептиду неубластину включає амінокислотну послідовність такого, що зустрічається у природі, щурячого, людського або мишачого поліпептиду неубластину в амінокислотах 1-94 і 96113 мутантного поліпептиду неубластину, наприклад, поліпептид має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2, 3 або 4 у цих положеннях. Мутантний поліпептид неубластину, відмінний послідовністю від розкритих у SEQ ID NO:1-4, може включати одну або декілька замін консервативних амінокислот. Альтернативно або на додаток, мутантний поліпептид неубластину може відрізнятися однією або декількома замінами не консервативних амінокислот або делеціями, або вставками. Переважно, заміни, вставки або делеції не ліквідують біологічну активність виділеного білка. Консервативна заміна являє собою заміну однієї амінокислоти іншою з подібними характеристиками. Консервативні заміни включають заміни у межах наступних груп: валін, аланін і гліцин; лейцин, валін та ізолейцин; аспарагінова кислота і глутамінова кислота; аспарагін і глутамін; серин, цистеїн і треонін; лізин і аргінін; і фенілаланін і тирозин. Неполярні гідрофобні амінокислоти включають в себе аланін, лейцин, ізолейцин, валін, пролін, фенілаланін, триптофан і метіонін. Полярні нейтральні амінокислоти включають в себе гліцин, серин, треонін, цистеїн, тирозин, аспарагін і глутамін. Позитивно заряджені (основні) амінокислоти включають в себе аргінін, лізин і гістидин. Негативно заряджені (кислі) амінокислоти включають в себе аспарагінову кислоту і глутамінову кислоту. Будь-яку заміну одного члена зазначених вище полярних, основних або кислих груп іншим членом тієї ж самої групи можна вважати консервативною заміною. Інші заміни можуть бути легко виявлені звичайним фахівцем у даній галузі. Наприклад, для амінокислоти аланіну заміну можна взяти будь-яку з D-аланіну, гліцину, бета-аланіну, цистеїну і Dцистеїну. Для лізину заміною може бути будь-яка з D-лізину, аргініну, D-аргініну, гомоаргініну, метіоні 91178 18 ну, D-метіоніну, орнітину або D-орнітину. Як правило, замінами у функціонально важливих областях, від яких потрібно чекати змін у властивостях виділених поліпептидів, є ті, в яких: (і) полярний залишок, наприклад, серии або треонін, замінює гідрофобний залишок (і навпаки), наприклад, лейцин, ізолейцин, фенілаланін, або аланін; (іі) залишок цистеїну замінює будь-який інший залишок або замінюється будь-яким іншим залишком; (ііі) залишок, що має електропозитивний бічний ланцюг, наприклад, лізин, аргінін або гістидин, замінює залишок, що має електронегативний бічний ланцюг (і навпаки), наприклад, глутамінову кислоту або аспарагінову кислоту; або (iv) залишок, що має великий бічний ланцюг, наприклад, фенілаланін, замінює залишок, що не має такого бічного ланцюга (і навпаки), наприклад, гліцин. Ймовірність того, що одна з попередніх неконсервативних замін може змінити функціональні властивості білка, також корелює з положенням заміни відносно функціонально важливих областей білка. Декілька неконсервативних замін можуть відповідно слабо вплинути або ніяк не вплинути на біологічні властивості. У багатьох випадках полімер-кон'югований мутантний поліпептид неубластину має більш тривалий час напівжиття у сироватці у порівнянні з часом напівжиття дикого поліпептиду або мутантного поліпептиду за відсутності полімеру. У деяких варіантах здійснення полімер-кон'югований мутантний поліпептид неубластину значно збільшував силу дії in vivo у порівнянні з силою дії поліпептиду або глікозильованого поліпептиду за відсутності полімеру. Полімер-кон'югований поліпептид неубластину може бути передбачений як димер, який включає щонайменше один полімер-кон'югований поліпептид неубластину. У деяких варіантах здійснення димер є гомодимером полімер-кон'югованих мутантних поліпептидів неубластину. В інших варіантах здійснення димер є гомодимером полімеркон'югованих мутантних усічених поліпептидів неубластину. В інших варіантах здійснення димер є гетеродимером, який включає один полімеркон'югований мутантний поліпептид неубластину і один поліпептид неубластину дикого типу. В інших варіантах здійснення димер є гетеродимером, 19 який включає один полімер-кон'югований мутантний поліпептид неубластину і один полімеркон'югований поліпептид неубластину дикого типу, де кон'югація полімеру відбувається у N-кінці, і де поліпептиди можуть бути або не бути усіченими. Інші димери включають гетеродимери або гомодимери форм полімер-кон'югованого мутантного поліпептиду неубластину, які можуть бути або не бути усіченими. У винахід включені зрілі та усічені мутантні поліпептидні послідовності, що містять найближчі до С-кінця амінокислотні залишки препро-NBN поліпептиду, такі як включені у SEQ ID NO:5, і які позначаються тут як NBN#, де # являє собою число Скінцевих залишків, що залишаються у згаданому поліпептиді неубластину. Полімер-кон'юговані поліпептиди неубластину, присутні у біологічно активних димерах неубластину, можуть бути продуктами реакції розщеплення протеазами або хімічної реакції розщеплення, або можуть бути експресовані з рекомбінантного ДНК-конструкту, або можуть бути синтезовані. Приклади поліпептидів неубластину включають, наприклад, NBN140, NBN116 і NBN113. Додаткові поліпептиди неубластину за винаходом включають NBN112, NBN111, NBN110, NBN109, NBN108, NBN107, NBN106, NBN105, NBN104, NBN103, NBN102, NBN101, NBN100 і NBN99 (SEQ ID NO:8-21). Переважним полімер-кон'югованим поліпептидом неубластину є гомодимер NBN106-N95K, кон'югований або з трьома 10 кДа залишками ПЕГ ("3x10 кДа ПЕГ NBN106-N95K"), або з чотирма 10 кДа залишками ПЕГ ("4x10 кДа ПЕГ NBN106N95K"). Також переважна змішана популяція NBN106-N95K гомодимерів, кон'югованих або з трьома 10 кДа залишками ПЕГ, або з чотирма 10 кДа залишками ПЕГ, що згадується тут як "3 (,4) x 10 кДа ПЕГ ΝΒΝ106-Ν95Κ". Також переважним є 3 (,4) x 10 кДа ПЕГ ΝΒΝ106-Ν95Κ гомодимер, в якому дві Ν-кінцевих амінокислоти ковалентно зв'язані з залишками ПЕГ, і третій і/або четвертий залишок ПЕГ ковалентно зв'язаний з одним або обома заміщеними Ν95Κ залишками. У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину базується на консенсусній послідовності SEQ ID NO:1. У визначених варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину включає в себе амінокислоти 1-7 з SEQ ID NO:1 на додаток до амінокислот 8-113. У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину, коли димеризований, зв'язує GFRa3. У деяких варіантах здійснення полімер-кон'югований поліпептид неубластину, коли димеризований, стимулює фосфорилування тирозину поліпептиду RET, або самостійно, або коли зв'язаний з GFRa3. У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину, коли димеризований, збільшує виживаність нейрона, наприклад, збільшує виживаність сенсорного нейрона. У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину, коли димеризований, зменшує або обертає патологічні зміни нейрона, такого як сенсорний нейрон. 91178 20 У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину, коли димеризований, збільшує виживаність нейрона, наприклад, вегетативного нейрона або дофамінергічного нейрона. У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину включає в себе одну, дві, три, чотири або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з амінокислоти, яка відрізняється від аргініну у положенні 14 в амінокислотній послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, амінокислоти, яка відрізняється від аргініну у положенні 39 в амінокислотній послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, амінокислоти, яка відрізняється від аргініну у положенні 68 в амінокислотній послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, і амінокислоти, яка відрізняється від аспарагіну у положенні 95 в амінокислотній послідовності полімеркон'югованого поліпептиду. У деяких варіантах здійснення амінокислота в одній або декількох амінокислотах у положеннях 14, 39, 68 і 95 являє собою лізин. Переважно, амінокислоти 8-94 і 96113 полімер-кон'югованого поліпептиду неубластину щонайменше на 90% ідентичні амінокислотам 8-94 і 96-113 з SEQ ID NO:1. Більш переважно, амінокислотні послідовності щонайменше на 95% ідентичні тим же. Найбільш переважно, амінокислотна послідовність полімер-кон'югованого поліпептиду неубластину включає амінокислотну послідовність такого, що зустрічається у природі, людського, мишачого або щурячого поліпептиду неубластину в амінокислотах 8-94 і 96-113 полімер-кон'югованого поліпептиду неубластину. Наприклад, амінокислоти 8-94 і 96-113 полімеркон'югованого поліпептиду неубластину можуть включати амінокислотну послідовність амінокислот 8-94 і 96-113 з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 або SEQ ID NO:4. У зазначених вище варіантах здійснення переважний залишок у положенні амінокислоти 95 являє собою лізин або цистеїн. Винахід відноситься до конструкту, який є гетеродимером або гомодимером, що містить полімер-кон'юговані злиті білки неубластину, наприклад, неубластин, забезпечений полігістидиновим (His) тегом, передбачений у SEQ ID NO:36, або злитий білок неубластину, де залишок, що бере участь у злитті, являє собою поліпептид імуноглобуліну (Ig), поліпептид сироваткового альбуміну або поліпептид-похідне реплікази. Злиті білки неубластину можуть мати поліпшені фармакокінетичні властивості і біодоступність in vivo. Винахід відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує зрілий або усічений поліпептид неубластину з мутантною поліпептидною послідовністю. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує даний поліпептид неубластину, переважно включена у вектор, наприклад, вектор, що експресує. Мутантна молекула нуклеїнової кислоти неубластину, або вектор, що містить її, можуть бути включені у клітину. Клітина може бути, наприклад, клітиною ссавця, клітиною гриба, дріжджовою клітиною, клітиною комахи або бактеріальною клі 21 тиною. Переважною клітиною ссавця є клітина яєчника китайського хом'ячка ("СНО клітина"). Крім того, винахід відноситься до способу одержання полімер-кон'югованого поліпептиду неубластину шляхом вирощування клітини, яка містить нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид неубластину при умовах, які дозволяють відбуватися експресії поліпептиду неубластину. У деяких варіантах здійснення неубластин кон'югується із залишком, що зустрічається у природі. У конкретних варіантах здійснення залишок, що зустрічається у природі, являє собою глікозильний залишок. У деяких варіантах здійснення експресується глікозильований неубластин, наприклад, у СНО клітині. Винахід далі відноситься до поліпептиду неубластину, експресованого у клітині. Подібні нуклеїнові кислоти, вектори, клітини хазяїна і способи виробництва поліпептиду розкриті тут для злитих білків (таких як злиті білки неубластину сироваткового альбуміну) за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення поліпептид неубластину, який експресований у клітині, збирається і кон'югується з полімером. У деяких варіантах здійснення полімер являє собою залишок поліалкіленгліколю. В окремих варіантах здійснення полімер являє собою залишок ПЕГ. Конкретно передбачена винаходом композиція, яка містить мутантний поліпептид неубластину, зв'язаний з полімером, що не зустрічається у природі. Мутантний поліпептид неубластину у композиції переважно включає в себе амінокислотну послідовність, щонайменше на 70% ідентичну амінокислотам 8-113 з SEQ ID NO:1, передбачаючи, що полімер-кон'югований поліпептид неубластину включає в себе одну або декілька амінокислотних замін, вибраних з групи, що складається з амінокислоти, яка відрізняється від аргініну у положенні 14 в амінокислотній послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, амінокислоти, яка відрізняється від аргініну у положенні 39 в амінокислотній послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, амінокислоти, яка відрізняється від аргініну у положенні 68 полімер-кон'югованого поліпептиду, і амінокислоти, яка відрізняється від аспарагіну у положенні 95 полімер-кон'югованого поліпептиду, де положення амінокислот пронумеровані відповідно до послідовності поліпептиду з SEQ ID NO:1. Винахід відноситься до стійкого, розчинного у воді кон'югованого поліпептиду неубластину або мутантного поліпептидного комплексу неубластину, що включає поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину, зв'язаний із залишком ПЕГ, де поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину зв'язаний із залишком ПЕГ лабільним зв'язком. У деяких варіантах здійснення лабільний зв'язок є біохімічним гідролізом, що розщеплюється, протеолізом або сульфгідрильним розщепленням. У деяких варіантах здійснення лабільний зв'язок є таким, що розщеплюється в умовах in vivo. Крім того, винахід відноситься до способу одержання модифікованого поліпептиду неубластину, який має збільшений час напівжиття у сироватці у порівнянні з неубластином дикого типу. 91178 22 Спосіб передбачає заготовку поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину і зв'язування поліпептиду або мутантного поліпептиду неубластину із залишком полімеру, що не зустрічається у природі, таким чином формуючи зв'язану композицію полімеру і поліпептиду неубластину. Полімер-кон'юговані мутантні поліпептиди неубластину за даним винаходом включають в себе заміну однієї або декількох амінокислот, наприклад, амінокислоти, крім аргініну у положенні 14 в амінокислотній послідовності полімеркон'югованого поліпептиду, амінокислоти, крім аргініну у положенні 39 в амінокислотній послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, амінокислоти, крім аргініну у положенні 68 амінокислотної послідовності полімер-кон'югованого поліпептиду, або амінокислоти, крім аспарагіну у положенні 95 амінокислотної послідовності полімеркон'югованого поліпептиду, коли положення амінокислот нумеруються відповідно до послідовності поліпептиду з SEQ ID NO:1. Синтез і виділення поліпептидів неубластину дикого типу і мутантних Поліпептиди неубластину можуть бути виділені з використанням способів, відомих у техніці. Поліпептиди неубластину, що зустрічаються у природі, можуть бути виділені з клітин або тканинних джерел за допомогою відповідної схеми очищення з використанням стандартних способів очищення білка. Альтернативно, мутантні поліпептиди неубластину можуть бути синтезовані хімічно з використанням стандартних способів синтезу пептидів. Синтез коротких амінокислотних послідовностей добре відомий у техніці пептидів. Див., наприклад, Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed., 1984). У деяких варіантах здійснення мутантні поліпептиди неубластину виробляються методами рекомбінантної ДНК. Наприклад, молекула нуклеїнової кислоти, що кодує мутантний поліпептид неубластину, може бути вміщена у вектор, наприклад, вектор, що експресує, і нуклеїнова кислота може бути введена у клітину. Відповідні клітини включають, наприклад, клітини ссавців (такі як людські клітини або СНО клітини), клітини грибів, дріжджові клітини, клітини комах і бактеріальні клітини. Коли експресія здійснюється у рекомбінантній клітині, клітина переважно культивується при умовах, які дозволяють здійснити експресію мутантного поліпептиду неубластину. Мутантний поліпептид неубластину може бути виділений з клітинної суспензії, якщо бажано. Як використовується тут, «виділений» означає, що мутантний поліпептид дістали з тих компонентів клітини або культурального середовища, в яких він присутній до процесу виділення. Процес виділення може включати одну або декілька стадій рефолдингу або очищення. Мутантні поліпептиди неубластину можуть бути сконструйовані з використанням будь-якого з декількох способів, відомих у техніці. Одним з таких способів є сайт-направлений мутагенез, при якому специфічний нуклеотид (або, якщо бажано, невелика кількість специфічних нуклеотидів) змі 23 нюється, щоб змінити одну амінокислоту (або, якщо бажано, невелику кількість заздалегідь позначених амінокислотних залишків) у поліпептиді неубластину, що кодується. Фахівці у даній галузі техніки усвідомлюють, що сайт-направлений мутагенез є типовим і широко використовуваним способом. Фактично, багато комплектів для сайтнаправленого мутагенезу комерційно доступні. Один такий комплект "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" продається Clontech Laboratories (Palo Alto, Каліфорнія). При здійсненні на практиці даного винаходу будуть використовуватися, якщо не визначено інакше, звичайні способи клітинної біології, культури клітин, молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантної ДНК, хімії білка та імунології, які знаходяться у межах технічних навичок. Такі способи описані у літературі. Див., наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4683195 (Mullis et al); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Haines and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Haines and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (ІЗ.РегЬаі), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al, eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M-Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Кон'югація поліпептидів неубластину з полімером Хімічно модифіковані поліпептиди неубластину можуть бути одержані фахівцем, базуючись на даному розкритті. Хімічні залишки, переважні для кон'югації з поліпептидом неубластину являють собою водорозчинні полімери. Водорозчинний полімер вигідний, тому що білок, до якого він прикріплюється, не випадає в осад у водному оточуючому середовищі, такому як фізіологічне оточуюче середовище. Переважно, полімер є фармацевтично прийнятним для приготування лікувального продукту або композиції. Якщо бажано, одинична молекула полімеру може використовуватися для кон'югації з поліпептидом неубластину, хоча більш ніж одна молекула полімеру також може бути приєднана. Композиції кон'югованого неубластину за винаходом можуть виявитися корисними для застосування як in vivo, так і не in vivo. Крім того, встановлено, що полімер, який кон'югується, може використовувати будь-які інші групи, залишки або інші кон'юговані різновиди, які підходять для кінцевого використання додатку. Наприклад, у деяких застосуваннях може бути корисно ковалентно зв'язати з поліме 91178 24 ром функціональний залишок, що надає полімеру стійкості до деградації під дією ультрафіолету або антиоксидантних властивостей, або інших властивостей або характеристик. Як наступний приклад, у деяких застосуваннях може бути вигідно внести у полімер функціональну групу, щоб надати йому реакційної здатності або здатності до поперечних зшивань по характеру, посилити різні властивості або характеристики всього кон'югованого матеріалу. Відповідно, полімер може містити будь-які функціональні групи, групи, що повторюються, зв'язки або інші структурні складові, які не перешкоджають ефективності кон'югованої композиції неубластину для його передбачуваного призначення. Фахівець у даній галузі техніки буде здатний вибрати бажаний полімер, базуючись на таких міркуваннях, як чи буде кон'югат полімеру/білка використовуватися терапевтично, і якщо так, бажану дозу, час циркуляції, стійкість до протеолізу та інші міркування. Ефективність дериватизації може бути встановлена шляхом введення похідного у бажаній формі (наприклад, осмотичним насосом або, більш переважно, шляхом ін'єкції або інфузії, або далі приготованого у вигляді композиції для орального, пульмонального або інших шляхів введення) і визначення його ефективності. Відповідні водорозчинні полімери включають, але не обмежуються ними, ПЕГ, співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-діоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етиленового/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (або гомополімери, або випадкові співполімери) і декстран або полі-(нвінілпіролідон)-ПЕГ, гомополімери пропропіленгліколю, співполімери поліпропілен оксиду етиленоксиду, поліоксіетильовані багатоатомні спирти (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт та їх суміші. Полімер може мати будь-яку придатну молекулярну масу і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Для ПЕГ відповідна середня молекулярна маса знаходиться між приблизно 2 кДа і приблизно 100 кДа. Це забезпечує зручність у поводженні і виробництві. Фахівці у даній галузі техніки оцінять, що у препаратах ПЕГ деякі молекули будуть мати більшу масу, деякі меншу, ніж заявлена молекулярна маса. Таким чином, молекулярна маса звичайно позначається як «середня молекулярна маса». Інші молекулярні маси (розміри) можуть використовуватися в залежності від бажаного терапевтичного профілю (наприклад, бажаної тривалості безперервного виділення; впливів, якщо такі взагалі є, на біологічну активність; легкість у поводженні; ступеня антигенності або її відсутності та інших відомих впливів ПЕГ на лікувальний білок). У різних варіантах здійснення молекулярна маса становить приблизно 2 кДа, приблизно 5 кДа, приблизно 10 кДа, приблизно 15 кДа, приблизно 20 кДа, приблизно 25 кДа, приблизно 30 кДа, приблизно 40 кДа або приблизно 100 кДа. У деяких переважних варіантах здійснення середня молекулярна маса кожного ланцюга ПЕГ становить приблизно 20 кДа. У деяких переважних варіантах 25 здійснення середня молекулярна маса становить приблизно 10кДа. Число молекул полімеру, приєднаних таким чином, може змінюватися, і фахівець у даній галузі техніки буде здатний встановити вплив на функцію. Можлива монодериватизація, або можливе проведення ди-, три-, тетра- або деякої комбінації дериватизації з тими ж самими або різними хімічними залишками (наприклад, полімерами, такими як ПЕГ різної маси). Співвідношення між молекулами полімеру і молекулами білка (або поліпептиду) буде змінюватися у міру того, як будуть змінюватися їх концентрації у реакційній суміші. Загалом, оптимальне співвідношення (з точки зору ефективності реакції, в якій немає надлишку білка або полімеру, що не прореагував) буде визначатися факторами, такими як бажаний ступінь дериватизації (наприклад, моно, ди-, три- і т.д.), молекулярна маса вибраного полімеру, є полімер розгалуженим чи ні і умовами реакції. Молекули ПЕГ (або інших хімічних залишків) повинні приєднуватися до білка з урахуванням впливу на функціональні або антигенні області білка. Існує множина способів приєднання, доступних фахівцям у даній галузі техніки. Див., наприклад, ЕР 0401384 (зв'язування ПЕГ з гранулоцитарним колонієстимулюючим фактором (G-CSF)); Malik et al, Exp. Hematol. 20:1028-1035, 1992 (звіт про кон'югацію з ПЕГ GM-CSF з використанням трезилхлориду). Наприклад, ПЕГ може бути ковалентно зв'язаний з амінокислотними залишками за допомогою реакційноздатної групи, такої як вільна аміногрупа або карбоксильна група. Амінокислотні залишки, що мають вільну аміногрупу, включають в себе залишки лізину і залишок N-кінцевої амінокислоти. Ті, які мають вільну карбоксильну групу, включають в себе залишки аспарагінової кислоти, залишки глутамінової кислоти і залишок С-кінцевої амінокислоти. Сульфгідрильні групи також можуть використовуватися як реакційноздатна група для прикріплення молекул(и) ПЕГ. Для терапевтичних цілей прикріплення може здійснюватися до аміногрупи, наприклад, до N-кінця або групи лізину. Особливо бажаним може виявитися білок, хімічно модифікований у N-кінці. Використовуючи ПЕГ як ілюстрацію даних композицій, можна вибирати з різноманітності молекул ПЕГ (за молекулярною масою, розгалуженням і т.д.), співвідношення молекул ПЕГ і молекул білка (або пептиду) у реакційній суміші, типу виконуваної реакції кон'югації з ПЕГ і способу одержання вибраного кон'югованого з ПЕГ у N-кінцевій області білка. Способом одержання препарату, кон'югованого з ПЕГ в N-кінцевій області (тобто відділення цього залишку від інших монокон'югованих з ПЕГ залишків, якщо необхідно) може бути очищення кон'югованого з ПЕГ в N-кінцевій області матеріалу від популяції кон'югованих з ПЕГ молекул білка. Селективна хімічна модифікація N-кінця може бути виконана шляхом відновного алкілування, яке використовує диференціальну реакційну здатність різних типів первинних аміногруп (лізину проти N-кінцевої), доступних для дериватизації в окремому білку. При відповідних 91178 26 умовах реакції досягають в основному селективної дериватизації N-кінця білка полімером, що містить карбонільну групу. Наприклад, можна селективно зв'язати з ПЕГ кінцеву амінокислоту білка, проводячи реакцію при рН, який дозволить використовувати переваги відмінностей між рКа епсилон ( )аміногрупи залишків лізину і альфа ( )-аміногрупи N-кінцевого залишку білка. Шляхом такої селективної дериватизації контролюється прикріплення водорозчинного полімеру до білка: кон'югація з полімером має місце переважно в N-кінці білка, і жодної істотної модифікації інших реакційноздатних груп, таких як аміногрупи бічного ланцюга лізину, не відбувається. При використанні відновного алкілування водорозчинний полімер може мати тип, описаний вище, і повинен мати єдиний реакційноздатний альдегід для прикріплення до білка. Може використовуватися пропіоновий альдегід ПЕГ, що містить єдиний реакційноздатний альдегід. Даний винахід відноситься до мутантних поліпептидів неубластину, які експресуються у прокаріотах або еукаріотах або створені штучно. У деяких варіантах здійснення неубластин глікозильований. У деяких специфічних варіантах здійснення димер неубластину кон'югований з полімером біля кожного N-кінця і глікозильований по кожному внутрішньому залишку Asn95. В інших варіантах здійснення мутантний димер неубластину кон'югований з полімером біля кожного N-кінця і кон'югований з полімером біля одного або обох внутрішніх залишків Lys95. Кон'югація з ПЕГ може бути виконана за допомогою будь-якої придатної реакції кон'югації з ПЕГ. Різні хімізми кон'югації з ПЕГ відомі у техніці. Див., наприклад, Focus on Growth Factors, 3 (2): 4-10, 1992; ЕР 0154316; ЕР 0401384; та інші процитовані тут публікації, які стосуються кон'югації з ПЕГ. Кон'югація з ПЕГ може бути виконана через реакцію ацилювання або реакцію алкілування з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічного реакційноздатного водорозчинного полімеру). Кон'югація з ПЕГ за допомогою ацилювання звичайно передбачає реагування активного складноефірного похідного ПЕГ. Будь-яка відома або згодом виявлена реакційноздатна молекула ПЕГ може використовуватися, щоб виконати кон'югацію з ПЕГ. Переважним активованим складним ефіром ПЕГ є ПЕГ, етерифікований Nгідроксилсукцинімідом (NHS). Як використовується тут, «ацилювання» включає без обмеження наступні типи зв'язків між лікувальним білком і водорозчинним полімером, таким як ПЕГ: амідний, карбаматний, уретановий і т.п. див. Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Реакційні умови можуть бути вибрані з будь-яких, відомих у техніці кон'югації з ПЕГ, або розроблених згодом, але потрібно уникати умов, таких як температура, розчинник і рН, які могли б інактивувати білок, що модифікується, або поліпептид неубластину. Кон'югація з ПЕГ за допомогою ацилювання, як правило, буде приводити до продукту білка неубластину, зв'язаного з декількома молекулами ПЕГ. Переважно, з'єднувальні зв'язки є амідними. Також переважно, продукт, що одержують, є в ос 27 новному тільки (наприклад, >95%) моно-, ди- або трикон'югованим з ПЕГ. Проте, деякі різновиди з більш високими ступенями кон'югації з ПЕГ можуть бути сформовані у кількостях, які залежать від конкретних використовуваних умов реакції. Якщо бажано, більш очищені кон'юговані з ПЕГ різновиди можуть бути виділені з суміші, особливо різновиди, що не прореагували, стандартними способами очищення, які включають, серед інших, діаліз, висолювання, ультрафільтрацію, іонообмінну хроматографію, гель-фільтраційну хроматографію та електрофорез. Кон'югація з ПЕГ за допомогою алкілування, як правило, передбачає реакцію кінцевого альдегідного похідного ПЕГ з неубластином у присутності відновного агента. Кон'югація з ПЕГ за допомогою алкілування також може привести до полікон'югованих з ПЕГ білковихпродуктів неубластину. Крім того, можна керувати умовами реакції, щоб істотно сприяти зв'язуванню з ПЕГ тільки з а-аміногрупою N-кінця неубластину (тобто монокон'югованому з ПЕГ білку). Як у випадку монокон'югації з ПЕГ, так і полікон'югації з ПЕГ, ПЕГ-групи переважно прикріпляються до білка через групу -CH2-NH-. Особливо у відношенні групи -СН2-, цей тип зв'язку згадується тут як «алкільний» зв'язок. Дериватизація через відновне алкілування з одержанням монокон'югованого з ПЕГ продукту використовує диференціальну реакційну здатність різних типів первинних аміногруп (лізину проти Nкінцевої), доступних для дериватизації. Реакцію проводять при рН, який дозволяє використовувати переваги відмінностей між рКа ε-аміногруп залишків лізину і α-аміногрупи N-кінцевого залишку білка. За допомогою такої селективної дериватизації регулюється прикріплення до білка водорозчинного полімеру, який містить реакційноздатну групу, таку як альдегід: кон'югація з полімером має місце переважно у N-кінці білка, і жодної істотної модифікації інших реакційноздатних груп, таких як аміногрупи бічного ланцюга лізину, не відбувається. Молекули полімеру, що використовуються і у підході ацилювання, і у підході алкілування, можуть бути вибрані з числа водорозчинних полімерів, як описано вище. Вибраний полімер повинен бути модифікований, щоб мати єдину реакційноздатну групу, таку як активну ефірну для ацилювання або альдегідну для алкілування, переважно так, щоб ступінь полімеризації можна було регулювати, як передбачено у даних способах. Прикладом реакційноздатного альдегіду ПЕГ є пропіоновий альдегід ПЕГ, який стійкий у воді, або моно С1-С10 алкокси або арилокси його похідні (див. патент США 5252714). Полімер може бути розгалуженим або нероз галу женим. Для реакцій ацилювання вибраний(і) полімер(и) повинен(ні) мати єдину реакційноздатну ефірну групу. Для даного відновного алкілування вибраний(і) полімер(и) повинен(ні) мати єдину реакційноздатну альдегідну групу. Як правило, водорозчинний полімер не буде вибраний з глікозильних залишків, що зустрічаються у природі, оскільки їх звичайно більш зручно виробляти за допомогою рекомбінантних експресійних систем ссавців. Полімер може мати 91178 28 будь-яку молекулярну масу і може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Прикладом водорозчинного полімеру для використання тут є ПЕГ. Як використовується тут, поліетиленгліколь містить у собі будь-яку з форм ПЕГ, які використовувалися для дериватизації інших білків, включаючи, але не обмежуючись ними, наприклад, моно-(С1-С10)алкокси- або арилокси-ПЕГ. Як правило, хімічна дериватизація може бути виконана при будь-якій придатній умові, що використовується для реагування біологічно активної речовини з активованою молекулою полімеру. Способи одержання кон'югованого з ПЕГ неубластину звичайно будуть включати стадії: (а) реагування білка або поліпептиду неубластину з ПЕГ (таким як реакційноздатне складноефірне або альдегідне похідне ПЕГ) при умовах, відповідно до яких молекула стає прикріпленою до однієї або більше груп ПЕГ, і (b) одержання продукту(ів) реакції. Як правило, оптимальні реакційні умови для реакцій ацилювання будуть вибрані у кожному окремому випадку, базуючись на відомих параметрах і бажаному результаті. Наприклад, чим більше співвідношення ПЕГ:білок, тим вищий процентний вміст полі-кон'югованого з ПЕГ продукту. Відновне алкілування з одержанням в основному гомогенної популяції монополімеру/неубластину, буде, як правило, включати наступні стадії: (а) реагування білка або поліпептиду неубластину з реакційноздатною молекулою ПЕГ в умовах відновного алкілування, при рН, придатному для здійснення pen-nit селективної модифікації α-аміногрупи у N-кінці неубластину; і (b) одержання продукту(ів) реакції. Для в основному гомогенної популяції монополімеру/неубластину реакційними умовами відновного алкілування є ті, які дозволяють селективне прикріплення водорозчинного полімерного залишку до N-кінця неубластину. Такі реакційні умови звичайно забезпечують відмінності рКа між аміногрупами лізину і α-аміногрупою на N-кінці (рКа являє собою рН, при якому 50% аміногруп приєднали протон і 50% - ні). рН також впливає на використовуване співвідношення полімеру до білка. Загалом, чим рН нижчий, тим більший надлишок полімеру до білка буде бажаний (тобто чим менш реакційноздатна N-кінцева α-аміногрупа, тим більше полімеру потрібно, щоб досягти оптимальних умов). Якщо рН вище, співвідношення полімергбілок не повинно бути великим (тобто реакційноздатних груп доступно більше, так що молекул полімеру необхідно менше). Для цілей даного винаходу рН буде, головним чином, відноситися до діапазону 3-9, переважно 3-6. Іншим важливим міркуванням є молекулярна маса полімеру. Як правило, чим вища молекулярна маса полімеру, тим менше молекул полімеру може бути приєднано до білка. Подібним чином, розгалуження полімеру повинно братися до уваги при оптимізації цих параметрів. Як правило, чим вища молекулярна маса (або чим більше гілок), тим вище співвідношення полімергбілок. Загалом, для реакцій кон'югації з ПЕГ, включених сюди, переважна середня молекулярна маса складає від 29 приблизно 2 кДа до приблизно 100 кДа. Переважна середня молекулярна маса складає від приблизно 5 кДа до приблизно 50 кДа, особливо переважно від приблизно 10 кДа до приблизно 20 кДа. Переважна повна молекулярна маса складає від приблизно 10 кДа до приблизно 40 кДа. У деяких варіантах здійснення поліпептид неубластину зв'язаний з полімером через кінцеву реакційноздатну групу на поліпептиді. Альтернативно або на додаток, поліпептид неубластину може бути зв'язаний через аміногрупу бічного ланцюга внутрішнього залишку лізину, наприклад, залишку лізину, введеного в амінокислотну послідовність поліпептиду неубластину, що зустрічається у природі. Таким чином, кон'югації можуть також відгалужуватися від некінцевих реакційноздатних груп. Полімер з реакційноздатною(ими) групою(ами) позначається тут як «активований полімер». Реакційноздатна група вибірково реагує з реакційноздатними групами на білці, наприклад, вільними аміногрупами. Прикріплення може відбутися в активованому полімері до будь-якої доступної аміногрупи неубластину, такої як альфа аміногрупи або епсилон аміногрупи залишку або залишків лізину, введені в амінокислотну послідовність поліпептиду неубластину. Вільні карбоксильні групи, належним чином активовані карбонільні групи, гідроксил, гуанідил, імідазол, залишки окиснених вуглеводів і меркаптогрупи неубластину (якщо є) також можуть використовуватися як ділянки прикріплення. Головним чином, використовується від приблизно 1,0 до приблизно 10 моль активованого полімеру на моль білка, в залежності від концентрації білка. Кінцева кількість є балансом між максимізацією ступеня реакції при мінімізації неспецифічних модифікацій продукту і, у той же самий час, визначенням хімізмів, які підтримують оптимальну активність, у той же самий час оптимізації, якщо можливо, часу напівжиття білка. Переважно, зберігається щонайменше приблизно 50% біологічної активності білка, і найбільш переважно, зберігається близько 100%. Полімер може бути зв'язаний з поліпептидом неубластину з використанням методів, відомих у техніці. Наприклад, в одному варіанті здійснення поліалкіленгліколевий залишок зв'язується з групою лізину мутантного поліпептиду неубластину. Зв'язування з групою лізину може бути виконане з N-гідроксилсукцинімідним (NHS) активним складним ефіром, таким як сукцинімідилсукцинат-ПЕГ (SS-PEG) і сукцинімідилпропіонат (SPA-PEG), придатні поліалкіленгліколеві залишки включають в себе, наприклад, карбоксиметил-NHS, норлейцинNHS, SC-PEG, трезилат, альдегід, епоксид, карбонілімідазол і карбонат PNP. Додаткові реагуючі з аміном лінкери ПЕГ можуть заміщувати сукцинімідильний залишок. Вони включають, наприклад, ізотіоціанати, нітрофенілкарбонати, епоксиди і бензотриазолкарбонати. Умови переважно вибираються, щоб максимізувати селективність і ступінь реакції. Якщо бажано, полімер-кон'юговані поліпептиди неубластину можуть містити тег, наприклад, тег, який згодом може бути вивільнений протеолі 91178 30 зом. Таким чином, залишок лізину може бути модифікований селективно: спочатку модифікований His-тег буде реагувати з низькомолекулярним лінкером, таким як реактив Traut (Pierce), який буде реагувати як з лізином, так і N-кінцем, а потім Hisтег буде відщеплений. Поліпептид буде тоді містити вільну групу SH, яка може бути селективно модифікована ПЕГ, що містить головну групу, яка реагує з тіолами, таку як малеімідна група, вінілсульфонова група, галогенацетатна група або вільна або захищена SH. Реактив Traut може бути замінений будь-яким лінкером, який введе специфічну ділянку для прикріплення ПЕГ. Наприклад, реактив Traut міг бути замінений SPDP, SMPT, SATA або SATP (всі доступні від Pierce). Подібним чином, можливо викликати реакцію білка з реагуючим з аміном лінкером, який вставляє малеімідну (наприклад SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS або GMBS), галогенацетатну групу (SBАР, SIA, SIAB) або вінілсульфонову групу, і викликати реакцію одержаного у результаті продукту з ПЕГ,який містить вільний SH. Єдиним обмеженням розміру лінкера, який використовується, є те, що він не може блокувати подальше видалення N-кінцевого тегу. Таким чином, в інших варіантах здійснення поліалкіленгліколевий залишок приєднується до групи цистеїну мутантного поліпептиду неубластину. Зв'язування може бути здійснене з використанням, наприклад, малеімідної групи, вінілсульфонової групи, галогенацетатної групи і тіольної групи. У переважних варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину у композиції має більш тривалий час напівжиття у сироватці відносно часу напівжиття поліпептиду неубластину за відсутності полімеру. Альтернативно або на додаток, полімер-кон'югований димер поліпептиду неубластину у композиції зв'язує GFRa, активує RET, нормалізує патологічні зміни нейрона, збільшує виживаність нейрона або ослаблює нейропатичний біль, або виконує комбінацію цих фізіологічних функцій. Випробування для визначення того, чи збільшує поліпептид виживаність нейрона або чи нормалізує патологічні зміни нейрона, описані в, наприклад, WO00/01815. Переважно, нейрон є сенсорним нейроном, вегетативним нейроном або дофамінергічним нейроном. У переважних варіантах здійснення композиція передбачена як стійкий водорозчинний поліпептидний комплекс кон'югованого неубластину, що включає поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину, зв'язаний із залишком ПЕГ. Якщо бажано, поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину може бути зв'язаний із залишком ПЕГ за допомогою лабільного зв'язку. Лабільний зв'язок може бути розщеплений при, наприклад, біохімічному гідролізі, протеолізі або сульфгідрильному розщепленні. Наприклад, зв'язок може бути розщеплений в умовах in vivo (фізіологічних). Інші параметри реакції, такі як розчинник, час реакції, температури і т.д., і засоби очищення продуктів можуть бути визначені у кожному окремому випадку, базуючись на опублікованій інформації, 31 яка стосується дериватизації білків з водорозчинними полімерами. Якщо бажано, може бути використана одна молекула полімеру для кон'югації на поліпептиди неубластину. Альтернативно, може бути прикріплена більш ніж одна молекула полімеру. Композиції кон'югованого неубластину за винаходом можуть застосовуватися як in vivo, так і не in vivo. Крім того, вважається, що для кон'югації з полімером можуть бути використані будь-які інші групи, залишки, або інші кон'юговані різновиди, які відповідають кінцевому використанню додатку. Наприклад, може бути корисно у деяких застосуваннях ковалентно зв'язати полімер з функціональним залишком, що надає полімеру стійкості до деградації під дією ультрафіолету або антиоксидантних або інших властивостей або характеристик. Як наступний приклад може бути вигідно у деяких застосуваннях зробити полімер функціональним, щоб зробити його за характером реакційноздатним або здатним до утворення поперечних зв'язків, щоб посилити різні властивості або характеристики всього кон'югованого матеріалу. Відповідно, полімер може містити будь-які функціональні групи, групи, що повторюються, зв'язки або інші складові структури, які не перешкоджають ефективності композиції кон'югованого мутеїну неубластину для її передбачуваної мети. Ілюстративні полімери, які можуть успішно використовуватися, щоб досягти цих бажаних характеристик, описані тут нижче у показових реакційних схемах. У застосуваннях ковалентно зв'язаних пептидів полімеру може бути надана функціональність, і потім він зв'язується з вільною(ими) амінокислотою(ами) пептиду(ів) з утворенням лабільного зв'язку. Реакції можуть мати місце за допомогою будьякого придатного способу, що використовується для взаємодії біологічно активних матеріалів з інертними полімерами, переважно при рН приблизно 5-8, наприклад, рН 5, 6, 7 або 8, якщо реакційноздатні групи знаходяться на альфа аміногрупі у N-кінці. Загалом, процес включає підготовку активованого полімеру і після цього реагування білка з активованим полімером з одержанням розчинного білка, придатного для лікарської композиції. Зазначена вище реакція модифікації може бути виконана декількома способами, які можуть включати одну або декілька стадій. Можуть використовуватися лінійні і розгалужені форми ПЕГ, так само як інші алкіловані форми. Довжина ПЕГ може бути різною. Найпоширеніші форми відрізняються за розміром від 2 до 100 кДа. У той час як представлені приклади свідчать, що намічена кон'югація з ПЕГ N-кінця не впливає на фармакокінетичні властивості, факт, що матеріал зберіг фізіологічну функцію, вказує, що модифікація на ділянці або ділянках, розкритих тут, не є шкідливою. Отже, у виробництві мутантних форм неубластину, які могли б забезпечити додаткові ділянки прикріплення шляхом вставки залишків лізину, вірогідний результат того, що ці форми будуть кон'юговані з ПЕГ як по лізину, так і по Nкінцю, включений у винахід. 91178 32 Одна або декілька ділянок на поліпептиді неубластину можуть бути зв'язані з полімером. Наприклад, один, два, три, чотири або п'ять залишків ПЕГ можуть бути зв'язані з поліпептидом. У деяких варіантах здійснення залишок ПЕГ зв'язаний з Nкінцем і/або амінокислотами 14, 39, 68 і 95 поліпептиду неубластину, пронумерованими, як показано у таблиці 1 і SEQ ID NO:1. У вигідних варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину у композиції має більш тривалий час напівжиття у сироватці відносно напівжиття неубластину дикого типу або мутантного поліпептиду за відсутності полімеру. Альтернативно або на додаток, полімеркон'югований поліпептид неубластину у композиції зв'язує GFR 3, активує RET, нормалізує патологічні зміни нейрона, збільшує виживаність нейрона або ослаблює нейропатичний біль, або виконує комбінацію цих фізіологічних функцій. У деяких варіантах здійснення мутантний поліпептид неубластину або полімер, кон'югований у комплексі, має фізіологічну активність, вибрану з групи, що складається зі: зв'язування GFR 3, активації RET, нормалізації патологічних змін нейрона, збільшення виживаності нейрона або ослаблення нейропатичного болю. Також передбачені винаходом мультимерні поліпептиди, які включають полімер-кон'югований поліпептид неубластину. Мультимерні поліпептиди переважно передбачаються як очищені мультимерні поліпептиди. Приклади мультимерних комплексів включають, наприклад, димерні комплекси. Мультимерний комплекс може бути передбачений як гетеромерний або гомомерний комплекс. Таким чином, мультимерний комплекс може бути гетеродимерним полімер-кон'югованим поліпептидним комплексом, що включає один мутантний поліпептид неубластину і один немутантний неубластин, або гетеродимерним полімер-кон'югованим поліпептидним комплексом, що включає два або декілька мутантних поліпептидів неубластину. У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований поліпептид неубластину зв'язує GFR 3. Переважно, зв'язування полімеркон'югованого поліпептиду неубластину стимулює фосфорилування поліпептиду RET. Щоб визначити, чи зв'язує поліпептид GFR 3, випробування можуть бути виконані, як описано у WO00/01815. Наприклад, присутність неубластину у надосадовій рідині середовища клітин лінії СНО може бути описана з використанням модифікованої форми потрійного комплексного випробування, описаного Sanicola et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6238). У цьому випробуванні здатність GDNFподібних молекул може бути оцінена за їх здатністю опосередковувати зв'язок між позаклітинним доменом RET і різними корецепторами, GFR 1, GFR 2 і GFR 3. Розчинні форми RET і корецепторів виробляються як злиті білки. Злитий білок між позаклітинним доменом щурячого RET і плацентарною лужною фосфатазою (RET-АР) і злитий білок між позаклітинним доменом щурячого GFR -1 (розкритого в опублікованій заявці WO9744356; 27 листопада 1997 р.) і Fc-областю людського IgGl 33 (rGFR( 1-Ig) були описані (Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238). Полімер за винаходом переважно є поліалкіленгліколевим залишком і більш переважно - залишком ПЕГ. У деяких варіантах здійснення залишок полімеру має середню молекулярну масу від приблизно 100 Да до приблизно 25000 Да; від приблизно 1000 Да до приблизно 20000 Да; або від приблизно 5000 Да до приблизно 20000 Да. У деяких варіантах здійснення щонайменше один полімерний залишок має середню молекулярну масу приблизно 5000 Да; середню молекулярну масу приблизно 10000 Да; або середню молекулярну масу приблизно 20000 Да. Функціональна група на поліалкіленгліколевому залишку може бути, наприклад, карбоксиметилNHS, норлейцин-NHS, SC-PEG, трезилатом, альдегідом, епоксидом, карбонілімідазолом або PNP карбонатом. Прикріплення може відбутися за допомогою активного складного ефіру Nгідроксилсукциніміду (NHS). Активний складний ефір може бути, наприклад, сукцинімідилсукцинатом-ПЕГ (SS-PEG), сукцинімідилбутиратом (SPBPEG) або сукцинімідилпропіонатом (SPA-PEG). У деяких варіантах здійснення залишок поліалкіленгліколю зв'язаний з групою цистеїну поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину. Наприклад, прикріплення може відбутися за допомогою малеімідної групи, вінілсульфонової групи, галогенацетатної групи і тіольної групи. У різних варіантах здійснення поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину включає в себе один, два, три або чотири залишки ПЕГ. У деяких варіантах здійснення полімер зв'язаний з поліпептидом на ділянці неубластину, яка являє собою N-кінець. У деяких варіантах здійснення полімер зв'язаний з поліпептидом на ділянці у некінцевій амінокислоті поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину. У деяких варіантах здійснення полімер зв'язаний з відкритою для розчинника амінокислотою поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину. У деяких варіантах здійснення полімер зв'язаний з поліпептидом неубластину або мутантним поліпептидом неубластину біля залишку, вибраного з групи, що складається з амінокислоти N-кінця полімер-кон'югованого поліпептиду, положення 14 в амінокислотній послідовності поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину, положення 39 в амінокислотній послідовності поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину, положення 68 в амінокислотній послідовності поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину і положення 95 в амінокислотній послідовності поліпептиду неубластину або мутантного поліпептиду неубластину. Полімер-кон'юговані злиті білки неубластину Якщо бажано, полімер-кон'югований поліпептид неубластину може бути наданий як злитий білок. Злиті поліпептидні похідні білків за винаходом також включають різні структурні форми первинного білка, які зберігають біологічну активність. Полімер-кон'юговані злиття неубластину сироваткового альбуміну можуть бути одержані з вико 91178 34 ристанням способів, відомих у техніці. Будь-який з ряду крос-лінкерів, які містять відповідну групу, що реагує з амінами, і групу, що реагує з тіолами, може використовуватися, щоб зв'язати неубластин з сироватковим альбуміном. Приклади відповідних лінкерів включають реагуючі з амінами крослінкери, які вставляють реагуючий з тіолами малеімід. Вони включають, наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS або GMBS. Інші придатні лінкери вставляють реагуючу з тіолами галогенацетатну групу. Вони включають, наприклад, SBAP, SIA, SIAB і ті, які надають захищений або незахищений тіол для реакції з сульфгідрильними групами, щоб створити зв'язок, що відновлюється, - SPDP, SMPT, SATA або SATP всі з яких комерційно доступні (наприклад, Pierce Chemicals). Фахівець у даній галузі техніки може подібним чином уявити собі альтернативні підходи, які зв'яжуть N-кінець неубластину з сироватковим альбуміном. Також вважається, що фахівець у даній галузі техніки може зробити кон'югати з сироватковим альбуміном, які не націлені на N-кінець неубластину або на тіольні залишки на сироватковому альбуміні. Якщо бажано, злиття неубластинусироваткового альбуміну може бути здійснене з використанням методів генної інженерії, в яких неубластин зливається з геном сироваткового альбуміну в його С-кінці, N-кінці або в обох кінцях. Будь-який кон'югат неубластину, який приводить до продукту зі збільшеним часом напівжиття, наприклад, in vivo або конкретно у тварин (включаючи людей), може бути зроблений з використанням подібної стратегії. Іншим прикладом кон'югату неубластину, який приводить до продукту зі збільшеним часом напівжиття in vivo, є злитий білок неубластину, де партнером злиття є Ig. Інші похідні полімер-кон'югованих неубластинів включають ковалентні або агрегатні кон'югати мутантного неубластину або його фрагментів з іншими білками або поліпептидами, такими як одержані синтезом у рекомбінантній культурі як додаткові N-кінці або С-кінці. Наприклад, кон'югований пептид може бути сигнальною (або лідерною) поліпептидною послідовністю в N-кінцевій області білка, яка одночасно з трансляцією або після трансляції направляє переміщення білка від ділянки його синтезу до ділянки його функції всередині або ззовні клітинної мембрани або стінки (наприклад, лідер альфа-фактора дріжджів). Білки неубластинового рецептора можуть включати в себе пептиди, додані щоб полегшити очищення або ідентифікацію неубластину (наприклад, злиття гістидину/неубластину). Амінокислотна послідовність неубластину також може бути зв'язана з пептидом Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:22) (Норр et al., Biotechnology 6:1204 (1988)). Остання послідовність дуже антигенна і забезпечує антигенну детермінанту, яка оборотно зв'язується зі специфічним моноклональним антитілом, що дозволяє швидко проводити аналіз і полегшує очищення рекомбінантного білка, що експресується. Дана послідовність також специфічно розщеплюється ентерокіназою бичачої слизової оболонки 35 по залишку, який йде безпосередньо за парою Asp-Lys. Біологічно активні поліпептиди Поліпептиди за винаходом можуть бути надані у будь-якій біологічно активній формі, включаючи форму пре-про-білків, пробілків, зрілих білків, глікозильованих білків, неглікозильованих білків, фосфорилованих білків, нефосфорилованих білків, усічених форм або будь-якого іншого білка, що був підданий посттрансляційній модифікації. Біологічно активний поліпептид неубластину включає в себе поліпептид, який, наприклад, коли димеризований, один або у присутності кофактора (такого як GFRa3 або RET), зв'язується з RET, індукує димеризацію RET і аутофосфорилування RET. Поліпептиди за винаходом можуть, зокрема, бути N-глікозильованим поліпептидом, який переважно глікозильований в області N-залишків, позначених у списках послідовностей. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO:6, утримуючи глікозильований залишок аспарагіну у положенні 122; або амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO:14, утримуючи глікозильований залишок аспарагіну у положенні 95, або в аналогічному положенні у будь-якому мутантному поліпептиді неубластину, якщо він вирівняний за допомогою, наприклад, програмного забезпечення ClustalW. У деяких варіантах здійснення поліпептид за винаходом має амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO:23, згадується тут як NBN113-N95K, містить залишок лізину, який замістив залишок аспарагіну у положенні 95 з SEQ ID NO:2; або амінокислотну послідовність, представлену як SEQ ID NO:24, згадується тут як NBN106N95K; або аналогічне положення у будь-якому мутантному поліпептиді неубластину, якщо він вирівняний за допомогою, наприклад, програмного забезпечення ClustalW. Даний винахід також відноситься до злитих білків мутантного неубластину, таких як Ig-злиття, як описано, наприклад, у патенті США 5434131, або злиття сироваткового альбуміну. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:1, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:1. В інших варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:2. 91178 36 У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:3, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше 40 приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:3. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептидів, які мають амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:4. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:5. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептидів, які мають амінокислотну послідовність SEQ ID NO:6, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:6. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:7, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:7. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність будь-якої з SEQ ID NO:8-21, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як будь-яка з SEQ ID NO:8-21. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:36, за винятком однієї замі 37 ни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з послідовністю, представленою як SEQ ID NO:36. У наступних варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність будь-якої з SEQ ID NO:1-21 і 36, за винятком однієї заміни, або амінокислотну послідовність, яка має щонайменше приблизно 85%, переважно щонайменше приблизно 90%, більш переважно щонайменше приблизно 95%, більш переважно щонайменше приблизно 98% і найбільш переважно щонайменше приблизно 99% ідентичність з будь-якою з послідовностей, представлених як SEQ ID NO:1-21 і 36. В інших варіантах здійснення мутантний поліпептид за винаходом містить «відбиток пальця» підсімейства GDNF, тобто консервативні амінокислотні залишки цистеїну, позначені у таблицях 3 і 4. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до мутантного поліпептиду, що кодується полінуклеотидною послідовністю, здатною до гібридизації в умовах високої жорсткості з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид SEQ ID NO:1, її комплементарним ланцюгом, або її субпослідовністю. У деяких варіантах здійснення мутантний поліпептид за винаходом кодується полінуклеотидною послідовністю, яка має щонайменше 70% ідентичність з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептидів, які раніше не існували, що кодуються полінуклеотидною послідовністю, здатною до гібридизації в умовах високої жорсткості з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид SEQ ID NO:2, її комплементарним ланцюгом, або її субпослідовністю. У деяких варіантах здійснення мутантний поліпептид за винаходом кодується полінуклеотидною послідовністю, яка має щонайменше 70% ідентичність з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид SEQ ID NO:2. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до мутантних поліпептидів, які кодуються полінуклеотидною послідовністю, здатною до гібридизації в умовах високої жорсткості з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид будьякої з SEQ ID NO:8-21, її комплементарним ланцюгом, або її субпослідовністю. В інших варіантах здійснення мутантний поліпептид за винаходом кодується полінуклеотидною послідовністю, яка має щонайменше 70% ідентичність з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид будьякої з SEQ ID NO:8-21. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до поліпептидів, які раніше не існували, що кодуються полінуклеотидною послідовністю, здатною до гібридизації в умовах високої жорсткості з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид SEQ ID NO:36, її комплементарним ланцю 91178 38 гом, або її субпослідовністю. У деяких варіантах здійснення мутантний поліпептид за винаходом кодується полінуклеотидною послідовністю, яка має щонайменше 70% ідентичність з полінуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид SEQ ID NO:36. Біологічне походження Некон'югований димер поліпептиду неубластину може бути виділений і потім кон'югований з одним або декількома полімерами з одержанням полімер-кон'югованого димеру поліпептиду неубластину за винаходом. Димер поліпептиду неубластину може бути виділений з клітини ссавця, переважно з людської клітини або з клітини мишачого походження, або з клітини, що походить з яєчника китайського хом'ячка. Нейротрофічна активність Модифіковані поліпептиди неубластину, включаючи усічені поліпептиди неубластину за винаходом, придатні для ослаблення метаболізму, росту, диференціювання або виживання нерва або клітини нейрона. Зокрема, модифіковані поліпептиди неубластину використовуються, щоб вилікувати або полегшити розлад або хворобу тварини, наприклад, людини, причому розлад або хвороба відповідають на активність нейротрофічного засобу. Таке лікування і способи описані більш детально нижче. Фармацевтичні композиції, що включають неубластин-полімерні кон'югати Крім того, передбачена фармацевтична композиція, що включає димер модифікованого поліпептиду неубластину за даним винаходом. Полімер-неубластинові кон'югати за винаходом можуть бути введені у чистому вигляді, а також у формі фармацевтично прийнятних складних ефірів, солей та інших їх фізіологічно функціональних похідних. У таких фармацевтичних і медикаментозних композиціях полімер-кон'югований кон'югат неубластину переважно використовувати разом з одним або декількома фармацевтично прийнятним(и) носієм(ями) і, за вибором, з будьякими іншими лікувальними інгредієнтами. Носій(ї) повинен(ні) бути фармацевтично прийнятним(ими) у значенні сумісності з іншими компонентами лікарської композиції і не бути надмірно шкідливим(и) для реципієнта. Полімеркон'югований неубластин передбачений у кількості, ефективній, щоб досягти бажаного фармакологічного впливу або вигідного медичного впливу, як описано тут, і у кількості, відповідній, щоб досягти бажаної біодоступної in vivo дози або концентрації. Композиції включають препарати, придатні для парентерального, а також для не парентерального введення і специфічних способів введення, включаючи оральне, ректальне, букальне, місцеве, назальне, очне, підшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньовенне, черезшкірне, інтратекальне, внутрішньосуглобове, внутрішньоартеріальне, субарахноїдальне, бронхіальне, лімфатичне, вагінальне і внутрішньоматкове введення. Переважні лікарські препарати, придатні для аерозольного і парентерального введення, як місцевого, так і системного. 39 Коли полімер-кон'югований неубластин використовується у композиції, що включає рідкий розчин, препарат може бути вигідно вводити орально, через бронхи або парентерально. Коли полімеркон'югований неубластин використовується у формі рідкої суспензії або у вигляді порошку у біологічно сумісному носії, лікарський препарат може бути вигідно вводити орально, ректально або через бронхи. Альтернативно, він може бути введений через ніс або бронхи, шляхом розпилення порошку у газі-носії, щоб утворити газоподібне розсіювання порошку, який вдихується пацієнтом з дихального контуру, що включає відповідний розпилювальний пристрій. Лікарські композиції, що включають білки за даним винаходом, можуть бути зручно представлені у стандартних дозованих формах і можуть бути приготовані будь-яким зі способів, відомих у фармації. Такі способи звичайно включають стадію введення активних інгредієнтів у зв'язок з носієм, який складає один або декілька додаткових компонентів. У типовому випадку композиції готуються шляхом однакового і тісного приведення активного(их) компонента(ів) у зв'язок з рідким носієм, тонкоподрібненим твердим носієм або обома, а потім, якщо необхідно, формування продукту у дозованих формах бажаного препарату. Композиції за даним винаходом, придатні для орального введення, можуть бути представлені у вигляді дискретних одиниць, таких як капсули, облатки, таблетки або коржики, кожна з яких включає в себе заздалегідь визначену кількість активного компонента у вигляді порошку або гранул; або суспензії у водній рідині або неводній рідині, такій як сироп, еліксир, емульсія або доза рідких ліків. Композиції, придатні для парентерального введення, зручно включають стерильний рідкий препарат активного кон'югату, який переважно ізотонічний з кров'ю реципієнта (наприклад, фізіологічний сольовий розчин). Такі композиції можуть включати суспендуючі речовини і загусники або інші системи мікрочастинок, які призначені для націлювання сполуки на компоненти крові або один або декілька органів. Композиції можуть бути представлені у формі з разовою дозою або багатьма дозами. Композиції у вигляді назальних спреїв включають очищені водні розчини активного кон'югату з речовинами, що консервують, та ізотонічними речовинами. Такі композиції переважно приводити до рН та ізотонічного стану, сумісних зі слизовими оболонками носа. Композиції для ректального введення можуть бути представлені у вигляді супозиторію з відповідним носієм, таким як олія какао, гідрогенізовані жири або гідрогенізована жирна карбонова кислота. Лікарські форми для очей, такі як краплі для очей, готуються за подібною методикою з назальними спреями, за винятком того, що рН та ізотонічні фактори переважно пристосовуються, щоб відповідати таким ока. Композиції для місцевого застосування містять кон'югат за винаходом, розчинений або суспендо 91178 40 ваний в одному або декількох середовищах, таких як мінеральне масло, вазелін, багатоатомні спирти або інші основи, що використовуються у фармацевтичних композиціях для місцевого застосування. На додаток до зазначених вище інгредієнтів, композиції за даним винаходом можуть додатково включати один або декілька додаткових інгредієнтів, вибраних з розчинників, буферів, ароматизаторів, засобів, що викликають дезінтеграцію, поверхнево-активних речовин, загусників, мастил, консервантів (включаючи антиоксиданти) і т.п. Попередні міркування застосовуються також до злитих білків неубластину за винаходом (наприклад, злитих білків неубластину сироваткового альбуміну). Відповідно, даний винахід відноситься до забезпечення відповідними злитими білками для стабілізації in vitro кон'югату полімер-кон'югованого неубластину у розчині, як переважне ілюстративне застосування винаходу. Злиті білки можуть використовуватися, наприклад, щоб збільшити стійкість до ферментативної деградації полімеркон'югованого поліпептиду неубластину, і надають засіб поліпшення терміну придатності, стабільності при кімнатній температурі і т.п. Зрозуміло, що попередні міркування застосовуються також до злитих білків неубластину-сироваткового альбуміну (включаючи злиті білки людського неубластинулюдського сироваткового альбуміну) за винаходом. Способи лікування Композиції за винаходом можуть використовуватися для лікування або полегшення розладу або хвороби у ссавця, наприклад примата, включаючи людину, якщо розлад або хвороба реагує на дію нейротрофічних засобів. Композиції за винаходом можуть використовуватися безпосередньо через, наприклад, ін'єктовані, імплантовані або прийняті всередину фармацевтичні композиції, щоб лікувати патологічний процес, що реагує на поліпептиди неубластину. Композиції можуть використовуватися для полегшення розладу або хвороби живого організму тварини, включаючи людину, якщо розлад або хвороба реагують на дію нейротрофічних засобів. Розлад або хвороба можуть, зокрема, бути ушкодженням нервової системи, викликаним травмою, операцією, ішемією, інфекцією, порушеннями обміну речовин, нестачею харчування, злоякісною пухлиною або токсичними речовинами і спадковими або ідіопатичними процесами. Ушкодження може, зокрема, виникати у сенсорних нейронах або гангліозних клітинах сітківки, включаючи нейрони у гангліях задніх корінців або у будь-якій з наступних тканин: колінчастому, кам'янистому і вузлуватому гангліях; вестибулярнослуховому комплексі восьмого черепного нерва; вентролатеральному полюсі верхньонижньощелепної частки ганглію трійчастого нерва; і середньомозковому ядрі трійчастого нерва. У деяких варіантах здійснення способу за винаходом хвороба або розлад є нейродегенеративною хворобою, що залучає уражені і травмовані нейрони, такою як травматичні ушкодження периферичних нервів, мозку і/або спинного мозку, це 41 ребральне ішемічне ушкодження нейронів, нейропатія і особливо периферична нейропатія, травма або ушкодження периферичного нерва, ішемічний інсульт, гостре ушкодження мозку, гостре ушкодження спинного мозку, пухлини нервової системи, множинний склероз, вплив нейротоксинів, порушення обміну речовин, такі як діабет або порушення функції нирок, і ушкодження, викликані збудниками інфекцій, нейродегенеративними захворюваннями, включаючи хворобу Альцгеймера, хворобу Гентінгтона, хворобу Паркінсона, паркінсонізм-плюс синдроми, прогресуючий над'ядерний параліч (синдром Стіла-РічардсонаОльшевського), оливопонтоцеребелярну атрофію (ОРСА), синдром Шая-Дрейджера (атрофію множини систем), гуамський комплекс паркінсонізмудеменції, бічний аміотрофічний склероз або будьяке інше природжене або нейродегенеративне захворювання і погіршення пам'яті, пов'язане з деменцією. У деяких варіантах здійснення можна лікувати сенсорні нейрони і/або нейрони вегетативної системи, зокрема, можна лікувати ноцицептивні і механорецептивні нейрони, більш конкретно, нейрони волокна Α-дельта, С-волокна і Α-бета волокна. Крім того, можна лікувати симпатичні і парасимпатичні нейрони вегетативної системи. У деяких варіантах здійснення можна лікувати хвороби моторного нейрона, такі як бічний аміотрофічний склероз ("БАС") і спінальна м'язова атрофія. В інших варіантах здійснення молекули неубластину за даним винаходом можуть використовуватися, щоб поліпшити відновлення нерва після травматичного ушкодження. Альтернативно або на додаток, канал направлення нерва з матриксом, що містить полімер-кон'юговані поліпептиди неубластину або злиття, або кон'югати мутантних поліпептидів неубластину, може використовуватися у способах, описаних тут. Такі канали направлення нерва розкриті, наприклад, у патенті США № 5834029. У деяких варіантах здійснення композиції, розкриті тут (і фармацевтичні композиції, що включають те ж саме), використовуються при лікуванні периферичних нейропатій. Серед периферичних нейропатій, включених для лікування молекулами за даним винаходом, знаходяться викликані травмою нейропатії, наприклад, викликані фізичним ушкодженням або хворобливим станом, фізичним ушкодженням головного мозку, фізичним ушкодженням спинного мозку, інсультом, пов'язаним з ушкодженням мозку, і неврологічними розладами, пов'язаними з нейродегенерацією. Також включені сюди нейропатії, вторинні по відношенню до інфекції, впливу токсину і впливу лікарського засобу. Додатково сюди включені нейропатії, вторинні по відношенню до системного захворювання або порушення обміну речовин. Наприклад, розкриті тут композиції також можуть використовуватися для лікування нейропатій, викликаних хіміотерапією (таких як викликані введенням хіміотерапевтичних засобів, наприклад, таксолу або цисплатину); токсичних нейропатій, лікарських нейропатій, нейропатій, викликаних вітамінною недостатністю; ідіопатичних нейропатій; діабетичних нейропатій; і 91178 42 постгерпетичної невралгії. Див., наприклад, патенти США 5496804 і 5916555. Додатковими станами, які можна лікувати відповідно до винаходу, є мононейропатії, множинні мононейропатії і полінейропатії, включаючи аксональні нейропатії та нейропатії, що демієлінізують. У деяких варіантах здійснення композиції за винаходом (і фармацевтичні композиції, що включають те ж саме) використовуються при лікуванні різних захворювань очей, включаючи втрату фоторецепторів сітківки у хворих, уражених дегенерацією жовтої плями, пігментним ретинітом, глаукомою і подібними захворюваннями. Способи і фармацевтичні композиції Даний винахід відноситься до способів лікування нейропатичного болю, лікування тактильної алодинії і зменшення втрати больової чутливості, пов'язаної з нейропатією. Дані способи використовують димери полімер-кон'югованого поліпептиду неубластину, включаючи димери, що містять біоактивні поліпептиди неубластину повної довжини або біоактивні усічені поліпептиди неубластину. Крім того, винахід відноситься до фармацевтичних композицій, що включають димер полімеркон'югованого поліпептиду неубластину, суспендований, розчинений або диспергований у фармацевтично прийнятному носії. 1. Лікування нейропатичного болю В одному варіанті здійснення винахід відноситься до способу лікування нейропатичного болю у суб'єкта, що передбачає введення суб'єкту ефективної кількості полімер-кон'югованого димеру поліпептиду неубластину. У деяких варіантах здійснення винахід відноситься до способу лікування нейропатичного болю у суб'єкта, що передбачає введення суб'єкту фармацевтично ефективної кількості або тільки полімер-кон'югованого димеру поліпептиду неубластину, що включає, наприклад, поліпептиди неубластину дикого типу, усічені або мутантні, у тому числі, наприклад, будь-який з SEQ ID NO:1, 2, 6-21 і 36 або його мутантну форму, або введення суб'єкту також ефективної кількості сполуки, що індукує анальгезію, вибраної з групи, що складається з опіоїдів, протиаритмічних засобів, місцеводіючих анальгетиків, місцевих анестетиків, протисудомних засобів, антидепресантів, кортикостероїдів і нестероїдних протизапальних засобів (НПЗЗ). У переважному варіанті здійснення сполука, що індукує анальгезію, є протисудомним засобом. В іншому переважному варіанті здійснення сполука, що індукує анальгезію, є габапентином ((іамінометил)циклогексаноцтовою кислотою) або прегабаліном (S-(+)-4-аміно-3-(2метилпропіл)бутановою кислотою). Поліпептиди неубластину і нуклеїнові кислоти за даним винаходом (і фармацевтичні композиції, що містять полімер-кон'юговані димери поліпептиду неубластину, описані тут) використовуються при лікуванні болю, пов'язаного з периферичними нейропатіями. Серед периферичних нейропатій, які можна лікувати відповідно до даного винаходу, знаходяться викликані травмою нейропатії, наприклад, викликані фізичним ушкодженням або хворобливим станом, фізичним ушкодженням голов 43 ного мозку, фізичним ушкодженням спинного мозку, інсультом, пов'язаним з ушкодженням мозку, і неврологічними розладами, пов'язаними з нейродегенерацією. Винахід також передбачає лікування нейропатій, викликаних хіміотерапією (таких як викликані введенням хіміотерапевтичних засобів, наприклад, таксолу або цисплатину); токсичних нейропатій, лікарських нейропатій, нейропатій, викликаних патогенами (наприклад, викликаних вірусом), нейропатій, викликаних вітамінною недостатністю; ідіопатичних нейропатій; і діабетичних нейропатій. Див., наприклад, патенти США № 5496804 і 5916555, кожний включений сюди шляхом посилання. Більш того, винахід може використовуватися для лікування мононейропатій, множинних мононейропатій і полінейропатій, включаючи аксональні нейропатії та нейропатії, що демієлінізують, з використанням нуклеотидів і поліпептидів неубластину за даним винаходом. Нейропатичний біль може бути пов'язаний з множиною периферичних нейропатій, включаючи: (а) викликані травмою нейропатії, (b) викликані хіміотерапією нейропатії, (с) токсичні нейропатії (включаючи, але не обмежуючись ними, нейропатії, викликані алкоголізмом, інтоксикацією вітаміном В6, гексакарбоновою інтоксикацією, аміодароном, хлорамфеніколом, дисульфірамом, ізоніазидом, золотом, літієм, метронідазолом, мізонідазолом, нітрофурантоїном), (d) викликані лікарським засобом нейропатії, включаючи викликаний лікарським препаратом нейропатичний біль (такий як викликаний протипухлинними засобами, особливо протипухлинними засобами, вибраними з групи, що складається з таксолу, таксотеру, цисплатину, нокодазолу, вінкристину, віндезину і вінбластину; і такий як викликаний противірусними засобами, особливо противірусними засобами, вибраними з групи, що складається з ddl, DDC, d4T, фоскарнету, дапсону, метронідазолу та ізоніазиду), (e) нейропатії, викликані вітамінною недостатністю (включаючи, але не обмежуючись ними, недостатність вітаміну В12, недостатність вітаміну В6 і недостатність вітаміну Е), (f) ідіопатичні нейропатії, (g) діабетичні нейропатії, (h) ушкодження нерва, викликане патогеном, (і) ушкодження нерва, викликане запаленням, (j) нейродегенерацію, (к) спадкову нейропатію (включаючи, але не обмежуючись ними, атаксію Фрідрейха, сімейну амілоїдну нейропатію, танджирську хворобу, хворобу Фабрі), (1) метаболічні розлади (включаючи, але не обмежуючись ними, ниркову недостатність і гіпотиреоз), (m) інфекційні і вірусні нейропатії (включаючи, але не обмежуючись ними, нейропатичний біль, пов'язаний з проказою, лаймську хворобу, нейропатичний біль, пов'язаний з інфекцією, викликаною вірусом, особливо вірусом, вибраним з групи, що складається з вірусу герпесу (наприклад, оперізувальний герпес, який може вести до постгерпетичної невралгії), вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) і вірусу папіломи), (n) аутоімунні нейропатії (включаючи, але не обмежуючись ними, синдром Гійєна-Барре, хронічну запальну полінейропатію, що демієлінізує, моноклональну гаммапатію невизначеного значення і полінейропатію), (о) 91178 44 невралгію трійчастого нерва і тунельні синдроми (включаючи, але не обмежуючись ним, зап'ястний канал) і (р) інші синдроми нейропатичного болю, включаючи посттравматичну невралгію, фантомний біль у кінцівці, біль при множинному склерозі, складні регіональні больові синдроми (включаючи, але не обмежуючись ними, симпатичну рефлекторну дистрофію, каузальгію), біль, пов'язаний з пухлиною, васкулітну/ангіопатичну нейропатію та ішіалгію. Нейропатичний біль може виявлятися як алодинія, гіперальгезія, спонтанний біль або фантомний біль. 2. Лікування тактильної алодинії Термін «тактильна алодинія» звичайно відноситься до стану у суб'єкта, у якого біль викликаний стимулюванням шкіри (наприклад, дотиком), у нормі нешкідливим. Даний винахід відноситься до способу лікування тактильної алодинії у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення тактильна алодинія лікується введенням суб'єкту фармацевтично ефективної кількості тільки полімеркон'югованого димеру мутантного поліпептиду неубластину. У пов'язаному варіанті здійснення винахід відноситься до способу лікування тактильної алодинії у суб'єкта або за допомогою введення суб'єкту ефективної кількості тільки полімер-кон'югованого димеру поліпептиду неубластину, що містить усічені поліпептиди дикого типу або мутантні поліпептиди неубластину, включаючи, наприклад, щонайменше один з SEQ ID NO:1, 2, 6-21 і 36 або його мутантну форму; або за допомогою введення суб'єкту ефективної кількості поліпептиду неубластину з ефективною кількістю сполуки, що індукує анальгезію, вибраної з групи, що складається з опіоїдів, протиаритмічних засобів, місцеводіючих анальгетиків, місцевих анестетиків, протисудомних засобів, антидепресантів, кортикостероїдів і нестероїдних протизапальних засобів (НПЗЗ). У переважному варіанті здійснення сполука, що індукує анальгезію, є протисудомним засобом. В іншому переважному варіанті здійснення сполука, що індукує анальгезію, є габапентином ((іамінометил)циклогексаноцтовою кислотою) або прегабаліном (S-(+)-4-аміно-3-(2метилпропіл)бутановою кислотою). У деяких варіантах здійснення полімеркон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться у поєднанні з лікувальним засобом, включаючи, але не обмежуючись ними, протипухлинний засіб або противірусний засіб. Протипухлинні засоби включають, але не обмежуються ними, таксол, таксотер, цисплатин, нокодазол, вінкристин, віндезин і вінбластин. Противірусні засоби включають, але не обмежуються ними, ddl, DDC, d4T, фоскарнет, дапсон, метронідазол та ізоніазид. 3. Лікування для зменшення втрати больової чутливості В іншому варіанті здійснення винахід відноситься до способу зменшення втрати больової чутливості у суб'єкта, ураженого нейропатією. У переважному варіанті здійснення нейропатія є діабетичною нейропатією. У переважному варіанті здійснення втрата больової чутливості є втратою 45 теплової больової чутливості. Даний винахід розглядає як профілактичне, так і терапевтичне лікування. При профілактичному лікуванні полімеркон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться суб'єкту з підвищеним ризиком розвитку втрати больової чутливості; слід чекати, що такі суб'єкти будуть суб'єктами з ранньою стадією нейропатії. Лікування неубластином у таких обставинах служило б для превентивного лікування пацієнтів з підвищеним ризиком. При терапевтичному лікуванні полімеркон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться суб'єкту, який відчув втрату больової чутливості внаслідок ураження нейропатією; слід чекати, що такі суб'єкти будуть суб'єктами з пізньою стадією нейропатії. Лікування полімер-кон'югованим димером мутантного поліпептиду неубластину у таких обставинах служило б для того, щоб врятувати відповідну больову чутливість у суб'єкта. 4. Лікування вірусних інфекцій і вірусних нейропатій Профілактичне лікування інфекційних і вірусних нейропатій розглянуто. Профілактичне лікування показане після визначення вірусної інфекції і перед появою нейропатичного болю. Під час лікування полімеркон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться, щоб запобігти появі нейропатичного болю, включаючи, але не обмежуючись ними, нейропатичний біль, пов'язаний з проказою, лаймську хворобу, нейропатичний біль, пов'язаний з інфекцією, викликаною вірусом, особливо вірусом, вибраним з групи, що складається з вірусу герпесу (більш конкретно, оперізувального герпесу, який може вести до постгерпетичної невралгії), вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) і вірусу папіломи. В альтернативному варіанті здійснення полімер-кон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться, щоб зменшити тяжкість нейропатичного болю, якщо б він з'явився. Симптоми гострої вірусної інфекції часто включають появу висипу. Інші симптоми включають, наприклад, розвиток постійного болю в ураженій області тіла, який є звичайним ускладненням інфекції оперізувального герпесу (оперізувального лишаю). Постгерпетична невралгія може тривати протягом місяця або більше і може з'явитися через декілька місяців після того, як будь-які подібні до висипу симптоми зникли. 5. Лікування хворобливої діабетичної нейропатії Профілактичне лікування хворобливої діабетичної нейропатії розглянуто. Профілактичне лікування діабетичних нейропатій слід починати після визначення початкового діагнозу діабету або пов'язаних з діабетом симптомів і перед початком нейропатичного болю. Профілактичне лікування хворобливої діабетичної нейропатії може також початися після визначення того, що у суб'єкта підвищений ризик розвитку діабету або пов'язаних з діабетом симптомів. Протягом лікування полімеркон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться, щоб запобігти появі нейропатичного болю. В альтернативному варіанті здійс 91178 46 нення полімер-кон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину вводиться, щоб зменшити тяжкість нейропатичного болю, який вже з'явився. 6. Захворювання нервової системи У наступному аспекті винахід відноситься до способу лікування або запобігання захворюванню нервової системи у суб'єкта (такого як людина) шляхом введення суб'єкту, який потребує цього, терапевтично ефективної кількості полімеркон'югованого поліпептиду неубластину, композиції, що містить поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину, пов'язаний з полімером, або комплекс, який включає в себе стабільний водорозчинний кон'югований поліпептид неубластину, або комплекс мутантного поліпептиду неубластину, що включає поліпептид неубластину або мутантний поліпептид неубластину, пов'язаний з поліалкіленовим залишком, таким як, наприклад, ПЕГ. Захворювання нервової системи може бути захворюванням периферичної нервової системи, таким як периферична нейропатія або синдром нейропатичного болю. Люди є переважними суб'єктами лікування. Полімер-кон'югований димер поліпептиду неубластину за винаходом придатний для лікування дефекту нейрона, включаючи без обмеження уражені нейрони і травмовані нейрони. Периферичні нерви, які зазнали травми, включають, але не обмежуються ними, нерви мозку або спинного мозку. Винахідницькі полімер-кон'юговані димери поліпептиду неубластину придатні для лікування нейродегенеративного захворювання, наприклад, церебрального ішемічного ушкодження нейронів; нейропатії, наприклад, периферичної нейропатії, хвороби Альцгеймера, хвороби Гентінгтона, хвороби Паркінсона, бічного аміотрофічного склерозу (БАС). Такі димери поліпептиду неубластину можуть використовуватися при лікуванні погіршення пам'яті, пов'язаного з деменцією. Додаткові приклади станів або захворювань включають захворювання периферичної нервової системи, мозку або спинного мозку, так само як травматичні нейропатії, викликані хіміотерапією нейропатії, токсичні нейропатії, лікарські нейропатії, викликані вітамінною недостатністю нейропатії; ідіопатичні нейропатії; і діабетичні нейропатії, нейропатичний біль, пов'язаний з токсичним ушкодженням нерва, ушкодженням нерва, викликаним патогеном, ушкодженням нерва, викликаним запаленням або нейродегенерацією. Винахідницький димер поліпептиду неубластину додатково придатний для лікування нейропатичного болю, для лікування тактильної алодинії і для зменшення втрати больової чутливості, пов'язаної з нейропатією. 7. Дозування Зазначені вище способи розглядають введення суб'єкту, переважно системне, композиції, що містить димер полімер-кон'югованого мутантного поліпептиду неубластину, який може бути або не бути усіченим, у дозуванні від 0,01 мкг/кг до 1000 мкг/кг маси тіла суб'єкта на дозу. Переважне дозування від 1 мкг/кг до 100 мкг/кг маси тіла суб'єкта 47 на дозу. Більш переважне дозування від 1 мкг/кг до 30 мкг/кг маси тіла суб'єкта на дозу, наприклад, від 3 мкг/кг до 10 мкг/кг маси тіла суб'єкта на дозу. Терапевтично ефективні кількості композиції за винаходом можуть вводитися суб'єкту, який потребує цього, у режимі дозування, який може бути уточнений фахівцем у відповідній галузі без недоречного експериментування. 8. Введення Поліпептидний димер, що використовується у зазначених вище способах, може вводитися за допомогою будь-якої придатної системи введення і переважно з групи, що складається з внутрішньовенного введення, внутрішньом'язового введення, внутрішньолегеневого введення, підшкірного введення і внутрішньочеревинного введення, найбільш переважне внутрішньом'язове введення, внутрішньовенне введення або підшкірне введення. Поліпептид неубластину, що використовується у зазначених вище способах, може також вводитися інтратекально. Введення полімер-кон'югованого димеру поліпептиду неубластину може бути, наприклад, системним або місцевим. Композиції включають такі, придатні для парентерального, так само як для не парентерального введення, а конкретні способи введення включають оральне, ректальне, букальне, місцеве, назальне, очне, підшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньовенне, трансдермальне, інтратекальне, внутрішньосуглобове, внутрішньоартеріальне, субарахноїдальне, бронхіальне, лімфатичне, вагінальне і внутрішньоматкове введення. Включені композиції, придатні для аерозольного і парентерального введення, як місцевого, так і системного. Переважними композиціями є придатні для підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення. 9. Режими У деяких варіантах здійснення частота дозування поліпептидного димеру за винаходом забезпечує введення суб'єкту композиції три рази на тиждень протягом двох тижнів. Щоб оптимізувати терапевтичну ефективність, полімер-кон'югований димер мутантного поліпептиду неубластину спочатку вводиться у різних режимах дозування. Разова доза і режим залежать від факторів, які включають, наприклад, вид імунізованого ссавця, його імунний статус, масу тіла ссавця. Як правило, вміст білка у тканині контролюється з використанням відповідних скринінгових проб як частина процедури клінічного випробування, наприклад, щоб визначити ефективність даного режиму лікування. Частота дозування для полімер-кон'югованого димеру мутантного поліпептиду неубластину за даним винаходом знаходиться у межах досвіду і клінічної думки лікарів. Як правило, режим введення встановлюється клінічними випробуваннями, які можуть встановити оптимальні параметри введення. Однак практикуючий лікар може змінювати такі режими введення відповідно до віку, здоров'я, ваги, статі і медичного статусу суб'єкта. Частота дозування також може відрізнятися при 91178 48 гострому і хронічному лікуванні нейропатії. Крім того, частота дозування може відрізнятися в залежності від того, чи є лікування профілактичним або терапевтичним. Винахід далі ілюструється наступними необмежувальними прикладами. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Біодоступність неубластину з кон'югованим з ПЕГ N-кінцем Було зазначено, що одержані з клітин СНО і Е. соlі рекомбінантні неубластини швидко видаляються з кровотоку, якщо їх вводять внутрішньовенно щурам. Білки були нижче порогу виявлення у сироватці після підшкірного введення. Щоб збільшити біодоступність неубластину, були створені кон'юговані з ПЕГ форми мутантного неубластину. Оскільки у послідовності неубластину немає лізину, хімізми специфічної кон'югації з ПЕГ амінів приведуть до кон'югації з ПЕГ поліпептиду неубластину дикого типу в області N-кінця. Таким чином, до кожного димеру неубластину повинні прикріпитися два залишки ПЕГ. Відповідно, форми ПЕГ були спочатку безпосередньо направлені на N-кінець з використанням специфічних для амінів реакцій. Дивно, кон'югація з ПЕГ неубластину дикого типу, що експресується Е. соlі , навіть з прикріпленням двох 20 кДа залишків ПЕГ, дещо поліпшила час напівжиття, вказуючи на те, що механізм, який базується на шляху виведення, подолав збільшення часу напівжиття, яке, як очікувалося, буде досягнуто кон'югацією з ПЕГ. Приклад 2: Створення кон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину (Ν95Κ) Наступною досліджували біодоступність форм мутантного неубластину, кон'югованих з ПЕГ в області внутрішніх амінокислотних залишків. Ряд з чотирьох мутантів із замінами залишків, що зустрічаються у природі, у положеннях 14, 39, 68 і 95, якщо їх пронумерувати, як показано у SEQ ID NO:1, був розроблений, щоб вставити лізини у вибрані ділянки послідовності. Ці лізини створили б альтернативні ділянки для прикріплення ПЕГ. Дані ділянки були вибрані з використанням кристалічної структури GDNF (Nat. Struct. Biol. 4: 4358,1997) як основи, щоб виявити поверхневі залишки. Дослідження мутагенезу химери персефін/неубластин (J. Biol. Chem. 275: 3412-20, 2000) було використано, щоб виявити функціонально важливі області структури, яких треба уникати. Щоб експресувати ген неубластину дикого типу в Е. соlі, були створені сингени з нижчим вмістом GC і переважними Е. соlі кодонами. Синген був клонований у двох векторах, рЕТ19b і pMJB164, похідного від рЕТ19b. У рЕТ19b послідовність, що кодує зрілу область неубластину (NBN113), пов'язана безпосередньо з ініціюючим метіоніном. У pMJB164 зріла область неубластину пов'язана з гістидиновим тегом (наприклад, 10 гістидинів) і відділена від гістидинового вільного кінця ділянкою, що розщеплюється ентерокіназою (SEQ ID NO:35 і 36). Ініціюючий метіонін передує гістидиновому тегу. 49 Дві з мутацій (R39 і R68) служили цілями в області, яка, відповідно до розподілу позитивних зарядів на поверхні, могла представляти ділянку зв'язування гепарину. Ця ділянка, ймовірно, відповідає за швидке виведення білка. Третя ділянка служила ціллю в N95, природна ділянка глікозилювання у неубластині дикого типу. У природних умовах дана ділянка модифікується складною вуглеводневою структурою. Тому очікувалося, що модифікація за допомогою ПЕГ на цій ділянці не буде впливати на функцію. Четверта ділянка (R14) була вибрана в області, яка не зачіпалася жодною з модифікацій. Мутант, в якому залишок аспарагіну у положенні 95 був замінений лізином («N95K мутант»), був вибраний для досліджень, розкритих тут. Були одержані чотири різних мутантних щурячих неубластини, що включають одну або більшу кількість змін у послідовності поліпептиду щурячо 91178 50 го неубластину дикого типу. Дані мутантні неубластини містили заміни єдиної амінокислоти: R14K; R68K; R39K або N95K. У таблиці 1А ці ілюстративні точкові мутації виділені напівжирним шрифтом. В "X1N1X2" номенклатурі, X1 відноситься до амінокислоти поліпептиду неубластину дикого типу, Ν1 відноситься до числового положення амінокислоти Х1 у послідовності, пронумерованій відповідно до SEQ ID NO:1, і Х2 відноситься до амінокислоти, що заміщає амінокислоту дикого типу у вказаному числовому положенні N1. Щоб створити мутацію щурячого N95K неубластину, був виконаний сайт-направлений мутагенез на рСМВ020, плазміді, що кодує щурячий неубластин дикого типу. Послідовність нуклеотидів щурячого неубластину дикого типу і амінокислотна послідовність поліпептиду, що кодується таким чином, представлені нижче: 51 91178 52 Мутагенез рСМ020 з використанням олігонуклеотидів KD3-210 і KD3-211 привів до формування плазміди рСМВ027: У рСМВ027 кодон, що кодує аспарагін у положенні 95, був заміщений кодоном, що кодує лізин. Мутантний неубластин R14K був сформований шляхом заміни кодона, що кодує аргінін у положенні 14, на кодон, що кодує лізин у послідовно сті рСМВ020, що кодує неубластин. Сайтнаправлений мутагенез був виконаний на рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3254 і KD3-255: Результуючий конструкт одержав назву рСМВ029. Мутантний неубластин R68K був сформований шляхом заміни ко дона, що кодує аргінін у положенні 68, на кодон, що кодує лізин у послідовно сті рСМВ020, що кодує неубластин. Сайтнаправлений мутагенез був виконаний на рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3258 і KD3-259: Результуючий конструкт одержав назву рСМВ030. Мутантний неубластин R39K був сформований шляхом заміни аргініну у положенні 39 на лі зин у послідовності рСМВ020, що кодує неубластин. Сайт-направлений мутагенез був виконаний на рСМВ020 з використанням олігонуклеотидів KD3-256 і KD3-257: 53 Експресія і визначення параметрів мутантного неубластину в Е. соlі Для експресії і очищення плазміда, що кодує поліпептид щурячого неубластину N95K, була експресована в Е. соlїі у вигляді злитого білка, забезпеченого His-тегом, з ділянкою, що розщеплюється ентерокіназою, яка впритул прилягає до початку послідовності зрілого неубластину зі 113 амінокислот. Е. соlі вирощували у 500-літровому ферментері і готували заморожену клітинну пасту. Клітини Е. соlі лізували в APV Gaulin Press і щурячий неубластин N95K виділяли з нерозчинної відмитої кульової фракції. Мутантний неубластин N95K діставали з кулі гідрохлоридом гуанідину, піддавали рефолдингу і His-тег видаляли ентерокіназою (див. приклад 5). Продукт потім піддавали хроматографії на Ni-NTA агарозі (Qiagen) і на катіонообмінній смолі Bakerbond WP СВХ. Обробка ентерокіназою продукту, що містить His-тег, привела до аберантного розщеплення білка по аргініну 7 у зрілій послідовності. Результуючий дез 1-7 продукт неубластину (NBN106N95K) був повністю активним в KIRA ELISA і структурно не відрізнявся від зрілої форми за своєю сприйнятливістю до індукованої гуанідином денатурації і тому використовувався для подальшої роботи. Щурячий мутантний неубластин NBN106-N95K кон'югували з ПЕГ в середньому залишками 3,3 ПЕГ на молекулу неубластину з використанням як реагенту метоксилполі(етиленгліколь)сукцинімідилпропіонату (SPA-PEG) з молекулярною масою 10000 Да. Одержаний у результаті кон'югований з ПЕГ продукт піддавали широкому визначенню параметрів, включаючи аналіз за допомогою SDS-PAGE, ексклюзійну хроматографію з виключенням за розміром молекули (SEC), ВЕРХ з оберненою фазою, матриксну мас-спектрометрію з лазерною десорбцією та іонізацією проби (МАLD/IМS), картування пептиду, оцінку активності в KIRA ELISA і визначення вмісту ендотоксину. Чистота продукту неубластину N95K до кон'югації з ПЕГ, виміряна шляхом SDS-PAGE і SEC, була більше 95%. Продукт неубластину N95K мігрував при невідновних умовах як димер, що узгоджувалося з його передбаченою структурою. Після кон'югації з ПЕГ кінцевий продукт складався з ряду модифікованих продуктів приєднання, включаючи 2 ПЕГ на молекулу, який становив 5% продукту, З ПЕГ на молекулу, який становив 60% продукту, 4 ПЕГ на молекулу, який становив 30% продукту, і декількох неосновних форм з більш високою масою. У кон'югованій з ПЕГ пробі не було ніяких ознак агрегатів. Залишкові рівні немодифікованого неубластину у продукті були нижче меж кількісного аналізу. Вміст ендотоксину у матеріалі звичайно був меншим, ніж 1 EU/мг. Специфічна активність кон'югованого з ПЕГ неубластину в KIRA ELISA 91178 54 становила 10 нМ. З кон'югованого з ПЕГ продукту був приготований препарат на PBS рН 6,5 з концентрацією 1,1 мг/мл. Матеріал, подібний за активністю до неубластину дикого типу (NBN113), може постачатися у вигляді замороженої рідини, яка зберігається при -70°С. Мутантні поліпептиди неубластину R14K, R39K і R68K були експресовані в Е. соlі і можуть бути піддані тим же методам очищення, кон'югації з ПЕГ і оцінки функції, які описані вище для неубластину NBN106-N95K. Одержання мутантного кон'югованого з ПЕГ неубластину NBN106-N95K 230 мл підданого рефолдингу щурячого мутантного неубластину N95K (2,6 мг/мл), який був продукований Е. соlі і зберігався при 4°С в 5 мМ фосфаті натрію з рН 6,5, 100 мМ NaCl, розчиняли у 77 мл води, 14,4 мл 1М HEPES з рН 7,5 і 2,8 г ПЕГ SPA з 10000 Да (кінцева 10 мг/мл) (Shearwater Polymers, Inc). Пробу інкубували при кімнатній температурі протягом 4 годин у темряві, потім обробляли 5 мМ імідазолом (кінцева), фільтрували і зберігали протягом ночі при 4°С. Було вироблено дві партії продукту, одна містила 130 мл об'єму N95K, і друга містила 100 мл об'єму. Кон'югований з ПЕГ неубластин очищали від реакційної суміші на Fractogel EMD SO3- (M) (EM Industries). Колонку запускали при кімнатній температурі. Всі буфери готували без пірогенів. Хлорид натрію додавали до реакційної суміші до кінцевої концентрації 87 мМ і пробу завантажували у 45 мл колонку (внутрішній діаметр 5 см) з Fractogel. Колонку промивали одним об'ємом колонки 5 мМ фосфатом натрію з рН 6,5, 80 мМ NaCl, потім трикратними одному об'єму колонки аліквотами 5 мМ фосфату натрію, що містять 50 мМ NaCl. Смолу переносили у колонку діаметром 2,5 см і кон'югований з ПЕГ неубластин елюювали з колонки за шість десятимілілітрових стадій, що містять 5 мМ фосфат натрію з рН 6,5, 400 мМ NaCl, три стадії, що містять 500 мМ NaCl і шість стадій, що містять 600 мМ NaCl. Фракції елюювання аналізували на вміст білка за спектральною поглинальною здатністю при 280 нм і потім за ступенем модифікації за допомогою SDS-PAGE. Вибрані фракції об'єднували, фільтрували через 0,2 мкм фільтр і розбавляли водою до 1,1 мг кон'югованого з ПЕГ щурячого неубластину на мл. Після оцінки рівнів ендотоксину в окремих партіях їх об'єднували і повторно фільтрували через 0,2 мкм мембрану. З кінцевого матеріалу відбирали аліквотні проби, які зберігали при -70°С. УФ-спектр очищеного мутантного кон'югованого з ПЕГ неубластину NBN106-N95K УФ-спектр (240-340 нм) кон'югованого з ПЕГ NBN N95K одержували на чистій пробі. Пробу аналізували тричі. Кон'югована з ПЕГ проба показала максимум спектральної поглинальної здатності при 275-277 нм і мінімум спектральної поглина 55 льної здатності при 247-249. Цей результат узгоджувався з тим, що спостерігалося в основній частині проміжної сполуки. Концентрацію білка кон'югованого з ПЕГ продукту оцінювали за спектром з 0,1% = використанням коефіцієнта екстинкції ΢280 0,50. Концентрація білка в основній частині кон'югованого з ПЕГ неубластину становила 1,1 мг/мл. Каламутність проби була відсутньою, що виявляється з відсутності поглинання при 320 нм. Визначення параметрів мутантного кон'югованого з ПЕГ неубластину ΝΒΝ106-Ν95Κ за допомогою SDS-PAGE Аліквоти кон'югованого з ПЕГ неубластину, що містять 3; 1,5; 0,75 і 0,3 мкг продукту, піддавали SDS-PAGE на 4-20% градієнтному гелі (Owl). Гель був забарвлений Кумасі діамантовим синім R-250. Паралельно були запущені маркери молекулярної маси (GIBGO-BRL). Аналіз за допомогою SDS-PAGE кон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину NBN106-N95K при невідновних умовах виявив ряд смуг, що відповідають модифікаціям з 2, 3, 4 і більше ніж 4 ПЕГ на молекулу. Найбільша смуга з уявною масою 98 кДа містить З ПЕГ на молекулу. В очищеному кон'югованому з ПЕГ продукті некон'югований з ПЕГ неубластин не був виявлений. Присутність суміші продуктів з 2, 3 і 4 прикріпленими ПЕГ була перевірена MALDI мас-спектрометричним аналізом. Співвідношення продукту, що містить 2, 3 і 4 ПЕГ, було визначене денситометрією і становило 7, 62 і 30% від загальної кількості, відповідно. Визначення параметрів мутантного кон'югованого з ПЕГ неубластину NBN106-N95K за допомогою ексклюзійної хроматографії з виключенням за розміром молекули Кон'югований з ПЕГ мутантний неубластин NBN106-N95K піддавали ексклюзійній хррматографії з виключенням за розміром молекули на аналітичній колонці Superose 6 HR10/30 FPLC, з використанням 5 мМ MES з рН 6,5, 300 мМ NaCl як рухомої фази. Колонку запускали зі швидкістю 20 мл/год. Фракції елюювання перевіряли на спектральну поглинальну здатність при 280 нм. Кон'югований з ПЕГ мутантний неубластин елюювався у вигляді єдиного піку з уявною молекулярною масою приблизно 200 кДа, що узгоджувалося з великим гідродинамічним об'ємом ПЕГ. Ніяких ознак агрегатів не спостерігалося. Вільний неубластин, який елююється з уявною молекулярною масою приблизно 30 кДа, у препараті виявлений не був. Аналіз мутантного кон'югованого з ПЕГ неубластину NBN106-N95K за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою Кон'югований з ПЕГ мутантний неубластин NBN106-N95K піддавали ВЕРХ з оберненою фазою на колонці Vydac С4 (5 мкм, 1 x 250 мм). Колонку елюювали з використанням 60 мм градієнта від 40 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФОК, буфер В: 75% ацетонітрилу/0,085% ТФОК). Потік, що виходить з колонки, перевіряли на спектральну погли 91178 56 нальну здатність при 214 нм і фракції збирали для подальшого аналізу. Кон'югований з ПЕГ ΝΒΝ106Ν95Κ фракціонували на його різні ди-(60,5 мм), три- (63,3 мм) і тетра- (67,8 мм) кон'юговані з ПЕГ компоненти за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою на колонці С4. Відносна інтенсивність піків свідчила про те, що співвідношення компонентів становить 5,4, 60,5 і 30,1%, відповідно. Пікові інтенсивності перевіряли за допомогою MALDI-MS. Не було ніяких ознак некон'югованого з ПЕГ ΝΒΝ106Ν95Κ (елюює при 5-15 мм) у продукті. Аналіз мутантного контрольованого з ПЕГ неубластину ΝΒΝ106-Ν95Κ за допомогою масспектрометрії Кон'югований з ПЕГ мутантний неубластин ΝΒΝ106-Ν95Κ був знесолений на С4 Zip Tip і проаналізований за допомогою мас-спектрометрії на Voyager-DE™ STR (PerSeptive Biosystems), матриксному час-пролітному мас-спектрометрі з лазерною десорбцією та іонізацією проби (MALDI-TOF) з використанням як матриксу синапінової кислоти. 0,5 мкл очищеного білка змішували з 0,5 мкл матриксу на мішені. Mac-спектрометрія кон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину NBN106-N95K виявила одно- і двохзаряджені форми трьох продуктів приєднання. Маси 43803 Да, 54046 Да і 64438 Да, що спостерігаються, узгоджуються з модифікаціями 2, 3 і 4 ПЕГ на молекулу. Аналіз мутантного кон'югованого з ПЕГ неубластину NBN106-N95K за допомогою пептидного картування Специфічність реакції кон'югації з ПЕГ оцінювали пептидним картуванням. Кон'югований з ПЕГ неубластин розділяли на ди-, три- і тетракон'юговані з ПЕГ компоненти, які потім відновлювали, алкілували і далі розділяли на їх одноланцюгові компоненти за допомогою ВЕРХ на колонці С4. Ці компоненти і відновлений та алкілований некон'югований з ПЕГ NBN106-N95K як контроль переварювали протеїназою Asp-N і кінцеві продукти розщеплення розділяли на фракції за допомогою ВЕРХ з оберненою фазою на колонці Vydac C18 (5 мкм, 1 x 250 мм) з використанням 60 мм градієнта від 0 до 60% В (буфер А: 0,1% ТФОК, буфер В: 75% ацетонітрилу/0,085% ТФОК). Потік, що виходить з колонки, перевіряли на спектральну поглинальну здатність при 214 нм. Послідовність щурячого неубластину містить п'ять внутрішніх аспарагінових кислот, і тому очікувалася, що після переварювання ендопротеїназою Asp-N він дасть простий профіль розщеплення. Всі піки від Asp-N гідролізату щурячого N95K ідентифікували за допомогою мас-спектрометрії і/або визначенням N-кінцевої послідовності за Едманом, і, таким чином, пептидна карта може використовуватися як простий інструмент для дослідження на ділянці модифікації по наявності або відсутності піку. Ідентичність різних піків підсумована нижче у Таблиці 7. 57 Оскільки неубластин у природі існує у вигляді гомодимеру, продукт щурячого мутантного неубластину NBN106-N95K містить чотири потенційних ділянки для кон'югації з ПЕГ, два N-кінцевих аміни від кожного з ланцюгів і дві N95K ділянки, які були створені у конструкті. У пептидній карті дикон'югованого з ПЕГ ланцюга тільки пік, який містить пептид з N95K мутацією, був змінений модифікацією ПЕГ. Жодний з інших піків не був порушений модифікацією ПЕГ. Дані картування тому вказують, що залишок ПЕГ специфічно приєднаний до цього пептиду, а не до будь-якого іншого з пептидів, які були піддані скринінгу· Друга потенційна ділянка прикріплення, N-кінець, знаходиться на пептиді, довжина якого становить лише три амінокислоти і який не виявлений на пептидній карті. Те, що додаткові прикріплення ПЕГ знаходяться на цій ділянці, виведено логічним шляхом. Узгоджуючись з цим представленням, невеликий процент щурячого мутантного неубластину Ν95Κ не усічений і містить зрілу Аlа-1 послідовність. Цей пептид елюює при 30 мкм і помітний у пептидній карті від некон'югованого з ПЕГ гідролізату, але відсутній у гідролізаті кон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину ΝΒΝ106-Ν95Κ. Приклад 3: Оцінка активності внутрішньо кон'югованого з ΠЕΓ мутантного неубластину NBN106N9SK в активації рецептора кінази (KIRA) ELISA Активність кон'югованого з ПЕГ мутантного щурячого неубластину вимірювали з використанням залежної від неубластину активацііУфосфорилування c-Ret як вісника активності неубластину в ELISA, яка була специфічною для присутності фосфорилованого RET. Клітини NB41 A3-mRL3 клітинна лінія адгезивної мишачої нейробластоми, яка експресує Ret і GFR 3 - поміщали по 2 x 105 клітин на ямку у 24-ямкові планшети з модифікованим за Дульбекко середовищем Ігла (DMEM), до них додавали 10% сироватку коров'ячих ембріонів і вирощували 18 год. при 37°С і 5% СО2. Клітини відмивали PBS і обробляли послідовним розведенням неубластину в 0,25 мл DMEM протягом 10 хвилин при 37°С і 5% СО2. Кожну пробу аналізували двічі. Клітини відмивали 1 мл PBS і лізували протягом 1 год. при 4°С 0,30 мл 10 91178 58 мМ трис НС1, рН 8,0, 0,5% Nonidet P40, 0,2% деоксихолату натрію, 50 мМ NaF, 0,1 мМ Na3VO4, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду при обережному похитуванні планшету. Лізати потім збовтували повторним набиранням у піпетку і 0,25 мл проби переносили у 96-ямковий планшет ELISA, який був покритий 5 мкг/мл антитілами до Ret mAb (AA.GE7.3) в 50 мМ карбонатному буфері, рН 9,6, при 4°С протягом 18 год., і блокували при кімнатній температурі протягом однієї години блоковим буфером (20 мМ Трис НС1, рН 7,5, 150 мМ МаСІ, 0,1% Твін-20 (TBST), що містить 1% нормальної сироватки миші і 3% бичачого сироваткового альбуміну). Після інкубації протягом 2 год. при кімнатній температурі, ямки 6-разово промивали ТВ ST. Фосфорилований Ret виявляли шляхом інкубації ямок при кімнатній температурі протягом 2 год. з 2 мкг/мл антитіл до фосфотирозину 4G10, кон'югованих з пероксидазою хрону (HRP) у блоковому буфері, 6-разового промивання TBST і вимірювання активності HRP при 450 нм з колориметричним реактивом виявлення. Показники спектральної поглинальної здатності ямки, обробленої лізатом або буфером лізису, вимірювали і фоновий коригувальний сигнал викреслювали як функцію концентрації неубластину, присутнього у суміші активації. Активність кон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину (3 (,4) x 10кДа ПЕГ ΝΒΝ106-Ν95Κ) у KIRA ELISA не відрізнялася від активності матеріалу дикого типу ΝΒΝ113 (таблиця 8). Не відмічалося ніякого впливу двох циклів заморожуваннявідтавання на активність, і після цієї обробки не було істотного збільшення каламутності проби, свідчачи про те, що проби можуть благополучно відтаюватися для вивчення. У незалежних дослідженнях, що оцінювали активність продукту з трьома і чотирма 10 кДа ПЕГ на молекулу окремо, було визначено, що продукт приєднання з трьома ПЕГ був повністю активний, у той час як продукт з чотирма ПЕГ мав знижену активність (таблиця 8). Ці дані демонструють, що 3 (,4) x 10 кДа ПЕГ ΝΒΝ106-Ν95Κ і 3 x 10 кДа ПЕГ ΝΒΝ106-Ν95Κ активують Ret в аналогічній мірі і з тією ж залежністю від дози, що і немутантний (дикого типу) неублас 59 тин, NBN113. Проте, хоча 4 x 10 кДа ПЕГ ΝΒΝ106Ν95Κ активує Ret в аналогічній мірі, як і немутантний (дикого типу) NBN113, 4 x 10 кДа ПЕГ NBN106N95K приблизно у 10 разів менш активний, ніж немутантний (дикого типу) NBN113, в активуванні Ret. Розраховані EC50 представлені у таблиці 8. Приклад 4: Фармакокінетичні дослідження внутрішньо кон'югованого з ПЕГ мутантного щурячого неубластину NBN106-N95K у щурів і мишей Були досліджені фармакокінетичні властивості різних кон'югованих з ПЕГ і некон'югованих з ПЕГ продуктів мутантного неубластину на моделях щурів і мишей (див. сумарні результати у таблиці 8). Дані показали, що кон'югація з ПЕГ щурячого мутантного неубластину NBN106-N95K з 3,3 10000 Да ПЕГ приводить до незначного впливу на час напівжиття і біодоступність неубластину. Після в/в введення щурам породи Sprague Dawley 1 мг/кг пікові рівні кон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину в 3000 нг/мл були зареєстровані через 7 хвилин, а рівні 700 нг/мл були зареєстровані через 24 год., 200 нг/мл через 48 год. і 100 нг/мл через 72 год. На відміну від цього, після в/в введення 1 мг/кг некон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину N95K, рівні 1500 нг/мл були зареєстровані через 7 хвилин, але потім рівні швидко знижувалися до 70 нг/мл через 3 год. і не визначалися після 7 год. Вплив кон'югації з ПЕГ був ще більш помітним у тварин, яких лікували підшкірним введенням кон'югованого з ПЕГ неубластину. Після п/ш введення 1 мг/кг циркулюючі рівні кон'югованого з ПЕГ неубластину досягали максимуму 200 нг/мл через 24 год. і залишалися на цьому рівні протягом триденного дослідження. Навпаки, кількостей неубластину, що виявляються, не спостерігалося у будь-який момент часу після введення некон'югованого з ПЕГ мутантного неубластину. Аналіз кон'югованих з ПЕГ N95K проб ускладнювався присутністю продуктів приєднання, що містять 2, 3 і 4 ПЕГ на молекулу, кожний з яких показував відмінний профіль РК. У ранніх дослідженнях РК використовувалися миші, щоб полегшити відбірні проби різноманітних кандидатів і шляхів введення. Дослідження на мишах показали різкі відмінності у біодоступності кандидатів. Однак, коли продукт приєднання 3,3 10 кДа ПЕГ випробовували на щурах, було виявлено, що він володіє меншою біодоступністю у щурів, ніж у мишей. Ця відмінність у біодоступності була особливо виразною після інтраперитонеального введення. Рівні у мишей досягали 1600 нг/мл через 7 годин і залишалися на 400 нг/мл через 24 години. Навпаки, рівні у щурів були постійними - 100 нг/мл протягом 4-48 годин. Два дивних і несподіваних результати виявили у дослідженнях РК, підсумованих у таблиці 8: 1) кон'югації з ПЕГ N-кінцевих амінокислот неглікозильованого неубластину недостатно, щоб істотно збільшити сироватковий вплив; і 2) кон'югації з ПЕГ N-кінцевої(их) амінокислоти(амінокислот) неубластину разом з модифікацією (наприклад, кон'югацією з ПЕГ або глікозилюванням) амінокислоти 95 досить, щоб істотно збільшити сироватко 91178 60 вий вплив. Наприклад, глікозильований NBN104 (СНО) не здійснював впливу, що виявляється, після п/ш введення; однак глікозильований 1x20 кДа ПЕГ NBN104 (СНО) здійснював значний сироватковий вплив після п/ш введення. Точно так само 2x20 кДа ПЕГ NBN113 здійснював низький або помірний сироватковий вплив після п/ш введення; однак глікозильований 2x20 кДа ПЕГ NBN104 (СНО) здійснював високий сироватковий вплив після п/ш введення. Ці результати показали, що кон'югація з полімером N-кінцевої амінокислоти(амінокислот) неубластину у поєднанні або з кон'югацією з полімером внутрішньої амінокислоти (наприклад у положенні 95), або глікозилюванням внутрішньої амінокислоти (наприклад у положенні 95), приводить до істотного підвищення сироваткового впливу після системного введення. Як щурячий неубластин дикого типу, так і мутантний неубластин N95K, були піддані рефолдингу і очищені до >95% для випробувань ефективності на моделі нейропатії у щурів лінії STZ, які страждають діабетом. З неубластину дикого типу був приготований препарат, безпосередньо направлений у випробування на тваринах, у той час як N95K був приготований до кон'югації з ПЕГ з 10 кДа ПЕГ-SPA. Щоб досягти мети рефолдингу і очищення, був розроблений спосіб рефолдингу, що використовує ексклюзійну хроматографію з виключенням за розміром молекули (SEC), що дозволило ренатурувати неубластин з тілець включення Е. соlі у великих кількостях і високих концентраціях. Крім SEC використовували і колонкову хроматографію, як з Ni-NTA, так і з силікагелем CM, щоб збільшити кінцеву чистоту білка. Білки піддавали широкому дослідженню параметрів, включаючи аналіз за допомогою SDS-PAGE, ексклюзійну хроматографію з виключенням за розміром молекули, ESMS, оцінку активності за допомогою KIRA ELISA і визначення вмісту ендотоксину. SDS-PAGE і SEC кінцевих білкових продуктів показали чистоту, що перевищує 95%. Рівень ендотоксину у кожному продукті був