Рослинна днк-послідовність, що кодує мутантну 5-енол-пірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (epsps), мутантний epsps-білок, трансформовані рослини з поліпшеною толерантністю до гліфосату та спосіб їх одержання

1. Рослинна ДНК-послідовність, що кодує мутантну 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), представлену SEQ ID No: 5. 2. Рослинна ДНК-послідовність за п.1, яка відрізняється тим, що представлена SEQ ID No: 4. 3. Рослинна ДНК-послідовність за п.1 або 2, яка відрізняється тим, що походить від кукурудзи. 4. Мутантний EPSPS-білок, який відрізняється тим, що представлений SEQ ID No: 5. 5. Химерний ген, що включає кодуючу послідовність, а також регуляторні елементи в позиціях 5' та 3', які гетерологічні і здатні функціонувати в C2 2 (11) 1 3 75315 4 нанесення на рослину, вони переміщаються в дав EPSPS-послідовності будь-якого походження, ну рослину, де акумулюються в її частинах, які зокрема, рослинного, бактеріального, водоростешвидко ростуть, зокрема, у верхівках стебел та вого або грибкового походження. коріння, спричинюючи пошкодження у відповідній Транзитні пептиди, які використовуються в гаточці руйнування чутливих рослин. лузі, можуть бути, per se, рослинного походження, Пластидна EPSPS, на яку головним чином наприклад, походити з кукурудзи, соняшника, госпрямована дія цих продуктів, являє собою ферроху або подібних до них культур. Перший та друмент біосинтетичного шляху ароматичних аміногий транзитні пептиди можуть бути ідентичними, кислот, який кодується одним або кількома ядераналогічними або різними. Кожний з них може ними генами і синтезується у формі включати, крім того, одну або декілька одиниць цитоплазматичного попередника, що імпортується транзитного пептиду, відповідно до [Європейської потім в ці пластиди, де він нагромаджується у виПатентної Заявки ЕР 0508909]. Значення цієї хагляді своєї зрілої форми. рактеристичної ділянки полягає в тому, щоб доТолерантність рослин до гліфосату і до продузволити вивільнення зрілого та нативного білку, і, ктів даної родини досягають шляхом стійкої інтроособливо, згаданої вище мутантної EPSPS, в пладукції в їхній геном гена EPSPS рослинного або змідний компартмент з максимальною ефективбактеріального походження, який є мутантним або ністю. інакшим стосовно характеристик інгібування проПромоторна ділянка відповідного химерного дукту цього гена гліфосатом. Враховуючи тип дії гена, згідно з цим винаходом, переважно складагліфосату і міру толерантності до гліфосату продується, як мінімум, з одного генного промотору або ктів генів, які використовуються, це надає перевагу промоторного фрагменту, який експресується в в здібності експресувати продукт трансляції цього рослинах природним способом (тубулін, інтрони, гена з погляду можливості нагромадження його в актин, гістон). пластидах в значних кількостях. Нетранслюєма ділянка сигналу термінації траЗ [патенту США 4535060], наприклад, відомо, нскрипції на S'-кінці даного химерного гена може що для надання рослині толерантності до гербіцибути будь-якого походження, наприклад, бактеріаду вищезгаданого типу, особливо Nльного походження, такого як ділянка гена нопаліфосфонометилгліцину або гліфосату, в геном роснсинтази, або рослинного походження, такого як лини інтродукують ген, що кодує EPSPS, який неділянка гістону Н4А748 з Arabidopsis thaliana., згідсе, як мінімум, одну мутацію, яка робить цей ферно з Європейською Патентною Заявкою [Європеймент більш резистентним до його конкурентного ська заявка 633317]. інгібітора (гліфосату) після розміщення даного Химерний ген згідно з цим винаходом вклюферменту в пластидному компартменті. Однак, ці чає, крім вищезгаданих основних частин, як мініметоди необхідно вдосконалювати, з метою досямум, одну проміжну (лінкерну) нетранслюєму ділягнення більш високої надійності застосування цих нку, яка може бути розташованою між ділянками, рослин в умовах сільського господарства. що транскрибуються диференційно, описаними У цьому описі "рослина" являє собою поняття вище. Ця проміжна ділянка може бути будь-якого для позначення будь-якого диференційованого походження, наприклад, бактеріального, вірусного багатоклітинного організму, здатного до фотосинабо рослинного походження. тезу, а "рослинна клітина" являє собою поняття Виділення кДНК, що кодує EPSPS кукурудзи для позначення будь-якої клітини, що походить з Нижче описані різні стадії, які призводять до рослини і є здатною створювати недиференційоотримання кДНК EPSPS кукурудзи, яка служить вані тканини, такі як калюси, або диференційовані субстратом для інтродукції двох мутацій. Всі опетканини, такі як зародки чи частини рослини або рації, описані нижче, даються як приклад, згідно з насіння. вибором, зробленим на підставі використання різМета цього винаходу полягає в одержанні них способів, придатних для досягнення того ж трансформованих рослин, що відзначаються підсамого результату. Цей вибір не впливає на відповищеною толерантністю до гербіцидів фосфоновідну якість одержуваного результату, і через це метилгліцинової родини, шляхом регенерації клібудь-який з відповідних методів може використотин, трансформованих через нові химерні гени, що вуватися фахівцями для отримання того ж самого містять ген толерантності до цих гербіцидів. результату. Більшість цих методів, за принципом Метою цього винаходу є також химерний ген техніки здобуття фрагментів ДНК, описані в ["Curдля надання рослинам підвищеної толерантності rent Protocols in Molecular Biology", Том 1 і 2, Ausuщодо гербіциду, об'єктом дії якого є EPSPS і який bel F.M. зі співавт., опублікованому видавництвами включає такі елементи, призначені для керування Greene Publishing Associates та Wiley-lnterscience транскрипцією: промоторну ділянку, необов'язково (1989)] (надалі посилання на умови експериментів, - ділянку транзитного пептиду, послідовність гена, описані в даній роботі, будуть позначатися як "ref. що кодує фермент толерантності до гліфосату, і CPMB"). Операції, які стосуються ДНК, що їх здійсділянку нетранслюємого сигналу поліаденілюваннювали згідно з умовами експериментів, описаних ня на З'-кінці, який відрізняється тим, що ген толев цій роботі, полягають, зокрема, у таких діях: лігурантності до гліфосату містить - стосовно гена, з вання ДНК-фрагментів, обробка за допомогою якого він одержаний - заміну "треонін 102 на ізоДНК-полімерази Кльонова і Т4-ДНК-полімерази, лейцин" в "aroA''-ділянці (EPSPS). У способі, якому одержання плазміди і ДНК-бактеріофага , у вивіддається перевага, він включає, крім того, в тій гляді мініпрепарату або у вигляді максипрепарату, самій ділянці, заміну "пролін 106 на серин". Ці заі, відповідно, аналіз ДНК і РНК згідно з Саузерн- і міни можуть бути інтродукованими або присутніми Нозерн-методами, відповідно. Інші методи, описа 5 75315 6 ні в даній роботі, були супутніми, і нижче описані vitro за допомогою інкапсулюючих екстрактів, а тільки суттєві модифікації і доповнення до цих саме Gigapack Gold, згідно з інструкціями постачаумов експериментів. льника; цю бібліотеку титрували з використанням Приклад 1 бактерії Е. coli C600hf1. Одержану таким чином 1. Одержання фрагменту EPSPS з Arabidopsis бібліотеку ампліфікували і зберігали згідно з інthaliana струкціями того ж самого постачальника, і створюа) Два 20-ланкових олігонуклеотиди відповідвали кДНК-бібліотеку суспензії BMS-клітин кукуної послідовності: рудзи. 5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' 3. Скринінг кДНК-бібліотеки суспензії клітин 5-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3 BMS кукурудзи за допомогою EPSPS-зонда Arabiсинтезували з послідовності EPSPS-гена Aradopsis thaliana bidopsis thaliana [KleeH.J. зі співавт. (1987) Mol. Наведений нижче протокол являє собою умоGen. Genet., 210, 437-442]. Ці два олігонуклеотиди ви, взяті з ["Current Protocols in Molecular Biology", знаходяться, відповідно, в позиціях 1523-1543 і томи 1 і 2, Ausubel F.M. зі співавт., опублікованих у 1737-1717, опублікованої послідовності і в протиGreene Publishing Associates і Willey-interscience лежних напрямах. (1989)] (CPMB). Якщо викласти стисло, приблизно б) Тотальна ДНК Arabidopsis thaliana (var. Co106 рекомбінантних фагів поміщали на LB-чашки lumbia) одержана від Clontech (каталогове посипри середній густині 100фагів/см2. Здобуті літичні лання: 6970-1). бляшки реплікували повторно на мембрани Amerв) 50 нанограмів (нг) ДНК змішували з 300нг sham Hybond N. кожного з цих олігонуклеотидів і піддавали 35 цикДНК фіксували на фільтрах шляхом обробки лам ампліфікації в апараті Perkin-Elmer 9600, в 1600kJUV (Stratagene Stratalinker). Ці фільтри преумовах стандартного середовища для ампліфікагібридизували в 6×SSC/0,1% SDS/0,25 збираного ції, яке рекомендоване постачальником. Одержумолока протягом 2год при 65 С. Пробу EPSPS ваний 204п.н.-фрагмент складає EPSPS-фрагмент Arabidopsis thaliana помічали за допомогою Arabidopsis thaliana. [32P]dCTP шляхом випадкового праймування від2. Створення бібліотеки кДНК з BMS лінії кліповідно до інструкцій постачальника (Pharmacia тин кукурудзи Ready to Go kit). Одержана специфічна активність а). 5г відфільтрованих клітин подрібнюють в становить порядку 10cpm на мкг фрагменту. Після рідкому азоті, і тотальну нуклеїнову кислоту екстденатурації протягом 5хв при 100 С цю пробу дорагують згідно з методом, описаним у Shure зі спідавали до вказаного прегібридизаційного середовавт., з такими модифікаціями: вища, і гібридизацію продовжували протягом 14 - pH лізуючого буфера доводять до pH 9,0; годин при 55 С. Одержані фільтри піддавали - після осадження за допомогою ізопропанолу, флюорографії протягом 48год при -80 С з плівкою осад піднімається у воді і, після розчинення, довоKodak XAR5 та підсилюючими екранами Amerдять до 2,5 М LiCI. Після інкубації протягом 12год sham Hyperscreen RPN. Співставлення позитивних при С осад, здобутий після центрифугування проплям на фільтрі з чашками, з яких вони походять, тягом 15хв при 30000g та 4 С, розчиняли повтордає можливість зонам, що відповідають фагам, які но. Далі повторювали LiCI-осадження. Цей перепоказують позитивну гібридизаційну відповідь із розчинений осад являє собою фракцію РНК зондом EPSPS Arabidopsis thaliana, бути відібразагальної нуклеїнової кислоти. ними з чашки. Ця стадія посіву, перенесення, гібб). Poly (А)+-РНК-фракцію з фракції РНК отриридизації та витягання повторюється доти, поки мували шляхом хроматографії на оліго(dТ)всі плями на чашці послідовно очищуваних фагів целюлозній колонці, як це описано в ["Current Proне засвідчать 100%-ий позитив в гібридизації. Неtocols in MolecularBiology"]. залежну пляму фагового лізису відбирають потім в в) Синтез дволанцюгової кДНК, що має синтерозбавленому середовищі (Тріс-НСІ pH 7,5; 10тичний EcoRI-кінець: це здійснюють відповідно до мМ MgS04; 0,1 М NaCI; 0,1% желатин); ці фаги в протоколу постачальника різних реагентів, необрозчині утворюють EPSPS-позитивні клони сухідних для такого синтезу, у вигляді набору: "коспензії BNS клітин кукурудзи. пійний набір" від компанії In Vitrogen. 4. Одержання та аналіз ДНК з EPSPS клонів Два однониткові та частково комплементарні суспензії BMS клітин кукурудзи олігонуклеотиди відповідних послідовностей: Близько 5×108 фагів додавали до 20мл бакте5'-AATTCCCGGG-3' рій C600hfl при значенні OD600HM 2/мл та інкубува5'-CCCGGG-3' (остання є фосфорильованою) ли протягом 15 хвилин при 37 С. Цю суспензію лігували з тупими кінцями дволанцюгових кДНК. розбавляли потім в 200мл бактеріального ростоЦе лігування адаптерів призводить до утвового середовища в 1-1 Ерленмейерівській склянці рення Smal-сайтів, приєднаних до двохланцюгових та перемішували на ротаційній мішалці при кДНК і EcoRI-сайтам у липкій формі на кожному 250об/хв. Лізис реєстрували, коли це середовище кінці цих двохланцюгових кДНК. ставало прозорим, що свідчило про лізис бактерій, г). Створення бібліотеки: які каламутили середовище, приблизно через 4год Ці кДНК, що відзначаються наявністю штучних перемішування. Потім цей супернатант обробляли липких EcoRI-сайтів на своїх кінцях, лігували з згідно з [описом в "Current Protocols in Molecular кДНК бактеріофага gt10, який розрізали EcoRI і Biology"]. Одержувана ДНК відповідає згаданим дефосфорилювали відповідно до протоколу посEPSPS-клонам із суспензії BMS-клітин кукурудзи. тачальника New England Biolabs. Від одного до двох мкг цієї ДНК розрізали за Аліквоту з реакції лігування інкапсулювали in допомогою EcoRI та розділяли в 0,8%-ому 7 75315 8 LGTA/TBE агарозному гелі (ref. CPMB). Остаточне щали в градієнті CsCI, як це описано в ["Current здійснення контролю полягає у перевірці того, щоб Protocols in Molecular Biology"]. Очищену ДНК частвиділена ДНК дійсно проявляла гібридизаційний ково секвенували за допомогою набору Farmacia, сигнал з EPSPS-пробою Arabidopsis thaliana. Після відповідно до інструкцій постачальника, прямий та електрофорезу одержані фрагменти ДНК перенозворотний універсальні праймери, М13, що постасили на мембрани Amersham Hybond N відповідно вляються тим самим постачальником, використодо [протоколу Саузерн-аналізу, описаного в вували як праймери. Одержувана неповна послі"Current Protocols in Molecular Biology"]. Одержаний довність охоплює приблизно 0,5т.п.н. Одержувана фільтр гібридизували з EPSPS-пробою Arabidopsis амінокислотна послідовність у відповідній ділянці thaliana згідно з умовами, описаними у наведеному цього зрілого білка (близько 50 амінокислотних вище розділі 3. Клон, що виявляє гібридизаційний залишків) свідчить про 100%-ну ідентичність з відсигнал з EPSPS-пробою Arabidopsis thaliana і вміповідною амінокислотною послідовністю зрілої щує найбільш довгий EcoRI-фрагмент, має ділянEPSPS кукурудзи, описаною в [Американському ку, за оцінкою в гелі, приблизно у вигляді 1,7т.п.н. патенті USP 4971908]. Цей клон, що відповідає 5. Одержання клону pRPA-ML-711 1,7т.п.н. EcoRI-фрагменту ДНК EPSPS із суспензії Десять мкг фагового клону, що містив 1,7т.п.н. BMS-клітин кукурудзи, позначили як pRPA-ML-711. вставку, розщеплювали за допомогою EcoRI та Повну послідовність цього клону визначали в обох розділяли у 0,8 LGTA/TBE агарозному гелі (ref. ланцюгах з використанням протоколу набору CPMB). Одержаний у гелі фрагмент, що містив Pharmacia і синтезу комплементарних олігонуклезгадану 1,7т.п.н. вставку, вирізали з цього гелю отидів і олігонуклеотидів протилежної орієнтації, після забарвлення ЕтБ, і гелевий фрагмент оброкожний, приблизно, по 250п.н. Повна послідовність, одержана з цього 1713п.н. клону, надається бляли за допомогою -агарази відповідно до проу SEQ ID No. 1. токолу постачальника, New England Biolabs. ДНК, в. Одержання клону pRPA-ML-715 що виділяється з 1,7т.п.н. фрагменту, лігували при Аналіз послідовності одержаного клону pRPA12 С протягом 14год із ДНК з плазміди pUC 19 ML-711, і, особливо, порівняння одержаної аміно(New England Biolabs), різали за допомогою EcoRI кислотної послідовності з послідовністю з кукурувідповідно до умов експерименту з лігування, опидзи, свідчать про подовження послідовності на саного в ["Current Protocols in Molecular Biology"]. 92п.н. вище від кодону GCG, що кодує NH2-кіцевий Два мкл з одержаної згідно з наведеним вище аланін зрілої частини EPSPS кукурудзи [Америописом суміші для лігування використовували для канський Патент USP 4971908]. Аналогічно спотрансформації аліквоти електрокомпетентної Е. стерігали подовження на 288п.н. нижче від кодону coli DH10B; трансформацію виконували шляхом ААТ, що кодує СООН-кінцевий аспарагін зрілої електропорації з використанням наведених нижче частини EPSPS кукурудзи [Американський Патент умов: суміш з компетентних бактерій та лігуючого USP 4971908]. Ці дві частини могли б відповідати, середовища поміщали до кювети для електропоу разі NH2-кінцевого подовження, частині послідорації товщиною 0,2см (Biorad), заздалегідь охоловності транзитного пептиду, для локалізації у пладжену до 0 С. Фізичні умови електропорації, з вистиді, а у разі СООН-кінцевого подовження, - З'користанням електропоратора від фірми Biorad, нетранслюємій ділянці кДНК. такі: 2500вольт, 25mkF та 200 . У цих умовах Для одержання кДНК, що кодує зрілу частину середній час розряджання конденсатора станокДНК EPSPS кукурудзи, як описано в [USP вить порядку 4,2мілісекунд. Потім бактерії помі4971908], виконували такі операції: щають в 1мл SOC-середовища (ref. СРМВ) і переа) Видалення З'-нетранслюємої ділянки: консмішують протягом 1 години при 200об/хв на труювання pRPA-ML-712: ротаційній мішалці в 15-мілілітрових ретортоподіКлон pRPA-ML-711 розрізали за допомогою бних пробірках. Після поміщення на LB/агарове рестрикційното ферменту Asel, і кінці, одержані середовище, з додаванням 100мкг/мл карбеніцивнаслідок цього розщеплення, затупляли шляхом ліну, мініпрепарати з бактеріальних клонів, які рообробки за допомогою фрагменту Кльонова ДНКсли протягом ночі при 37 С, одержували відповідполімерази І, згідно з протоколом, описаним в но до умов експерименту, описаного в ["Current СРМВ. Далі виконували розщеплення за допомоProtocols in Molecular Biology"]. Після розщеплення гою ферменту рестрикції Sacll. ДНК, що її одержуДНК за допомогою EcoRI і розділення електрофовали у цих операціях, розділяли в 1%-ому резом в 0,8% LGTA/TBE агарозному гелі (ref. LGTA/TBE агарозному гелі (ref. СРМВ). CPMB), зберігали клони, що мали 1/7т.п.н. вставку. Гелевий фрагмент, що містив 0,4т.п.н. вставку Остаточний контроль здійснювали перевіркою, в "Asel з тупими кінцями/Sacll", вирізали з цього геякій виділена ДНК дійсно виявляє гібридизаційний лю і очищали відповідно до протоколу, описаного сигнал з EPSPS-зондом Arabidopsis thaliana. Після у наведеному вище розділі 5. ДНК, одержану з електрофорезу одержані фрагменти ДНК переноклону pRPA-ML-711, різали за допомогою рестриксили на мембрани Amershame Hybond N відповідційного ферменту Hindlll no HindllI-11-сайті, локаліно до умов Саузерн-аналізу, описаного в ["Current зованому в полілінкері клонуючого вектора pUC19, Protocols in Molecular Biology"]. Одержаний фільтр і кінці, одержувані внаслідок цього розщеплення, гібридизували з EPSPS-зондом Arabidopsis thaliaзатупляли обробкою за допомогою фрагменту na відповідно до умов, описаних у наведеному «льонова ДНК-полімерази I. Після цього здійснювище розділі 3. Плазмідний клон, що має 1,7т.п.н. вали розщеплення за допомогою ферменту рествставку і гібридизується з EPSPS-зондом Arabiрикції Sacll. ДНК, що одержували внаслідок цих dopsis thaliana, одержували в найбільшій кількості, маніпуляцій, розділяли електрофорезом в 0,7%а ДНК, що одержується піспя лізису бактерій, очи 9 75315 10 ному LGTA/TBE агарозному гелі (ref. CPMB). ніновий і гліциновий кодони N-кінця були збережеФрагмент гелю, що містив приблизно 3,7т.п.н. ні, але модифіковані за третьою варіабельною вставку Hindlll з тупими кінцями/Sacll, вирізали з основою: початкова GCGGGT дає модифіковану цього гелю і виділяли очищенням відповідно до GCCGGC. протоколу, описаного у наведеному вище розКлон pRPA-ML-713 розрізали за допомогою ділі 5. рестрикційного ферменту Hindlll, і кінці цього розЦі дві вставки лігували, і 2мкл лігуючої суміші щеплення затупляли шляхом обробки за допомовикористовували для трансформації Е. coli DH10В, гою фрагменту Кльонова ДНК-полімерази 1. Далі як описано вище у розділі 5. здійснювали розщеплення за допомогою рестрикПлазмідну ДНК з різних клонів аналізували згіційного ферменту Sacl. ДНК, що її одержували дно з методикою, описаною для pRPA-ML-711. після цих маніпуляцій, розділяли електрофорезом Один з відібраних плазмідних клонів містив прибв 0,8%-ному LGTA/TВЕ агарозному гелі (ref. лизно 1,45т.п.н. вставку EcoRI-Hindlll. ПослідовCPMB). Фрагмент гелю, що містив 1,3т.п.н. вставку ність кінців цього клону показує, що 5'-кінець даної "Hind III з тупими кінцями/Sacl", вирізали з цього вставки точно відповідає кінцю pRPA-ML-711, і що гелю і очищали відповідно до протоколу, описаноЗ'-кінець відзначається такою послідовністю: го у наведеному вище розділі 5. Цю вставку лігу"5'-ATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA вали в присутності ДНК плазміди pUC19, розщепленої за допомогою рестрикційного ферменту AGCTT-3 ". Xbal, і кінці цього розщеплення затупляли шляхом Підкреслена послідовність відповідає кодону обробки за допомогою фрагменту Кльонова ДНКСООН-термінальної амінокислоти аспарагіна, а полімерази 1. Потім здійснювали розщеплення за наступний кодон відповідає стоп-кодону транслядопомогою рестрикційного ферменту Sacl. Два мкл ції. Нуклеотиди, розташовані нижче, відповідають цієї лігуючої суміші використовували для трансфоелементам послідовності з полілінкера pUC19. рмації E. coli DH10B, як описано вище у розділі 5. Цей клон, який включає послідовність pRPA-MLПісля аналізу плазмідної ДНК з різних клонів, згід711, аж до сайта термінації трансляції зрілої но з методом, описаним вище у розділі 5, один з EPSPS кукурудзи, і наступні послідовності з поліцих клонів, що має вставку приблизно 1,3т.п.н., лінкера pUC19, аж до Hindlll-сайта, був позначені зберігали для наступних аналізів. Послідовність як pRPA-ML-712. одержаних кінців відібраного клону показує, що б) Модифікація 5'-кінця pRPA-ML-712: конспослідовність ДНК є такою: послідовність з полілітруювання pRPA-ML-715: нкера pUC19 від сайта EcoRI до сайта Sacl, за Клон pRPA-ML-712 розрізали за допомогою якою слідує послідовність олігонуклеотидів, що ферментів рестрикції Pstl і Hindlll. ДНК, яку одервикористовуються для клонування, з якої видаляжували внаслідок цих маніпуляцій, розділяли елели 4п.н. GATCC з олігонуклеотиду І, описаного ктрофорезом у 0,8%-ому LGTA/TBE агарозному вище, за якою слідує залишок послідовності, гелі (ref. CPMB). Фрагмент гелю, що містив представленої в pRPA-ML-712 аж до Hindlll-сайта, і 1,3т.п.н. вставку Pstl-WcoRI, вирізали з цього гелю послідовність з полілінкера pUC19 від Xbal до і очищали відповідно до протоколу, описаного у Hindlll. Цей клон позначили як pRPA-ML-715. наведеному вище розділі 5. Цю вставку лігували в 7. Одержання кДНК, що кодує мутантную присутності еквімолярної кількості кожної з двох EPSPS кукурудзи частково комплементарних олігонуклеотидних Усі стадії мутагенезу здійснювали за допомопослідовностей: гою набору для мутагенезу Pharmacia U. S. Е., Олігонуклеотід 1: відповідно до інструкцій постачальників. Принцип S'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCG цієї системи мутагенезу полягає у таких операціях: AGGAGATCGTGCTGCA-S' плазмідну ДНК денатурують нагріванням і реасоОлігонуклеотід 2: ціюють у присутності молярного надлишку, в од5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGA ному випадку - олігонуклеотиду, що використовуGCTCGGCTC-3', ється для мутагенезу, а в іншому випадку, а також у присутності ДНК плазміди pUC19, олігонуклеотиду, що дає можливість унікальному розщепленої рестрикційними ферментами ВаглНІ і сайтові рестрикційного ферменту, присутньому в Hindlll. полілінкері, бути елімінованим. Після стадії реасоДва мкл цієї лігуючої суміші використовували ціації здійснювали синтез комплементарного ландля трансформації Е. coil DH10B, як описано вище цюга під впливом Т4-ДНК-полімерази в присутносу розділі 5. Після аналізу плазмідної ДНК з різних ті Т4-ДНК-лігази і гена 32 білка у відповідному клонів згідно з методикою, описаною вище у розбуфері, що додається. Одержаний продукт синтеділі 5, один з клонів, що має приблизно 1,3т.п.н. зу інкубують у присутності рестрикційного фермевставку, зберігали для наступних аналізів. Послінту, для якого допускається зникнення сайта під довність з 5'-кінця відібраного клону виявляє, що час мутагенезу. Штам Е. coli, який відзначається, послідовність ДНК в цій ділянці є такою: послідовзокрема, мутацією mutS, використовують як хазяїн ність з полілінкера pUC19 від сайта EcoRI до сайта для трансформації цієї ДНК. Після вирощування в BamHI, за якою слідує послідовність олігонуклеорідкому середовищі одержували тотальну плазмітидів, що використовуються для клонування, після дну ДНК і інкубували в присутності раніше викоричого слідує залишок послідовності, представленої станого рестрикційного ферменту. Після цих обров pRPA-ML-712. Цей клон позначили як pRPA-MLбок, штам E. coli використовували як хазяїн для 713. Цей клон має метіоніновий ATG-кодон, вклютрансформації. Одержували плазмідну ДНК з вичений у Ncol-сайт вище N-термінального аланіноділених клонів, а наявність інтродукованої мутації вого кодону зрілої EPSPS-синтази. Крім того, ала 11 75315 12 контролювали секвенуванням. Різні гени EPSPS-синтази, які інтродукуються у А) - модифікація сайтів або послідовностей вигляді касети Ncol-Hindlll в плазмідний вектор без принципового впливу на характер EPSPSpTrc99a (Pharmacia, ref. 27-5007-01), розрізали за стійкості кукурудзи до продуктів, які є конкурентдопомогою Ncol і Hindlll. Рекомбінантні бактерії E. ними інгібіторами синтазної активності EPSPS: coli DH10B, які надекспресують різні EPSPSелімінація внутрішнього Ncol-сайта з pRPA-MLсинтази, обробляли ультразвуком в 40мл буфера 715. на 10г осаджених клітин, і промивали тим же буПослідовність pRPA-ML-715 нумерували довіфером (200мМ Тріс-НСІ pH 7,8, 50мМ меркаптоельно шляхом поміщення першої основи Nтанолу, 5мМ ЕДТА і 1мМ PMSF), до якого додаватермінального аланінового кодону в позицію 1. Ця ли 1г полівінілпіролідону. Цю суспензію послідовність має Ncol-сайт в позиції 1217. Сайтперемішували протягом 15 хвилин при 4 С і потім модифікуючий олігонуклеотид має таку послідовцентрифугували протягом 20 хвилин при ність: 27000g і 4 С. 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3' До супернатанту додавали сульфат амонію, Після секвенування, згідно з посиланнями, нащоб довести цей розчин до 40%-го насичення суведеними вище, послідовність, що зчитується післьфатом амонію. Одержану суміш центрифугуваля мутагенезу, відповідає послідовності викорисли протягом 20 хвилин при 27000g і 4 С. Сульфат таного олігонуклеотиду. Ncol-сайт був дійсно амонію додавали до одержаного нового супернаелімінований, і трансляція амінокислот в цій ділятанту, щоб довести цей розчин до 70%-го насинці зберігає початкову послідовність, присутню в чення по відношенню до сульфату амонію. ОдерpRPA-ML-715. жану суміш центрифугували протягом 30 хвилин Цей клон позначили як pRPA-ML-716. при 27000g і 4 С. EPSPS-синтазу, присутню в цьо1340п.н. послідовність, одержана з цього клому білковому осаді, відбирали в 1мл буфера ну, представлена в SEQ ID No.2 і SEQ ID No.3. (20мМ Тріс-НСІ pH 7,8, 50мМ меркаптоетанолу). Б) - модифікації послідовності, що забезпечуЦей розчин діалізували протягом доби проти двох ють можливість підвищення EPSPS-стійкості до літрів цього ж буфера при 4 С. продуктів, які є конкурентними інгібіторами синтаз2. б: Ферментативна активність ної активності EPSPS. Активність кожного ферменту, як і їх стійкість Використовували такі олігонуклеотиди: до гліфосату, вимірювали in vitro протягом 10 хвиа) мутація Thr 102 IIe лин при 37 С у такій реакційній суміші: 100мМ ма5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATT леїнової кислоти pH 5,6, 1мМ фосфоенолпірувату, GACAGC-3' 3мМ шикімат-3-фосфату (приготовленого згідно з б) мутація Pro 106 Ser. [Knowless P.F. і Sprinson D.B. 1970. Methods in 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTT Enzymol 17A, 351-352 з Aerobacter aerogenes, GACAGC-3' штам ATCC 25597]) і 10мМ фториду калію. Екств) мутація Gly 101 Ala і Thr 102 IIe. ракт ферменту додавали в останній момент після 5-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCG додавання гліфосату, остаточна концентрація якоGCCATTG-3' го варіювала від 0 до 20мМ. г) мутації Thr 102 Ue і Pro 106 Ser. Активність вимірювали шляхом кількісного ви5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTC значення фосфату, що вивільнювався, згідно з CTTGACAGC-3' методикою [Tausky H.A. і Shorr Е. 1953. J. Biol. Після секвенування послідовність, що зчитуChem. 202, 675-685]. ється після мутагенезу по трьох мутантних фрагУ цих умовах природний фермент (WT) інгібументах, була ідентичною батьківській ДНКється вже на 85% при концентрації гліфосату послідовності pRPA-ML-716, за винятком мутагені0,12мМ. При цій концентрації мутантний фермент, зованої ділянки, яка відповідає ділянці використавідомий як Ser106, інгібується лише на 50%, а інші них для мутагенезу олігонуклеотидів. Ці клони бутри мутанти, llе102, lle102/Ser106 і АІа101/lle102, ли позначені: демонструють низьку інгібіцію або взагалі не інгіpRPA-ML-717 для мутації Thr 102 lle, pRPAбуються. ML-718 для мутації Pro 106 Ser, pRPA-ML-719 Концентрацію гліфосату збільшували на порядок, тобто до 1,2мМ, з метою досягнення 50%-го для мутації Gly 101 Ala і Thr 102 lle і pRPA-MLінгібування мутантного ферменту І1е102, мутантів 720 для мутації Thr 102 lle і Pro 106 Ser. I1e102/Ser106, Ala/l1e і Ala, які до цієї концентрації 1340п.н. послідовність з pRPA-ML-720 предне інгібувалися. ставлена в SEQ ID No. 4 і SEQ ID No. 5. Слід зазначити, що активність мутантів АІа/l1e 1395п.н. вставка Ncol-Hindlll є основою всіх і Ala не інгібується аж до концентрації гліфосату 10 конструкцій, що використовуються для трансформМ, і що активність мутанта l1e102/Ser106 не знимації рослин, для інтродукції стійкості до гербіцижується навіть при збільшенні концентрації гліфодів, які є конкурентними до інгібіторів EPSPS, і, сату вдвічі, тобто, до 20мМ. особливо - для інтродукції стійкості до гліфосату. Приклад 3 Ця вставка буде позначатися в іншій частині опису Резистентність трансформованих тютюнових як "подвійний мутант EPSPS кукурудзи". рослин Приклад 2 1-1 - Трансформація Толерантність до гліфосату для різних in vitro Вектор pRPA-RD-173 інтродукували в grobacмутантів terium tumefaciens штам ЕНА101 (Hood зі співавт., 2. а: Екстрагування EPSPS-синтази 1987), несучий косміду pTVK291 (Komari зі спі 13 75315 14 вавт., 1986). Техніка трансформації заснована на тродукованого химерного гена. методі Horsh зі співавт. (1985). Опис конструкцій плазмід 1-2 - Регенерація pRPA-RD-124: До pRPA-ML-720 додавали Регенерацію тютюну PBD6 (джерело SEITA "nos" поліаденілюючий сигнал для створення клоFrance) здійснювали з листових експлантатів в нуючої касети, що містить подвійний мутант основному середовищі Murashige і Skoog (MS), що EPSPS-гена кукурудзи (ThR 102 Не і Pro включає 30г/л сахарози, а також 200мкг/мл кана106 Ser). pRPA-ML-720 розщеплювали за допоміцину. Листові експлантати видаляли з рослин, могою HindIll та обробляли фрагментом Кльонова що культивуються в оранжереї або in vitro, і транДНК-полімерази І Е. coli для одержання тупого сформували згідно з методикою листових дисків кінця. Друге розщеплення здійснювали за допомо[Science, 1985, Vol. 227, pp. 1229-1231] на протязі гою Ncol, і одержаний фрагмент EPSPS очищали. трьох послідовних стадій: перша включає індукцію Потім EPSPS-ген лігували з очищеною pRPA-RDпроростання, протягом 15 днів, у середовищі з 12 (клонуюча касета, що містила сигнал поліаденідодаванням 30г/л сахарози, яка містить 0,05мг/л лювання нопалінсинтази) для одержання pRPAнафтилоцтової кислоти (NAA) і 2мг/л бензиламіноRD-124. Для того, щоб одержати практично чистий пурину (ВАР). Кільчики, одержані під час цієї ставектор pRPA-RF-12, останній необхідно завчасно дії, розвиваються далі протягом 10 днів при кульрозщепити за допомогою Sail, обробити ДНКтивуванні на MS-середовищі, з додаванням 30г/л полімеразою Кльонова і потім другий раз розщесахарози, але яке не містить ніякого гормону. Далі пити за допомогою Ncol. розвинуті кільчики видаляли та культивували на pRPA-RF-125: До pRPA-RD-124 додавали опMS-середовищі для вкорінення, яке мале полотимізований транзитний пептид (ОТР) для ствовинний вміст солей, вітамінів та цукру і не містило рення клонуючої касети, що містить EPSPS-ген, ніякого гормону. Приблизно через 15 днів, вкорінацілений на плазміди. pRPA-RD-7 [Європейська нені кільчики переносили в грунт. Патентна Заявка ЕР 652286] розщеплювали за 1-3-Стійкість до гліфосату допомогою Sphl, обробляли за допомогою Т4-ДНКРегенерували двадцять трансформованих рополімерази і потім розщеплювали за допомогою слин і переносили їх до оранжереї для конструюSpei, а одержаний фрагмент ОТР очищали. Цей вання pRPA-RD-173. Ці рослини обробляли в ораОТР-фрагмент клонували в pRPA-RD-124, який нжереї, на стадії 5-го листа, водною суспензією заздалегідь розщеплювали за допомогою Ncol, RoundUp, яка відповідає 0,8кг активної речовини обробляли за допомогою ДНК-полімерази Кльоногліфосату на гектар. ва для видалення виступаючої З'-частини і потім Відповідні результати показників спостерерозщеплювали за допомогою Spel. Далі цей клон жень фітотоксичности протоколювали через 3 тисеквенували з метою гарантування правильного жні після обробки. За цих умов встановлено, що трансляційного злиття між згаданим ОТР і згадарослини, трансформовані за допомогою конструкним EPSPS-геном. Після цього одержували pRPAції pRPA-RD-173, виявили дуже хорошу толерантRD-125. ність, тоді як нетрансформовані контрольні рослиpRPA-RD-130: До pRPA-RD-125 додавали пони повністю гинули. слідовність НЗС4 кукурудзяного гістонового проЦі результати ясно свідчать, що таке поліпмотора і послідовність інтрону 1 adh1 з pRPA-RDшення викликане використанням химерного гена 123 [Патентна Заявка ЕР 507698], з метою ствозгідно з цим винаходом замість такого ж гена, що рення касети для експресії в рослинах подвійного кодує толерантність до гліфосату. мутантного EPSPS-гена в тканинах однодольних. Приклад 4 pRPA-RD-123 (касета, що містить згаданий НЗС4 Трансформація та селекція клітин кукурудзи кукурудзяний гістоновий промотор, злитий із згаBMS (Black Mexican Sweet)-клітини кукурудзи в даним інтроном 1 adh1, розщеплювали за допомоекспонентній фазі росту бомбардували конструкцігою Ncol і Sacl. Фрагмент ДНК, що містив вказаний єю pRPA-RD-130 згідно зі специфікою та умовами промотор, одержаний з pRPA-RD-123, після цього експерименту, описаними у Klein зі співавт. 1987 очищали і лігували з pRPA-RD-125, яку заздале[Klein Т.М., Wolf E.D., Wu R. і Sandford J.C. (1987): гідь розщеплювали за допомогою Ncol і Sacl. High velocity microprojectiles for delivering nucleic pRPA-RD-159: До pRPA-RD-125 додавали гісacids into living cells, NATURE Vol. 327 pp. 70-73]. тоновий подвійний промотор Н4А748 Arabidopsis Через два дні після бомбардування ці клітини [Патентна Заявка ЕР 507698], з метою створення переносили в те ж саме середовище, що містило касети для експресії в рослинах, для експресії 2мМ N-(фосфонометил) гліцину. "ОТР-подвійного мутантного EPSPS-гена", гена в Через 8 тижнів селекції на цьому середовищі, тканинах дводольних. pRPA-RD-132 (касета, що калюси, які виросли, відбирали, потім ампліфікумістить згаданий подвійний промотор Н4А748 [Павали та аналізували за допомогою PCR і виявляли тентна Заявка ЕР 507698] ) розщеплювали за доочевидну присутність химерного OTP-EPSPS-гена. помогою Ncol і Sacl. Одержаний очищений фрагКлітини, які не піддавали бомбардуванню і які мент промотора клонували після цього в pRPAне росли на тому ж середовищі, що містило 2мМ RD-125, яку розщеплювали за допомогою ЕсоІ і N-(фосфонометил) гліцину, блокувалися гербіциSacl. дом і не розвивалися. pRPA-RD-173: До плазміди pRPA-BL-150A Рослини, трансформовані згідно з цим вина[Європейська Патентна Заявка 508909] додавали ходом, можуть бути використані як батьківські для "Н4А748 промотор-ОТР-подвійний мутантний одержання ліній та гібридів, які відзначаються феEPSPS-ген), ген з pRPA-RD-159, для створення з нотипічною ознакою, що відповідає експресії інAgrobacterium tumefaciens трансформуючого век 15 75315 16 тора. pRPA-RD-159 розщеплювали за допомогою гмент клонували після цього в pRPA-BL-150A за Notl і обробляли полімеразою Кльонова. Цей фрадопомогою Smal. 17 75315 18 19 Комп’ютерна верстка М. Ломалова 75315 Підписне 20 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601