Застосування паразитичних біологічних агентів для боротьби з захворюваннями
Формула / Реферат
1. Спосіб скринінгу препарату паразитичних гельмінтів, що змінює активність регуляторних Т-клітин, при цьому вказаний спосіб включає етапи:
(a) одержання препарату паразитичних гельмінтів;
(b) приведення вказаного препарату паразитичних гельмінтів у контакт з мішенню; та
(c) визначення рівня внутрішнього маркера для активності регуляторних Т-клітин у вказаній мішені після вказаного контакту, де вказаний внутрішній маркер являє собою Scurfin, Smad7, Gata3 або Tbet (Tbx21),
де зміна вказаного рівня вказаного внутрішнього маркера після вказаного контакту є показовою для вказаного препарату паразитичних гельмінтів, який змінює активність регуляторних Т-клітин.
2. Спосіб згідно з п. 1, в якому вказаний рівень вказаного транскрипційного фактора вимірюється на своєму білковому рівні або на рівні мРНК.
3. Спосіб скринінгу препарату паразитичних гельмінтів, що змінює активність регуляторних Т-клітин, при цьому вказаний спосіб включає етапи:
(a) одержання препарату паразитичних гельмінтів;
(b) приведення вказаного препарату паразитичних гельмінтів у контакт з мішенню; та
(c) визначення рівня маркера клітинної поверхні для регуляторних Т-клітин у вказаній мішені після вказаного контакту, де вказаний маркер поверхні клітин вибирають із групи, яка складається з: CD4, CD45RBlo, CD45Rc, антигену 4, асоційованого з цитолітичними Т-лімфоцитами (CTLA-4), Oх40, 4-1ВВ, CD25, CD103, CD62L, aEb інтегрину, пептиду, асоційованого з латентним станом (LAP), або білка, спорідненого з родиною рецептора TNF, що індукується глюкокортикоїдом (GITR), хемокінового рецептора CCR5, TI-ST2,
де зміна вказаного рівня вказаного маркера клітинної поверхні після вказаного контакту є показовою для вказаного препарату паразитичних гельмінтів, який змінює активність регуляторних Т-клітин.
4. Спосіб згідно з пунктом 3, в якому вказаний рівень вказаного маркера поверхні клітин вимірюється на його білковому рівні або на рівні мРНК.
5. Спосіб лікування тварин, що мають захворювання, пов'язані з Тh1 або Th2, шляхом введення препарату паразитичних гельмінтів, що змінює активність регуляторних Т-клітин, вказаній тварині.
6. Спосіб для моніторингу лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів для аутоімунного або алергічного захворювання у тварини, який включає:
(a) введення композиції, яка включає препарат паразитичних гельмінтів або його фракцію, вказаній тварині; та
(b) визначення рівня активності регуляторних Т-клітин у вказаної тварини після вказаного введення, в якому вказана активність регуляторних Т-клітин вимірюється шляхом визначення рівня маркера регуляторних Т-клітин, де вказаний маркер регуляторних Т-клітин являє собою внутрішній маркер, вибраний із групи, яка складається з Scurfin, Smad7, Gata3 або Tbet (Tbx21),
де підвищення вказаного рівня вказаної активності регуляторних Т-клітин після вказаного введення є показовим для лікувальної ефективності вказаного препарату паразитичних гельмінтів.
7. Спосіб для моніторингу лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів для аутоімунного або алергічного захворювання у тварини, який включає:
(a) введення композиції, яка включає препарат паразитичних гельмінтів або його фракцію, вказаній тварині; та
(b) визначення рівня активності регуляторних Т-клітин у вказаної тварини після вказаного введення, в якому вказана активність регуляторних Т-клітин вимірюється шляхом визначення рівня маркера регуляторних Т-клітин, де вказаний регуляторний Т-маркер являє собою маркер поверхні клітин, вибраний із групи, яка складається з: CD4, CD45RBlo, CD45RC, антигену 4, асоційованого з цитолітичними лімфоцитами (CTLA-4), Oх40, 4-1ВВ, CD25, CD103, CD62L, aEb інтегрину, пептиду, асоційованого з латентним станом (LAP), або білка, спорідненого з родиною рецептора TNF, що індукується глюкокортикоїдом (GITR), хемокінового рецептора CCR5, TI-ST2,
де підвищення вказаного рівня вказаної активності регуляторних Т-клітин після вказаного введення є показовим для лікувальної ефективності вказаного препарату паразитичних гельмінтів.
8. Спосіб для моніторингу лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів для аутоімунного або алергічного захворювання у тварини, який включає:
(a) введення композиції, яка включає препарат паразитичних гельмінтів або його фракцію, вказаній тварині; та
(b) визначення рівня активності регуляторних Т-клітин у вказаної тварини після вказаного введення, в якому вказана активність регуляторних Т-клітин вимірюється шляхом визначення рівня маркера регуляторних Т-клітин, де вказаний маркер регуляторних Т-клітин являє собою маркер, що секретується, вибраний із групи, яка складається з IL4, IL13, IL-5, IL-10 або TGFb, PgE2,
де підвищення вказаного рівня вказаної активності регуляторних Т-клітин після вказаного введення є показовим для лікувальної ефективності вказаного препарату паразитичних гельмінтів.
Текст
1. Спосіб скринінгу препарату паразитичних гельмінтів, що змінює активність регуляторних Тклітин, при цьому вказаний спосіб включає етапи: (a) одержання препарату паразитичних гельмінтів; (b) приведення вказаного препарату паразитичних гельмінтів у контакт з мішенню; та (c) визначення рівня внутрішнього маркера для активності регуляторних Т-клітин у вказаній мішені після вказаного контакту, де вказаний внутрішній маркер являє собою Scurfin, Smad7, Gata3 або Tbet (Tbx21), де зміна вказаного рівня вказаного внутрішнього маркера після вказаного контакту є показовою для вказаного препарату паразитичних гельмінтів, який змінює активність регуляторних Т-клітин. 2. Спосіб згідно з п. 1, в якому вказаний рівень вказаного транскрипційного фактора вимірюється на своєму білковому рівні або на рівні мРНК. 3. Спосіб скринінгу препарату паразитичних гельмінтів, що змінює активність регуляторних Тклітин, при цьому вказаний спосіб включає етапи: (a) одержання препарату паразитичних гельмінтів; (b) приведення вказаного препарату паразитичних гельмінтів у контакт з мішенню; та 2 (19) 1 3 94023 4 показовим для лікувальної ефективності вказаного препарату паразитичних гельмінтів. 7. Спосіб для моніторингу лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів для аутоімунного або алергічного захворювання у тварини, який включає: (a) введення композиції, яка включає препарат паразитичних гельмінтів або його фракцію, вказаній тварині; та (b) визначення рівня активності регуляторних Тклітин у вказаної тварини після вказаного введення, в якому вказана активність регуляторних Тклітин вимірюється шляхом визначення рівня маркера регуляторних Т-клітин, де вказаний регуляторний Т-маркер являє собою маркер поверхні клітин, вибраний із групи, яка складається з: CD4, CD45RBlo, CD45RC, антигену 4, асоційованого з цитолітичними лімфоцитами (CTLA-4), Oх40, 41ВВ, CD25, CD103, CD62L, E інтегрину, пептиду, асоційованого з латентним станом (LAP), або білка, спорідненого з родиною рецептора TNF, що індукується глюкокортикоїдом (GITR), хемокінового рецептора CCR5, TI-ST2, де підвищення вказаного рівня вказаної активності регуляторних Т-клітин після вказаного введення є показовим для лікувальної ефективності вказаного препарату паразитичних гельмінтів. 8. Спосіб для моніторингу лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів для аутоімунного або алергічного захворювання у тварини, який включає: (a) введення композиції, яка включає препарат паразитичних гельмінтів або його фракцію, вказаній тварині; та (b) визначення рівня активності регуляторних Тклітин у вказаної тварини після вказаного введення, в якому вказана активність регуляторних Тклітин вимірюється шляхом визначення рівня маркера регуляторних Т-клітин, де вказаний маркер регуляторних Т-клітин являє собою маркер, що секретується, вибраний із групи, яка складається з IL4, IL13, IL-5, IL-10 або TGF, PgE2, де підвищення вказаного рівня вказаної активності регуляторних Т-клітин після вказаного введення є показовим для лікувальної ефективності вказаного препарату паразитичних гельмінтів. Даний винахід стосується композицій паразитів та їх використання при запобіганні та/або лікуванні стану або хворобливого стану, що виникає внаслідок зміненої імунної відповіді. Паразити представляють собою живі організми, які населяють хазяйський організм, або іншим чином на деяких етапах своїх життєвих циклів забезпечують своє живлення за рахунок хазяїна. Паразити, які населяють кишечник, мають комплекс взаємодії з імунною системою слизової оболонки. Вони повинні встановити мирний взаємозв'язок з хазяйськими механізмами захисту слизової оболонки для свого виживання. Порушення регуляції імунної системи, що веде до аномальної Th1 або Th2 відповіді, може бути спричинене деякими захворюваннями людини. Деякі захворювання, які виникають в результаті домінантних Th1 відповідей, включають запальне захворювання кишечнику (IBD), ревматоїдний артрит, саркоїдоз, розсіяний склероз, інсулінозалежний цукровий діабет. Пов'язані з Th2 захворювання включають алергічні захворювання та рак. Нещодавно було продемонстровано, що піддання впливу паразитів знижує тяжкість експериментального аутоімунного енцефаломієліту (ЕАЕ) (Sewell та ін., 2003, International Immunology, 15: 59-69). Експериментальний аутоімунний енцефаломієліт (ЕАЕ) представляє собою тваринну модель для множинного склерозу (MS), що характеризується хронічною запальною демієлінізацією центральної нервової системи (ЦНС). Sewell повідомив, що у мишей, яких імунізували яйцями Schistosoma mansoni, тяжкість ЕАЕ знижується, як було виявлено за допомогою знижених клінічних показників та клітинних інфільтратів ЦНС. Хвороба Крона виникає внаслідок порушення регуляції запалення слизової оболонки Т хелперного (Тh)1-типу. Хвороба Крона рідко виникає в тропічних країнах, але превалює у розвинутих країнах з м'яким кліматом, в яких частота виникнення цього захворювання підвищилася після 1940 року. На противагу до цього, піддання впливу гельмінтних паразитів є звичайним у тропічних країнах, але є рідким у розвинутих країнах. Elliott та ін. (2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284: G385-G391) продемонстрував, що гельмінти можуть послаблювати (атенуювати) надлишкове запалення Тh1 типу. Для перевірки цієї гіпотези мишей піддавали дії яєць Schistosoma mansoni, а потім проводили ректальну стимуляцію за допомогою тринітробензолсульфонової кислоти (TNBS) для індукції коліту. Піддання дії яєць шистосоми атенуювало TNBS коліт та захищало мишей від летального запалення. Піддання дії яєць шистосоми знижувало рівень гамма-IFN та підвищувало продукцію IL-4 клітин анти-СD3стимульованої селезінки та мезентеріальних клітин лімфовузлів у мишей, яких оброблювали TNBS. Піддання дії яєць шистосом знижувало рівень гамма-IFN ободової кишки, але підвищувало рівень експресії мРНК IL-10 у мишей, яких оброблювали TNBS. Для атенуювання коліту була необхідна інтактна сигнальна трандукція та активатор транскрипції 6. Автори показали, що піддання дії гельмінтів може знизити запалення ободової кишки у мишей. de Jong та інші (2002, J. Immunol., 168:17041709) продемонстрував, що білковий екстракт, одержаний з гельмінту Schistosoma mansoni, індукував утворення DC2, який промотує розвиток клітин Тh2 за допомогою підвищеної експресії ОХ40 ліганду. Крім того, токсин, виділений з екстрацелюлярної бактерії Vibrio cholerae, також індукував розвиток DC2, проте за допомогою шляху, неза 5 лежного від ОХ40 ліганду, тобто шляхом ще невідомого механізму. На противагу до цього, токсин з інтрацелюлярної бактерії Bordetella pertussis індукував розвиток DC1 з підвищеною продукцією IL12, що покращувало розвиток Th1 клітин. Полі(І:С) (дцРНК (дволанцюгова РНК, що імітує вірусну) індукувала розвиток дуже потужного DC1, що індукується Тh1, без підвищення продукції IL-12. Заявка на патент США № 2003/0103938 Α1 розкриває фармацевтичну композицію, яка складається з IL-4 та SDF-1, або IL-2 та SDF-1, для запобігання або лікування захворювань, пов'язаних з Тh1 клітинами або Th2 клітинами у людини або тварини шляхом модуляції співвідношення Th1/Th2. Doetze та ін. (2000, International Immunology, 12: 623-630) досліджував Т-клітинну проліферативну гіпореактивність стосовно Ov антигену (OvAg) за допомогою периферичних мононуклеарних клітин крові (РВМС), одержаних від індивідуумів з хронічними гельмінтними інфекціями, а саме з генералізованим онхоцеркозом (GEO), у порівнянні з РВМС, одержаними від путативно імунних індивідуумів (РІ). У цьому дослідженні вивчалися механізми, які опосередковують таку клітинну гіпореактивність у GEO: низька проліферативна відповідь на РВМС, одержані від GEO індивідуумів, асоціювалася з відсутністю продукції IL-4 та значно більш низькою продукцією IL-5 у порівнянні з такими для РІ індивідуумів, що свідчило проти загального зсуву до T(h)2 відповіді, що є причиною гіпореактивності. На противагу до цього, IL-10 та трансформуючий ростовий фактор (TGF)-бета, два цитокіни, асоційовані з T(h)3 відповіддю, виявилися такими, що опосередковують гіпореактивність: РВМС, одержані від індивідуумів з GEO, продукували набагато більше IL-10, a T-клітинна проліферативна гіпореактивність у цій групі могла бути змінена шляхом додання анти-IL-10 та aнтиTGF-бета антитіл. Автори показали, що гіпореактивність була специфічною для OvAg та не спостерігалася при стимуляції за допомогою родинних нематодних антигенів, що свідчило про опосередковану Т-клітинами Ov-специфічну знижувальну регуляцію. Ov-специфічні Τ клітини можуть бути клоновані з GEO РВМС, які мають унікальний цитокіновий профіль (відсутність IL-2, але високий рівень IL-10 та/або продукції TGF-бета), подібний до підмножини Τ клітин, відомих як такі, що інгібують постійне запалення (T(h)3 та Т(r)1), що свідчить про те, що цей тип клітин, які не були виявлені до цих пір при інфекційних захворюваннях, можуть бути втягнені в Ov-специфічну гіпореактивність. Th3 клітини представляють собою підмножину регуляторних Τ клітин, які були спочатку одержані та ідентифіковані у мишей, які були орально толеризовані до МВР, такі клітини пригнічували індукцію експериментального аутоімунного енцефаломієліту (ЕАЕ) за допомогою залежного від TGF-b механізму (Chen та ін., 1994, Science, 265: 12371240). Нещодавні дослідження дали можливість запропонувати, що регуляторні Τ клітини можуть бути індуковані проти бактеріальних, вірусних та паразитичних антигенів in vivo та можуть запобіга 94023 6 ти аутоімунним захворюванням, імунопатології, індукованої інфекцією, або подовжувати персистенцію патогену шляхом супресії протективних Th1 відповідей (див., наприклад, McGuirk та Mills, 2002, Trends in Immunology, 23: 450-455; Tung та ін., 2001, Immunological Reviews, 182: 135-148; та Maloy та Powrie, 2001, Nature Immunology, 2: 816822). Регуляторні Т клітини в загальному вигляді описуються як лімфоцити, які супресують імунні відповіді, тобто, такі, що опосередковані антитілом, та опосередковані клітинами (див., наприклад, для огляду, McGuirk P, Mills KН. Pathogenspecific regulatory T cells uprovoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23 (9): 450-5; Field, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch, та В. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ Τ cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170: 2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory Τ cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3): 223-32; Francois Bach J. Regulatory Τ cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory Τ cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14 (6): 771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory Τ cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23 (9): 450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug; 182: 135-48; Read S, Powrie F. CD4(+) regulatory Τ cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec; 13 (6): 644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory Τ cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3 (11): 899-904). Ці регуляторні Τ клітини (Тr клітини) експресують трансмембранний білок (який називається CD25), що представляє собою альфа ланцюг рецептора для інтерлейкіну-2 (IL-2). Подібно до інших Τ клітин, вони також експресують (альфа-бета) Τ клітинний рецептор для антигену (TCR), що може активуватися тільки тоді, якщо він зв'язується з класом II МНС пептидних молекул, або у випадку CD8 регуляторних клітин з класом І МНС, для яких він є специфічним. Проте після активації вони починають секретувати великі кількості інтерлейкіну-10 (IL-10), а також часто деяку кількість трансформуючого ростового факторабета (TGF-). Обидва ці лімфокіни є потужними імуносупресантами, які інгібують допомогу Th1 для опосередкованого клітинами імунітету та запалення, при цьому Th2 сприяє продукції антитіл та, ймовірно, дії CD8+ цитотоксичних Τ лімфоцитів (CTL). Деякі інші регуляторні Т клітини відрізняються від Тr клітин. Наприклад, Тr1 клітини мають схожість з Тr клітинами стосовно деяких параметрів, незважаючи на те, що вони не експресують великих кількостей CD25 на своїй поверхні. Вони вимагають IL-10 для свого утворення і тільки тоді, коли вони є зрілими, експресують його у великій кількості. Основний лімфокін Th3 клітин представляє собою TGF-. 7 Залишається невідомим, чи грають регуляторні Τ клітини певну роль у запобіганні або лікування захворювань, пов'язаних з Th1 або Th2, при використанні препаратів паразитичних гельмінтів. Даний винахід базується на відкритті того факту, що препарат паразитів може змінювати активність регуляторних Τ клітин при лікуванні захворювання, пов'язаного з Th1 або Th2. В одному втіленні даний винахід забезпечує спосіб скринінгу препаратів паразитичних гельмінтів, які змінюють активність регуляторних Τ клітин, способу, що включає етапи: (а) одержання препарату паразитичного гельмінту; (b) приведення препарату паразитичного гельмінту в контакт с мішенню; та; (с) визначення рівня внутрішнього маркера для активності регуляторних Τ клітин у мішені після контакту, де зміна рівня внутрішнього маркера після контакту є показовою для препарату паразитичного гельмінту, який змінює активність регуляторних Τ клітин. В іншому втіленні даний винахід забезпечує спосіб скринінгу препарату паразитичних гельмінтів, який змінює активність регуляторних Τ клітин, при цьому спосіб включає етапи: (а) одержання препарату паразитичного гельмінту; (b) приведення препарату паразитичного гельмінту в контакт с мішенню та (с) визначення рівня внутрішнього маркера для активності регуляторних Τ клітин у мішені після контакту, де зміна рівня внутрішнього маркера після контакту є показовою для препарату паразитичного гельмінту, який змінює активність регуляторних Τ клітин. В іншому втіленні даний винахід забезпечує спосіб лікування тварини з захворюваннями, пов'язаними з Th1 або Тh2, шляхом введення препарату паразитичних гельмінтів, який змінює активність регуляторних Τ клітин у цієї тварини. В іншому втіленні даний винахід забезпечує спосіб для моніторингу лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів щодо аутоімунного або алергічного захворювання у тварини, який включає: (а) введення композиції, яка включає препарат паразитичних гельмінтів або його фракцію тварині; та (b) визначення рівня активності регуляторних Τ клітин у тварини після введення, де підвищення рівня активності регуляторних Τ клітин після введення є показовим для лікувальної ефективності препарату паразитичних гельмінтів Бажано, коли захворювання, яке піддають лікуванню, представляє собою таке, що вибране з групи, яка включає: запальне захворювання кишечнику, ревматоїдний артрит, вовчак, підлітковий інсулінозалежний цукровий діабет (типу 1), саркоїдоз, множинний склероз, астму та алергічний риніт. Маркер регуляторних Τ клітин може представляти собою внутрішній маркер, маркер клітинної поверхні або маркер, який секретується. Бажано, коли внутрішній маркер представляє собою Scurfin, Smad7, Gata3, Tbet (Tbx21). Також є бажаним, коли маркер клітинної поверхні є вибраним з групи, яка складається з: CD4, CD45RBlo, CD45Rc, антигену 4, асоційованого з цитотоксичними лімфоцитами (CTLA-4), CD25, CD103, CD62L, αΕβ інтегрину, пептиду, асоційова 94023 8 ного з латентним станом (LAP), білка, спорідненого з родиною рецептора TNF, що індукується глюкокортикоїдом (GITR), експериментального алергічного енцефаліту (ЕАЕ), хемокінового рецептора CCR5, TI-ST2. Також є бажаним, коли маркер, який секретується, представляє собою IL-5, EL-10 або TGF. Фігура 1. Фігура описує концентрації IFN, IL-4 та IL-5, виміряні у супернатантах селезінки мишей, інфікованих М. avium, S. mansoni або обома організмами згідно з одним втіленням винаходу. Спленоцити (4 x 105/комірка) культивували in vitro протягом 48 годин при 37°С в 200 мкл середовища у присутності чи за відсутності оптимальних концентрацій PPD або SEA. Секрецію цитокіну кількісно оцінювали за допомогою ELISA. Фігура 2. Фігура описує концентрації ΙΡΝ та IL4 у супернатантах клітин гранульоми у мишей, інфікованих М. avium, S. mansoni або обома організмами згідно з одним втіленням винаходу. Клітини гранульоми (4 x 105/комірка) культивували in vitro протягом 48 годин при 37°С в 200 мкл середовища у присутності чи за відсутності оптимальних концентрацій PPD або SEA. Секрецію цитокіну кількісно оцінювали за допомогою ELISA. Фігура 3. Фігура описує сироваткові рівні IgG1, IgE та IgG2a, які вимірювали у мишей, інфікованих М. avium, S. mansoni або обома організмами (одночасно) згідно з одним втіленням винаходу. Концентрації імуноглобуліну визначали за допомогою ELISA. Фігура 4. Фігура показує, що лікування за допомогою IL-4 може вилікувати мишей від хронічної інфекції Н. polygyrus згідно з одним втіленням винаходу. Миші одержували три ін'єкції комплексу IL4, починаючи від 12 дня перед забиттям. Дані представляють собою середнє значення +/- стандартна похибка для багатократних вимірювань. Фігура 5: Дані представляють середнє значення показника запалення ± стандартне відхилення, які одержані з трьох експериментів аналізу > 4 миші дикого типу (WT)/ група згідно з одним втіленням винаходу. Фігура 6: Згідно з одним втіленням винаходу WT миші без IBD були колонізовані за допомогою Н. polygyrus. Контролі одержували симулятивне інфікування при годуванні через зонд. LPMC ізолювали від ТІ та культивували протягом 48 годин in vitro зі стимуляцією або без стимуляції антиСD3/анти-СD28. Кількість ΙFΝ в супернатантах вимірювали за допомогою ELISA. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 7: Згідно з одним втіленням винаходу WT мишей піддавали обробці, як представлено на Фіг. 2. Ізольовані LPMC культивували протягом 48 годин in vitro з CpG оліго для поліпшення продукції IL12. IL12 вимірювали за допомогою ELISA. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 8: Згідно з одним втіленням винаходу WT мишей без IBD колонізували за допомогою Н. polygyrus. Контролі одержували симулятивне інфі 9 кування при годуванні через зонд. LPMC ізолювали та культивували на 2 тижні більше, ніж представлено на Фігурі 2. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 9: Згідно з одним втіленням винаходу WT мишей без IBD колонізували за допомогою Н. polygyrus. LPMC ізолювали та культивували протягом 48 годин in vitro з анти-СD3/анти-СD28 +/IL10R моноклональним антитілом. IFN в супернатантах вимірювали за допомогою ELISA. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка трьох незалежних експериментів. Фігура 10: Згідно з одним втіленням винаходу WT мишей без IBD колонізували за допомогою Н. polygyrus. Контролі одержували симулятивне інфікування при годуванні через зонд. LPMC ізолювали та культивували на 2 тижні більше, ніж представлено на Фігурі 2. Даніпредставляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 11: Згідно з одним втіленням винаходу WT мишей без IBD колонізували за допомогою Н. polygyrus. Контролі одержували симулятивне інфікування при годуванні через зонд. LPMC ізолювали та культивували на 2 тижні більше, ніж представлено на Фігурі 2. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 12: Згідно з одним втіленням винаходу WT мишей без IBD колонізували за допомогою Н. polygyrus. Контролі одержували симулятивне інфікування при годуванні через зонд. LPMC ізолювали з ТІ та культивували протягом 48 годин in vitro зі стимуляцією або без стимуляції LPS. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 9 визначень з трьох незалежних експериментів. Фігура 13: Згідно з одним втіленням винаходу Τ клітини ізолювали з диспергованих кишкових LPMC при використанні магнітних кульок. Фракції, збагачені Τ клітинами (Т клітини) та виснажені по Т-клітинах фракції (не Τ клітини) культивували протягом 48 годин in vitro з анти-СD3/анти-СD28 стимуляцією або без неї перед визначенням IFN у супернатантах. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 14: Згідно з одним втіленням винаходу WT неінфіковані миші одержували 2 x 107 MLN клітин від мишей, колонізованих за допомогою Н. polygyrus. Через один тиждень LPMC ізолювали від цих реципієнтів та культивували протягом 48 годин з анти-СD3/анти-СD28 стимуляцією або без неї перед визначенням IFN у супернатантах. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 6 визначень з двох незалежних експериментів. Фігура 15: Згідно з одним втіленням винаходу GFP WT мишей колонізували за допомогою Н. polygyrus. Через два тижні MLN клітини, одержані від цих GFP мишей, яких піддавали колонізації, переносили у нормальних C57BL/6 мишей за допомогою інтраперитонеального введення. Через 7 днів власну пластину слизової оболонки диспергу 94023 10 вали та перевіряли на клітини GFP + Τ під флуоресцентним мікроскопом. A) GFP + LP Τ клітини. В) Те саме поле під світловим мікроскопом. Фігура 16: Згідно з одним втіленням винаходу IL10-/- тварини одержували корм, що містить піроксикам, починаючи з п'ятитижневого віку. Через 2 тижні лікування припиняли введення піроксикаму та коліти оцінювали через 2 тижні Підібрані за віком IL10-/- контролі не одержували піроксикаму. (Контроль). Коліти підраховували у гістологічних зрізах за допомогою сліпого зчитування при використанні шкали від 0 до 4. А) Товста кишка контролю IL10-/- мишей. В) Товста кишка підібраних за віком мишей IL10-/- після обробки піроксикамом. С) Інфільтрація власної пластинки слизової оболонки товстої кишки CD4+ Τ клітинами після обробки піроксикамом (Н&Е 10Х, ІНС 20Х). Графічні дані представляють собою середні значення, одержані з 5 окремих експериментів, кожний з яких включав 5-6 мишей/група. Фігура 17: Згідно з одним втіленням винаходу фотознімки А, В та С показують типове запалення товстої кишки у мишей, оброблених піроксикамом, які не одержували Н. polygyrus. Фотознімки D, Ε та F показують поліпшення коліту через 2 тижні після одержання Н. polygyrus (усі Н&Е, 4Х). Коліти підраховували згідно зі шкалою 0 - 4. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 11 тварин, яких вивчали у двох окремих експериментах. Фігура 18: Згідно з одним втіленням винаходу миші IL10-/- з колітами одержували Н. polygyrus або симулятивну інфекцію, як описано для Фіг. 12. Через 2 тижні LPMC ізолювали та культивували протягом 48 годин in vitro з анти-CD3/анти-CD28 стимуляцією (ΙΡΝ) або з CpG оліго (IL12) або без неї. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 8-9 визначень з трьох незалежних експериментів. Фігура 19: Згідно з одним втіленням винаходу мишей IL10-/- з колітами піддавали обробці так, як представлено на Фіг. 13. Дані представляють собою середнє значення ± стандартна похибка для 9 визначень з трьох незалежних експериментів. Фігура 20: Згідно з одним втіленням винаходу A) MLN клітини, ізольовані від мишей IL10-/- через 2 тижні після одержання Н. polygyrus або симулятивної інфекції (контроль) з кормом, переносили (20 х 106) шляхом інтраперитонеальної інфекції у мишей, яких піддавали обробці піроксикамом. Через два тижні після переносу коліти оцінювали так, як представлено на Фіг. 12. В) MLN T клітини, ізольовані з контрольних та колонізованих мишей, переносили (5x106) у мишей з колітами. Дані представляють собою середні значення ± стандартна похибка для 9 мишей/група у двох незалежних експериментах. Фігура 21: Згідно з одним втіленням винаходу мРНК екстрагували з MLN клітин, ізольованих з IL10-/- мишей через 2 тижні після симулятивної інфекції або інфекції Н. polygyrus, яку вводили через зонд, через 2 тижні після симулятивної обробки або обробки піроксикамом. ПЛР у реальному часі для FoxpS нормалізували до HPRT мРНК (Способи). Примітка: Більш висока експресія вима 11 гає менше ПЛР циклів для досягнення порогового значення. Дані представляють собою середні значення ± стандартна похибка з трьох незалежних експериментів, у кожному з яких використовували 4 миші/група. Фігура 22: Згідно з одним втіленням винаходу мРНК екстрагували з MLN клітин IL10-/- мишей через 2 тижні після симулятивної інфекції або інфекції Н. polygyrus, яку вводили з через зонд. Нижчий рівень експресії вимагає більше циклів ПЛР циклів для досягнення порогового значення. Дані представляють собою середні значення ± стандартна похибка з трьох незалежних експериментів, у кожному з яких використовували 4 миші/група. Фігура 23. Схематична діаграма процедури для одержання антигену згідно з одним втіленням винаходу. Винахід охоплює спосіб скринінгу паразитичного препарату, який змінює активність регуляторних Τ клітин. Як використовується в даній заявці, термін «препарат паразитичних гельмінтів» включає, але не обмежується, будь-який препарат, що містить цілого паразита, екстракт паразита, жіночу зародкову клітину паразита, екстракт жіночої зародкової клітини паразита, яйце паразита, екстракт яйця паразита, личинку паразита, екстракт личинки паразита, церкарію паразита та екстракт церкарії паразита. «Паразитичний препарат» може також бути ізольованим білком, полінуклеотидом, вуглеводом або ліпідом, який має походження від паразиту та його екстракту. Як використовується в даній заявці, термін «вільний від специфічного патогена» застосовується до тварин, вирощених для використанні у даному винаході, коли тварини є відомими як такі, що є вільними від специфічного патогенного мікроорганізму, який може викликати захворювання у цільової тварини або людини. Способи вирощування тварин, які не мають патогену, є відомими в галузі техніки, наприклад, див. посилання, Brown та ін., A Bibliography on the Culture and Maintenance Specific Pathogen-Free Organisms, що є доступною на сайті http://www.ctsa.org/upload/publication/CTS А_116631681202959092495.pdf (введено в дану заявку як посилання). Brown та ін. забезпечує посилання для вирощування різних сільськогосподарських тварин та лабораторних тварин у SPF навколишньому середовищі, а також процедури та вимоги стосовно проектування споруд та утримання. Див. також М. Michael Swindle (J. Invest. Surg., 9: 267-271, 1996, що введено в дану заявку як посилання) для SPF процедури та списків декількох потенціальних вірусних та бактеріальних патогенів людини, які потребують уваги. Як використовується в даній заявці, термін «регуляторні Τ клітини» відноситься до популяції клітин лімфоцитів, які секретують, принаймні, у два рази більше (наприклад, у 3 рази більше, у 4 рази більше, у 5 разів більше, у 6 разів більше, у 8 разів більше, у 10 разів більше або ще більше) IL10 та/або TGF у порівнянні з Т-клітинами, які не піддавали впливу. Визначення IL-10 або TGF секреції є відомим в галузі техніки. Наприклад, це може бути визначено шляхом культивування клі 94023 12 тин in vitro протягом 24 або 48 годин зі стимулятором або без стимулятора Τ клітин, подібного антиСD3, та подальшого аналізу культуральних супернатантів для цих цитокінів при використанні специфічного для цитокінів ELISA. У доповнення до цього, регуляторні Τ клітини згідно з даним винаходом також характеризуються високим рівнем FoxP3 транскрипту у порівнянні з іншими типами Τ клітин (наприклад, Τ клітинами, які не піддавали обробці). «Високий рівень FoxP3 транскрипту» відноситься до, принаймні, чотирьохкратного підвищення рівня у порівнянні з іншими типами Τ клітин. FoxP3 визначається при використанні ПЛР у реальному часі або за допомогою кількісної ПЛР (наприклад, при використанні ПЛР праймерів CCCAGGAAAGACAGCAACCTT, TTCTCACAACCAGGCCACTTG (SEQ ID NO. 1), та міченого зонду 6FAMATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-TAMRA (SEQ ID NO. 2), як описано у Hori, S., Т. Nomura, та S. Sakaguchi. 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299: 1057-1061). Значення нормалізують до HPRT експресії, що представляє собою облігатний ген. Альтернативно, FoxP3 білковий продукт, Scurfm, може бути визначений за допомогою аналізу Вестерн-блоттінгу, як відомо з рівня техніки, наприклад, при використанні козячого анти-FoxP 3 (FoxP3) поліклонального антитіла (каталожний номер ab2481, Novus Biologicals, Littleton, CO). Необов'язково регуляторні Т клітини можуть продукувати набагато менше IFN у порівнянні з іншими Τ клітинами (наприклад, Т-клітинами, які не піддавали обробці), тобто, принаймні, у 3 рази менше, у 4 рази менше, у 5 разів менше, у 6 разів менше, у 8 разів менше, у 10 разів менше або ще менше. Також необов'язково регуляторні Τ клітини також можуть бути визначені при використанні внутрішньоцитоплазматичного проточного аналізу для визначення Τ клітин, які експресують IL10 та/або TGF, але мало або зовсім не експресують IFN. Додаткові необов'язкові маркери, як описано в даній заявці нижче, можуть також використовуватися для визначення регуляторних Τ клітин або активності регуляторних Т-клітини. Як використовується в даній заявці, термін «Т клітини, які не піддавали обробці» відноситься до Τ клітин, які утворилися за допомогою продукції імунної системи свіжих клітин у кістковому мозку. Τ клітини, які не піддавали обробці, відповідають на нові патогени, що містять антигени, з якими імунна система ще не зустрічалася до цього. Τ клітини, які не піддавали обробці, можуть бути ідентифіковані згідно з методами, які є відомими з рівня техніки (для огляду див., наприклад, Tough та ін., 1999, Immunol Rev. 170: 39-47; Itano та ін., 2003, Nat Immunol. 4 (8): 733-9; Berard та ін., 2002, Immunology. 106 (2): 127-38). Як використовується в даній заявці, термін «паразитичний препарат, який змінює активність регуляторних Τ клітин» відноситься до паразитичного препарату, який змінює активність регуляторної Τ клітини в мішені, принаймні, на 40%, наприклад, 50%, 80%, 100%, у 2 рази, у 4 рази, у 6 разів, у 8 разів, у 10 разів або більше при контакті з мі 13 шенню у порівнянні з активністю регуляторних Τ клітин у мішені при відсутності контакту з паразитичним препаратом. Активність регуляторних Τ клітин може бути виміряна шляхом моніторингу рівня внутрішнього маркера регуляторних Τ клітин (наприклад, транскрипційного фактора, такого, як FoxP3 мРНК або його білкового продукту Scurin, Smad7, Gata3 або Tbet (Tbx21)), або поверхневого маркера регуляторних Τ клітин (наприклад, CD4, CD45RBlo, CD45Rc, антиген 4, асоційований з цитотоксичними Τ лімфоцитами (CTLA-4), Ох40, 41ВВ, CD25, CD 103, CD62L, Εβ інтегрин, пептид, асоційований з латентним станом (LAP), білок, споріднений з родиною рецептора TNF, що індукується глюкокортикоїдом (GITR), експериментального алергічного енцефаліту (ЕАЕ), хемокінового рецептора CCR5, TI-ST2) або маркера, що секретується (наприклад, IL4, IL13, IL-5, IL-10, TGF). Підвищена активність регуляторних Τ клітин може бути представлена підвищенням (наприклад, FoxP3, Ох40, 4-1ВВ, CD4, CTLA-4, CD25, CD103, CD62L, Εβ інтегрин’ LAP, GITR, EAE, CCR5, TIST2, L-10, TGF) або зниженням (наприклад, D45Rc) рівня маркера регуляторних Τ клітин, на, принаймні, 40%, наприклад, 50%, 80%, 100%, у 2 рази, у 4 рази, у 6 разів, у 8 разів, у 10 разів або більше, як вимірюється згідно зі способами, відомими з рівня техніки та так, як описано в даній заявці. Бажано, коли паразитичний препарат, який змінює активність регуляторних Τ клітин змінює рівень двох або більше маркерів, як описано в даній заявці вище. Як використовується в даній заявці, термін «рівень маркера регуляторних Τ клітин» відноситься до кількості специфічного маркера регуляторних Τ клітин у мішені, наприклад, виміряного у мікрограмах або у молярних кількостях. Типово, маркер регуляторних Τ клітин представляє собою білок, кількість якого може бути виміряна за допомогою будь-якого зі способів, що відомі з рівня техніки для кількісного визначення білка, наприклад, за допомогою ELISA, Вестерн-блоттінгу, імунопреципітації, радіоімуноаналізу або FACS аналізу (що описані, наприклад, в Innis та ін. (1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2-е вид., Sambrook, та ін. (1989); та Current Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel та ін., John Weley & Sons, Inc.). Рівень білкового маркера може також бути виміряний на півні його мРНК згідно зі способами, які є відомими з рівня техніки, наприклад, за допомогою нозерн-блоттінгу, кількісної RT-ПЛР, мікроматричного аналізу (наприклад, як описано в Innis та ін., (1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2-е вид., Sambrook, та ін. (1989); та Current Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel та ін., John Weley & Sons, Inc.). Як використовується в даній заявці, термін «мішень» відноситься до in vitro системи (наприклад, культивованої тканини або клітин, транскрипційного/трансляційного екстракту) або до in vivo системи (наприклад, тварини). Бажано, коли мішень представляє собою in vivo систему, яка містить тваринну клітину, вклю 94023 14 чаючи людську клітину. Більш бажано, коли мішень представляє собою тварину. Навіть більш бажано, коли мішень представляє собою ссавця. Ще більш бажано, коли мішень представляє собою людину. Винахід також охоплює спосіб запобігання захворюванню, яке спричинене зміненою імунною відповіддю у тварини, який включає введення препарату паразитичних гельмінтів у кількості, яка є достатньою для запобігання або лікування захворювання у тварини. Як використовується в даній заявці, термін «захворюванню, яке спричинене зміненою імунною відповіддю у тварини» відноситься до захворювання, яке розвивається у тварини (наприклад, людини) завдяки відмінності в її імунній відповіді у порівнянні з твариною, яка не має захворювання. Наприклад, хвора тварина може мати аномальну (наприклад, надлишкову або недостатню) імунну відповідь на антиген (наприклад, власний або не власний антиген) у порівнянні з відповіддю на той самий антиген у нормальної не хворої тварини. Термін «захворювання, спричинене зміненою імунною відповіддю» згідно з даним винаходом включає, але не обмежене, пов'язане з Th1 захворювання або захворювання, пов'язане з Th2, як описано в даній заявці. Як використовується в даній заявці, термін «пов'язане з Th1 захворювання» відноситься до захворювання, при якому забезпечення, пов'язане з Th1 клітинами, викликає або опосередковує хворобливий процес, або при якому Th1 клітини втягнені у лікування або полегшення симптомів захворювання, яке може бути представлене підвищеною або зниженою активністю Th1. Під «підвищеною» розуміють, що хвора тварина має збільшення (наприклад, принаймні у 2 рази, та можливо, у 5 разів, у 6 разів, у 8 разів, у 10 разів або більше) своєї Th1 активності у порівнянні з іншою твариною, яка не має захворювання. Підвищена Th1 активність може бути виміряна за допомогою збільшення рівня секретованих цитокінів (наприклад, IL-2, IFN-, TNF, IgG2a, IL-12, IL-18, IL-23) або зниження рівня секретованих цитокінів (наприклад, IL-4, IL-13) згідно зі способами, які відомі з рівня техніки. Під «зниженим» розуміють, що хвора тварина має зниження (наприклад, принаймні, на 50%, або у 2 рази, та можливо, у 5 разів, у 6 разів, у 8 разів, у 10 разів, або нижче) своєї Th1 активності у порівнянні з іншою твариною, яка не має захворювання. Знижена Th1 активність може бути виміряна за допомогою зниження рівня секретованих цитокінів (наприклад, IFN-, TNF, IgG2a) або підвищення рівня секретованих цитокінів (наприклад, IL-4, IL-13) згідно зі способами, які відомі з рівня техніки, та так, як описано в даній заявці та патентних заявках США з реєстраційними номерами 09/209,732 та 09/362,598, посилання на які введено в дану заявку у своїй цілісності. Як використовується в даній заявці, «знижений» використовується з терміном «зменшений», замінюючи один на одний, а термін «підвищений» використовується з терміном «збільшений», замінюючи один на одний. 15 Як використовується в даній заявці, термін «захворювання, пов'язане з Th2» відноситься до захворювань, при яких забезпечення, пов'язане з Th2 клітинами, викликає або опосередковує хворобливий процес, або при якому Th1 клітини втягнені у лікування або полегшення симптомів захворювання, яке може бути представлене підвищеною або зниженою активністю Th2. Під «підвищеною» розуміють, що хвора тварина має збільшення (наприклад, принаймні у 2 рази, та можливо, у 5 разів, у 6 разів, у 8 разів, у 10 разів або більше) своєї Тh2 активності у порівнянні з іншою твариною, яка не має захворювання. Підвищена Th2 активність може бути виміряна за допомогою збільшення рівня секретованих цитокінів та антитіл (наприклад, IL-4, IL-5, IgE та IgG1) згідно зі способами, які відомі з рівня техніки. Під «зниженим» розуміють, що хвора тварина має зниження (наприклад, принаймні, на 50%, або у 2 рази, та можливо, у 5 разів, у 6 разів, у 8 разів, у 10 разів або нижче) своєї Th2 активності у порівнянні з іншою твариною, яка не має захворювання. Знижена Th2 активність може бути виміряна за допомогою зниження рівня секретованих цитокінів та антитіл (наприклад, IL-4, IL-5, IgE та IgG1) згідно зі способами, які відомі з рівня техніки, та так, як описано в даній заявці та в патентних заявках США з реєстраційними номерами 09/209,732 та 09/362,598, посилання на які введено в дану заявку у своїй цілісності. Як використовується в даній заявці, термін «ефективність лікування» відноситься до результативності лікування захворювання при використанні паразитичного препарату. «Ефективність лікування» звичайно вимірюється за допомогою клінічної відповіді на специфічне захворювання, для лікування якого тварину піддавали або піддають лікуванню за допомогою такого паразитичного препарату. Корисні гельмінтні паразити включають, але не обмежені, дві групи. Перша група представляє собою гельмінтних паразитів, які в природі колонізують людей, а друга група представляє собою гельмінтних паразитів, які колонізують тварин, але можуть забезпечувати захист для людей. У першій групі гельмінтні паразити є детально розробленими багатоклітинними глистами зі складними життєвими циклами та розвитком. Нематоди (несегментовані кільчасті черви) та платигельмінти (плоскі глисти) представляють собою дві групи гельмінтів, які колонізують кишечник людини. У відповідності до даного винаходу будь-який з ряду гельмінтних паразитів, що у природі колонізують людей або тварин, буде забезпечувати заплановані результати. Нематоди, які часто населяють травний тракт людини представляють собою Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis (гострик), Trichuris trichiura (власоглав), Ancylostoma duodenale та Necator americanus (анкілостоми), та Strongyloides stercoralis. Trichinella spiralis заражає тонкий кишечник. Платигельмінти включають трематод та цестод. Найбільш загальні дорослі трематоди, які населяють тонкий кишечник людини, представляють 94023 16 собою види Fasciolopsis, Echinostoma та Hetewphyes. Такі, що живуть у системі жовчного міхура, включають Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini rafelineus та Fasdola hepatica. Schistosoma перебуває у венозній системі, але деякі види хронічно уражують кишечник при проходженні яєць через стінку кишечнику. Дорослі цестоди, які в загальному випадку інфікують людей, представляють собою види Diphyllobothrium (риб'ячий стрічковий черв'як), Taenia saginata (бичачий солітер), Taenia solium (свинячий солітер) та Hymenolepsis папа (карликовий солітер). Інші гельмінти, які представляють інтерес, включають філяріозних паразитів та легеневих сисунів. Ці паразити не мають кишечної фази, але стимулють сильну відповідь Тh2-типу. Друга загальна група гельмінтних паразитів, що можуть використовуватися у даному винаході, включає гельмінтів, які колонізують тварин, але можуть забезпечувати захист людей проти захворювань, опосередкованих імунітетом. Такі паразити включають Trichuris muris (мишачий солітер), Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis, Heligtnonsomoides poly gyms та Hymenolepsis nаnа, які усі є кишковими гельмінтами, що інфікують мишей. Крім того, Angiostrongylus представляє собою гельмінта пацюків. Trichuris suis та Ascaris suum є гельмінтами свиней, що можуть інфікувати людей. Trichuris vulpis, види Toxocara, Gnathostoma та Ancylostoma є гельмінтами собак або котів, що також можуть інфікувати людей. Anisakis та Pseudoterranova представляють собою нематоди морських ссавців, які можуть передаватися людям. Пташині шистосоми можуть тимчасово інфікувати людей. Такі шистосоми включають S. douthitti, Trichobilharzia ocellata, Т. stagnicolae, Т. physellae та Gigantobilharzia huronensis. Гельмінтний препарат може бути вибраним з групи, яка складається з гельмінтів, які в природі колонізують людей, та гельмінтів, які колонізують тварин, але можуть захищати людей або тварин від захворювання, спричиненого зміненою імунною відповіддю. У деяких втіленнях даного винаходу гельмінтний паразит представляє собою нематоду та може бути вибраний з групи, що включає Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale та Necator americanus, Strongyloides stercoralis та Trichinella spiralis. В інших втіленнях винаходу гельмінтний паразит представляє собою плоский гельмінт (платигельмінт) та може бути вибраний з групи, яка складається з трематод та цестод, таких, як види Fasciolopsis, Echinostoma та Heterophyes, Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, Fasciola hepatica, види Schistosoma, види Diphyllobothrium, Taenia saginata, Taenia solium та Hymenolepsis nаnа. В інших втіленнях гельмінтний паразит є вибраним з групи, яка складається з філяріозних паразитів та легеневих сисунів. У бажаних втіленнях гельмінтні паразити є вибраними з групи, яка складається з Trichuris muris, 17 Trichinella spiralis, Nippostrongylus prasiliensis, Heligmonsomoides polygyrus, Hymenolepsis nanan, видів Angiostrongylus, Trichuris suis, Ascaris suum, Trichuris vulpis, видів Тохосага, видів Gnathostoma, видів Ancylostoma, видів Anisakis та видів Pseudoterranova. Є бажаним, щоб тварини для одержання паразитів та препарату були вирощені у специфічному навколишньому середовищі, вільному від патогенів (SPF) (наприклад, вільному від специфічних патогенів людини). Захворювання, які піддаються лікуванню згідно з винаходом Приклади захворювань, які піддаються лікуванню згідно з винаходом, включають, але не обмежені, захворювання, пов'язані з Th1, та захворювання, пов'язані з Th2, у тому числі види раку, що пов'язані з Th1 або Th2. Захворювання, пов'язані з Th1 Захворювання, пов'язані з Th1, включають наступні групи захворювань: інфекційні захворювання, аутоімунні захворювання, захворювання гіперчутливості відстроченого типу та рак. Група інфекційних захворювань включає захворювання, спричинені паразитами та вірусами, такими, як ВІЛ. Група аутоімунних захворювань включає енцефаломієлопатичні, демієлінізуючі та інші аутоімунні захворювання. Приклади енцефаломієлопатичних захворювань включають, але не обмежені, множинний склероз (MS); розсіяний склероз; вогнищевий склероз; острівковий склероз; прогресуючу рухому атаксію (сухотка спинного мозку); гострий та хронічний експериментальний алергічний (або аутоімунний) енцефаломієліт (ЕАЕ), що представляє собою тваринну модель MS; гострий первинний ідіопатичний поліневрит; експериментальний алергічний неврит (тваринна модель гострого первинного ідіопатичного поліневриту); гострий розсіяний енцефаломієліт; міалгічний енцефаломієліт (доброякісний та епідемічний); вірусний енцефаломієліт; грануломатозний енцефаломієліт; тощо. Сюди також включаються захворювання тварин, такі як, але без обмеження, собача чума; кошача чума; конячий енцефаломієліт (східний, венесуельський та західний); пташиний енцефаломієліт; свинячий енцефаломієліт; бичачий енцефаломієліт; мишачий енцефаломієліт; тощо. Приклади демієлінізуючих захворювань включають, але не обмежені, множинний склероз (MS), розсіяний склероз (DS), гострий розсіяний енцефаломієліт, прогресивну багатофокальну лейкоенцефалопатію (PML) та підгострий склеротичний паненцефаліт (SSPE). Приклади інших аутоімунних захворювань включають множинний склероз (MS), поліартритну нодозну астму, гіперчутливий пульмоніт, інтерстиціальне захворювання легень, саркоїдоз, ідіопатичний легеневий фіброз, інтерстиціальне захворювання легень, асоційоване з хворобою Крона або виразковим колітом, або захворюванням Уїпла, інтерстиціальне захворювання легень, асоційоване з грануломатозом Вегенера або гіперчутливим васкулітом, 94023 18 синдроми васкуліту, пурпуру ХеночаШонлейнса, синдром Гудпасчура, грануломатоз Вегенера, ниркові захворювання, такі, як опосередкована антитілами гломерулопатія, така, як при гострому гломерулонефриті, нефрит, асоційований з системним еритематозним вовчаком (SLE), нефрит, асоційований з іншими системними захворюваннями, такими, як грануломатоз Вегенера та синдром Гудпасчура, та змішане захворювання сполучних тканин, хронічний інтерстиціальний нефрит, хронічний гломерулонефрит, шлунково-кишкові захворювання (наприклад, IBD), такі, як хвороба Крона, виразковий коліт, глютенова ентеропатія, захворювання Уїпла, колагенозний коліт, еозинофільний коліт, лімфоцитарний коліт, гепатобіліарні захворювання, такі, як аутоімунний гепатит, гепатит, індукований алкоголем, періпортальний фіброз, первинний біліарний цироз, склеротизуючий холангіт, шкірні захворювання, такі, як псоріаз, атопічний дерматит, екзема, алергічне захворювання шкіри, прогресивний системний склероз (склеродерма), лускатий дерматит, звичайна пузирчатка, захворювання суглобів, такі, як ревматоїдний артрит (RA), анкілозуючий спондиліт, артрит, асоційований з псоріазом або запальним захворюванням кишечнику. скелетно-м'язові захворювання, такі, як астенічний бульбарний параліч (MG), поліміозит, ендокринні захворювання, такі, як інсулінозалежний цукровий діабет (IDDM), аутоімунний тиреойодит (Хашимото), тиреотоксикоз, гіпертироїдизм (хвороба Граве), захворювання гематопоетичної системи, такі, як аутоімунна анемія, аутоімунна тромбоцитопенія, аутоімунна апластична анемія, серцево-судинні захворювання, такі, як кардіоміопатія, васкуліт, серцево-судинне захворювання, асоційоване з системними захворюваннями, такими, як системний еритематозний вовчак, нодозний поліартрит, ревматоїдний артрит, склеродерма, саркоїдоз, Визначною характеристикою аутоімунних захворювань є їх спадкова кластеризація та асоціація з експресією певних генів, зокрема, генів класу І та класу II основного комплексу гістосумісності (МНС). Наприклад, велика частина пацієнтів з MS мають HLA-DR2 гаплотип (Beall S S, Concannon Ρ, Charmley Ρ, та ін., J. Neuroimmunol., том 21, стор. 59-66, 1989). Оскільки не усі суб'єкти з чутливим генотипом розвивають аутоімунне захворювання, виявляється, що фактори навколишнього середовища також відіграють основну роль. Наприклад, MS, як виявляється, є найбільш звичайним явищем у суб'єктів, які живуть у районах з м'яким кліматом (Kurtzke J F, IN: Multiple Sclerosis, Hallpike J F, Adams С W M, Tourtelotte W W, ред., Williams та Wilkins, Baltimore, Md., 1983, стор. 49-95). До цих пір вважається, що фактор навколишнього середовища для аутоімунних захворювань може представляти собою інфекційний агент, такий, як вірус. Етіологія деяких захворювань людини та тварин може бути приписана вірусній інфекції. Наприклад, 19 мишачий енцефаліт Тейлера представляє собою демієлінізуюче захворювання з клінічними та патологічними симптомами, подібними до таких ЕАЕ. Незважаючи на те, що антитіла є втягненими у деякі ефекторні відповіді при аутоімунних захворюваннях, запуск у більшості випадків починається з активації CD4 Τ клітин, які є необхідними для дозрівання В клітин та клонального розмноження. Група гіперчутливості відстроченого типу включає контактну гіперчутливість до речовин з низькою молекулярною вагою. А. Запальні захворювання кишечнику (CD та UC): Епідеміологічні дані передбачають генетичну чутливість до розвитку хвороби Крона (CD) та виразкового коліту (UC). Частота виникнення CD у промислових країнах підвищилася з 1950-их років до середини 1980-их, та зараз ця величина складає від 1 до 8 на 100000 осіб на рік. Це дає змогу запропонувати, що невідомі зміни у нашому оточенні впливають на частоту виникнення CD. Оскільки причина виникнення IBD залишається невизначеною, то це передбачає що вона виникає внаслідок порушення регуляції імунної системи слизової оболонки кишечнику. Запальні клітини у слизовій оболонці у нормі захищають нас від вмісту кишечнику. Таке ефективне хронічне запалення вузько контролюється для обмеження пошкодження тканини. IBD може виникати з причини неприйнятно інтенсивних імунних відповідей на фактори вмісту кишечнику. CD, як виявляється, представляє собою сильне запалення Th1-типу, яке викликає утворення IFN- та TNF. Природа UC не так добре визначена. Виразковий коліт (UC) та хвороба Крона (CD) представляють собою розлади, що мають комплексне походження, яке спричинене взаємодією погано визначених факторів впливу навколишнього середовища та, принаймні, у деяких випадках спричинене успадковуванням генів чутливості. Підтвердженням генетичної схильності до IBD, що часто приводиться, є те, що частота виникнення IBD є вищою за ту, яку можна очікувати у членів родини пацієнтів, які мають цей стан, а також високим ступенем поширення цього захворювання у єврейських популяціях західних країн (Roth MP, Petersen GM, McElree С та ін. Geographic origins of Jewish patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1989; 97 (4): 900-4). Поки що IBD набагато менше поширене у єврейській популяції Ізраїлю (Fireman Z, Grossman A, Lilos Ρ та ін. Epidemiology ofCrohn's disease in the Jewish population of central Israel, 1970-1980. Am J Gastro 1989; 84 (3): 255-8) з подібним етнічним походженням (Grossman A, Fireman Z, Lilos Ρ та ін. Epidemiology ofulcerative colitis in the Jewish population of central Israel 1970-1980. HepatoGastroenterology 1989; 36 (4): 193-7). Дослідження Твіна забезпечують підтвердження генетичної схильності, принаймні, для CD (Halfvarson J, Bodin L, Tysk С та ін. Inflammatory bowel disease in a Swedish twin cohort: a long-term follow-up of concordance and clinical characteristics. Gastroenterology 2003; 124 (7): 1767-73.). Генетичний дефект у CARD15/NOD2, внутрішньоклітинно 94023 20 му білку, що сприймає бактеріальний продукт мурамілдипептид (Inohara Μ, Ogura Y, Fontalba А та ін. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2: implications for Crohn's disease. J Biol Chem 2003; Girardin SE, Boneca IG, Viala J та ін. Nod2 is a general sensor ofpeptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J Biol Chem 2003), робить деяких людей більш чутливими до CD. Різноманітні інші генетичні зміни пропонуються як IBD фактори ризику. Поки що генетична схильність не пояснює швидкого росту частоти виникнення захворювання. Існує декілька тваринних моделей хронічного кишкового запалення, наприклад, як вказано Elliott та ін. (Elliott та ін., 1998, Inflammatory Bowel Disease and Celiac Disease. In: The Autoimmune Diseases, третє вид., N.R. Rose та I.R. MacKay, ред. Academic Press, San Diego, CA). Важливим доказом є нещодавнє відкриття, яку полягає у тому, що деякі миші з генетично створеними делеціями можуть розвивати хронічне запалення кишечнику, подібне до IBD, див. Elson та ін., 1995, Gastroenterology 109: 1344. Такі включають мутантних мишей, які несуть націлені делеції для IL-2, IL-10, МНС класу II або TCR генів серед інших. Використовуючи деякі моделі, Berg та ін., 1996, J. of Clin. Investigation 98:1010, Ludviksson та ін., 1997, J. of Immunol. 158: 104, та Mombaerts та ін., 1993, Cell 75: 274, показали, що порушена імунна система сама по собі може опосередковувати пошкодження кишечнику. Запалення слизової оболонки деяких з цих моделей індукує утворення великих кількостей IFN- та TNF-, що дає змогу запропонувати, що надлишок продукції цитокінів Th1 типу є загальним механізмом, що лежить в основі патогенезу захворювання. Крім того, блокування Th1 схеми запобігає запаленню. CD представляє собою Th1 відповідь. Таким чином, ці моделі можуть мати безпосередні наслідки, які стосуються імунопатології цього процесу захворювання людини. B. Ревматоїдний артрит (RA): RA представляє собою хронічне захворювання, яке характеризується персистентним запальним синовітом, що звичайно втягує периферичні суглоби при симетричному поширенні. Це запалення може приводити до руйнування кісток, пошкодження хрящів та деструкції суглобів. Ревматоїдний артрит є хворобою, що уражує приблизно 1% населення. Схильність до цього захворювання збільшується з віком, при цьому жінки піддаються цьому захворюванню частіше, ніж чоловіки. Поширення RA представляє собою імунологічно опосередковану подію, що приводиться у дію за допомогою CD4+ Th1 клітин. C. Інсулінозалежний ювенільний цукровий діабет (DM) (тип 1): Тип 1 DM представляє собою захворювання, яке звичайно починається в ранньому дорослому віці, і має причиною нездатність продукувати інсулін у відповідь на підвищення рівня цукру у крові. Такий персистентний високий рівень цукру у крові та нездатність до власного метаболізму глюкози викликає метаболічні порушення, які з часом приводять до пошкодження очей, нирок, серця та ін 21 ших органів. Приймаючи інсулін парентерально, можна частково контролювати ці метаболічні проблеми. DM типу 1 виникає внаслідок аутоімунної атаки на бета клітини підшлункової залози, які є джерелом інсуліну. Активовані макрофаги та цитотоксичні Τ клітини оточують та руйнують бета клітини підшлункової залози. Генетична схильність та, в меншій мірі, певні умови навколишнього середовища запускають процес захворювання. D. Еритематозний вовчак (LE): LE представляє собою системне аутоумінне захворювання, що найбільш часто зустрічається у жінок в дорослому ранньому - середньому віці. Пошкодження тканини спричинене антитілами та гіперреактивними регуляторними Т клітинами. Аномальна імунна відповідь приводить до безперервної продукції патогенних антитіл та імунних комплексів. Це веде до пошкодження м'язовоскелетної, шкірної, гематологічної, ниркової та інших систем. Аномальна імунна відповідь, ймовірно, залежить від взаємодії між множини спадкових факторів та факторів навколишнього середовища. Е. Саркоїдоз: Саркоїдоз представляє собою хронічне грануломатозне захворювання легенів та інших органів невідомої причини. Більшість пацієнтів має вік від 20 до 40. Найбільш частий симптом представляє собою коротке дихання. Захворювання виникає внаслідок гіперболізованої клітинної імунної відповіді Th1 типу, ймовірно, на обмежену кількість антигенів. Саркоїдоз є поширеним у всьому світі та уражує усі раси. Проте існують значні відмінності у схильності до саркоїдозу серед певних етнічних та расових груп. Наприклад, захворювання є рідким у Польщі, Південно-східній Азії та Індії. Г. Множинний склероз (MS): MS представляє собою хронічний рецидивуючий, багатовогнищевий запальний розлад центральної нервової системи, що веде до вогнищевої демієлінізації та рубцювання мозку. Він представляє собою досить часте захворювання, на яке страждають 350,000 американців та яке починається в ранньому - середньому дорослому віці. MS представляє собою аутоімунне захворювання, яке опосередковане, принаймні, частково Th1 клітинами. Пошкодження MS мають схожість з тими, які індукуються відстроченою гіперчутливою відповіддю, яка втягує активовані Τ клітини та макрофаги. Це захворювання є характерним для помірного клімату, при цьому схильність до цього підвищується з віддаленням від екватору. Захворювання, пов'язані з Th2 Захворювання, пов'язані з Th2, включають наступні групи захворювань: алергічні захворювання та рак. Добре відомо, що генетично схильні індивідууми стають чутливими (алергічними) до антигенів, які походять з багаточисленних джерел навколишнього середовища, дії яких піддаються ці індивідууми. Алергічна реакція виникає тоді, коли попередньо сенсибілізований індивідуум повторно піддається впливу того самого або гомологічного алергену. Алергічні відповіді коливаються у межах від сінної лихоманки, ринокон'юнктивіту, риніту та 94023 22 астми до системного анафілактичного шоку та смерті у відповідь, наприклад, на ужалювання бджолами або шершнями або укуси комах. Реакція є негайною та може бути спричинена різноманітністю алергенів, таких, як сполуки, які мають походження від трави, дерев, бур'янів, комах, кліщів (які містяться у домашньому пилі), їжі, лікарських засобів, хімічних речовин та парфумів. Група алергічних захворювань включає сінну лихоманку, ринокон'юнктивіт, риніт та астму. Найбільш поширені алергени, до яких виникають алергічні реакції, включають інгаляційні алергени, які походять, наприклад, від дерев, трав, грибів, кліщів, домашнього пилу, кліщів, поширених у місцях зберігання продуктів, тарганів, шерсті тварин, пір'їв птахів та лупи. Важливі алергени пилку дерев, трав та бур'янів є такими, що мають походження від таксономічних порядків Fagales, Oleales та Pinales включаючи, наприклад, березу (Betula), вільху (Alnus), ліщину (Corylus), граб (Carpinus) та оливу (Оlеа), порядків Poales, включаючи, наприклад, трави родів Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis та Secale, порядків Asterales та Urticales, включаючи, наприклад, трави родів Ambrosia та Artemisia. Важливі інгаляційні алергени серед грибів представляють собою, наприклад, такі, що походять від родів Alternaria та Cladosporium. Інші важливі інгаляційні антигени є такими, що мають походження від кліщів домашнього пилу родів Dermatophagoides, кліщів, які поширені у місцях зберігання, роду Lepidoglyphys destructor, таких, що походять від тарганів, та таких, що походять від ссавців, таких, як коти, собаки, коні, корови, та птахів. Крім того, часто спостерігаються алергічні реакції на ужалювання або укуси комах, таких, як ті, що належать до таксономічного ряду Hymenoptera, включаючи бджіл, шершнів та мурашок. Специфічні алергенні компоненти є добре відомими спеціалісту у даній галузі техніки та включають, наприклад, Bet ν 1 (В. verrucosa, береза), Aln g 1 (Alnus glutinosa, вільха), Cor a 1 (Corylus avelana, ліщина) та Car b 1 (Carpinus betulus, граб) порядку Fagales. Інші представляють собою Cry j 1 (Pinales), Amb a 1 та 2, Art ν 1 (Asterales), Par j 1 (Urticales), Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Суn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol 1 1, Lol p 1 та 5, Pas n 1, Phi p 1 та 5, Poa p 1, 2 та 5, Sec с 1 та 5, та Sor h 1 (пилок різноманітних трав), Alt а 1 та Cha h 1 (гриби), Der f 1 та 2, Der p 1 та 2 (кліщі домашнього пилу D. farinae та D. pteronyssinus, відповідно), Lep d 1, Bla g 1 та 2, Per a 1 (таргани, Blatella germanica та Periplaneta americana, відповідно), Fel d 1 (коти), Can f 1 (собаки), Equ с 1,2 та 3 (коні), Apis m 1 та 2 (медоносна бджола), Ves g 1, 2 та 5, Pol a 1, 2 та 5 (усі шершні) та Sol і 1, 2, 3 та 4 (вогняний мураха), які є найбільш загальними. А. Астма У багатьох людей астма виникає як алергічна реакція на речовини, які звичайно вдихаються з повітрям, такі, як лупа тварин, пилок або кліщі пилу або продукти життєдіяльності тарганів. Різноманітність усіх названих речовин, алергенів відноситься до таких, що викликають алергічну реакцію. Деякі люди мають генетичну схильність до реакції 23 на певні антигени. У 1988 році за оцінками 17 мільйонів американців страждали на астму, що складає 6,4% населення. Діти нараховують 4,8 мільйонів американців з астмою. Доступні експериментальні та клінічні дані, одержані як на тваринних моделях, так і за допомогою клінічних досліджень стосовно патології астми людини, свідчать про те, що Th2 клітини втягнені у патологію цих захворювань. Види раку, пов'язані з Th1- та Th2В загальному випадку ракові клітини можуть викликати імунну відповідь на антигени, які специфічно експресуються раковою клітиною. Оскільки Th1 та Th2 імунні відповіді можуть викликати сильні запальні відповіді, що веде до цитотоксичного знищення тканини, модуляція Th1 або Th2 імунних відповідей може використовуватися для лікування раку. Види раку, які можуть піддаватися лікуванню за допомогою композиції згідно з даним винаходом, можуть бути гістогенетично класифіковані як злоякісні епітеліальні пухлини, включаючи карциноми та аденокарциноми, та як злоякісні пухлини не епітеліального походження, включаючи ліпосаркоми, фібросаркоми, хондросаркоми, остеосаркоми лейоміосаркоми, рабдоміосаркоми, гліоми, нейробластоми, медулобластоми, злоякісні меланоми, злоякісні менінгіоми, різні види лейкемій, різноманітні мієлопроліферативні розлади, різноманітні лімфоми (лімфома Ходжкіна та неходжкінська лімфома), гемангіосаркому, саркому Капоші, лімфангіосаркому, злоякісну тератому, дисгерміному, семіному та хорікарциному. Карциноми та аденокарциноми є найбільш численними (нараховують приблизно 90% смертей від раку) і, таким чином, представляють собою захворювання, що представляють інтерес для лікування/запобігання згідно з даним винаходом. Найбільш важливі карциноми та аденокарциноми є такими повітряних шляхів (зокрема, бронхіального походження), молочної залози, прямої кишки та шлунка. Проте карциноми та аденокарциноми передміхурової залози, яєчника, лімфоїдної тканини та кісткового мозку, матки, стравоходу, сечового міхура та нирки також викликають велику кількість смертей і тому також викликають інтерес. Група ракових захворювань додатково включає ретикулоз Сезарі, шкірну Т-клітинну лімфому, печінкову карциному та легеневий рак. Регуляторні T клітини у захворюваннях, які повязані з ТН1 або ТН2 Регуляторні Τ клітин можуть індукувати периферичну толерантність та обмежувати реактивність слизової оболонки (McGuirk Ρ, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells uprovoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23 (9): 450-5). В різноманітних тваринних моделях було продемонстровано декілька фенотипів регуляторних Τ клітин. Регуляторні Τ клітин експресують різноманітні маркери та були продемонстровані як такі, що втягнені у різноманітні захворювання (див, наприклад, Field, A. C, L. Caccavelli, Μ. F. Bloch, та В. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ Τ cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of 94023 24 Immunology. 170: 2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory Τ cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3): 223-32; Francois Bach J. Regulatory Τ cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3): 189-98; Curotto de LafailleMA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory Τ cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14 (6): 771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory Τ cells uprovoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23 (9): 450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug; 182: 135-48; Read S, Powrie F. CD4(+) regulatory Τ cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec; 13 (6): 644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory Τ cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep; 3 (11): 899-904). У деяких системах вони відрізняються диференціальною експресією поверхневих молекул, подібних CD25 (Shevach, Ε. Μ. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T-cells: more questions than answers. Nature Reviews.Immunology. 2: 389400), CD45RB (Annacker, О. та F. Powrie. 2002. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection. 4: 567-574), та CTLA-4 (Read, S., V. Malmstrom та F. Powrie. 2000. Cytotoxic Τ lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J. Exp. Med. 192: 295-302). Ця модель експресії білка поверхні клітин передбачає, що вони можуть бути у примованому ефекторному стані або у примованому стані пам'яті. Ці регуляторні клітини можуть опосередковувати деякі зі своїх впливів за допомогою продукції IL10 та TGF. Описуються анергічні регуляторні Τ клітини а(Тr1), які продукують високі рівні IL10 та TFG. Інші клітини, які називаються Th3, пригнічують індукцію експериментального аутоімунного енцефаломієліту, головним чином, через продукцію TGF TGF. Ще інші не залежать від розчинного IL10 або TGF, але замість цього експресують на своїй поверхні пептид, асоційований з латентністю, який представляє собою амінотермінальний домен пептидного попередника TGF (Oida Τ, Zhang X, Goto Μ та ін. CD4+CD25-T cells that express latency-associated peptide on the surface suppress CD4+CD45RB high-induced colitis by a TGF-beta-dependent mechanism. J Immunol 2003; 170 (5): 2516-22). Внутрішньоклітинні маркери були продемонстровані для регуляторних Τ клітин (Schubert LA, Jeffery Ε, Zhang Υ, Ramsdell F, Ziegler SF, Scurfin (FOXP3) acts as a repressor of transcription and regulates Τ cells activation. J Biol Chem. 2001 Oct 5; 276 (40): 37672-9). Усі наведені статті приведені як посилання. Rag мишей, який реконструювали за допомоhigh гою CD4+, CD45 T клітин, можуть розвивати тяжкий коліт, якому можна запобігти за допомогою сумісного переносу CD4+, CD45low Τ клітин (Annacker О, Powrie F. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection 2002; 4 (5): 567-74). TGF/3 та IL10 є необхідними для захисту, 25 що дає змогу передбачити роль цих цитокінів у регуляторному процесі. Препарати паразитичних гельмінтів згідно з винаходом Гельмінти представляють собою паразитичних тварин (глистів), які в залежності від видів живуть місцях, подібних просвіту кишечнику, у крові або мускулатурі хазяїна. Ці організми колонізують більше 1/3 населення усього світу. Колонізація гельмінтами є найбільш звичайною у дітей, які живуть у теплому кліматі та в антисанітарних умовах. Інфекційні форми цих організмів поширюються через контакт з зараженим ґрунтом, їжею або водою. До 1940-их років багато дітей та дорослих у Сполучених Штатах мали гельмінтів. Наявність глистів є найбільш загальною у сільських районах Півдня та у бідних популяціях в великих містах (Elliott DE, Urban JF, Jr., Argo CK та ін. Does the failure to acquire helminthic parasites predispose to Crohn's disease? FASEB J 2000; 14 (12): 1848-55). У Сполучених Штатах та у Європі колонізація гельмінтами постійно знижується. їх знаходять у нових іммігрантів з менш розвинутих країн (Salas SD, Heifetz R, Barrett-Connor E. Intestinal parasites in Central American immigrants in the United States. Arch Intern Med 1990; 150 (7): 1514-6) та в економічно бідних популяціях, які живуть у малозабезпечених районах Сполучених Штатів, подібним деяким індіанським резерваціям (Healy GR, Gleason NN, Bokat R та ін. Prevalence of ascariasis and ame bias is in Cherokee Indian school children. Public Health Rep 1969; 84 (10): 907-14). Поширення гельмінтів є найвищим у країнах з теплим кліматом та у скупчених популяціях, при антисанітарних умовах життя та забруднених продуктах харчування. Запальне захворювання кишечнику (IBD), ревматоїдний артрит та аутоімунні захворювання є рідкими в цих районах. Нематоди, які часто населяють шлунковокишковий тракт людини, представляють собою Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis (гострик), Trichuris trichiura (власоглав), Ancylostoma duodenale та Necator americanus (анкілостоми), та Strongyloides stercoralis. Trichinella spiralis інфікує тонкий кишечник в незначній мірі. Плоскі гельмінти включають трематод та цестод. Найбільш поширеними трематодами дорослих, що населяють кишечник людини, є види Fasciolopsis, Echinostoma та Heterophyes. Такі, які живуть у жовчній системі, включають Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini та felineus, та Fasciola hepatica. Schistosoma перебуває у венозній системі, але деякі види хронічно уражують кишечник при проходженні яєць через стінку кишечнику. Дорослі цестоди, які в загальному випадку інфікують людей, представляють собою види Diphyllobothrium (рибний стрічковий черв'як), Taenia saginata (бичачий солітер), Taenia solium (свинячий солітер) та Hymenolepsis папа (карликовий солітер) Хазяїн одержує різні види гельмінтів шляхом контакту з ґрунтом, продуктами харчування або водою, які заражені інфекційними формами паразиту. Діти найбільш часто одержують гельмінтні інфекції з причини їх тісного контакту з ґрунтом та 94023 26 недостатнього дотримання гігієнічних правил. Гельмінти стимулюють кишкову Th2 відповідь, яка може спричинити вигнання або обмеження амплітуди інфекції. Більшість дітей, які живуть у промислово не розвинутих країнах, мають цих паразитів. Багато видів гельмінтів живуть роками жити у травному тракті, жовчній системі або мезентеріальних венах, відкладаючи тисячі яєць кожного дня. Таким чином, починаючи з дитинства ці глисти та/або їх яйця вивільняють молекули, які контактують з поверхнею слизової оболонки кишечнику роками, стимулюючи запалення Тh2-типу. А. Вакцини життєздатних організмів: Життєздатні організми паразитичних гельмінтів можуть забезпечувати найбільш глибоку адаптацію слизової оболонки кишечнику, завдяки їх відносній довгостроковості у порівняні з компонентами вакцин. Життєздатні організми можуть вводитися або у формах яєць, личинок, церкарії або інкапсульованої личинки в залежності від гельмінту. Можуть використовуватися гельмінти, які можуть колонізувати людей та лабораторних тварин. Лабораторна тварина може потребувати проведення маніпуляцій для того, що забезпечити високу доступність для гельмінтів. Таке проведення маніпуляцій може включати лікування за допомогою агентів, що можуть бути імуносупресивними, подібно до глюкокортикоїдів або азатіотропіну; агентів, що протидіють Th2 ефектам, які подібні до антигістамінів, антицитокінів або рекомбінантних цитокінів; агентів, які впливають на моторику кишечнику, подібних антихолінергічним речовинам або опіатам. Корм тварин буде змінюватися для зниження вмісту грубих волокон. Тваринана може бути пацюком, свинею, хом'яком, птахом або іншою лабораторною твариною. Лабораторні тварини вирощуються у навколишньому оточенні, що є вільним від специфічних патогенів (SPF) (наприклад, специфічних для людини патогенів) згідно зі способами, відомими з рівня техніки. Вони можуть піддаватися аналізу для впевненості у відсутності бактеріальних, мікобактеріальних та вірусних патогенів людини. Способи для вирощування тварин у SPF навколишньому середовищі та перевага, яка забезпечується за допомогою цих способів, описані в галузі техніки, наприклад, М. Michael Swindle (J. Invest. Surg., 9: 267-271, 1996, що введено в дану заявку як посилання). Swindle також приводить список деяких потенціальних вірусних та бактеріальних патогенів людини, що потребують уваги. Згідно з цим паразитичні препарати, які одержані від тварин, вирощених у навколишньому оточенні, що є вільним від специфічних патогенів людини, не будуть мати цих патогенів людини, і таким чином відрізняються від паразитичних препаратів, одержаних від тварин, вирощених у будьякому SPF навколишньому середовищі. Яйця: Деяких кишкових гельмінтів набувають шляхом споживання життєздатних яєць. Гельмінти вирощуються в SPF лабораторних тваринах, наприклад, SPF свинях. Для збору яєць тварини одержують спеціальний корм з низьким вмістом грубих волокон. Тваринам вводять перорально послаблюючий засіб для індукції дефекації. Екск 27 ременти збирають та ферментативно перетравлюють для збору яєць. Яйця ізолюють зі зріджених екскрементів шляхом флотації у градієнті концентрації, відбирають за допомогою фільтрації, Візерфільтрації або центрифужного відстоювання. Способи зберігання яєць варіюють в залежності від гельмінту, який використовується. Яйця гельмінтів, які є стійкими до зневоднення, висушують, змішують з інертним матеріалом, вводять в кишкову капсулу та заморожують. Яйця гельмінтів, які є чутливими до зневоднення, зберігають за допомогою заморожування у рідкому середовищі або шляхом додання кріопротектора та заморожування у рідкому азоті. Життєздатні яйця промивають, змішують з охолодженою, вільною від лактози напіврідкою речовиною або іншими носіями для доставки. Яйця, які зберігаються з кріопротером на основі гліцерину, можуть не потребувати промивання. Яйця, одержані з кожної серії, піддають аналізу на швидкість вилуплювання з яєць для визначення ефективного дозування. Яйця, одержані з кожної серії, піддають аналізу на відсутність бакетріальних та вірусних патогенів Личинки: Деякі гельмінти (тобто анкілостоми) потребують стадії визрівання у ґрунті перед тим, як вони зможуть колонізувати людей. Яйця, одержані від цих агентів, будуть інкубуватися при оптимальних умовах до ембріональної зрілості або такі яйця вирощуватися до вилуплювання та забезпечують личинкові форми. Пацієнти можуть інокулюватися за допомогою підшкірної ін'єкції або перорального споживання життєздатних личинок. Церкарії: Деякі гельмінти мають складні життєві цикли, що втягують використання проміжного хазяїна. Проміжний хазяїн поширює форму, яка здатна колонізувати людей. Церкарії представляють собою форму для трематодних гельмінтів (тобто сисунів), яка поширюється проміжними хазяйськими організмами, подібними равликам. Церкарії ізолюють з колонізованих равликів, яких вирощували в умовах SPF. Церкарії промивають. їх зберігають шляхом додання кріопротектора та заморожування у рідкому азоті. Розморожені або свіжі церкарії промивають та вводять шляхом підшкірної ін'єкції для інокуляції пацієнта. Зразки з кожної партії аналізують на відсутність патогенів та для визначення ефективної дози. Інкапсульовані личинки: Деякі гельмінти (наприклад, солітери) утворюють інкапсульовану личинку або цистицерки у проміжних хазяйських організмах. Вони представляють собою форму личинки в оболонці, що ініціює колонізацію людини. Інкапсульовані личинки виділяються з проміжних хазяйських організмів, наприклад, худоби, риб або рослин, вирощених в SPF умовах. Цисти промивають у вільному від залишкової тканини хазяїна вигляді. Цисти можуть зберігатися шляхом додання кріопротектора та заморожування у рідкому азоті. Цисти розморожують або використовують свіжими, промивають, змішують з охолодженою напіврідкою речовиною, вільною від лактози, або іншим носієм для доставки та згодовують індивідуумам. Зразки з кожної партії аналізують на відсутність патогенів та для визначення ефективної дози. 94023 28 В. Вакцини на основі нежиттєздатного компоненту Нежиттєздатні компоненти гельмінтних паразитів забезпечують достатню Th2 адаптацію імунною відповіді для запобігання патології, опосередкованої Th1. Нежиттєздатні компоненти одержують з яєць, личинок або дорослих глистів. Нежиттєздатні інтактні яйця шистосоми забезпечують сильну Th2 відповідь. Яйця ізолюють з печінок лабораторних тварин (наприклад, хом'яків), вирощених в SPF умовах. Яйця ізолюють за допомогою способу, який представляє собою модифікацію того, що спочатку був описаний Coker та Lichtenberg, 1956, Proceedings of the Soc. For Exp. Biol. & Med. 92: 780. Модифікації полягають у тому, що використовують фосфатно-буферний сольовий розчин з глюкозою замість 1,7% фізіологічного розчину, для проведення етапів промивання та інкубації, а також зменшення часу аутолітичного перетравлювання. Такі зміни поліпшують ізоляцію життєздатних яєць. Спосіб полягає у наступному. Інфікували золотих хом'яків за допомогою 1000 - 1500 церкаріїв. Проводили визрівання інфекції (6-7 тижнів). Видаляли печінки з тварин та поміщали їх у 600 мОсм стерильний фосфатнобуферний розчин, який містить 5% глюкози, 100 од./мл пеніциліну та 100 мг/мл стрептоміцину. Печінки піддавали аутоперетравлюванню протягом 24 годин при кімнатній температурі. Здійснювали віброгомогенізацію печінок при низькій швидкості протягом 3 хвилин у охолодженому пристрої для змішування Waring. Інкубували гомогенат з колагеназою (2 мг/мл) та трипсином (2 мг/мл) при 32°С протягом однієї години. Фільтрували гомогенат через сито з розміром пор 50 та 80-100 меш для видалення грудок тканин та дебрису. Вилучали яйця з фільтрату за допомогою пропускання через сито 325 меш. Яйця не проходили через сито. Відбирали яйця з сита та поміщали у поліпропіленову центрифужну пробірку на 50 мл. Промивали яйця за допомогою низько швидкісного (400 x g) центрифугування у стерильному фосфатнобуферному розчині з 4% глюкози. Яйця повинні бути вільними від будь-якого колагенового дебрису. Підраховували аліквоти яєць у камері Седвіка на 1 мл для визначення загальної кількості яєць. Ізольовані яйця суспендували у фізіологічному розчині та заморожували у рідкому азоті без кріопротектора. Це вбиває яйця. Розморожені яйця вводили підшкірно, внутрішньом'язово або внутрішньовенно або у сайти Th1 запалення для індукції сильних Th2 відповідей. Також можна використовувати яйця від інших гельмінтів. Компонентні вакцини можуть також використовуватися так, як використовуються білки, ліпіди або вуглеводи, ізольовані з яєць паразитів. Приклад представляє собою розчинні антигени яєць шистосоми (SEA). Спосіб для одержання антигену яєць шистосоми був раніше описаний Boros та Warren, 1970, J. of Experimental Med. 132: 488 та коротко описується так, як приведено нижче. Промиті яйця ресуспендували у концентрації 50000 яєць/мл у забуференому фосфатом фізіологічному розчині. Цю суміш переносили до скля 29 ного гомогенізатора тканин. Яйця гомогенізували на льоду. Для того, щоб впевнитися, що усі оболонки та мірацидії були зруйновані, аліквоту (5 мл) видаляли для перевірки під мікроскопом. Переносили гомогенат в ультрацентрифужні пробірки. Центрифугували при 100,000 x g протягом 2 годин при 4°С. Відновлювали водну фракцію (SEA) та визначали вміст білка. Зберігали SEA у вигляді невеликих аліквот при -70°С. Цей спосіб може вимагати модифікації для ізоляції продуктів яєць паразитів, що сильно посилюють Th2 адаптацію, тобто для досягнення оптимально ефективної концентрації (100 мкг SEA або 10,000 яєць/тварина). Яйця або розчинні компоненти яєць використовують для ініціації Th2 відповідей або для підвищення Th2 відповідей, які попередньо були ініційовані за допомогою колонізації життєздатними гельмінтами. Яйця або компоненти яєць піддавали аналізу для підтвердження відсутності патогенів та ендотоксинів. Компонентні вакцини можуть також бути одержані з личинок та дорослих глистів гельмінтних паразитів. Личинки або глисти ізолюють з лабораторних тварин, вирощених у SPF умовах. Вакцини, які використовують нежиттєздатні інтактні організми або білки, ліпіди або вуглеводи, ізольовані з гельмінту, одержують та використовують за допомогою способу, подібного до того, який раніше був описаний для яєць гельмінтів. Даний винахід також охоплює вакцини, які містять субфракції гельмінтних паразитів, а також вакцини, які містять ізольовані білки, полінуклеотиди, вуглеводи, ліпіди, тощо, що мають походження від гельмінтних паразитів згідно з відомими способами рівня техніки, наприклад, як описано Williams та ін., 1994, Leukocytes of patients with Schistosoma mansoni respond with a Th2 pattern of a cytokine production to mitogen or egg antigens but with a Th0 pattern to worm antigens. J. Infect. Dis. 170: 946; Xu-Amano та ін., 1993, Helper Τ cell subsets for immunoglobulin A responses: oral immunization with tetanus toxoid and cholera toxin as adjuvant selectively induces Th2 cells in mucosa associated tissues. J. Exp. Med. 178:1309; Ausiello та ін., 2000, Cell mediated immunity and antibody responses to Bordetella pertussis antigens in children with a history of pertussis infection and in recipients of an acellular pertussis vaccine. J. infect. Dis., 181: 1989. Наприклад, фракції або субфракції можуть бути одержані згідно зі способом, описаним у Thaumaturgo та ін. (2001, Preliminary Analysis of Sml4 in Distinct Fractions of Schistosoma mansoni Adult Worm Extract, Mem. Inst. Oswaldo Cruz том 96 додат. том. 96, Дод: 79-83, що введено в дану заявку як посилання у своїй цілісності). У цьому способі паразити S. mansoni були одержані за допомогою ретроградної перфузії при використанні гепаринизованого сольового розчину (0,85% розчин NaCl), через 45 днів після інфекції (Pellegrino & Siqueira 1956, Теспіса de perfusao para colheita de Schistosoma mansoni em cobaias experimentalmente infectadas. Rev Bras Mai D Trop 8: 589-597), їх використовували для одержання різних екстрактів. 94023 30 Приготування екстракту з дорослих глистів (SE). Паразитів промивали у PBS. Живих глистів потім залишали при кімнатній температурі (від 28°С до 30°С) у свіжому PBS (фосфатнобуферний сольовий розчин) протягом 2-3 годин та заморожували при -20°С. Після відтаювання PBS суспензії глистів (1 г глистів/10 мл PBS) фільтрували через дротяне сито та центрифугували при 10,000 g протягом 1 години при 4°С (Tendler & Scapin 1981, Schistosoma mansoni antigenic extracts obtained by different extraction procedures. Mem List Oswaldo Cruz 76: 103-109; Tendler та ін. 1982, Immunogene and protective activity of an extract of Schistosoma mansoni. Mem Inst Oswaldo Cruz 77: 275-283). Білковий вміст SE оцінювали згідно з методом Лоурі (Lowry та ін. 1951), та одержаний розчин, який мав концентрацію білка 1 мг/мл зберігали при -20°С. Екстракти самок та самців готували у відповідності до тієї самої методики, використовуючи паразитів, яких розділяли негайно після перфузії. Приготування «фракції» швидкого вивільнення екстрактів дорослих глистів (SEi) - SEi препарат відповідає початковому етапу SE: після перфузії, як описано для SE, живих глистів інкубують протягом 2-3 годин при кімнатній температурі (від 28°С до 30°С) в PBS. Потім дорослих глистів фільтрують з інкубаційного розчину (SEi) через дротяне сито. Приготування SE2. Дорослих глистів, які залишилися після початкового етапу приготування SE, повторно заморожували (-20°С) в PBS протягом одного тижня (1 г глистів/10 мл PBS). Після відтаювання PBS суспензії фільтрували через дротяне сито та центрифугували при 10,000 g протягом 1 години при 4°С. Паразитичні антигени також можуть бути екстраговані так, як описано на Фігурі 1 Thaumaturgo та ін. (вище) (відтворено як Фігура 23). Альтернативно, паразитичні антигени можуть бути приготовлені так, як описано у Deelder та ін. (1980. Applicability of different antigen preparations in the enzyme-linked immunosorbent assay for schistosomiasis mansoni Am. J. Trop. Med. Hyg. 29: 401-410). Наприклад, антигени можуть бути одержані зі SWAP, що приготовлений як розчинні супернатантні рідкі речовини з гомогенатів на основі фосфатно-буферного сольованого розчину відповідних стадій життєвого циклу (Goes та ін. 1989, Production and characterization of human monoclonal antibodies against Schistosoma mansoni. Parasite Immunol 11: 695-711). SWAP піддавали фракціонуванню за допомогою аніонообменної хроматографії на FPLC (рідинна експрес-хроматографія білків), як було описано раніше (Hirsch & Goes 1996, Characterization of fractionated Schistosoma mansoni soluble adult worm antigens that elicit human cell proliferation and granuloma formation in vitro. Parasitology 112: 529-535). Коротко, білки елюювали за допомогою 20 мМ Трис-НСІ, рН 9,6 при використанні багатоетапного підвищення градієнту аж до 1 Μ NaCl, що переривалося інтервалами підтримання градієнту при 0, 100, 280, 450, 600 та 750 мМ. Фракції, що витікали, піддавали концентрації шляхом ліофілізації. Сконцентрова 31 ний матеріал піддавали діалізу проти 0,15 Μ фосфатно-буферного розчину (PBS), рН 7,4, стерилізували шляхом фільтрації та зберігали при -70°С. Вміст білка вимірювали у відповідності з мікроаналізом Бредфорда (Bradford 1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Analyt Biochem 72: 248-254, що введено як посилання у своїй цілісності). Аналіз шести фракцій, розділений за допомогою 10% SDS-ΠΑΓΕ (додецилсульфат натрію-електрофорез у поліакриламідному гелі) в умовах відновлення (Laemmli 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, що введено як посилання у своїй цілісності), показав багаточисленні білкові смуги, фракція III містила білки з високою молекулярною масою (97 та 160 кДа), середньою молекулярною масою(52 та 56 кДа) та низькою молекулярною масою(28 та 36 кДа). Цю фракцію називали Рlll та використовували у різних імунологічних аналізах. Ліпіди також можуть бути одержані так, як описано у рівні техніки, наприклад, у van der Kleij та ін. (1999, Recognition of Schistosome Glycolipids byImmunoglobulin E: Possible Role in Immunity Infection та Immunity, 67: 5946-5950, що введено як посилання у своїй цілісності). В одному втіленні ліпіди дорослих глистів S. mansoni (12 г [волога вага]) та яйця (1,6 г [волога вага]) піддавали екстракції за допомогою способу, описаного Bligh та Dyer (1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917). Органічну фазу висушували за допомогою роторного випаровування, розчиняли у 10 мл хлороформу та вносили у колонку з ТЕАЕ-целюлозою як аніонним обмінником (Serva, Heidelberg, Germany), що була перетворена у гідроксильну форму. Ліпіди елюювали так, як описано Rouser та ін. (1969. Diethylaminoethyl and triethylaminoethyl cellulose column chromatographic procedures for phospholipids, glycolipids, and pigments. Methods Enzymol. 14: 272-317). Згідно з цим прописом фракції містили наступні ліпіди: фракція 1, холестерин, гліцериди та інші нейтральні ліпіди; фракція 2, цереброзиди, гліцеринові дигліцериди, фосфатидилхолін та сфінгомієлін; фракція 3, церамідполігексозиди; фракція 4, неорганічні речовини; фракція 5, фосфатидилетаноламін та вільні жирні кислоти; фракція 6, фосфатидилсерин; фракція 7, відсутня (етап промивання); та фракція 8, фосфатидна кислота, кардіоліпін, фосфатидилгліцерин, фосфатидилінозитол та інші кислі ліпіди. Присутність гліколіпідів у фракціях 2 та 3 підтверджували за допомогою забарвлювання орцинолом ліпідних фракцій на HPTLC планшетах (1956. Quantitative estimation of cerebrosides in nervous tissue. J. Neurochem. 1: 42-53). C. Підтримання організмів гельмінтів: Цикл розвитку гельмінтів здійснюють за допомогою проміжних та лабораторних тварин, вирощених у SPF умовах. Зразки популяцій гельмінтів піддавали аналізу для підтвердження фенотипічної стабільності, такої, як швидкості колонізації, плодовитість та чутливість для протигельмінтних препаратів. 94023 32 Дозування, введення та фармацевтичні композиції Індивідууми, які потребують лікування, одержують інфекційну форму паразиту (яйце, церкарія або личинка) перорально або парентерально в залежності від природного життєвого циклу вибраного паразиту. Альтернативно, розчинні екстракти глистів або яєць можуть прийматися перорально або парентерально для індукції ТН2 відповідей. Стосовно кишкових та печінкових гельмінтів та шистосом, то вони починають продукцію яєць, які виявляються в екскрементах приблизно через 3060 днів після інокуляції. Кількісна оцінка яєць в екскрементах продемонстрована як достатня для визначення адекватності та інтенсивності інфекції. Аліквоти екскрементів піддавали обробці за допомогою цукрової флотації для визначення загальної кількості яєць у кожному зразку. Флотація у розчині сахарози представляє собою спосіб, який часто використовується для ізоляції яєць з екскрементів для точного підрахунку, як показано Koontz та Weinstock, 1996, Gastroenterology Clinics of N, America, 25: 435. Паразитичні гельмінтні сполуки згідно з винаходом можуть бути рецептовані для введення будь-яким прийнятним шляхом, таким чином, винахід включає в межах свого об'єму фармацевтичні композиції, які включають сполуку гельмінтних паразитів згідно з винаходом, адаптовану для використання у людей. Такі композиції можуть бути представлені для використання традиційним способом за допомогою необхідних фармацевтичних носіїв та наповнювачів. Сполука паразитичних гельмінтів згідно з винаходом може бути рецептована для ін'єкції та, таким чином, для вакцинного застосування, та може бути представлена у вигляді одиничної дози в ампулах, або у вигляді багатодозових контейнерів, при необхідності, з доданням консерванту. Композиції можуть також мати таку форму як суспензії, розчини або емульсії у масляних або водних носіях, та можуть містити додаткові рецептурні агенти, такі, як суспендувальні, стабілізуючі та/або диспергувальні агенти. Альтернативно, гельмінтний паразит може бути у формі порошку або може бути відновлений за допомогою прийнятного носія, наприклад, стерильної, вільної від пірогенів води, перед застосуванням. Якщо це є бажаним, то така порошкова композиція може містити прийнятну нетоксичну основу для того, щоб бути впевненим, що порошок відновлюється за допомогою води, рН одержаної водної композиції є фізіологічно прийнятним. Сполуки гельмінтних паразитів можуть бути також рецептовані як супозиторії, наприклад, такі, що містять традиційні основи для супозиторію, такі, як масло какао або інші гліцериди. Сполуки гельмінтних паразитів можуть також бути рецептовані для перорального дозування з традиційними наповнювачами, носіями та екціпієнтами. Кількість паразиту, що вводиться індивідууму, який цього потребує, представляє собою кількість, достатню для запобігання або лікування аутоімунного захворювання. Ця кількість може варіювати в залежності від захворювання, яке під 33 дають лікуванню або якому запобігають, та гельмінтного паразиту, від того, чи вводиться паразит в інтактній формі, або як яйця, личинки, екстракт або церкарії. Типово, коли паразити вводяться для усіх аутоімунних захворювань, які обговорюються в даній заявці, то ця кількість коливається від приблизно 50 до приблизно 50000. Зокрема, ця кількість може коливатися в межах від приблизно 500 до приблизно 5000. Коли використовуються яйця, то приблизно може використовуватися від приблизно 500 до приблизно 5000 для лікування аутоімунних захворювань, розкритих в даній заявці. Коли вводяться екстракти, то використовується від приблизно 100 мкг до приблизно 10000 мкг для лікування аутоімунних захворювань. Коли вводяться личинки та церкарії, то дозування може коливатися в межах від приблизно 500 до приблизно 5000 у кожному випадку. З метою запобігання або вакцинного застосування кількості паразитів можуть складати від 500 до 5000. Дозування паразитичного препарату можна піддавати моніторингу шляхом вимірювання Th1, Th2 або регуляторних клітинних відповідей. Альтернативно, дозування можна піддавати моніторингу шляхом оцінювання патології або симптомів певного захворювання, які є відомим в галузі техніки або описані в даній заявці. A. Визначення Th1та Th2 відповідей Для того, щоб продемонструвати ефективність даного винаходу можна розрізняти Th1 та Th2 відповіді. Metawali та ін., 1996, J. of Immunol. 157: 4546 показав, що у мишей можливо розрізнити Th1 відповідь від Th2 відповіді шляхом гістологічного аналізу та за допомогою аналізу профілів цитокіну та імуноглобуліну. Крім того, Sandor та ін., 1990, J. of Exp. Med. 171: 2171 показали, що експресія на поверхні клітин Fcg3 та молекул класу II МНС піддається розрізненню. У цьому процесі тонкий кишечник та товстий кишечник досліджуються гістологічно для визначення ступеня запалення слизової оболонки, еозинофіли та мастоцитозу. Останні типи клітин є показовими для Th2 відповіді. Мезентеріальні лімфатичні вузли (MLN) та селезінка можуть бути дисоційовані до суспензії, яка включає одиничні клітини для культури in vitro у мікротитрувальних планшетах. Клітини (1-2 x 106/комірка) у повному RPMI середовищі культивують до 72 годин у присутності чи за відсутності антигену глистів або анти-СD3, а потім супернатанти досліджують на цитокіни та імуноглобуліни. IFN-, TNF та IgG2a характеризують Th1 відповідь, у той час, як IL-4, IL-5, IgE та IgG1 є типовими для Th2 реакції. Крім того, сироватка може бути оцінена на концентрації цитокіну та імуноглобуліну. Крім того, дисперговані запальні лейкоцити досліджують шляхом проточної цитометрії на експресію Fc3 на макрофагах (Th1) та експресії МНС класу II на В клітинах (Th2). Контролі включають сироватку, клітини MLN та селезінки від прийнятним чином підібраних за віком мишей з одного приплоду, що не мають паразитів. Подібний аналіз може розрізнити Th1 відповідь та Th2 відповідь. Можна перевіряти запалені 94023 34 тканини, ізолювати лейкоцити з ділянок запалення, а також клітини периферичної крові. Лейкоцити культивують in vitro або окремо або у присутності паразитичного антигену або мітогенів для стимуляції вивільнення цитокінів. IgG2 замінює IgG2a. B. Визначення активності регуляторних Τ клітин Способи ізоляції регуляторних Τ клітин з in vitro культури або тварин є відомими в галузі техніки, наприклад, як описано у McGuirk Ρ, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells uprovoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23 (9): 450-5; Field, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch, та В. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ Τ cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170: 2508-2515; von HerrathMG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory Τ cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3): 22332; Francois Bach J. Regulatory Τ cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory Τ cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14(6): 771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory Τ cells uprovoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23(9): 450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug; 182: 135-48; Read S, Powrie F. CD4(+) regulatory Τ cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec; 13(6): 644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory Τ cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep; 3(11): 899-904; Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor Τ cells: more questions than answers. Nature Reviews.Immunology. 2: 389-400; Annacker, О. та F. Powrie. 2002. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection. 4: 567-574; Read, S., V. Malmstrom, та F. Powrie. 2000. Cytotoxic Τ lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J. Exp. Med. 192: 295-302. Відповідь або активність регуляторних Т клітин можуть бути виміряні за допомогою внутрішнього маркера, маркера клітинної поверхні або секретованого маркера, як описано в даній заявці. Корисні внутрішні маркери для регуляторних Τ клітин включають, але не обмежені, транскрипційні фактори, такі, як Scurfin, Smad7, Gata3, Tbet (Tbx21). Корисні поверхневі маркери для регуляторних Τ клітин включають, але не обмежені, CD4, CD45RBlo, CD45Rc, цитоплітичний антиген 4, асоційований з Τ лімфоцитами (CTLA-4), CD25, CD103, Ох40, 4-1ВВ, CD62L, Εβ інтегрин, пептид, асоційований з латентністю (LAP), або родину споріднених білків рецептора TNF, що індукується глюкортикоїдом (GITR), хемокіновий рецептор CCR5, TI-ST2. Корисні маркери, що секретуються, для регуляторних Τ клітин включають, але не обмежені, IL5, IL-10 TaTGF. 35 С. Необмежувальні приклади способів для invitro вимірювання кількості маркерів Визначення цитокінів за допомогою проточної цитометрії: Спленоцити, MLN або кишкові запальні клітини в RPMI повному середовищі поміщали в планшети для тканинних культур на 24 комірки в концентрації 2 x 106 клітини/комірка. Клітини інкубували протягом 4-6 годин у присутності чи за відсутності анти-СD3 або прийнятного антигену з брефелдіном А у концентрації 10 мкг/мл. Брефелдін запобігає екзоцитозу білків та сприяє акумуляції цитокіну у клітині. Для визначення цитоплазматичного цитокіну клітини піддавали фіксації у 2% параформальдегіді при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, після чого проводили забарвлювання поверхні для розрізнення підтипів клітин. Клітини промивали та ресуспендували в 50 мкл PBS 0,2% сапоніну та 1 мкг анти-цитокінового антитіла та інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Далі клітини промивали двічі у сапоніні та ресуспендували у PBS/FCS. Специфічність забарвлювання цитокінового антитіла підтверджували за допомогою попереднього блокування клітин при використанні надлишку некон'югованого антитіла того самого ізотипу та цитокінової специфічності або за допомогою інкубації клітин у присутності рекомбінантного цитокіну. Фікоеритрин (РЕ)-мічені нерелевантні контролі антитіла також включалися для оцінки фонового забарвлювання. Клітини аналізували при використанні проточної цитометрії. ELISA: Вимірювали концентрації цитокіну та антитіла за допомогою ELISA у кілтинних супернатантах, одержаних з клітин, які культивували у мікротитрувальних планшетах та піддавали обробці так, як описано вище. Багато з цих аналізів вже є робочими в нашій лабораторії. Цитокіни оцінювали при використанні двох моноклональних антитіл (mAb) у твердо фазному імуноферментному аналізі с флуоресцентним підсиленням. Антицитокінові моноклональні антитіла очищали за допомогою амонійної преципітації з супернатантів антитіл, секретованих гібридомними клонами. Мікротитрувальні планшети покривали 50 мкл 1 мкг/мл антитіла для покриття у PBS, що містить Твін 20 (PBS-T), та інкубували при 4°С протягом ночі. Потім комірки блокували за допомогою додання 150 мкл 10% FCS в PBS з інкубацією при 37°С протягом 30 хвилин. Стандарти включали рекомбінантний цитокін або супернатанти, які містять цитокін, що були одержані з клітин селезінки, які активовані мітогеном або антигеном, що були одержані від мишей, інфікованих шистосомами. Зразки та стандартні розведення здійснювали в RPMI, що містить 10% FCS (повне RPMI) в окремому мікротитрувальному планшеті на 96 комірок з плоским дном, потім 50 мкл об'єму переносили до планшетів ELISA, які були промиті три рази у PBS-T. Зразки інкубували у планшетах для аналізу протягом 1 години при 37°С. Прийнятні моноклональні антитіла кон'югували з біотином. Після трьохкратного промивання в PBS-T у кожну комірку додавали 50 мкл антитіло-біотинового кон'югату при концентрації 0,5 мкг/мл в 1% BSA/PBS-T. Планшети інкубували при кімнатній температурі 94023 36 протягом 1 години, після чого тричі промивали у PBS-Т. Додавали кон'югати стрептавідинпероксидаза хрону (75 мкг) у концентрації 1 мкг/мл в 1% BSA/PBS-T та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Планшети промивали десять разів у свіжому PBS-T та додавали 100 мкл субстрату (2.2'-азино(3етилбензтіазолінсульфонова кислота) при концентрації 1 мг/мл у 44 мМ Na2HPO4, 28 мМ лимонної кислоти та 0,003% Н2О2. Забарвлений продукт піддавали вимірюванню при довжині хвилі 405 нм з контролем при довжині хвилі 490 нм, використовуючи мультисканувальний пристрій для зчитування мікропланшетів. Імуноглобуліни кількісно оцінювали, використовуючи анти-ізотипічні специфічні ELISA. Афінно очищені козячі анти-IgM, -IgG1, -IgG2a, -IgG2b, IgG3, -IgA та -IgE використовували для захвату антитіл та абсорбували до гнучких полівінілових мікротитрувальних чашок при концентрації 10 мкг/мл. Після додання культуральних супернатантів, інкубації та промивання використовували прийнятний ізотип козячого анти-імуноглобуліну, кон'югованого з лужною фосфатазою, для визначення загальної кількості мишачого імуноглобуліну, який зв'язався з чашками. Одержували стандартні криві, використовуючи очищений імуноглобулін. Для вимірювання антитіла, специфічного для паразитичного антигену, розчинний антиген піддавали біотинілюванню та використовували для визначення зв'язаного мишачого імуноглобуліну. Планшети аналізували на пристрої для зчитування ELISA при довжині хвилі 410 нм та визначали концентрації загального імуноглобуліну, використовуючи стандартну криву та програмне забезпечення для аналізу найбільшої відповідності. Концентрації антиген-специфічного антитіла порівнювали відповідно зі зчитування оптичної густини, оскільки розчинний паразитичний антиген не є визначеним антигеном, що дозволяє проводити точну кількісну оцінку. ELISPOT аналізи: ELISPOT аналізи проводили для підрахунку лімфоцитів, які секретують або поліклональні антитіла, або цитокіни. Мікротитрувальні планшети на 96 комірок на основі нітроцелюлози покривали протягом ночі при 4°С за допомогою 1 мкг/мл або анти-імуноглобулінових або анти-цитокінових антитіл в PBS-T. Потім планшети блокували за допомогою PBS, що містить 10% FCS та інтенсивно промивали PBS-T. Серійні розведення клітинної суспензії одиничних клітин, починаючи з 5 x 104 клітин/комірка, інкубували на планшеті протягом 5 годин при 37°С у вологій атмосфері з 5% СО2. Планшети промивали за допомогою PBS-T та покривали за допомогою біотинильованих анти-імуноглобулінових або анти-цитокінових антитіл протягом ночі при температурі 4°С. Потім планшети промивали та обробляли за допомогою кон'югату стрептавідинглюкозаоксидаза протягом 2 годин та знову промивали. Антитіло або цитокін, секретовані одиничними клітинами, візуалізували за допомогою субстрату. Колориметричну реакцію зупиняли через 30 хвилин шляхом промивання та плями пронумерову 37 вали при 30 X збільшенні. Розведення клітин, які продукують 10-50 плям/комірка, використовували для підрахунку загальної кількості секретуючих клітин на зразок. Контролі включали комірки, вкриті прийнятним козячим антитілом або неприйнятним антигеном, або такі, що не піддавали покриттю. Модифікація аналізу при використанні розчинного антигену для покриття комірок дозволяє також здійснювати кількісну оцінку паразитичного антиген-специфічного імуноглобуліну, який секретується В-клітинами. Коротко, наприклад, планшети покривають за допомогою антигену зрілого Т. muris при концентрації 0.25 мкг/комірка або прийнятним нерелевантним контрольним антигеном. Клітини додають до комірок після промивання. Після прийнятної інкубації планшети знову промивають та обробляють так, як описано вище. D. Оцінка патології захворювання Підтвердження наявності аутоімунного захворювання та його лікування або послаблення симптомів є необхідним для визначення необхідності лікування, а також для спостереження за розвитком процесу лікування. Наступні процедури використовують для вимірювання клінічних параметрів зазначених захворювань. 1. Запальні захворювання кишечнику Оцінка запалення: У мишей клінічне підтвердження захворювання включає втрату ваги, діарею, ректальний пролапс та гістологічне підтвердження кишкового запалення. Таким чином, поліпшення цих параметрів буде свідчити про полегшення захворювання. Для градації кишкового запалення у тваринних моделей видаляють тканини, піддають обробці при використанні методики Swiss-roll, поміщають їх у парафін згідно зі стандартними способами. Зрізи забарвлюють за допомогою гематоксиліну та еозину. Ступінь запалення товстого кишечнику класифікують на кілька рівнів напівкількісно від 0 до 4 за допомогою сліпого способу, що здійснюється одним патологом при використанні стандартизованої методики: 0 = немає запалення; 1 = низький рівень запалення; 2 = середній ступінь запалення з потовщенням стінки; та 4 = трансмуральна інфільтрація та втрата келихоподібних клітин з потовщенням стінки. Для підрахунку кількості мастоцитів готують зразки кишкової тканини, одержані від індивідуальних мишей за допомогою методики Swiss-roll, піддають їх фіксації у фіксаторі Карноя, поміщають у парафін та піддають обробці для забарвлення за допомогою алціанового синього та сафраніну. При дослідженні мастоцитів піддають скануванню п'ятдесят суміжних полів даного зрізу з власної пластини слизової оболонки та м'язових шарів. Мастоцити ідентифікують за їх відмінним внутрішньоклітинним гранулярним забарвлюванням при використанні алціанового синього. Усі зразки оцінюють за допомогою сліпого способу. Активність захворювання у людей піддають моніторингу при використанні клінічних лабораторних та гістологічних критеріїв. Існує декілька добре встановлених індексів активності IBD захворювання, що дають змогу стежити за клінічними 94023 38 параметрами, подібними частоті діареї та абдомінальному болю. Один особливо корисний індекс для оцінки хвороби Крона представляє собою індекс активності хвороби Крона або CDAI (Best та ін., 1976, Gastroenterology 70: 439). CDAI включає 8 змінних, пов'язаних з активністю захворювання, він використовувався у найбільш сучасних дослідженнях застосування терапевтичних агентів при хворобі Крона. Він включає кількість рідких або дуже м'яких екскрементів, тяжкість абдомінального болю або появу спазмів, загальний стан здоров'я, наявність екстракишкових проявів захворювання, наявність або відсутність абдомінальної маси, застосування антидіарейних лікарських засобів, гематокрит та вагу тіла. Складене значення коливається у межах від 0 до приблизно 600. Значення нижче 150 свідчить про ремісію, а значення вище 450 свідчить про тяжке захворювання. Проаналізований, прийнятий та специфічний для даного захворювання список питань стосовно якості життя може використовуватися перед або після лікування для оцінки терапевтичного прогресу. Збірка питань Ірвіна для запального захворювання кишечнику представляє собою 32 питання (Irvine та ін., 1996, The Short Inflammatory Bowel Disease Questionnaire: a quality of life instrument for community physicians managing inflammatory bowel disease. CCRPT Investigators. Canadian Crohn's Relapse Prevention Trial. Am J Gastroenterol. 1996 91(8): 1571-8). Така збірка оцінює якість життя стосовно функції кишечнику (наприклад, рідкі екскременти та абдомінальний біль), системні симптоми (втомлюваність, та змінена модель сну), соціальні функції (відвідування роботи та необхідність відмінити соціальну активність) та емоційний стан (злість, депресія або дратівливість). Це значення коливається в межах від 32 до 224, при цьому вищі значення свідчать про крашу якість життя. Пацієнти, які перебувають на стадії одужання, звичайно мають значення, вищі за 170. Для оцінки можна також проводити ендоскопічну, рентгенівську та гістологічну оцінку активності кишкового захворювання. Рівні С-реактивно білка та швидкість осідання клітин крові можуть також піддаватися моніторингу як системні індикатори запалення. 2. Ревматоїдний артрит Оцінка запалення: Мишей з колаген-індукованим артритом піддавали аналізу кожного дня та їх кінцівки оцінювали наступним чином: 0, нормальна; 1, еритема та слабке напухання, які обмежені гомілковоступеневим суглобом або пальцями; 2, еритема та середнє опухання поширюється від гомілковоступеневого суглобу до середнього відділу стопи; 3, еритема та значне опухання поширюється від лодижки до метатарзального суглобу; та 4, анкілозуюча деформація з опуханням суглоба. Ці чотири параметри можуть корелювати з гістологічними змінами в артритних суглобах. Успіх лікування приводить до зниження значення артриту з поліпшенням гістології. Anthony DD. Haqqi TM. ,Collagen-induced arthritis in mice: an animal model to study the pathogenesis of rheumatoid arthritis. 39 Clinical & Experimental Rheumatology. 17(2): 240-4, 1999. Для пристан-індукованого артриту суглоби можна вимірювати за допомогою мікрометра для визначення напухання. У людей RA підраховується шляхом вимірювання напухання суглобів, еритеми, обмеження рухливості та болі. Крім того, синовіальна рідина може бути проаналізована на концентрації цитокіну та запального білка, а також на склад та функцію лейкоцитів згідно зі способами, відомими в галузі техніки. Синовіальні біопсії забезпечують тканину для гістологічного аналізу згідно зі способами, відомими в галузі техніки. Felson DT. Anderson JJ. Boers M. Bombardier С Furst D. Goldsmith С Katz LM. Lightfoot R Jr. Paulus H. Strand V. та ін. American College of Rheumatology. Preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis .Arthritis & Rheumatism. 38(6): 727-35, 1995 Schiff M. A rationale for the use of summary measurements for the assessment of the effects of rheumatoid arthritis therapies.Clinical Therapeutics. 25 (3): 993-1001, 2003 3. Вовчак Оцінка запалення: Нормальний розвиток та функція імунної системи значною мірою залежать від видалення небажаних клітин за допомогою процесу, який називається апоптозом. Взаємодія клітина-клітина за допомогою специфічних молекул, які знаходяться на поверхні клітин, а також їх рецепторів, часто запускають цей процес. Одна така система називається FAS та FAS лігандом. Миші, які є дефектними за FAS (LPR-/-) або FAS лігандом (GLD-/-) розвивають системне захворювання, схоже на вовчак. Reilly CM. Gilkeson GS. Use of genetic knockouts to modulate disease expression in a murine model of lupus, MRL/lpr mice Immunologic Research. 25(2): 143-53, 2002. Колонії LPR або GLD мишей вирощують в мікроізольованих будиночках в умовах навколишнього середовища, вільних від специфічного патогену. Такі миші можуть розвивати аутоімунітет спонтанно, але напевно після штучної індукції. Для індукції захворювання мишей у віці 8 тижнів піддають ін'єкції за допомогою агенту, подібного пристану. Протягом двох місяців миші мають аутоімунне захворювання. В галузі техніки відомо багато клінічних, гістологічних та імунологічних критеріїв, корисних для оцінки індукції захворювання та полегшення як у мишей, так і у людей. Satoh Μ. Richards HB. Shaheen VM. Yoshida Η. Shaw Μ. Nairn JO. Wooley PH. Reeves WH. Widespread susceptibility among inbred mouse strains to the induction of lupus autoantibodies by pristane. Clinical & Experimental Immunology. 121(2): 399-405, 2000 4. Ювенільний інсулінозалежний цукровий діабет (тип І) Оцінка запалення: NOD миші розвивають тип 1 цукрового діабету, подібний до людського, завдяки аутоімунному руйнуванню β клітин підшлункової залози. Клінічне, біохімічне, імунологічне та гістологічне дослідження згідно зі способами, відомим з рівня техніки дозволяє проводити оцінку індукції 94023 40 захворювання та полегшення у мишей. Див., наприклад. Adorini L. Gregori S. Harrison LC. Understanding autoimmune diabetes: insights from mouse models. Trends in Molecular Medicine. 8(1): 31-8, 2002 5. Саркоїдоз Оцінка запалення: У моделі легеневого запалення шляхом емболізації за допомогою гранул антигени (тобто, Th1 або Th2) зливали з гранулами Сефарози, які емболізовали в легені шляхом ін'єкції в їх хвостові вени. Тварин звичайно попередньо сенсибілізували за допомогою злитого антигену. Імунна система хазяїна розвиває інтенсивну імунну відповідь до гранул, що викликають алергічну реакцію. Такі вогнищеві запальні відповіді, які можуть тривати кілька тижнів, можуть бути перевірені на розмір. Вони також можуть бути ізольовані від тканин та вивчатися на склад клітин та продукцію цитокіну. Крім того, прикореневі лімфовузли та селезінки є легко доступними для експериментів. Див., наприклад, Kunkel SL. Lukacs NW. Strieter RM. Chensue SW. Animal models of granulomatous inflammation. Seminars in Respiratory Infections. 13 (3): 221-8, 1998 Саркоїдоз представляє собою захворювання людини, що звичайно втягує легені. Визначення саркоїдозу та ступеня захворювання може бути зроблене згідно зі способами, відомими з рівня техніки. Аналізи на легеневу функцію можуть оцінювати еластичність та функцію легенів. Крім того, бронхіолярні змиви дають запальні клітини, які були інфільтровані у бронхіальне дерево під час запального процесу. Такі клітини можуть вивчатися на склад та функції. Легеневі інфільтрати та прикоренева лімфоаденопатія є характерними для саркоїдозу. Таким чином, періодична рентгенографія грудної клітки або СТ сканування може допомогти оцінити активність захворювання згідно зі способами, відомими з рівня техніки. Серологічні аналізи, такі, як вимірювання активності ангіотензинперетворюючого ферменту згідно з відомими з рівня техніки способами, можуть використовуватися для класифікації ступеня та активності захворювання. Див., наприклад, Hunninghake GW. Costabel U. Ando M. Baughman R. Cordier JP. du Bois R. Eklund A. Kitaichi M. Lynch J. Rizzato G. Rose С Selroos O. Semenzato G. Sharma OP. ATS/ERS/WASOG statement on sarcoidosis. American Thoracic Society/European Respiratory Society/World Association of Sarcoidosis та other Granulomatous Disorders. Sarcoidosis Vasculitis & Diffuse Lung Diseases. 16 (2): 149-73, 1999. 6. Розсіяний склероз Оцінка запалення: Експериментальний аутоімунний енцефаломієліт індукується у чутливих мишей шляхом повторюваної ін'єкції прийнятних сенсибілізуючих мієлінових антигенів. Мишей оцінюють клінічно згідно з наступними критеріями: 0, відсутність захворювання; 1, атонія хвоста; 2, слабкість задній кінцівок; 3, параліч задніх кінцівок; 4, параліч задніх кінцівок та параліч або слабкість передніх кінцівок; 5, агонія. Для гістологічного аналізу видаляють спинний мозок та головний мозок та фіксують їх у 41 формаліні. Зрізи, які поміщаються у парафін, забарвлюють та вивчають під світловим мікроскопом. Дисперговані спленоцити та клітини з інших ділянок можуть вивчатися in vitro так, як описано вище. Такі параметри можуть допомогти визначити послаблення симптомів або полегшення, див. наприклад, Sewell, Diane, Zing Qing, Emily Reinke, David Elliott, Joel Weinstock, Matyas Sandor, та Zsuzsa Fabry. Immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by helminth ova immunization. International Immunol. 15: 59-69, 2003. У людей активність захворювання MS визначається шляхом моніторингу розвитку та ремісії неврологічних ознак та симптомів. Вимірювання, що найбільш часто використовується для оцінки результатів, називається розширеною шкалою стану непрацездатності (інвалідності). Склад білків спинномозкової рідини та склад клітин, які аналізуються згідно зі способами, відомими з рівня техніки, можуть також використовуватися для моніторингу активності захворювання. Крім того, серійні MRI дослідження показують нові ураження мозку, які виявляються за допомогою гадолінію. McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD, McFarland HF, Paty DW, Polman CH, Reingold SC, Sandberg-Wollheim M, Sibley W, Thompson A, van den Noort S, 94023 42 Weinshenker BY, Wolinsky JS. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: Guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis Ann Neurol 50(1): 121-7. 2001. Poser CM, Pary DW, Scheinberg L, та ін. "New Diagnostic Criteria For Multiple Sclerosis: Guidelines For Research Protocols" Ann Neurol 1983: 13: 227231. Статистичні способи: Деякі дані для одного зразка аналізуються за допомогою критерію Ст'юдента для того, щоб визначити, чи середні значення значним чином відрізняються від 0. Парний критерій Ст'юдента використовується для аналізу відмінностей між групами середніх значень. Аналіз відхилення та критерій Дуннетта використовують для аналізу множинних порівняльних даних. Тваринні моделі, що є корисними згідно з винаходом Наведена нижче Таблиця 1 ілюструє необмежувальні приклади тваринних моделей, які є корисними згідно з даним винаходом. Додаткові необмежувальні приклади можуть бути знайдені у рівні техніки, наприклад, так, як описано в Current Protocols in Immunology (2001, Eds. John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, published by John Wiley & Sons). Таблиця 1 Захворювання, яке піддають лікуванню Деякі тваринні моделі 1. Запальні захворювання кишечнику TNBS colitis (Neurath та ін., 1995, J. of Ехр. Med. 182: 1281) IL-2 mutant mice (Ludviksson та ін., 1997, J. of Immunol. 158: 104) IL-10 mutant mice (Berg та ін., 1996, J. of Clin. Investigation 98: 1010) TCR transgenic mice (Mombaerts та ін., 1993, Cell 75: 274) CD45+ Τ cells transferred into SCID mice (Powrie та ін., 1994. Immunity 1: 553) 2. Ревматоїдний артрит Murine pristane-induced arthritis (Stasluk та ін., 1997. Immunol. 90:81) Murine collagen-induced arthritis (Horsfall та ін, 1997. J. of Immunol. 159: 5687) 3. Інсулінозалежний діабет (тип 1) NOD mouse (Cameron та ін, 1997, J. of Immunol. 159: 4686) 4. Вовчак (NZWXNZB) F1 models (Santiago та ін, 1997, J. ofExp. Med. 185:65) GRD, LPR mouse (FAS mutation) (Bhandoola та ін, 1994. Int. Rev. of Immunol. 11: 231) 5. Саркоїдоз Murine Berylliosis (Pfeifer та ін, 1994, Int. Archives of Allergy & Immunol. 104: 332) M. avium mouse (Chen та ін, 1994, Science 265:1237) 6. Множинний склероз Experimental allergic encephalomyelitis in mice Owens T. Sriram S. 1995. Neurol Clin. 13(1): 51-73. Review. Degaonkar та ін, 2002, J Magn Reson Imaging. 16(2): 153-9. Duckers та ін, 1996, Neuroscience 1(2): 507-21. Приклади Винахід ілюструється наступними прикладами, які не обмежують його, та в яких використовуються приведені матеріали та способи. Повне розкриття кожного з літературних посилань, що приво диться в даній заявці, введено в дану заявку тільки як посилання. Приклад 1. Загальні способи: Тварини: Колонії 129/SVIL-10-/- мутантних мишей та прийнятні контрольні тварини вирощуються згідно зі стандартними способами у спеціальних 43 клітках у приміщеннях, де підтримується навколишнє середовище, що не має патогену. Підтримання паразиту, тваринна інфекція, одержання яєць шистосоми: Підтримання Т. muris та спосіб, який використовується для інфікування, є такими, як описано Else та Wakelin, 1990, Parasitology, том. 100, частина 3: 479. Яйця шистосоми збирають з печінок хом'яків, інфікованих шистосомами, та зберігають так, як описано Elliott, 1996, Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 9: 255. П'ять інфікованих хом'яків дають приблизно 2 x 106 яєць. Одержання яєць Т. suis: Наступний процес використовували при одержанні та зборі яєць Т. suis. Дорослих глистів Т. suis ізолювали з товстого кишечнику свиней через 7-8 тижнів після піддання свиней експериментальній інокуляції яйцями Т. suis. Яйця з зародком одержували шляхом культивування дорослих глистів в умовах in vitro, а потім виділені яйця відокремлювали від культурального середовища шляхом центрифугування, поміщали у 0,2% розчин дихромату калію при 22°С на 5-6 тижнів з барботуванням для одержання інфекційних личинок першого покоління. Яйця промивали двічі у стерильній воді при центрифугуванні при 1200 x g протягом 10 хвилин, підраховували та повторно суспендували у бажаній кількості фізіологічного розчину на основі підрахованої дози 2500. Ці яйця зберігали для використання у суб'єктів. Яйця є стабільними протягом, принаймні, одного року при зберіганні у холодильнику. Для гарантії інфективності ми спостерігали за появою яєць в екскрементах пацієнтів після колонізації. Кількість яєць в екскрементах є пропорційною інтенсивності зараження. Крім того, час від часу ми інфікували свиней за допомогою яєць, які зберігаються, для гарантування постійної інфективності. Інфекція Μ avium: Мишей інфікували шляхом введення 106 колонієутворюючих одиниць (CFU) Mycobacterium avium (ATCC 25291) інтраперитонеального. На 60 день після інфікування деякі миші також одержували 35 церкарій S. mansoni для індукції інфекції. Інфекція шистосомами та ізоляція яєць: У деяких експериментах використовували мишей (1820 г), інфікованих протягом 8-9 тижнів за допомогою S. mansoni. Мишей інфікували підшкірно за допомогою 40 церкарій пуерто-ріканського штаму. Ізоляція гранульоми та диспергування: Гранульоми утворюються у мишей, інфікованих шистосомами внаслідок природного відкладання яєць, яке починається на 6-ому тижні після інфекції. М. avium також індукує утворення гранульом. Ми вивчали печінкові гранульоми, ізольовані від інфікованих мишей так, як було описано (Elliott, 1996, вище). Гранульоми диспергували для одержання суспензій одиничних клітин. Ізольовані гранульоми перемішували протягом 35 хвилин при 37°С у пристрої для струшування на водній бані у RPMI середовищі, що містить 5 мг/мл колагенази. Гранульоми, що залишилися, відсмоктували та пропускали через шприц на 1 мл для індукції додаткової дисоціації. Одержану клітинну суспензію фільтрували через дротяну сітку та тричі промивали. Життєздатність клітин визначали за допомо 94023 44 гою еозин-Y виключення. Цей пропис приводить до одержання високого виходу життєздатних запальних клітин, що зберігають експресію поверхневих молекул. Диспергування селезінки та MLN: Спленоцити та MLN диспергували шляхом препарування та промивання тканини через корозійно стійке стальне сито. Забруднення RBC піддавали лізису за допомогою Н20, та клітини промивали x 3 в RPMI перед використанням. Індукція TNBS коліту: Коліти індукували шляхом ректальної інсталяції тринітробензолсульфонової кислоти (TNBS) так, як описано Neurath та ін., 1995, J. Exp. Med., 182: 1281. Коротко, BALB/c контрольні миші або миші, яких піддавали інфікуванню паразитом, голодували протягом 30 годин, потім їх анестезували за допомогою метоксифлурану. Катетер розміром 1,2 мм вводили на 4 см у кишечник та вливали 0,1 мл розчину TNBS (5 мг/мл TNBS (Sigma) в 50% етанолі). Тварин тримали за хвіст протягом 3 хвилин для того, щоб впевнитися в однаковому контакті зі слизовою оболонкою кишечнику. Оцінка запалення слизової оболонки: Для класифікації кишкового запалення видаляли тканину у вказані моменту часу, піддавали обробці згідно з методикою Swiss-roll та поміщали у парафін у відповідності до стандартних способів. Зрізи забарвлювали за допомогою гематоксиліну та еозину. Ступінь запалення кишечнику класифікували напівкількісно від 0 до 4 за допомогою сліпого способу одним патологом при використанні нашої звичайної стандартизованої методики (19). 0 = відсутність запалення, 1 = низький рівень запалення, 2 = середній рівень запалення, 3 = високий рівень запалення з потовщенням стінки, 4 = трансмуральна інфільтрація, втрата келихоподібних клітин, потовщення стінки. Ізоляція клітин та збагачення Т-клітинами: Th1, Th2 та регуляторні Τ клітини можуть бути ізольовані згідно зі способами, відомими в галузі техніки, наприклад, так, як описано в Current Protocols in Immunology (2001, ред., John Ε. Coligan, Ada Μ. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, опубл. John Wiley & Sons) В одному втіленні суспензії одиничних клітин MLN одержували шляхом обережного препарування за допомогою голки в RPMI 1640 середовищі (GIBCO, Grand Island, NY). Клітини протягом нетривалого періоду часу повторно суспендували у великому об'ємі дистильованої води для лізису RBC. Потім MLN тричі промивали у великому об'ємі RPMI. Кишкові LPMC ізолювали так, як описано вище. Кишкові тканини інтенсивно промивали за допомогою RPMI, та усі видимі Пейєрові бляшки видаляли ножицями. Кишку розкривали уздовж, розрізали на шматочки 5 мм, а потім інкубували у 0,5 мМ ЕДТА у розчині Хенкса, вільному від кальцію та магнію, протягом 20 хвилин при 37°С при струшуванні для вивільнення інтраепітеліальних лімфоцитів та епітеліальних клітин. Цю процедуру повторювали після ретельного промивання. Потім тканину інкубували протягом 20 хвилин при 37°С в 45 20 мл RPMI, що містить 10% FCS, 25 мМ HEPES буфера, 2 мМ L-глутаміну, 5 x 105 Μ βмеркаптоетанолу, 1 мМ пірувату натрію, 100 од./мл пеніциліну, 5 мг/мл гентаміцину та 100 мг/мл стрептоміцину (усі GIBCO) та 1 мг/мл колагенази (Sigma #СО130). У кінці процесу інкубації тканину піддавали додатковому механічному руйнуванню при використанні шприцу на 1 мл. Для видалення дебрису препарати LPMC промивали через попередньо зволожену марлю, шар якою містився у воронці з RPMI. Потім LPMC один раз промивали та просіювали через попередньо зволожений 2 см шар колонки, яка містить нейловону вату, упаковану у шприц на 10 мл. Після промивання клітини (до 2 x 10 ) нашаровували на колонку Percoll з градієнтом 30:70%. Клітини піддавали центрифугуванню при швидкості 2200 x G при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. LPMC, зібрані з 30:70 поверхні розділу фаз, промивали та витримували на льоду до використання. Життєздатність клітин складала 90%, як визначали за допомогою способу еозин-Y виключення. Для експериментів на клітинний перенос MLN Τ клітини ізолювали за допомогою негативної селекції при використанні процедури SpinSep збагачення за допомогою покритих антитілами частинок з високою масою так, як описано виробником (#17031, #17032, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada). Проточну цитометрію використовували після кожного розділення для гарантії прийнятного відновлення та чистоти (>98%) Th+ Т-клітин. Перенос клітин: MLN клітини ізолювали з IL10-/- мишей, колонізованих за два тижні перед цим за допомогою Н. polygyrus або від підібраних за віком здорових IL10-/- мишей, в яких відсутня така колонізація. Такі нефракціоновані, дисперговані MLN клітини (2 x 107 клітини/миша) або MLN Τ клітини (5 x 106 клітини/миша) потім переносили у IL10-/- мишей з колітом через 2 дні після завершення обробки піроксикамом шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Коліти оцінювали через 14 днів. Додаткові способи для одержання регуляторних Τ клітин У деяких втіленнях даного винаходу регуляторні Τ клітин можуть бути одержані з культивованих клітин або тварин для подальшого аналізу згідно зі способами, відомими з рівня техніки, наприклад, так, як описано у патентних заявках США з реєстраційними номерами 2003/0170648, 2003/0157057, 2003/0133936, 2003/0064067, 2003/0049696, 2002/0182730, 2002/0090724, 2002/0090357, які введені в дану заявку як посилання. In vivo джерела популяцій клітин, корисні як джерела клітин, включають, але не обмежені, периферичну кров, продукти лейкофорезу крові, продукти аферезу крові, периферичні лімфатичні вузли, лімфоїдну тканину, асоційовану з кишечником, селезінку, тимус, пуповинну кров, мезентеричні лімфатичні вузли, печінку, сайти імунологічних пошкоджень, наприклад, синовіальну рідину, підшлункову залозу, спинно-мозкову рідину, зразки пухлини, тощо. Донор переважно представляє собою людину та може бути зародком, новонаро 94023 46 дженим, дитиною, дорослою людиною, а також може бути здоровим, хворим або схильним до захворювання індивідуумом, що представляє інтерес. Наприклад, регуляторні Τ клітини згідно з даним винаходом можуть бути збагачені на основі експресії маркерів поверхні клітин. В одному втіленні клітини є позитивно відібраними на експресію CD4 та CD25, та можуть бути негативно відібрані на відсутність CD45RA. Необов'язково можуть використовуватися інші маркери для подальшого розділення субпопуляцій регуляторних Τ клітин, включаючи CD69, CCR6, CD30, CTLA-4, CD62L, CD45RB та CD45RO. Способи можуть включати додаткові процедури збагачення або очистки або етапи для ізоляції клітин шляхом позитивної селекції на інші специфічні для клітин маркери. В іншому втіленні регуляторні Τ клітини відокремлювали від складної суміші клітин за допомогою способів, які збагачують її на клітини, що мають характеристики CD4+CD25+ та необов'язково CD45RA-. Для ізоляції клітин від тканини можна використовувати прийнятний розчин для диспергування або суспензії. Такий розчин у загальному випадку буде представляти собою збалансований сольовий розчин, наприклад, нормальний фізіологічний розчин, PBS, збалансований сольовий розчин Хенкса, тощо, який прийнятним чином доповнюється бичачою фетальною сироваткою, BSA, нормальною козячою сироваткою або іншими факторами, які існують в природі, у сполученні з прийнятним буфером у низькій концентрації, в загальному випадку від 5-25 мМ. Прийнятні буфери включають HEPES, фосфатні буфери, лактатні буфери та інші. В іншому втіленні відокремлення популяції регуляторних Τ клітин використовує афінне відокремлення для забезпечення суттєво чистої популяції. Способи для афінного відокремлення можуть включати магнітне відокремлення при використанні магнітних частинок, покритих антитілами, афінної хроматографії, цитотоксичних агентів, з'єднаних з моноклональним антитілом або таким, що використовується разом з моноклональним антитілом, наприклад, комплемент та цитотоксини, та «пеннінг» метод з антитілами, прикріпленими до твердого матриксу, наприклад, планшету, або за допомогою інших прийнятних технологій. Способи, які забезпечують точне розділення, включають пристрій для сортування активованих флуоресценцією клітин, що має варіабельні ступені удосконалення, такі, як багаточисленні канали забарвлювання, канали визначення за допомогою малого кута та приглушеного світлорозсіювання, канали електричного опору, тощо Клітини можуть бути відібрані проти мертвих клітин при використанні барвників, асоційованих з мертвими клітинами (йодид пропідію, LDS). Може використовуватися будь-яка технологія, яка не є надлишково шкідливою для життєздатності вибраних клітин. Афінні реагенти можуть бути специфічними рецепторами або лігандами для молекул поверхні клітин, що зазначені вище. У доповнення до реагентів антитіл, можуть використовуватися також пари пептид-МНС антиген та рецептор Τ клітин; 47 пептидні ліганди та рецептор; молекули ефектора та рецептора, тощо. Антитіла та рецептори Τ клітин можуть бути моноклональними або поліклональними та можуть бути одержані за допомогою трансгенних тварин, імунізованих тварин, вбитих В-клітин людини або тварини, клітин, трансфікованих за допомогою ДНК векторів, що кодують антитіло або рецептор Τ клітин, тощо. Деталі одержання антитіл та їх прийнятність для використання як специфічних зв'язувальних членів є добре відомими спеціалісту в даній галузі техніки. Особливий інтерес представляє використання антитіл як афінних реагентів. Традиційно ці антитіла кон'югують з міткою для використання при розділенні. Мітки включають магнітні гранули, які дозволяють здійснювати безпосереднє розділення, біотин, який може бути видалятися за допомогою авідину або стрептавідину, зв'язаними з носієм, флуорохроми, що можуть використовуватися разом з сортувальним пристроєм для активованих флуоресценцією клітин, або подібних, для того, щоб дозволити проводити легке відокремлення особливих типів клітин. Флуорохроми, що знайшли своє використання, включають фікобіліпротеїн, наприклад, фікоеритрин та алофікоціаніни, флуоресцеїн та техаський червоний. Часто кожне антитіло є міченим різними флуорохромами для того, що проводити незалежне сортування на кожний маркер. В одному втіленні антитіла додають до суспензії клітин та інкубують протягом періоду часу, достатнього для зв'язування поверхневих антигенів життєздатних клітин. Інкубація буде звичайно тривати, принаймні, 5 хвилин та звичайно менше, ніж 30 хвилин. Є бажаним мати достатню концентрацію антитіл у реакційній суміші, так, що ефективність розділення не є обмеженою відсутністю антитіла, тобто, використовуючи насичуючу кількість антитіла. Прийнятна концентрація може також бути визначена шляхом титрування. Середовище, в якому проводять розділення клітин, буде будь-яким середовищем, яке підтримує життєздатність клітин. Бажане середовище представляє собою фосфатно-буферний сольовий розчин, який містить від 0,1 до 0,5% BSA. Різноманітні середовища є комерційно доступними та можуть використовуватися згідно з природою клітин, включаючи модифіковане Дюльбекко середовище Ігла (dMEM), основний сольовий розчин Хенкса (HBSS), фосфатно-буферний сольовий розчин Дюльбекко (dPBS), RPMI, середовище Ісковера, PBS з 5 мМ ЕДТА, тощо, які часто є доповненими бичачою фетальною сироваткою, BSA, HSA, тощо. За інтенсивністю забарвлювання клітин можна слідкувати за допомогою проточної цитометрії, де лазери визначають кількісні рівні флуорохрому (які є пропорційними кількості зв'язаного з антитілами антигену поверхні клітин). Проточна цитометрія, або FACS, може також використовуватися для розділення клітинної популяції на основі інтенсивності забарвлювання антитіл, а також інших параметрів, таких, як розмір клітин та розсіяння світла. Незважаючи на те, що абсолютні рівні забарвлювання можуть відрізнятися в залежності від конк 94023 48 ретного флуорохрому та препарату антитіла, дані можуть бути нормалізовані до контролю. Мічені клітини потім розділяють відносно експресії CD4 та CD25. Розділені клітини можуть бути зібрані у будь-якому прийнятному середовищі, що підтримує життєздатність клітин та звичайно містить підкладку на дні пробірки для збору клітин. Різноманітні середовища є комерційно доступними та можуть використовуватися згідно з природою клітин, включаючи dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, середовище Ісковера, тощо, що часто доповнені бичачою фетальною сироваткою. Композиції, високо збагачені на активність людських регуляторних Τ клітин, можна одержати таким чином. Популяція, яку необхідно одержати, буде міститися у кількості 70% або приблизно 70% або більше від клітинної композиції, та звичайно 90% або приблизно 90% або більше від клітинної композиції, та може бути настільки великою, що містить приблизно 95% або більше клітинної популяції. Збагачена клітинна популяція може використовуватися негайно. Клітини також можна заморожувати, незважаючи на те, що є бажаним заморожувати клітини перед проведенням процедури розділення, або можна заморожувати при температурах рідкого азоту та зберігати протягом тривалих періодів часу, розморожувати та використовувати повторно. Клітини звичайно будуть зберігатися в ДМСО та/або FCS у поєднанні із середовищем, глюкозою, тощо. Розморожені клітини можна розмножувати при використанні ростових факторів, антигенної стимуляції, дендритних клітин, тощо, для проліферації та диференціації. Клітинні культури: Для аналізу цитокінів, клітини культивували протягом 48 годин у мікротитрувальних планшетах на 96 комірок (Corning, Cambridge, MA) з 200 нл середовища (5 x 105 клітин/комірка) при 37°С. Як культуральне середовище використовували RPMI, що містить 10% FCS, 25 мМ HEPES буфера, 2 мМ 5 L-глутаміну, 5 x 10 Μ -меркаптоетанолу, 1 мМ пірувату натрію, 100 од./мл пеніциліну, 5 мг/мл гентаміцину та 100 мг/мл стрептоміцину (усі від GIBCO). Для більшості експериментів клітини культивують без додання або з доданням анти-CD3 (2С11, АТСС) та анти-СD28 моноклонального антитіла (Pharminogen, San Diego, СА) (кожне у концентрації 1 мкг/мл). Ізольовані Τ клітини культивували у комірках, які попередньо були покриті протягом ночі за допомогою анти-СD3 та -CD28 моноклонального антитіла. Для аналізу IL12 клітини культивували з олігонуклеотидом, який має фосфортіоатний скелет ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT) (SEQ ID NO. 3) який містить два (підкреслено) імуностимуляторні CpG фрагменти (13; 14), що забезпечується Соlеу Pharmaceutical Group (Wellesley, MA), та використовували його у концентрації 0,6 мкг/мл для стимуляції продукції. ELISA для мишачих цитокінів: ELISA проводили так, як описано у розділі VI, що приведений вище. Приклад 2. Th2 відповідь на S. mansoni виявляє знижувальну модуляцію на існуючу Th1 відпо 49 відь на неспоріднений бактеріальний Th1індукований антиген: Добре відомо, що Th-клітинні імунні відповіді можуть поляризуватися в Th1 або Th2 моделі. Така поляризація виникає внаслідок того, що IFN з Th1 клітин інгібує проліферацію Th2 клітин, у той час як IL-4 та IL-10 з Th2 клітин інгібують розвиток Th1 клітин. Наступні експерименти продемонстрували, що шистозоматоз змінює Th1 відповідь у мишей на встановлену мікобактеріальну інфекцію. Мишей сумісно інфікували за допомогою М. avium та S. mansoni для оцінки відповіді хазяйського організму на ці чітко відмінні Th1 та Th2 стимули запалення. BALB/cAnN миші розвивали хронічну М. avium інфекцію, коли проводили ін'єкцію цього організму (106 CFU). Через 60 днів після встановлення мікобактеріальної інфекції, мишей інфікували за допомогою S. mansoni (40 церкаріїв). Через 60 днів мишей забивали. Контрольні групи включали мишей, які одержували або тільки М. avium протягом 120 днів, або тільки S. mansoni протягом 60 днів. Дисперговані спленоцити або ізольовані клітини гранульоми з цих тварин культивували in vitro (4 x 105 клітини/комірка) протягом 48 годин у присутності або за відсутності антигену яєць шистосоми (SEA, сильний Th2 антиген) або очищеної білкової похідної мікобактеріальних антигенів (PPD, сильний антиген, що індукує Th1), які використовували в оптимальній концентрації. Після інкубації супернатанти аналізували на продукцію цитокіну або імуноглобуліну при використанні ELISA. Дані на Фігурах 1-3 представляють собою середні значення +/- стандартна похибка трьох окремих експериментів. Спленоцити від мишей, інфікованих за допомогою М. avium, секретували велику кількість IFN після стимуляції за допомогою PPD (Th1 антиген). Клітини селезінки від неінфікованих контрольних мишей не продукували IF-Ν. Найбільш важливим є те, що не визначали ΙFΝ у культурах клітин селезінки, одержаних від одночасно інфікованих мишей (тільки М. avium проти одночасної інфекції, Р
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюUse of an agent produced from a parasite for control of diseases
Автори англійськоюWeinstock Joel, Elliott David E.
Назва патенту російськоюПрименение паразитических биологических агентов для борьбы с заболеваниями
Автори російськоюВейнсток Джоел В., Эллиотт Девид Э.
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/00, C12Q 1/68, G01N 33/50, A61P 37/00, A61K 35/56, C12Q 1/02
Мітки: боротьби, біологічних, агентів, паразитичних, застосування, захворюваннями
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/38-94023-zastosuvannya-parazitichnikh-biologichnikh-agentiv-dlya-borotbi-z-zakhvoryuvannyami.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Застосування паразитичних біологічних агентів для боротьби з захворюваннями</a>
Попередній патент: Застосування інгібітору il-18 для лікування і/або попередження алкогольного гепатиту
Наступний патент: Спосіб тиснення виробів і пристрій для тиснення (варіанти)
Випадковий патент: Спосіб уловлювання благородних металів у виробництві азотної кислоти