Консорціум штамів бактерій васіllus меgатеrіuм, bacillus freudenreichii, agrobacterium sp., arthrobacter oxamicetus, що використовується для очистки стічних вод від діетиленгліколю та метанолу

Изобретение откосится к области биотехнологии, в частности, к биологической очистке промышленных сточных вод, и касается консорциума штаммов бактерий, который предназначен для совместного разрушения диэтиленгликоля (ДЭГ) и метанола в высоких концентрациях. Известно, что консорциум бактерий Agrobacterium sp. 172, Bacillus megaterium 171, Bacillus pumilus 123 может утилизировать из воды до 10000мг/дм3 ДЭГ/А.С. СССР №1774602 МКИ5 С02F3/34С12Р33/00 БИ, 1992, №41(ДСП). Штамм Methylomonas methanica способен утилизировать метанол из воды полностью в массовой концентрации до 10000мг/дм3 (А.С. СССР №1150892, МКИ5 С02Р3/34 (ДСП). В то же время совместное присутствие ДЭГ и метанола в сточной воде в больших концентрациях делает возможным очистку этой воды активным илом (Роговская Ц.И. Лазарева М.Ф., Троян О.С, Ермолова М.А. Очистка промстока, содержащего метанол и деструкция одноатомных спиртов С3-С9. // Водоснаб. и санит. техн., 1978. №9. -С.30-32. Известно использование адаптированной микрофлоры активного ила (А.С. СССР №1174388 МКИ5 С02F34/34, опубл. БИ, 1985, №31) при очистке высокоминерализованной сточной воды от ДЭГ и метанола с массовой концентрацией 1000мг/дм - 2000мг/дм , соответственно, которая осуществляется за 40-120 часов при разбавлении стока пресной воды в 70-100 раз. В данном случае об эффективности очистки говорить трудно, т. к. такая степень разбавления сточной воды делает содержание ксенобиотиков настолько минимальным (3050мг/дм3), что не представляет трудностей для активного ила традиционных очистных сооружений, для которых ПДК ДЭГ - до 300мг/дм3, метанола - до 30мг/дм3. Таким образом известные технические решения не позволяют эффективно очистить сточные воды от ДЭГ и метанола при их совместном присутствии в высоких концентрациях. Задачей изобретения является получение консорциума штаммов бактерий, которые обеспечат полное разрушение высоких концентраций ДЭГ (до 10000мг/дм3) и метанола (до 5000мг/дм3). Для решения поставленной задачи, предложенный консорциум штаммов микроорганизмов (в % отношении): Bacillus megaterium ВКПМ (171) В-5168 Bacillus freudenreichii ВКПМ (124) В-3158 Agrobacterium sp. ВКПМ (172) В-5163 Arthrobacter oxamicetus ВКПМ (168) S-918 40:25:20:15, обладает высокой деструктивной активностью по отношению к ДЭГ и метанолу в высоком массовом содержании до 10000 и 5000мг/дм3, соответственно. Штаммы, входящие в консорциум, обладает следующими свойствами. Штамм Bacillus megaterium 171 ВКПМ В-5168. Культурально-морфологические свойства. Клетки представляют собой неподвижные грамположительные крупные палочки 1,6´5,0-8,0мкм. Образуют эллипсовидные эндоспоры. В протоплазме видны глобулы. В мазке клетки располагаются одиночно. Мясопептонный агар (30°С, 24ч.). Колонии плотные, матовые, беловато-сероватого цвета, центр складчатый с островками выпуклостей, вокруг него валик с зубчатыми краями. Мясопептонный бульон (30°С, 24ч.). Бульон прозрачный, образует рыхлый осадок. Пигмента не образует. Штамм растет в мясопептонном бульоне, содержащем 7% хлористого натрия. Физиолого-биохимические свойства. Факультативный анаэроб. Метаболизм дыхательный и бродильный. Растет при температуре (10-42°С), в диапазоне pH6,0-9,0. Желатину разжижает. Гидролизует крахмал, казеин, тирозин. Нитраты не редуцирует. Утилизирует цитрат. Обладает ярко выраженной левансахарозной активностью. На среде Кларка образует ацетоин. Уреазоположительная. Отношение к источникам углерода. Образует кислоту и газ из глюкозы, ксилозы, маннита, арабинозы. Образует щелочь на среде с цитратом. Сохраняет жизнеспособность и деструктивную активность в лиофильно высушенном состоянии. Штамм не патогенен. Культура идентифицирована как штамм Bacillus megaterium 171. Штамм Bacillus freudenreichii 124 ВКПМ В-3158. Культурально-морфологические свойства. Клетки представляют собой подвижные, грамположительные, крупные клетки. Образует эллипсовидные споры. Мясопептонный агар (30°С, 24ч.). Образует колонии беловатого цвета, выпуклые, блестящие, зернистой структуры, матовые. Мясопептонный бульон (30°С, 24ч.). Отмечается равномерное помутнение, пленка. Штамм растет в мясопептонном бульоне, содержащем 7% хлористого натрия. Физиолого-биохимические свойства. Факультативный анаэроб. Метаболизм дыхательный и бродильный. Растет в диапазоне рН6,0-9,0, при температуре (10-42°С). Желатину разжижает. Крахмал не гидролизует. Не продуцирует индола. Нитраты редуцирует. Утилизирует цитрат. Уреазоположительная. Отношение к источникам углерода. Образует кислоту и газ из фруктозы, галактозы, мальтозы, сахарозы. Не утилизирует глюкозу. Штамм не патогенен. Культура идентифицирована как Bacillus freudenreichii 124. Штамм Agrobacterium sp. 172 ВКПМ В-5163. Культурально-морфологические свойства. Клетки представляют подвижные, грамотрицательные, очень мелкие (0,4-8,0мкм) палочки. Капсул и спор не обнаружено. В мазке клетки одиночные. Мясопептонный агар (30°С, 24 или 48ч.). Образует колонии белого цвета, диаметром 2-3мм, края ровные, выпуклые, гладкие, слизистой консистенции, блестящие. Мясопептонный бульон. Отмечается легкое помутнение среды, небольшой зонтичный осадок. Пигмента не образует. Растет в мясопептонном бульоне, содержащем 5 или 7% хлористого натрия. Агаризованная синтетическая среда с 5г/дм3 ДЭГ и 2г/дм3 метанола в качестве единственного источника углерода(30°С, 24ч.). Образует колонии округлые, липкие, белые (1,2-1,7мм), края ровные, колонии выпуклые, блестящие. Физиолого-биохимические свойства. Факультативный аэроб, метаболизм дыхательный и бродильный. Растет при температуре 22-32°С. Растет в диапазоне pH6,0-9,0. Желатину не разжижает. Крахмал и казеин не гидролизует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Выделяет сероводород при росте в МПБ. Обладает слабой липолитической и лецитиназной активностью. Активный денитрификатор. Индол не образует. Отношение к источникам углерода. Образует кислоту, но не газ из арабинозы, мальтозы, рамнозы, ксилозы, трегалозы, галактозы, глюкозы, фруктозы, сорбита. Растет на аспарагине, глицине, b-аланине, креатине, инозите, манните, этаноле. Штамм чувствителен к ауреомицину. неомицину, новомицину, тетрациклину. Штамм не патогенен. Культура по своим свойствам близка к виду A. tumeracieus однако способность образовывать галлы на стебле растений нами не определялась, поэтому была идентифицирована как Agrobacterium sp. 172. Штамм Agrobacter oxamicetus 168BKПM-918. Культурально-морфологические свойства. Палочковидные клетки варьирующих размеров (0,5-0,6´3,0-4,0mк). Образует V-образные сочетания. Мясопептонный агар (30°С, 24 или 48ч.). Образует мелкие матовые выпуклые колонии светло-розового цвета. Мясопептонный бульон (30°С, 24ч.). Отмечается поверхностный рост в виде шероховатой складчатой пленки. Пигмента не образует. Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Метаболизм дыхательный. Растет при температуре 22-32°С. Не растет при 41°С. Желатину не разжижает. Крахмал и казеин не гидролизует. Нитраты в нитриты не превращает. Выделяет сероводород при росте на МПБ. Молоко не пептонизирует, но слегка подкисляет. Обладает ярко выраженной уреазной активностью. Индол не образует. Отношение к источникам углерода. Утилизирует a-фруктозу, сахарозу, сорбит, маннит, глюкозу. Не утилизирует ксилозу, рамнозу, галактозу, мальтозу, дульцит. Штамм не патогенен. Культура идентифицирована как Arthrobacter oxamicetes 168. Пример получения консорциума. Активные штаммы бактерий первоначально были получены методом накопительных культур из образцов почв, взятых с территории газовых промыслов, где для осушки газа используется ДЭГ и метанол. Затем селекцию штаммов-деструкторов продолжали в проточных условиях при иммобилизации бактерий на насадке из синтетического волокна, изготовленной на вязальной машине и имеющего форму "ВИИ"® ТУ995990. В такую установку вносили активные штаммы микроорганизмов-деструкторов, полученные методом накопительных культур. При постепенном увеличении концентрации ксенобиотиков в подаваемой воде в биореакторе происходит селекция высокоактивных штаммов. При утилизации максимальных концентраций ДЭГ и метанола были выделены культуры микроорганизмов, из которых и составлен консорциум. Консорциум микроорганизмов использует ДЭГ и метанол в качестве единственного источника углерода и энергии в проточных условиях, при постоянной аэрации и иммобилизации клеток на инертной насадке при исходном массовом содержании ДЭГ 10000мг/дм3 и метанола - 5000мг/дм3. Консорциум способен расти на среде, содержащей г/дм3: Na2НРО4-0,6, NH4 NO3-0,4, KCI-0,02, MnSO4-0,01, MgCl2-0,02, СаСІ2-0,01, ДЭГ - до 10000мг/дм3, метанол - до 5000мг/дм3, водопроводная вода - до 1дм3, величина pH6,9-7,2. При конструировании консорциума для научных и практических целей брали вегетативный материал компонентов и смешивали в один инокулят. Стабильность консорциума подтверждается высевом на твердую среду с подсчетом колоний разного типа. Конкурентоспособность консорциума при использовании его в нестерильных средах (при очистке реальных сточных вод), велика, т. к. в результате сильного токсического воздействия ДЭГ и метанола (при высоких концентрациях) микроорганизмы, попавшие в установку при случайном заражении, в этих условиях не размножаются. Пример использования консорциума. 1. В периодических условиях при температуре 30°С, на качалке (150об/мин) изучали деструктивные свойства консорциума микроорганизмов: Bacillus megaterium ВКПМ (171) В-5168 Bacillus freudenreichii ВКПМ (124) В-3158 Agrobacterium sp. ВКПМ (172) В-5163 Arthrobacter oxamicetus ВКПМ (168) S-918 в различных процентных соотношениях. Консорциум составлен из исходных суспензий микроорганизмов, содержащих по 10-9 клеток на 1мл среды. Для исследований был взят штамм Bacillus pumilus BKПM(123)B-3160, который входит в состав консорциума микроорганизмов, разрушающих ДЭГ в концентрации 10000мг/дм3(А.С. СССР №1774602 МКИ5 С02F3/34С12Р33/00 (ДСП). Как видно из таблицы 1, штамм Bacillus pumilus не утилизирует метанол и, повидимому, присутствие метанола в среде ингибирует деструктивную активность его по отношению к ДЭГ. Поэтому нецелесообразно вводить его в состав консорциума. Остальные штаммы в отдельности разрушают часть взятых ксенобиотиков. Причем штамм Bacillus megaterium разрушает ДЭГ на 40% и Agrobacterium sp. на 30%. Штаммы В. freudenreichii и А. oxamicetus разрушают в большей степени метанол - на 35 и 39% соответственно. Исследование различных соотношений указанных культур показало, что наибольшую деструктивную активность по отношению к ДЭГ (утилизация 97%) и метанолу (утилизация на 99%) проявили микроорганизмы, взятые в следующем процентном соотношении Bacillus megaterium / Bacillus freudenreichii / Agrobacterium sp. / Arthrobacter oxamicetus как 40:25:20:15. 2. Использование консорциума в проточных условиях проводили в 18-ти секционном реакторе объемом 3,6дм с насадкой из синтетического волокна. Температура очистки 20-26°С, время очистки - 48 часов. Модельная сточная вода следующего состава, г/дм3: Na2 HPO4-0,6, NH4NO3-0,4, MnSO4-0,01, KCI-0,02, МgСІ2-0,02, CaCI 2-0,01, ДЭГ-10,0, метанола-5,0, водопроводная вода до 1дм3. Консорциум микроорганизмов вносили в установку в процентном соотношении В. megaterium / В. freudenreichii / Agr. sp. / A. oxamicetus как 40:25:20:15. Модельную сточную жидкость подавали в установку вначале с очень маленькой скоростью протока, начальное время пребывания воды в установке 120-144 часа. При постепенном снижении содержания ксенобиотиков на выходе из сооружения, время пребывания постепенно уменьшается. Через 6 недель прошла полная адаптация бактерий к данному составу воды, на насадке сформировался биоценоз с толщиной биопленки 0,5-1,5мм. Время пребывания воды в установке - 48 часов. Разрушение ксенобиотиков происходит на 97-99% (по ХПКбихр) (табл. 2). При полной утилизации ДЭГ и метанола из первых секций установки микробиологическими методами установлены доминирующие бактерии, %: Bacillus megaterium 40±5 Agrobacterium sp. 25±3 Bacillus freudenreichii 20±5 Arthrobacter oxamicetus 15±2 3. Консорциум использован при очистке высококонцентрированных реальных сточных вод, образующихся при сушке газа на стадии подземного хранения газа. Массовое содержание в воде ДЭГ - до 10г/дм3, метанола до 5г/дм3, ХПК - 15000-25000мг/дм3 . Суточный объем воды - 20м3, время пребывания - 48 часов, температура - 20-26°С. Для иммобилизации бактерий в очистных сооружениях использовали насадку из синтетического волокна типа "ВИЯ"Ò. В качестве биогенных веществ использовали нитроаммофоску из расчета 0,1г/дм3 сточной воды. В биореактор внесена биомасса бактерий-деструкторов в процентном соотношении 40:25:20:15. Через месяц после адаптации микроорганизмов наблюдалось практически полное разрушение ксенобиотиков (табл.2). Таким образом, предложенный консорциум позволяет очистить сточные воды, содержащие ДЭГ до 10000мг/дм3 и метанол до 5000мг/дм3, на 97-99%. Остаточные количества ксенобиотиков не превышали ПДК для традиционных очистных сооружений с активным илом: ДЭГ - 20-200мг/дм3, метанола - 2-20мг/дм3, т.е. эти очищенные воды можно сбросить в городскую канализацию.