Консорціум штамів бактерій аgrовастеrіuм sр. 172, васіllus меgатеrіuм 171, васіllus рuтіlus 123, що використовується для очистки стічних вод від діетиленгліколю

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности микробиологии очистки сточных вод, и касается нового консорциума штаммов бактерий, который предназначен для биодеструкции диэтиленгликоля (ДЭГ) в больших концентрациях. Отдельные бактерии рода Acinetobacter [1] разрушают ДЭГ в массовой концентрации 100-200 мг/дм 3 за 7-15 дней. Известный штамм Bacillus pumilus 123 [2] способен утилизировать ДЭГ из воды полностью в массовой концентрации - 1000 мг/дм 3. Однако, во многих промышленных сточных водах, особенно южных газовых промыслов, содержание ДЭГ может достигать 10000 мг/дм 3. Увеличение концентрации ДЭГ в воде делает невозможным обработку ее одним штаммом, т.к. разрушение его в такой концентрации культурой микроорганизмов Bacillus pumllus 123 идет на 40-50 % за 24-48 часов. Задачей изобретения является формирование консорциума штаммов микроорганизмов путем селекции активных штаммов-деструкторов и подбора их соотношения в консорциуме, обеспечивающего биодеструкцию ДЭГ на 96-99 % при его исходном массовом содержании в воде до 10 000 мг/дм 3. Поставленная задача достигается путем обработки сточных вод консорциумом штаммов микроорганизмов Agrobacierlum sp ВКПМ (172) В-5163 Bacillus megaterlum ВКПМ (171) В-5168 Bacillus pumllus ВКПМ (123) B-3160. Штаммы, входящие в консорциум, обладают следующими свойствами. Штамм Agrobacterlum sp 172 (ВКПМ) В-5163. Морфолого-культуральные свойства. Выделенный штамм Agrobacrerlum sp ВКПМ (172) В-5163 имеет следующие морфолого-культуральные признаки: подвижные клетки, палочковидные, очень мелкие (0,4х8 m ) грамотрицательные. Спор и капсул не образуют. Колонии на МПА блестящие, гладкие, выпуклые, белого цвета, слизистой консистенции, диаметром 23 мм, края ровные. На МПБ штамм дает равномерное легкое помутнение, небольшой зонтичный осадок, пигмента, не образует. Оптимальная температура роста 30-32°С, не растет при 41°С и 5°С. Физиолого-биохимические свойства. Культура Agrobacterlum sp оксидазо- и каталазоположительная, желатину не разжижает, крахмал и казеин не гидролизует, активный денитрификатор, обладает арги-ниндегидрогеназной активностью, липолитическая активность слабая, реакция на ацетоин и метилрот - отрицательная, индол не образует, сероводород выделяется на рост на МПБ, лецитиназная активность слабая, леван-сахарозы нет, растет при 7 % NaCI, утилизирует с подкислеиием среды арабинозу, мальтозу, рамнозу, ксилозу, трегалозу, галактозу, глюкозу, фр уктозу, сорбит, растет на аспарагине, глицине, b -аланине, креатине, инозите, макните, гиппуровой кислоте, этаноле, аргинине. Штамм Bacillus megaterium 171 (ВКПМ В-5168). Морфолого-культуральные свойства. Выделенный штамм Bacldus megaterium ВКПМ (171) В-5168 имеет следующие морфолого-культуральные признаки: неподвижные крупные палочки (1,6х5,0-8,0 m ) грамотрицательные, образующие эллипсовидные эндоспоры, аэробы, в протоплазме хорошо видны неокрашенные глобулы. На МПА образуют плотные колонии диаметром 5-6 мм беловато-сероватого цвета, матовые, центр складчатый с островками выпуклостей, вокруг него валик с зубчатыми краями. На МПБ образует рыхлый осадок, пигмента не образует. Физиолого-биохимические свойства. Культура Bacillus megaterium оксидазо-отрицательная, обладает слабой каталазной активностью, желатин разжижает, гидролизует казеин, крахмал, тирозин, редукцию нитратов не производит, обладает ярко выраженной левансахаразной активностью, не растет при 50°С. растет при 7 % NaCI. Образует кислоту и газ из глюкозы, утилизирует цитрат, образует ацетоин на среде Кларка, уреазоположительная. Штамм Bacillus pumHus 123 (ВКПМ) В-3160. Морфолого-культуральные свойства. Выделенный штамм Bacillus pumllus ВКПМ (123) В-3160 имеет следующие морфолого-культурадьные признаки: колонии на МПА средних размеров, беловатые, блестящие с выпуклыми краями. На МПБ штамм образует равномерное помутнение и осадок. Грамположительные аэробы, клетки крупные, размеры 0,6-0,7 m , палочковидные, полиморфные, расположены одиночно, подвижные (вращательный тип движения), споры расположены ЦТ. Оптимальная температура выращивания 26-30°С. Физиолого-биохимические свойства. Культура Bacillus pumllus оксидазоотрицательная, каталазоположительная, желатин не разжижает, не осуществляет гидролиз крахмала, обнаруживает рост на среде с мочевиной, реакция на аммиак и ФогесПроскауэра отрицательна. На минеральной среде Омелянского с бромтимоло-вым синим образует кислоты: из арабинозы, рамнозы, фруктозы, мальтозы, сорбита, глицерина, инозита; не использует инулин, галактозу, сахарозу, маннит. Метиленовое молоко восстанавливает. Культура усваивает цитрат, ацетат, лактат натрия. Штамм разрушает 1 г/дм 3 ДЭГ на 95-99 % в периодических условиях за 36 часов и 96-100 % за 18-23 часа в условиях протока. Штамм выращивают на синтетической среде следующего состава, г/дм 3: Na2HPO4 - 0,6, NH4NO3 – 0,4, MnSO4 - 0,01, KCI - 0,02, СаСІ2 - 0,01, МgСІ 2 - 0,02, ДЭГ-1. водопроводная вода до 1 дм 3, рН 6,9-7,2. Периодическое культивирование проводят при 30°С, концентрация клеток в среде – 109 кл/мл. Штаммы хранят на плотной среде того же состава с добавлением 1 % МПБ при температуре +4°С. Все штаммы консорциума не патогенны. Пример получения консорциума. Первоначально из образцов почв, взятых с территории газовых промыслов, где используют ДЭГ и длительное время контактировали с ним, методом накопительных культур получали активные штаммы бактерий. Затем смесь полученных микроорганизмов вносили в работающую в проточном режиме в аэробных условиях установку с насадкой из синтетического волокна. Путем постепенного увеличения концентрации ДЭГ в установке селекционировали активную биомассу микроорганизмов. При утилизации 10000 мг/дм ДЭГ из установки выделяли чистые штаммы-деструкторы, из которых и составляли консорциум. Консорциум микроорганизмов использует ДЭГ в качестве единственного источника углерода и энергии в условиях проточного культивирования, при длительной аэрации и иммобилизации клеток на инертной насадке типа "ВИЯ"® при исходном массовом содержании - 10000 мг/дм 3. Состав среды, на котором способен расти консорциум, г/л: Na2HPO4 - 0,6, NH4NO 3 – 0,4, KCI - 0,02, MnSO4 0,01, MgCl2,- 0,02, CaCl 2 - 0,01, ДЭГ до 10000 мг/дм 3, водопроводная вода до 1 дм 3, величина рН 6,9-7,2. Примеры использования консорциума. 1. Периодическое культивирование консорциума микроорганизмов Agrobacterium sp ВКПМ(172) В-5163, BaefHus megaterfum ВКПМ (171) В-5168, Bacillus pumllua ВКПМ (123) В-3160 проводят при температуре 30°С на качалке при 150 об/мин. Среда культивирования та же, что и при получении консорциума. В таблице 1 представлены результаты изучения деструктивной активности отдельных штаммов консорциума и самого консорциума бактерий, взятых в равном соотношении. Концентрация микроорганизмов 10 9 клеток на 1 мл среды. Время контакта от 18 до 72 часов. Как видно из табл. 1, отдельные культуры не полностью утилизируют ДЭГ, причем, при высоких концентрациях лучше проявляют себя бактерии Agrobacteriun» Sp., затем Вас. megaterium и, наконец, Bacillus pumiius. Консорциум в периодических условиях имеет большую деструктивн ую активность по сравнению с отдельными штаммами. Уже через 18 часов 1000 мг/дм ДЭГ полностью разрушаются бактериями. Через 24 часа 5000 мг/дм утилизируется на 80 %, и через 48 часов -10000 мг/дм 3 на 60 % в соотношениях микроорганизмов в консорциуме 1:1:1. 2. Периодическое культивирование консорциума в различных соотношениях штаммов микроорганизмов проводят на сточной воде того же состава, что и в предыдущи х случаях, и в те х же условиях инкубации, что, и а примере 1. Время контакта 48 часов. Как видно из табл. 2, высокой деструктивной активностью обладает консорциум микроорганизмов в соотношении Agrobactertum sp: Bacillus megaterlum : Bacillus pumllus как 5-6:4-5:2-3, который утилизирует 10000 мг/дм 3 на 96-98 %. Остальные соотношения проявляют меньшую активность и разрушение ДЭГ происходит на 96 %. 3. Использование консорциума в условиях протока проводили в 18-ти секционном реакторе объемом 3,6 дм 3 с насадкой из синтетического волокна "ВИЯ"®. Температура очистки - 20-26°С. Использовали сточную жидкость следующего состава, г/л: Na2HPO4 - 0,6; NH4NO3 - 0,4, MnSO4 - 0,01, KCI - 0,02, MgCl2 – 0,02, СаСІ2 – 0,01, ДЭГ 10,0, водопроводная вода - до 1 дм 3. Консорциум взят в соотношении 5-6:4-5:2-3. Результаты очистки представлены в табл. 3, где видно, что консорциум во взятом соотношении обладает повышенной деструктивной активностью к массовому содержанию ДЭГ в сточной воде до 10 г/дм 3 и очищает сточную воду на 96-99 % за 48 часов контакта. 4. Испытания работы консорциума в условия х протока на реальной сточной воде проводили на пилотной установке объемом 10дм на площадке южного газового промысла. Состав очищаемой воды, г/дм: ДЭГ - 10,0, поверхностно-активные вещества - до 0,05, конденсат и нефтепродукты - до 0,05. Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов-деструкторов в сточную воду добавляли биогенные вещества, г/дм; Na2HPO4 –0,6, NH 4NO3 - 0,04, MnSO4 –0,01, KCl - 0,02, MgCl2 - 0,02, CaCl 2 – 0,01. Консорциум бактерий взят в соотношении 5-6:4-5:2-3. Время контакта 48 часов. После периода адаптации продолжительностью 2-3 недели консорциум микроорганизмов очищал реальные сточные воды на 96 % (табл.4).