Спосіб визначення днк бактерій виду chlamydia abortus, chlamydia pecorum, chlamydia psittaci у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена, що кодує ендорибонуклеазу р (rnase p rna)

Реферат: Винахід належить до способу визначення ДНК бактерій Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci, що викликають захворювання у свійських собак, у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена, що кодує ендорибонуклеазу Р (RNase Р RNA), за допомогою пари праймерів: прямого: CHCPF:5'-GGAGAAACTCCAGGGGCCGT-3' та UA 110546 C2 (12) UA 110546 C2 зворотного: CHCPR:5'-GGCAACCATTCATCTAGGGGA-3' ендорибонуклеази розміром 253 пари нуклеотидів. з одержанням фрагмента гена UA 110546 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Винахід належить до молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини. Він може бути використаний для діагностики та дослідницьких робіт. Одним із способів діагностики хвороб, що викликаються мікроорганізмами, є визначення останніх за унікальністю нуклеїнової кислоти, оснований на ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (ШІР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з олігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої праймерами ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу - від 30 до 40. Ключовим параметром, що визначає специфічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації. Існує ПЛР-тест-система "Полимик" виробництва НВФ "Литех" для ПЛР-ампліфікації ДНК Chlamydia trachomatis [1]. Основною відмінністю тест-системи, що пропонується є ПЛРампліфікація ДНК Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci, які є етіологічними чинниками хламідіозів ссавців, зокрема свійських собак. В основу винаходу поставлено задачу сконструювати праймери власного дизайну, що будуть обмежувати за складом нуклеотидних послідовностей ділянку гена, який кодує ендорибонуклеазу Ρ (RNase P RNA) бактерії роду Chlamydia (Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci) для діагностики хламідійних інфекцій свійських собак. Поставлена задача вирішується тим, що як і в способі визначення бактерії Chlamydia trachomatis за методом ПЛР, у способі, що пропонується також використовується такий підхід. Створення олігонуклеотидних праймерів для визначення хламідійних інфекцій свійських собак у полімеразній ланцюговій реакції передбачало пошук специфічних ділянок гена, що кодує RNase Ρ RNA бактерії роду Chlamydia трьох видів: Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci (які є етіологічними чинниками хламідіозів ссавців, зокрема свійських собак) та зручних для електрофоретичної детекції. Для аналізу з бази даних GenBank [1], були вибрані первинні послідовності геномів бактерій родини Chlamydia трьох означених видів: Chlamydia: DQ257295 Chlamydia abortus, AJ012173 Chlamydia pecorum, AJ310737 Chlamydia psittaci. Згідно з винаходом, для ПЛР використовуються олігонуклеотидні праймери, які обмежують консервативну ділянку гена, що кодує ендорибонуклеазу Ρ (RNase P RNA) бактерії родини Chlamydiaceae роду Chlamydia видів Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci. Для цього використовується пара розроблених праймерів одного прямого: CHCPF:5’GGAGAAACTCCAGGGGCCGT-3" та одного зворотного: CHCPR:5'GGCAACCATTCATCTAGGGGA-3" Продуктом ПЛР є фрагмент гена RNase Ρ RNA, що має розмір - 253 пари нуклеотидів характерний для бактерії Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci, що викликають захворювання ссавців, і свійських собак зокрема. Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР у поліакриламідному або агарозному гелі дозволяє чітко визначати наявність ДНК збудників хламідіозу свійських собак за відповідним розміром ампліфікованого фрагмента. Ідентичність продукту ПЛР підтверджується рестрикційним аналізом з використанням ендонуклеази Аlu І, в результаті якого повинні утворюватися два фрагменти ДНК з розміром 104 та 149 пар нуклеотидів. Пропонований спосіб визначення збудника хламідіозу свійських собак має наступну перевагу: діагностика хламідійної інфекції за консервативною ділянкою ДНК бактерій Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci, що є ендемічним збудником хламідіозу у означеного виду ссавців. 50 55 Джерела інформації: 1. ТУ-9398-405-17253567-96. Наборы реагентов для обнаружения ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma Hominis, Ureaplasma urealyticum (ПОЛИМИК) в биологических пробах методом полимеразной цепной реакции. Инстр. по примен. - М., НПФ "ЛИТЕХ". - 1996. - 4 с. 2. GenBank (версія 00.2003 року). 3. Virtual Genome Center (http://alsec/med/umn/edu/VGC.html). 1 UA 110546 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб визначення ДНК бактерій виду Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена, що кодує ендорибонуклеазу Р (RNase Р RNA), який відрізняється тим, що ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки фрагмента гена RNase Р RNA здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: CHCPF:5'-GGAGAAACTCCAGGGGCCGT-3' та зворотного: CHCPR:5'GGCAACCATTCATCTAGGGGA-3' з одержанням фрагмента гена ендорибонуклеази розміром 253 пари нуклеотидів бактерій Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci, що викликають захворювання у свійських собак. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2