Спосіб визначення днк бактерій chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (момр)

Реферат: UA 109489 C2 (12) UA 109489 C2 Винахід належить до молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини, а саме, до способу визначення ДНК збудника хламідійних інфекцій домашніх котів у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР), причому ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки ДНК МОМР бактерії Chlamydia felis здійснюють з використанням пари праймерів: прямого CHFMF 5'GCAGCTTCTGGAACTGCAAGC-3' та зворотного CHFMR 5'-GGCGАААТСAGTTCCTGCAAGА-3' з одержанням фрагменту гена МОМР розміром 221 пара нуклеотидів бактерії Chlamydia felis, що викликає захворювання у ссавців означеного виду. UA 109489 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід має відношення до молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини. Він може бути використаний для діагностики та дослідницьких робіт. Одним із способів діагностики хвороб, що викликаються мікроорганізмами, є визначення останніх за унікальністю нуклеїнової кислоти, заснований на ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з олігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої праймерами ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу від 30 до 40. Ключовим параметром, що визначає специфічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації. Існує ПЛР-тест-система "Полимик" виробництва НВФ "Литех" для ПЛР-ампліфікації ДНК Chlamydia trachomatis [1]. Основною відмінністю тест-системи, що пропонується є ПЛРампліфікація ДНК Chlamydia felis, який викликає захворювання свійських котів на хламідіоз. В основу винаходу, поставлено задачу сконструювати праймери власного дизайну, що будуть обмежувати за складом нуклеотидних послідовностей ділянку гена МОМР бактерії Chlamydia felis для діагностики хламідійних інфекцій домашніх котів. Поставлена задача вирішується тим, що як і в способі визначення бактерії Chlamydia trachomatis за методом ПЛР, у способі, що пропонується також використовується такий підхід. Створення олігонуклеотидних праймерів для визначення хламідійних інфекцій свійських котів у полімеразної ланцюгової реакції передбачало пошук специфічних ділянок гена МОМР бактерії Chlamydia felis, що не зустрічаються у будь-яких інших бактерій роду Chlamydia, та зручних для електрофоретичної детекції. Для аналізу з бази даних GenBank [1], були вибрані первинні послідовності геномів родини Chlamydia: AF272945 та AF269256 Chlamydia abortus, Х56980 Chlamydia psittaci, X61096 Chlamydia felis, AF269282 Chlamydia caviae, AF269280, AY055109 та AF269279 Chlamydia pecorum, L04982, AF131889 та M64064 Chlamydia pneumonia, AF269278 Chlamydia suis, AY380118 Chlamydia trachomatis. Згідно з винаходом, для ПЛР використовуються олігонуклеотидні праймери, які обмежують консервативну ділянку гена головного мембранного білка (МОМР) бактерії родини Chlamydiaceae роду Chlamydia виду Chlamydia felis. Для цього використовується пара розроблених праймерів - одного прямого CHFMF: 5'-GCAGCTTCTGGAACTGCAAGC-3' та одного зворотного: CHFMR: 5'-GGCGАААТСAGTTCCTGCAAGА-3'. Продуктом ПЛР є фрагмент гена МОМР, що має розмір - 221 пару нуклеотидів характерний для бактерії Chlamydia felis, що викликає захворювання свійських котів. Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР у поліакриламідному або агарозному гелі дозволяє чітко визначати наявність ДНК збудника хламідіозу свійських котів за відповідним розміром ампліфікованого фрагмента. Ідентичність продукту ПЛР підтверджується рестрикційним аналізом з використанням ендонуклеази Аlu І, в результаті якого повинні утворюватися два фрагменти ДНК з розміром 94 та 127 пар нуклеотидів. Пропонований спосіб визначення збудника хламідіозу свійських котів має наступну перевагу: діагностика хламідійної інфекції за унікальною ділянкою ДНК бактерії Chlamydia felis, що є ендемічним збудником хламідіозу у означеного виду ссавців. Джерела інформації: 1. ТУ-9398-405-17253567-96. Наборы реагентов для обнаружения ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma Hominis, Ureaplasma urealyticum (ПОЛИМИК) в биологических пробах методом полимеразной цепной реакции. Инстр. по примен. - М., НПФ "ЛИТЕХ". - 1996. -4 с. 2. GenBank (версія 00.2000 року). 3. Virtual Genome Center (http://alsec/med/umn/edu/VGC.html). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 55 60 Спосіб визначення ДНК збудника хламідійних інфекцій домашніх котів у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР), який відрізняється тим, що ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки ДНК МОМР бактерії Chlamydia felis здійснюють з використанням пари праймерів: прямого CHFMF 5'-GCAGCTTCTGGAACTGCAAGC-3' та зворотного CHFMR 5' 1 UA 109489 C2 GGCGАААТСAGTTCCTGCAAGА-3' з одержанням фрагменту гена МОМР розміром 221 пара нуклеотидів бактерії Chlamydia felis, що викликає захворювання у ссавців означеного виду. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2