Спосіб визначення гранично допустимої концентрації шкідливих речовин у повітрі робочої зони

Реферат: Спосіб визначення гранично допустимої концентрації шкідливих речовин у повітрі робочої зони шляхом визначення параметрів цитотоксичної дії досліджуваних шкідливих речовин за значенням ІС50. Визначення параметрів цитотоксичної дії здійснюється на культурі клітин А549. UA 116481 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ГРАНИЧНО ДОПУСТИМОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ ШКІДЛИВИХ РЕЧОВИН У ПОВІТРІ РОБОЧОЇ ЗОНИ UA 116481 U UA 116481 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до гігієни праці, призначена для удосконалення способу визначення гранично допустимої концентрації (надалі ГДК) чи шкідливих речовин у повітрі робочої зони для гігієнічного нормування. Так, для нормування вмісту хімічних речовин у повітрі робочої зони проводять цілий ряд експериментальних досліджень, які визначають ступінь токсичної дії речовини при різних шляхах надходження, кумулятивні властивості, особливості органотропної дії тощо. Найближчим аналогом, до корисної моделі, яка заявляється, є метод, за допомогою якого можна розрахувати величину гранично допустимої концентрації шкідливих речовин, за значенням ІС50, яке отримують у дослідах на ізольованих мітохондріях, що описано у "Методических указаниях к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны" [1]. Недоліком вказаного аналога є те, що дослідження на моделях ізольованих мітохондрій вимагають наявності певного обладнання (спеціальної швидкісної центрифуги), швидкості проведення досліджень із дотриманням відповідних температурних режимів, що значно ускладнює проведення досліджень. В основу корисної моделі поставлено задачу, що полягає у вдосконаленні способу визначення гранично допустимої концентрації шкідливих речовин у повітрі робочої зони, в якому для розрахунку величини ГДК використовують величину ІС50, яку отримують у дослідах на культурі клітин А-549. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення гранично допустимої концентрації шкідливих речовин у повітрі робочої зони здійснюється шляхом визначення цитотоксичної дії досліджуваних шкідливих речовин за значенням ІС50 і, згідно з корисною моделлю, що заявляється, визначення параметрів цитотоксичної дії здійснюється на дослідженні культури клітин А-549. Спосіб здійснюється наступним чином. Для визначення величини ГДК шкідливих речовин у повітрі робочої зони експеримент здійснюють на культурі клітин А-549. Це епітеліальні клітини легенів людини, що виділені з аденокарциноми і використовуються як in vitro модель для вивчення особливостей токсичної дії хімічних речовин на бронхо-легеневу систему, а також для оцінки генотоксичних та канцерогенних ефектів. Процедура експерименту полягає у наступному. У перший день експерименту знімають клітини із культуральних флаконів за допомогою розчину трипсину, відповідно до рекомендацій по культивуванню клітинної лінії. Підраховують кількість клітин та визначають їх життєздатність у тесті з трипановим синім. Подальші дослідження цитотоксичної дії проводиться за умови наявності у клітинній суспензії не менше 90 % живих клітин. Далі готують суспензію клітин у 5 концентрації 1×10 клітин/мл та вносять по 100 мкл суспензії клітин у лунки 96-лункового 4 планшета (вихід - 1×10 клітин на лунку). Інкубують клітини у 96-лункових планшетах для адгезії клітин та утворення моношару в лунках протягом 24 год. На другий день експерименту обережно відбирають з кожної лунки середовище, відділяючи його від клітин. Далі вносять у кожну дослідну лунку по 100 мкл відповідного розведення препарату, використовуючи не менше 3 паралелей на кожне розведення. Серію розведень різних концентрацій досліджуваної речовини (8 концентрацій) готують у поживному середовищі для інкубації клітин. У контрольні лунки вносять по 100 мкл культурального середовища. Планшети інкубують в СO2-інкубаторі 24 години при температурі 37 °C. На третій день експерименту після припинення інкубації в кожну лунку 96-лункового планшета вносять по 10 мкл розчину МТТ (3-(4,5-діметілтіазол-2-іл)-2,5-дифеніл-тетразоліум бромід) та інкубують 3 год. в СО2-інкубаторі. Для приготування розчину барвника необхідно попередньо 50 мг МТТ розчинити в 10 мл розчину Хенкса. У разі тестування хімічних сполук, які мають виражені цитотоксичні властивості, а також здатність до окислення, рекомендується після припинення інкубації відібрати культуральне середовище, промити лунки теплим фосфатним буферним розчином. Потім додати середовище для інкубації (без додавання сироватки), після чого додати по 10 мкл розчину МТТ. По закінченню інкубації з вітальним барвником МТТ планшет центрифугують протягом 5 хв при швидкості 1500 об/хв, видаляють з лунок надосадову рідину та додають у кожну лунку по 50 мкл диметилсульфоксиду для розчинення кристалів формазану, витримуючи при кімнатній температурі 30 хв. Визначають оптичну густину вмісту лунок при довжині хвилі 540 нм за допомогою мультилункового спектрофотометра. Кількість життєздатних клітин розраховують за формулою: ОГДК/ОГДК×100 %, де: ОГКК - оптична густина в лунках з контрольними клітинами, ОГДК - оптична густина в лунках з дослідними клітинами. 1 UA 116481 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Для визначення параметрів цитотоксичної дії досліджуваних речовин, за отриманими показниками будують графік, відкладаючи по осі абсцис кількість життєздатних клітин (у %), а по осі ординат - відповідну концентрацію досліджуваної речовини. За графіком визначають концентрацію досліджуваної речовини, яка викликає загибель 50 % клітин -ІС50. Для більш точного обрахунку цитотоксичних концентрацій застосовують пробіт-аналіз за допомогою сучасних статистичних програм SPSS, STATISTICA тощо. Величину ГДК досліджуваної речовини розраховують за наведеною нижче формулою: -1 3 lg 1/ГДК (моль •м )=6,04+0,766 lg1/IC50, де ІС50 - концентрація, за якої відбувається пригнічення активності мітохондрій на 50 %. Приклади розрахунку: 1) Розрахунок величини ГДК кальцію сульфату (M(CaSO4)=154,1 г/Моль). За результатами експериментальних досліджень на культурі клітин А-549 у МТТ-тесті встановлено величину ІС50 для кальцію сульфату дигідрату 8,4 мг/мл=0,055 Моль/л. -1 lg 1/ГДК (моль ×л)=6,04+0,766 lg1/0,055 (моль/л)=7,00488218 -1 1/ГДК (моль ×л)=10113050,59 3 ГДК (моль-1×л)=9,89*10-8 (моль-1×л)*154,1 г/Моль=1,52*10-5 г/л=15,2 мг/м . 2) Розрахунок величини ГДК наночастинок сульфіду кадмію розміром 4,65±0,12 нм (M(CdS)=144,5 г/Моль). За результатами експериментальних досліджень на культурі клітин А-549 у МТТ-тесті встановлено величину ІС50 для наночастинок сульфіду кадмію розміром 4,65 нм 0,000698 Моль/л. -1 lg 1/ГДК (моль ×л)=6,04+0,766 lg 1/0,000698 (моль/л)=8,457606746 -1 1/ГДК (моль ×л)=286818226,6 -9 -7 3 ГДК (моль-1×л)=3,48653×10 (моль-1×л)*144,5 г/Моль=5,04×10 г/л=0,504 мг/м . 3) Розрахунок величини ГДК наночастинок сульфіду кадмію розміром 10,08 нм (M(CdS)=144,5 г/Моль). За результатами експериментальних досліджень на культурі клітин А-549 у МТТ-тесті встановлено величину IC50 для наночастинок сульфіду кадмію розміром 10,08 нм 0,000658 Моль/л. -1 lg 1/ГДК (моль ×л)=6,04+0,766 lg 1/0,000658 (моль/л)=8,477238965 -1 1/ГДК (моль ×л)=300081322,7 -9 -7 3 ГДК (моль-1×л)=3,33243×10 (моль-1×л)*144,5 г/Моль=4,82×10 г/л=0,482мг/м . 4) Розрахунок величини ГДК хлориду кадмію (М(СdСІ2)=183,4 г/Моль). За результатами експериментальних досліджень на культурі клітин А-549 у МТТ-тесті встановлено величину ІС50 для хлориду кадмію 0,000296 Моль/л. -1 lg 1/ГДК (моль ×л)=6,04+0,766 lg 1/0,000658 (моль/л)=8,742990549 -1 1/ГДК (моль ×л)=553338067,9 -9 -7 3 ГДК (моль-1×л)=1,80721×10 (моль-1×л)*183,4 г/Моль=3,31×10 г/л=0,331 мг/м . Таким чином підтверджується доцільність використання запропонованого способу визначення гранично допустимої концентрації шкідливих речовин у повітрі робочої зони. Джерела інформації: 1. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны", утв. Минздравом СССР, № 2163-80 от 04.04.80. 45 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 Спосіб визначення гранично допустимої концентрації шкідливих речовин у повітрі робочої зони шляхом визначення параметрів цитотоксичної дії досліджуваних шкідливих речовин за значенням ІС50, який відрізняється тим, що визначення параметрів цитотоксичної дії здійснюють на культурі клітин А-549. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2