Спосіб визначення активності препаратів trigonella foenum graecum l. за впливом на культури мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин

Реферат: Спосіб визначення активності препаратів Trigonella foenum graecum L. полягає в визначенні впливу препаратів Trigonella foenum graecum L. на культури клітин і оцінюванні результатів по життєздатності клітин, причому як об'єкт впливу препаратів використовують культуру мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин, а результат впливу визначають по кількості живих клітин після культивування, яку оцінюють, вимірюючи оптичну густину розчину, екстрагованого із клітин барвника кристалічного фіолетового. UA 117257 U (12) UA 117257 U UA 117257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до галузі біотехнології, і може бути застосована для дослідження біологічно активних речовин та препаратів з метою визначення їх цитотоксичного або стимулюючого впливу на проліферуючі клітини in vitro в установах та лабораторіях, які займаються створенням нових сполук, що можуть бути перспективними при розробленні нових препаратів. Використані терміни та скорочення: МСК - мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини; DMEM - Дульбекко модифіковане середовище Ігла (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); ETC - ембріональна теляча сироватка; МТТ - 3-(4,5-диметилтіазол-2-ил)-2,5-дифенілтетразоліумбромід. Відомий спосіб визначення активності препаратів Trigonella foenum graecumL., що вибрано за найближчий аналог, полягає в тому, що клітини різних пухлинних культур висівають в 96лунковий планшет при щільності 5000 клітин/лунку. Зразки інкубують при 37 °C протягом 72 і 96 годин в титрованому середовищі, що містить різні концентрації екстракту Trigonella foenum graecum L. Кількість життєздатних клітин оцінюють з МТТ-методом [Alsemari A. The selective cytotoxic anti-cancer properties and proteomic analysis of TrigonellaFoenum-Graecum. BMC Complement Altern Med. 2014 Mar 29; 14:114]. Недоліками найближчого аналогу є дослідження активності препаратів лише на пухлинних клітинах, довготривалий термін проведення випробування, а саме висновки про результати дослідження отримують лише через 5-6 діб, мінімально через 3 доби. Крім того, для оцінювання використовується МТТ-аналіз, який вимагає залучення дорогого реактиву. Для здійснення дослідження потрібно мати чи створювати банк перевивних культур, що потребує постійного підтримання культур в життєздатному стані або зберігання їх в кріосховищі. В основу корисної моделі поставлено задачу, яка полягає в розробленні способу визначення активності препаратів Trigonella foenum graecum L. за впливом на культури мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (МСК) шляхом культивування МСК в поживному середовищі, в склад якого входять препарати, виготовлені із Trigonella foenum graecum L., в певній концентрації, що дозволить зафіксувати зміни у стані культивованих клітин і визначити цитотоксичну або стимулюючу активність досліджуваних препаратів. Вивчення впливу різних концентрацій препаратів, виготовлених із Trigonella foenum graecum L., на МСК дає можливість вивчати дію препаратів не тільки на пухлинні клітини, а і на нормальні стовбурові клітини, що застосовуються в сучасній тканинній інженерії. Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який полягає в визначенні впливу препаратів Trigonella foenum graecum L. на культури різних пухлинних клітини (Т-клітинної лімфоми, В-клітинної лімфоми, папілярного раку щитовидної залози і раку, раку молочної залози), згідно з даною корисною моделлю, використовується культура мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (МСК). Мезенхімальні (стромальні) стовбурові клітини (МСК) дорослого організму поступово займають значне місце в клітинній терапії та регенеративній медицині завдяки їх плюрипотентності, тобто здатності диференціюватися в різні клітинні типи як in vitro під дією специфічних індукторів, так і після трансплантації в організм під дією мікрооточення. Спосіб виконується наступним чином. МСК отримують з тимусу мишей лінії C57BL/6 методом експлантатів. Для нарощування клітини культивують в середовищі DMEM/F12 (1:1) з додаванням 10 % ETC, 10 мМ L-глутаміну майже всі реактиви тут і далі - Sigma, США) і по 100 ОД/мл пеніциліну і стрептоміцину при 37 °C в 5 % атмосфері СO2. В лунки 96-лункового планшету вносять по 5000 МСК в 100 мкл поживного середовища. Через 24 години додають по 100 мкл середовища, що містить 10-кратні розведення досліджуваних препаратів Trigonella foenum graecum L. Як контроль використовують культури з поживним середовищем. Через 24 години стан культур оцінюють морфологічно. Для кількісної оцінки інтенсивності впливу різних розведень досліджуваних препаратів на культури МСК тимусу до прикріплених до поверхні клітин додають по 50 мкл 0,1 % розчину кристалічного фіолетового, промивають водою, висушують та екстрагують барвник 100 мкл 3 % розчину оцтової кислоти. Потім вимірюють оптичну густину розчину в кожній лунці при 630 нм. Приймаючи оптичну густину контрольних лунок за 1, підраховують індекс цитотоксичної або стимулюючої дії різних розведень досліджуваних препаратів. Дані наведено в таблиці. 1 UA 117257 U Таблиця Індекс цитотоксичної і стимулюючої активності препаратів по їх впливу на МСК тимусу мишей Контроль М 1,000 ±m n min p(t) p(U) 5 10 15 20 25 0,042 21 0,618 Розведення Trigonella Foenum-Graecum (водно-сольовий екстракт, III) -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 0,698 0,070 0,092 0,279 1,408 1,553 1,119 1,208 1,166 1,061 0,124 0,052 0,005 0,005 0,023 0,039 0,089 0,057 0,118 0,142 1 8 8 8 11 11 12 4 4 4 4 0,481 0,052 0,075 0,147 1,184 1,184 1.006 0,880 0,870 0,744