Спосіб індикації днк бактерії chlamydia pneumoniae у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (момр) для її видової диференціації

Реферат: Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia рnеumoniae у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (МОМР). Ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки означеного фрагмента гена МОМР Chlamydia рnеumoniae здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: ChPnMOMPL: 5'GGAACAAAGTCTGCGACCAT-3' та зворотного: ChPnMOMPR: 5'AAAGAAGGGTTCCATGCAGTT-3', з одержанням фрагмента гена розміром 191 пара нуклеотидів бактерій Chlamydia рnеumoniae, що є одним із видів збудників хламідіозів ссавців різних видів. UA 117492 U (12) UA 117492 U UA 117492 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини. Він може бути використаний для діагностики та дослідницьких робіт. Одним із способів діагностики захворювань, що викликаються мікроорганізмами, є визначення останніх за унікальністю нуклеїнової кислоти, заснований на ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з олігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої праймерами ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу - від 30 до 40. Ключовим параметром, що визначає специфічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації. Відомим аналогом є спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР) [1]. Основною відмінністю тест-системи, що пропонується є ПЛР-ампліфікація ДНК Chlamydia pneumoniae, яка викликає хламідіози у ссавців різних видів. В основу корисної моделі поставлена задача сконструювати праймери власного дизайну, що будуть обмежувати за складом нуклеотидних послідовностей ділянку гена МОМР бактерії Chlamydia pneumoniae для діагностики хламідійних інфекцій ссавців. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення бактерії Chlamydia felis за допомогою ПЛР, у способі, що пропонується також використовується такий підхід. Створення олігонуклеотидних праймерів для визначення хламідійних інфекцій ссавців викликаних Chlamydia pneumoniae у полімеразній ланцюговій реакції передбачало пошук специфічних ділянок гену МОМР бактерії Chlamydia pneumoniae, що не зустрічаються у будь-яких інших видів бактерій роду Chlamydia й інших мікроорганізмів, та зручних для електрофоретичної детекції. Для аналізу з бази даних GenBank [2] і PubMed [3] були вибрані первинні послідовності гена МОМР бактерій родини Chlamydia: AF269256, AF272945, CHTOMPAAD, СНТОМРАААА, DQ227703, DQ478954, DQ471955, EF202609, EU086705, EU515131, EU531729, JQ312426, КС879303, KF130872, КР984478 - Chlamydia abortus; KF366262-KF366266 - Chlamydia avium; AF269282, GQ332575, KP165541 - Chlamydia caviae; AF269257, AF269258, AY 184290, CHTOMPAAH, HQ335353, KP 165540, X61096 - Chlamydia felis; KT203195-KT203217; KT203219KT203232; LN626319-LN626326 Chlamydia gallinacea; CHTMOMPC, CHTMOMPZ, CHTOMPAAN, CTU60196 - Chlamydia muridarum; AF269279, AB512082, AB512077, EU350137, EU350138, GQ228166, GQ228169, GQ228183, GQ228185, GQ228192, GQ228194, GQ228196, HQ457484, HQ457492, HQ457493, JX272924, JF309281, JF309283-JF309286, JF309288-JF309291, JF309293JF309295, JN016880, JN594066, JN594068, JN594085-JN594122, JX311945-JX311952, KF150132KFI50137, KF150139-KF150141, LC021417-LC021422, ORF663 - Chlamydia pecorum; KJ541750KJ541758 - Chlamydia pneumoniae; AB239849; AB284055-AB284057; AB284059-AB284066; AB468956; AB512087; AF269259-AF269261; AF269263; AF269264; AF269267-AF269269; AF269265; AF269266; AF269281; AJ243525; AM050561; AY762608; AY762609; AY762611AY762613; EF202608; EU009488-EU009498; EU019091; EU048338; EU159263; EU682086EU682090; HE687292; LN624458; LN810481-LN810483; LN810469; LN810470; LN810472; LN810474; LN810477; KF770962; KP942829; KJ205581; KJ205582; KJ205584-KJ205586; KJ205588; KJ205590; KJ205591; KJ205594; KJ205596; KJ205597; HQ616169; HQ845540; HQ845543-HQ845547; HM214490; JN411078; JQ679391-JQ679394; JQ926183; JQ312425; X12647; Y16561; Y16562 - Chlamydia psittaci; AB270720, AB270722-AB270724, AB270736, AB270737, AB270739-AB270743, AJ004876-AJ004880, AJ005616, AJ440241, AF269270AF269278, AY601751, AY601752, AY687630-AY687639, CHTOMPAAM, DQ118378, KP165539, U82956, U82958-U82960 - Chlamydia suis. Згідно з корисною моделлю, для ПЛР використовуються олігонуклеотидні праймери, які обмежують специфічну ділянку гена головного мембранного білку (МОМР) бактерії родини Chlamydiaceae роду Chlamydia виду Chlamydia pneumoniae. Для цього використовується пара розроблених праймерів - одного прямого ChPnMOMPL: 5'-GGAACAAAGTCTGCGA-ССАТ -3' та одного зворотного: ChPnMOMPR: 5'-AAAGAAGGGTTCC-ATGCAGTT-3'. Продуктом ПЛР є фрагмент гену МОМР, що має розмір - 191 пару нуклеотидів специфічний для бактерії Chlamydia pneumoniae, що викликає захворювання ссавців різних видів. Структуру олігонуклеотидних праймерів для аналізу за допомогою ПЛР було сконструйовано за допомогою програми FastPCR [4]. 1 UA 117492 U 5 10 15 20 25 Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР у поліакріламідному або агарозному гелі дозволяє чітко визначати наявність ДНК бактерії Chlamydia pneumoniae за відповідним розміром ампліфікованого фрагмента. Пропонований спосіб індикації бактерії Chlamydia pneumoniae має наступну перевагу: діагностика хламідійної інфекції за специфічною ділянкою ДНК бактерії Chlamydia pneumoniae, що є збудником хламідіозів у ссавців різних видів. Даний спосіб забезпечує чітку диференціацію бактерії Chlamydia pneumoniae від інших видів бактерій родини Chlamydiaceae роду Chlamydia. Джерело інформації: 1. Пат. 109489 Україна, МПК С 12 Q 1/68, С 12 R 1/01. Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагменту гена головного білка мембрани (МОМР) / Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Цівенко Т.М.; заявники і власники Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Цівенко Т.М. - № 201315140; заявл. 24.12.2013; опубл. 25.08.2015, Бюл. №16. 2. GenBank (версія 03.2016 року). 3. PubMed (версія 03.2016 року). 4. Kalendar R. FastPCR software for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis / R. Kalendar, D. Lee, A.H. Schulman // Methods Моl Biol. - 2014. - V.1116. - P. 271 - 302. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia рnеumoniae у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (МОМР), який відрізняється тим, що ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки означеного фрагмента гена МОМР Chlamydia рnеumoniae здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: ChPnMOMPL: 5'-GGAACAAAGTCTGCGACCAT-3' та зворотного: ChPnMOMPR: 5'AAAGAAGGGTTCCATGCAGTT-3', з одержанням фрагмента гена розміром 191 пара нуклеотидів бактерій Chlamydia рnеumoniae, що є одним із видів збудників хламідіозів ссавців різних видів. 30 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2