Спосіб індикації днк бактерії chlamydia suis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (момp) для її видової диференціації

Реферат: Заявлений спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia suis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (МОМР). Ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки означеного фрагмента гена МОМР Chlamydia suis здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: ChSuMOMPL: 5'TTCTTTGCAATGCTGCTGAA-3', та зворотного: ChSuMOMPR: 5'-ATCAAAGCTTGCTCGAGACC3', з одержанням фрагмента гена розміром 215 пар нуклеотидів бактерій Chlamydia suis, що є одним із видів збудників хламідіозів свиней і ссавців інших видів. UA 117099 U (12) UA 117099 U UA 117099 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений спосіб належить до молекулярної біології, біотехнології та ветеринарної медицини. Він може бути використаний для діагностики та дослідницьких робіт. Одним із способів діагностики захворювань, що викликаються мікроорганізмами, є визначення останніх за унікальністю нуклеїнової кислоти, заснований на ампліфікації ДНК у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з одігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої праймерами ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу від 30 до 40. Ключовим параметром, що визначає специфічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації. Існує спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (МОМР) [1]. Основною відмінністю тест-системи, що пропонується є ПЛР-ампліфікація ДНК Chlamydia suis, яка викликає хламідіози у свиней і ссавців інших видів. В основу корисної моделі, поставлено задачу сконструювати праймери власного дизайну, що будуть обмежувати за складом нуклеотидних послідовностей ділянку гена МОМР бактерії Chlamydia suis для діагностики хламідійних інфекцій ссавців. Поставлена задача вирішується тим, що як і в способі визначення бактерії Chlamydia felis за методом ПЛР, у способі, що пропонується також використовується такий підхід. Створення олігонуклеотидних праймерів для визначення хламідійних інфекцій ссавців викликаних Chlamydia suis у полімеразній ланцюговій реакції передбачало пошук специфічних ділянок гена МОМР бактерії Chlamydia suis, що не зустрічаються у будь-яких інших видів бактерій роду Chlamydia й інших мікроорганізмів, та зручних для електрофоретичної детекції. Для аналізу з бази даних GenBank [2] і PubMed [3] були вибрані первинні послідовності гена МОМР бактерій родини Chlamydia: AF269256, AF272945, CHTOMPAAD, CHTOMPAAAA, DQ227703, DQ478954, DQ471955, EF202609, EU086705, EU515131, EU531729, JQ312426, KC879303, KF130872, KP984478-Chlamydia abortus; KF366262-KF366266-Chlamydia avium; AF269282, GQ332575, KP165541-Chlamydia caviae; AF269257, AF269258, AY184290, CHTOMPAAH, HQ335353, KP165540, X61096-Chlamydia felis; KT203195-KT203217; KT203219-KT203232; LN626319LN626326 Chlamydia gallinacea; CHTMOMPC, CHTMOMPZ, CHTOMPAAN, CTU60196-Chlamydia muridarum; AF269279, AB512082, AB512077, EU350137, EU350138, GQ228166, GQ228169, GQ228183, GQ228185, GQ228192, GQ228194, GQ228196, HQ457484, HQ457492, HQ457493, JX272924, JF309281, JF309283-JF309286, JF309288-JF309291, JF309293-JF309295, JN016880, JN594066, JN594068, JN594085-JN594122, JX311945-JX311952, KF150132-KF150137, KF150139KF150141, LC021417-LC021422, ORF663-Chlamydia pecorum; KJ541750-KJ541758-Chlamydia pneumoniae; AB239849; AB284055-AB284057; AB284059-AB284066; AB468956; AB512087; AF269259-AF269261; AF269263; AF269264; AF269267-AF269269; AF269265; AF269266; AF269281; AJ243525; AM050561; AY762608; AY762609; AY762611-AY762613; EF202608; EU009488-EU009498; EU019091; EU048338; EU159263; EU682086-EU682090; HE687292; LN624458; LN810481-LN810483; LN810469; LN810470; LN810472; LN810474; LN810477; KF770962; KP942829; KJ205581; KJ205582; KJ205584-KJ205586; KJ205588; KJ205590; KJ205591; KJ205594; KJ205596; KJ205597; HQ616169; HQ845540; HQ845543-HQ845547; HM214490; JN411078; JQ679391-JQ679394; JQ926183; JQ312425; X12647; Y16561; Y16562Chlamydia psittaci; AB270720, AB270722-AB270724, AB270736, AB270737, AB270739-AB270743, AJ004876-AJ004880, AJ005616, AJ440241, AF269270-AF269278, AY601751, AY601752, AY687630-AY687639, CHTOMPAAM, DQ118378, KP165539, U82956, U82958-U82960-Chlamydia suis. Згідно з корисною моделлю, для ПЛР використовуються олігонуклеотидні праймери, які обмежують консервативну ділянку гена головного мембранного білка (МОМР) бактерії родини Chlamydiaceae роду Chlamydia виду Chlamydia suis. Для цього використовується пара розроблених праймерів - одного прямого ChSuMOMPL: 5'-TTCTTTGCAATGCTGCT-GAA-3' та одного зворотного: ChSuMOMP: 5'-ATCAAAGCTTGCTCGAGACC-3'. Продуктом ПЛР є фрагмент гена МОМР, що має розмір - 215 пар нуклеотидів специфічний для бактерії Chlamydia suis, що викликає захворювання свиней і ссавців інших видів. Структуру олігонуклеотидних праймерів для аналізу за допомогою ПЛР було сконструйовано за допомогою програми FastPCR [4]. 1 UA 117099 U 5 10 15 Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР у поліакриламідному або агарозному гелі дозволяє чітко визначати наявність ДНК бактерії Chlamydia suis за відповідним розміром ампліфікованого фрагмента. Пропонований спосіб індикації бактерії Chlamydia suis має наступну перевагу: діагностика хламідійної інфекції за специфічною ділянкою ДНК бактерії Chlamydia suis, що є збудником хламідіозів у ссавців різних видів. Даний спосіб забезпечує чітку диференціацію бактерії Chlamydia suis від інших видів бактерій родини Chlamydiaceae роду Chlamydia. Джерела інформації: 1. Пат. UA 109489 Україна, МПК С12Q 1/68, С12R 1/01. Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia felis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (МОМР) / Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Цівенко Т.М.; заявники і власники Ксьонз І.М., Почерняєв К.Ф., Цівенко Т.М. - № 201315140; заявл. 24.12.2013; опубл. 25.08.2015, Бюл. № 16. 2. GenBank (версія 03.2016 року). 3. PubMed (версія 03.2016 року). 4. Kalendar R. FastPCR software for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis / R. Kalendar, D. Lee, A.H. Schulman // Methods Моl Biol. - 2014. - V. 1116. - P. 271-302. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб визначення ДНК бактерій Chlamydia suis у полімеразній ланцюговій реакції шляхом ампліфікації фрагмента гена головного білка мембрани (МОМР), який відрізняється тим, що ампліфікацію консервативної за нуклеотидним складом ділянки означеного фрагмента гена МОМР Chlamydia suis здійснюють за допомогою пари праймерів: прямого: ChSuMOMPL: 5'TTCTTTGCAATGCTGCTGAA-3', та зворотного: ChSuMOMPR: 5'-ATCAAAGCTTGCTCGAGACC3', з одержанням фрагмента гена розміром 215 пар нуклеотидів бактерій Chlamydia suis, що є одним із видів збудників хламідіозів свиней і ссавців інших видів. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2