Спосіб зберігання сперми осетрових риб

СОЮЗ СОВЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ РЕСПУБЛИК USD A 01 К 61/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3415620/28-13 ' (22) 31.03,82 (46) 07.12.84. Бюл. № 45 • \ (72) Н .С . Пушкарь , С В . Блохин , С.Ф.Копейка к А.П.Комлев (71* Институт проблем криобиологии и криомедицины АН Украинской ССР 1*>ї) £39.3.034(088.8) (Ь6) 1. Пгрсов Г.М. Некоторые данные по выживаемости спермкев севрюги (Acipenser stellatus, L.) ДАН СССР, 1941, 13, № 4, с.327-329. 2. Черфас Б.Л. Рыбоводство в естественных водоемах, М. t Пищепромиэдат, 1956, с.114-115. (54)(57) 1. СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ОСЕТРОВЫХ РЫБ, предусматривающий разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при температуре 1-10°С, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сохранения оплодотворяющей способности спермы, последнюю разбавляют защитным раствором в соотношении 1:1, полученную смесь разливаюі в сосуды слоем 2-10 мм, а в процессе выдерживания через термостат продувают воздух со скоростью 0,004-0,4 объема камеры в 1 ч. 2. Способ по п . 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что защитный раствор содержит воду, трис-цитратгый буфер рН 7,9-8,2, моногидрофогфат натрия , глюкозу, бычий сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов, мае.%: Трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,5 Моногидрофосфат натрия 0,5 -3,0 Гидрок арбон ат натрия 0,3 -2,0 Глюкоза 0,3 -3 ? 6 Бычий сывороточный альбумин 0,005 -0,1 Стрептомицина сульфат 0,001 -0,01 Вода Остальное 1127554 Изобретение относится к рыбоводству и может быть использовано для искусственного разведения осетровых рыб (белуги, севрюги, стерляди, осетра и д р . ) . _ Известен способ хранения спермы осетровых рыб, при котором сперму хранят на льду при температуре 1-3°С [і].. Однако данный способ позволяет сохранить сперму незначительное вре- 10 мя, при этом ее оплодотворяющая способность снижается с первых суток хранения. Наиболее близким к изобретению является способ хранения спермы осет-15 ровых рыб, предусматривающий разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при 1-10°с[2]. Однако известный способ не обеспечивает сохранение оплодотворяющей способности спермы. Цель изобретения - сохранение оплодотворяющей способности спермы. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу хранения спермы осетровых рыб, предусматривающему разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при температуре 1-10°С, сперму разбавляют защитным раствором в соотношении 1:1, полученную смесь разливают в сосуды слоем 2-10 мм, а в процессе выдерживания через термостат продувают воздух со скоростью 0,004-0,4 объема камеры в і ч . 20 25 местат продувают воздухом со скоростью 0,004-0,4 объема камеры в і ч . Для смешивания спермы берут защитный раствор при следующем соотношении компонентов, мае. % : Трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,5 Моногидрофосфат натрия 0,5-3,0 Гидрокарбонат натрич 0,3-2,0 Глюкоза 0,3-3,6 Бычий сывороточный альбумин 0,005-0,1 Стрептомицина супьфат 0,001-0,01 Вода Остальное Смешивание спермы с защитным раствором производят в соотношении 1:1, которое выбрано потому, что при изменении соотношения в сторону увеличения содержания спермы концентрация защитных добавок, входящих в раствор,становится недостаточной для сохранения оплодотворяющей способности спермы, а увеличение концентрации* добавок в самом защитном растворе изменяет его осмотиччость и тем самым делает его непригодным для использования. ^0 Увеличение разбавления спермы защитным раствором приводит к неоправданному увеличению расхода реактивов и габаритов сосудов для хранения спермы, причем сохранность спермы при этом не по35 вышается. В процессе хранения спермы через термостат продувают воздух, что необходимо для обеспечения нормального дыхания спермы в процессе 40 ее хранения. При недостаточной продувке в сперме из-за накопления углекислоты происходит закисление спермиев и даже их гибель. 45 При излишне интенсивной продувке наряду с подсыханием спермы возникает опасность развития губительных для клеток спермы процессов перекисного окисления. Кроме того, целесообразно включить в защитный раствор воду, трисцитратный буфер рН 7,9-8,2, моногидрофосфат натрия, глюкозу, бычий сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов , мае.% : Трис-цитратный буфер рН 7,9-8,2 0,15-6,5 Моногидрофосфат натрия " 0,5-3,0 Гидрокарбонат натрия 0,3-2,0 п Глюкоза 0,3-3,6 Бычий сывороточный альбумин 0,005-0,1 Стрептомицина сульфат 0,001-0,01 Вода Остальное 55 Способ осуществляется следующим образом. Сперму -охлаждают до 1-Ю С со скоростью 4-6 /мин и смешивают 1:1 с защитным раствором, имеющим такую же 60 температуру. Раствор готовят на речной воде„ Сперму, смешанную с раствором, разливают в плоские сосуды слоем 2-10 мм и устанавливают в термостат с температурой 1-10 С. Тер« Широкий предел расхода воздуха при продувке объясняется универсальностью способа, предусматривающего как очень плотную загрузку сосудами со спермой (в этом случае необхгдима продувка до 0,4 объема камеры в і ч ) так и минимальную загрузку, например 1 сосуд (чашка Петри) на 200--: литровый термостат (при этом вполне достаточна продувка 0,004 объема камеры в і ч ) . Воздух,используемый для продувки через термостат, должен содержать кислород не ниже нормального атмосферного уровня, температура его должна быть снижена до температуры 1127554 ратного буфера рН 8,2 б р 5? моногидхранения, а его относительная влажрсфосфата натоич 3; гидрокарбоната ность nocj.e охлаждения должна быть натрия 2; глюкозы 3,6; бычьего сыне ниже 7 0%. вороточного ачьбумкка 0,1? стрептоВысота слоя спермы в сосуде 2мицина сульбата 0,001 н остальное 10 мм обусловлена необходимостью 5 речная вода. Смесь разливают в сосуды нормального Газообмена и может кослоем 10 мм и помещают в термостат лебаться для разных видов осетровых с температурой Ю С . В процессе храрыб. нения производят продувку камера Так, например, для спермы белуги термостата воздухом со скоростью 0,4 и севрюги наилучшие результаты по10 объема камеры в і ч . Через 5 сут лучаются при высоте слоя 5 мм, а активность спермы 65%, оплодотворяюдня осетровых русского и персидскоіиая способность 7 2%. го видов высота слоя 1Q ^ j-'e^ не П р и м е р 3. Сперму севрюги сказывается значительно НР р е з у л ь (Aeipenser s t e l l a t u s . P a l l a s ) с актатах хранение. Г :я г а Высота слоя 10-мм яйляет' Р ~ * ' - 1 : тивностью 90% в количестве 100 см смечых ы б шив лют с 100 см' раствора, содержа- • яичной дня ^ ^х ЕНДСВ осе т р о Р ' щего, %: трис-цитратного буфера рН и увеличен, і приводі3ВИТИЮ 8,0 0,75; моногидрофосфата натрня 1; т к значительной шоксии при х] гидрокарбоната натрия 1 г Гэ; глюкозы ( независимо , и н - . . , н с , и в н о с Т 1 про1,8; бычьего сывороточного альбу20 мина 0 , 0 1 ; стрептомицина сульфата дувки термостаїа) . При снижении высота ело спермы 0,005 и остальное-речная вода D Смесь ниже 2 мм к сперматозоидам поступаразливают в сосуды слоем 5 мм и поет повешенное количество кислорода мещают в термостат с температурой и развивается гипероксия, при этом 4°С, через который продуваюі воздух происходит защелачивание спермы со скоростью 0,1 объема камеры т е р (двиг. 0,5-0,6 рН) за счет активимостата в 1 ч . зации внутриклеточного окисления, Через Ь сут хранения активность Ч'А'6 приводит к гибели сперматозоиспермы 75-80%, оплодотворяющая сподов , и создаются условия для развисобность 92%. тия перекисного окисления липидов 30 П р и м е р 4. Сперму белуги їв сперме, что также небезопасно для (Huso huso 1| c_активностью 80% нее, в количеств'е 3 0 см 3 смешивают с 30 см 3 Кроме того,сперма при хранении раствора, содержащего, %: трис-цитразделяется на два слоя: слой осевратного буфера рН 8,0 0 г 3 ; моногидроших на дно клеток и плазму. Если 35 фосфата натрия 1; гидрокарбоната натвлажносіный режим во ьремя хранения рия 1; глюкозы 2; бычьего сыворо, несколько смещается, плазма либо точного альбумина 0 f01; стрептомииспаряется, либо обводняется, происцина сульфата 0,01 и остальное ходит изменение ее осмотического давречная вода. Смесь разливают в с о ления, которое при значительном сме- 40 суды слоем 1 мм, помещают в термощении может вызвать гибель клеток. стат с температурой 5°С и продувают Однако при высоте слоя 2 мм изменевоздухом со скоростью 0,05 объема ние осмотического давления не являкамеры в 1 ч . ется губительным, так как слой клеток остается защищеннъам слоем лпазмьа Чгрез 7 2 ч хранения наступает П р и м е р 1. 50 см'спермы ь.лу-* AS гибель спермы в результате частичги ( Huso huso L ) с акгиг-іо стью 8'% ного высыхания смеси, смешивают с 50 см^ рас вор- а, со;-Р~ ; П р и м е р Б . 70 см спермы жавдего, %: Ті,ис-цитра ного буфє^'' -осетра (Aeipenser d u l d r n s t a d t i рН 7,9 0,15; моногид'офосфах-я натJ3randt) с активностью 90% смешивают рия 0,50; гидрокарбшата натрия 50 ( - ^0 см раствора, содержащего, %: 0 , 3 ; глюкезы 0 , 3 ; блчьего сыворо1-рис-цитратного буфера с рН 8,0 2; точного альбумина Г, 0050; стрептомоногидрофосфата натрия 0 , 8 ; гидромицина сульфата '•, 001 и остальное карбоната натрии 1,5; глюкозы 0 , 5 ; речная водз. После перемешивания бычьего сывороточного альбумина смесь разлив лот в сосуды споем .2 м-, 0 р 0 5 ; стрептомицина сульфата 0,01 с и помещают в термостат температу- 55 и остальное - речная вод?„ Смесь рой 1 е с , через который Продувают разливают в сосуды слоен 3 мм и воздух со скоростью 0,0С4 объема помещают в термостаг при т е ї т е р а камеры термостата в і ч . Через 5 сут туре 15°С с интенсивностью цродузхранения активность спермы 60%, оплоки воздухом 0/1 объема камеры в і ч . дотворяющая способность 70%. & Через 4 0 ч отмечается гибель клеток спер1*яьз. П р и м є р 2, 30 см ' спермы * » осетра (Acippnser g i i l d g n s t a d t i Biandt) П р и м е р е . Сперму севрюги' с активностью 75% смешивают с 30 см (Aeipenser s t s l i a t u s P a l l a s ) - с afcраствора, содержащего, %; трис-циттиэностью 60% в количестве 50 с м ? 1127554 и остальное - речная в е д а . Смесь смешивают с 50 смЗ раствора, содерРазливают в сосуды слоем 4 мм и пожащего, %: трис-цитратною буфера мещают в термостат с температурой рН 8,0 5; моногидрофосфата натрия Ю°с, предувая воздух со скоростью 1,2; глюкозы 3; бычьего сывороточ0,4 объема камеры з 1 ч . Чер^з 5 сут ного альбумина 0,01; стрептомицина активность спермы 2 5%, оплодотворяюсульфата 0,01 и остальное - речная щая способность 17%. Низкие рыбоводвода. Смесь разливают слоем 13 мм ные качества объясняются зателачии помещают в термостат при темпеванием спермы при хранении вследствие ратуре ,7°С. Термостат продувается недостаточной буферной емкости защитвоздухом со скоростью 0,01 объема 10 камеры в 1 ч. Через 100 ч сперма погибает от недостатка кислорода мь- < еврюги на дне сосуда под слоем плазмы. itei ' c u s ei На:.) с а к П р и м е р 7. 100 см* сперм тив о с ' -.ю 9(£т в количеа ІBfi 100 см белуги (Huso huso 1 ) с активностью '"Меті 'вают с іоо с м ^ Р 90% смешивают с 100 см э раствора, с гкь-цего, %: ^.р^с-цитра имеющего в своем составе, %: трисрй 7,5 0, 'д. ' м -оюгидрофог цитратного буфера рН 8,0 0,3; моно0,3; рия 0 , 5 ; Г И д р О к а р б о н а т а гидрофосфата натрия 1; гидрокарбо'ОГГ ГЛЮКОЗЫ г). ОЬТЧБ е Г О СЫЕ -,_ , ната натрия 1; глюкозы 2; бычьего альбумин Q C .j j треп томі, дина суль; сывороточного альбумина 0,1; стрепV (льное - речная вофата 0 Oj д томицина сульфата 0,01 и остальноеЛИВСІОТ в сосуды слоем д а . Смесь a a речная вода. Смесь разливают в со3 мм и П' чещают в термостат с темсуды слоем 5 мм и помещают в термоспературой 2°С, кота^а продувается тат с температурой 5°С, который воздухом со скоростью 0,1 объема продувается воздухом со скоростью 25 камеры в 1 ч.-"Через 5 сут отмечена 0,002 объема камеры в і ч . Через единичная активность спермиев, опло5 сут активность спермы 20-25%, дотворяющая способность отсутствует. оплодотворяющая способность 22%. Ввиду низкого рН (7,5) защитного Снижение рыбоводных качеств вызвано раствора сперма частично активиротеми же причинами, что и в примевана и теряет свои рыбоводные ка30 чества. ре 6. П р и м е р 8. Сперму севрюги П р и м е р 11. 100 см спермы (Acipenser stellatus Pallas) с белуги (Auso huso 1 ) , имеющейгактивактивностью 7 5% в количестве 50 см ность 80%, смешивают с 100 с м 5 растсмешивают с 50 см' раствора, содерсодержащего, %: трис-цитрат35 вора, буфера 0,3; моногидрофосфата жащего, %: трис-цитратного буфера ного рН 8,0 5; моногидрофосфата натрия натрия 1; гидрокарбоната натрия 1; 2,5; гидрокарбоната натрия 0,7; глюкозы 2; бычьего сывороточного глюкозы 0,2; бычьего сывороточного альбумина 0,1; стрептомицина сульфа'альбумина 0,01; стрептомицина сульта 0,000] и остальное - речная вода. фата 0,01 и остальное - речная вода. 40 Смесь разливают в сосуды слоем 5 мм Смесь, разлитую в сосуды слоем 4 мм, и помещают в термостат, где поддержипомещают в термостат. Температура вается температура 9 С и произвохранения 3 С, скорость продувки воздится продувка воздухом со скоростью духом 0,07 объема камеры в і ч . Чере: -0,006 оЗъема камеры в ч Чоре • 0ч 5 сут активность спермы составляет -ІЗ. та™е 45 слр-'оме гогибг.еі 40-45%. оплодотворяющая способность аи г ІЯ пжроф; ю р 47%. Ухудшение рыбоводных качеств Пре, . о е , обе с:ечі ЇЬ ве, %: трис-цитратного буфера рН 8,0 0,05; моногидрофосфата натрия 3 j 'тмичнесть pauon- э" гидрокарбоната натрия 2; глюкозы 55 сок^агихь количество 3,6; бычьего сывороточного альбумина путем более попнс ) Г О использования 0,1; стрептомицина сульфата 0,01 спермы. гг /і ВИП НИЛ занаэ 8773/2 Тираж 7'Ч Подписное І П "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, Ш 4