Середовище для консервування сперми та спосіб його приготування

1. Среда для консервирования спермы животных, включающая раствор углевода, глицерин и нативный желток, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что среда дополнительно со Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных и может быть применено в иммунологии, биологической промышленности и на госплемпредприятиях. Известна среда для консервирования спермы животных, включающая раствор углевода, глицерин и нативный желток. Готовя г эту среду путем смешивания всех компонентов - раствора углевода, глицерина и нативного желтка. Смесь расфасовывают во флаконы емкостью 190-200 мл и подвергают пастеризации в течение 45 мин при температуре 60-62°С. Срок хранения среды составляет 3-5 сут. держит 33 % раствор перекиси водорода при следующем соотношении компонентов, мл; Раствор углевода 63-75 Глицерин 5-7 Нативный желток 20-30 33% раствор перекиси водорода 0,01-0,1. 2. Способ приготовления среды для консервирования спермы животных включающий получение раствора путем смешивания раствора углевода, глицерина и нативного желтка, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что полученный раствор смешивают с 33% раствором перекиси водорода, затем расфасовывают в ампулы, герметизируют, прогревают по температуре 65-75°С, выдерживают при данной температуре в течение 20-40 минут, а затем охлаждают до комнатной температуры. Недостатком известной среды является то, что она не обеспечивает насыщения кислородом половых клеток в процесса консервирования спермы, что снижает сохранение биологической активности половых клеток и их оплодотворяющей способности. Недостатком способа приготовления среды является то. что наличие в составе нативного желтка, являющегося термолабильным веществом, исключает использование в дешевых эффективных способов стерилизации, что не позволяет централизовано производить искусственную среду и стандартизировать ее по биологическим и санитарным показателям. Задача изобретения - сохраниіь высокую биологическую активность спермиев за С GO СО О 13138 сет насыщения их кислородом в процессе консервирования, з также обеспечить условия длительного хранения среды. Для решения задачи в среду для консервирования спермы животных, включающую 5 раствор углевода, глицерин и нативный желток согласно изобретения в среду дополнительно воодят 33%-ный раствор перекиси водорода при следующем соотношении компонентов {в мл). Раствор углевода 63-75, гли- 10 церина - 57, нативный желток - 20-30, 33% раствор перекиси водорода - 0,01-0,1. Поставленная задача решена тем, что в способе приготовления среды для консерви рования спермы животных, включающем 15 получение раствора путем смешивания рас твора углевода, глицерина и иативного жел тка, согласно изобретению, в раствор дополнительно вводят 33% раствор переки си водорода, затем расфасовывают в ампу- 20 лы, герметизугат, прогревают до температуры 65-75°С, выдерживают при данной температуре в течение 20-40 мин, а затем охлаждают до комнатной температу ры. 25 П р и м е р 1. Навеску лактозы 69,3 г засыпали в мерный цилиндр № 1 и раствори ли ее до объема 130 мл бидистиллированной водой. К полученной смеси добавили 300 мл нативного желтка, 70 мл глицерина, смеша- 30 ли и получили 500 мл концентрированного (маточного) раствора, из которых отобрали пробы по 50 мл и расфасовали их в 7 стек лянных ампул. Параллельно с этим в 7 ана логичных ампул расфасовали по 50 мл 35 дистиллированную воду и внесли в каждую ампулу с водой 0,001; 0,005; 0,01; 0,015; 0,1; 0,15 мл 33%-ного раствора перекиси водо рода соответственно. В одну ампулу пере кись не вводили. 40 Затем полученные растворы перекиси водорода внесли в ампулы с концентрированными (маточными) растворами испытуемых сред. Ампулы запаяли на пламени газовой горелки и выдержали при комнат- 45 ной температуре в течение 24 ч. После этого из каждого флакона отобрали пробы сред для исследования на бактериальную загрязненность, оставшиеся среды использовали для замораживания спермы по Харьковской 50 технологии, криоконсервации спермы производителей. Результаты влияния различных концентраций перекиси водорода в искусственной среде на ее санитарные показатели и на 55 биологические показатели спермы при ее криоконсервзции сведены в табл. 1. Установлено, что оптимальные условия для выживаемости спермиев создаются при использовании п среде 33%-ного раствора перекиси водорода в концентрациях 0,010,1 объемных процента. Однако, при концентрации препарата 0,01% при котором выявлено наибольшее стимулирующее действие на сперму не обеспечивается полная стерильность среды. В связи с этим для усиления бактерицидного действия нами был применен дополнительный нагрев среды с использованием предельно допустимых температур относительно нативного желтка, входящего в состав испытуемой среды. П р и м е р 2. Приготовили среды по методике, описанной выше. Стеклянные ампулы со средами запаяли на пламени газовой горелки и поместили в водяную баню, прогрели их до температуры 70°С и выдержали при этой температуре в течение 30 мин. Затем ампулы со средой охладили до комнатной температуры, выдержали при этой температуре в течение 24 ч. Затем провели испытания сред при замораживании спермы и на их бактериальную загрязненность. Результаты испытаний приведены в табл. 2. Анализ результатов, приведенных *в примерах, показал, что использованный комплекс синеридных факторов (способ введения в среду предложенного препарата и дополнительный прогрев среды) обеспечили достоверное улучшение сохранения биологической активности половых клеток при криоконсервации и обеспечили надежный стерилизующий эффект желтоксодержащей среды при объемных дозах антисептика 0.01-0,1 мл на 100 мл среды. Эти же результаты были подтверждены после 1 г хранения указанной среды при комнатной температуре. П римерЗ . Приготовили среду с добавлением 0,01 перекиси водорода, заполнили ее в ампулы, запаяли и поместили в водяную баню, прогретую до 60°С, G5°C, 70°С, 75°С, 80°С с выдержкой при этой температуре определенного времени. Затем ампулы со средой охладили до комнатной температуры, выдержали при этой температуре 24 ч. Затем провели испытание среды при замораживании спермы и на их бактериальную загрязненность. Результаты опытной проверки приведены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что оптимальными режимами прогрева, которые не отразились бы на биологической активности спермы после деконсервации, являются 65-75°С с соответствующей выдержкой 20-40 мин. В качестве контроля использовали искусственную среду, приготовленную по общепринятой методике, без внесения 13138 80%, полную стерильность среды, увеличераствора перекиси водорода и прогрева срение срока хранения ее до 2 лет, вместо 3 ды. суток, снижение затрат на изготовление Предложенная среда для консервировадолгохранящбйся среды на 60-80%, возможния спермы и способ ее приготовления обеспечивает дост оверное улучшение 5 ность централизованного производства показателя абсолютной выживаемости долгохранящихся сред без нарушения экоспермиев после консервирования на 60логии окружающей среды. Таблица 1 Показатели Известная среда (прототип) Активность спермиеи после замораживания, балл Кол-во микробных тел в 1 мл среды, шт Конечная концентрация 33%-ного р-ра перекиси водорода в среде в мл 0,001 0,005 0,01 4,0 4,2 4,2 4,5 750 280 160 0.015 0.1 4,3 4,3 срериль- стерильно но 0,15 3,0 стерильно 10 Таблица 2 Показатели Конечная концентрация 33%-ного р-ра перекиси водорода в среде в сочетании с нагревом при 20°С 0 кон г. Активность спермиев после замораживания, балл Кол-во микробных тел в 1 мл среды, шт 0,001 0,005 0,01 0,015 0.1 0,15 4,0 4,2 4,3 4,5 4,4 4,3 3,5 580 60 стер. стер. стер. стер. стер. 13138 Таблица 3 Показатели Температура прогрева с выдержкой Упорядник Замовлення 4100 65°С 40 мин 70°С 30 мин 75°С 20 мин 4,5 4,5 4,5 4,5 20 Активность спермиев после замораживания, балл Кол-во микробных тел в 1 мл среды, шт 60°С 40 мин стер. стер. стер. Техред М.Моргентал Коректор 80°С 20 мин свертивание (денатурация) среды стерильно Н.Король Тираж Підписне Державне патентне відомство України. 254655, ГСП. Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна. 101